CN113316632A - 小球藻的改良菌株及生产方法 - Google Patents

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Abstract

公开了具有非常低的叶绿素含量的小球藻的改良菌株。还公开了用于生产它们的方法。所述方法包括实施小球藻的亲代菌株的诱变。此外，公开了包含来源于小球藻的改良菌株的藻类生物质的组合物以及它们在食品和/或化妆品以及其它应用中的用途。

Description

小球藻的改良菌株及生产方法
技术领域
本公开总体上涉及藻类或微藻类，并且更具体地涉及具有非常低的叶绿素含量的小球藻(Chlorella vulgaris)的改良菌株(modified strains，修饰菌株)。本公开涉及叶绿素含量小于相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株。此外，本公开还涉及生产叶绿素含量小于相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株的方法。此外，本公开涉及包含来源于上述小球藻的改良菌株或者通过实施上述方法获得的藻类生物质(algae biomass，藻生物质)的组合物。本公开还涉及微藻产品，其包含来源于上述小球藻的改良菌株或者通过实施上述方法获得的微藻生物质的匀浆(homogenate)。
背景技术
随着目前以及预计的全球人口增加，对于满足所有个体营养需求的需求不断增加。此外，为了满足这些营养需求，全球使用了大量土地来种植作物和/或开发植物基(plant-based)食品来源。除了植物基食品来源之外，全世界作为主要食品来源还依赖于动物基食品来源，如禽类、牛和海产食品，并且对于用于人消费的动物的养殖，需要大量土地、食品和水资源。由于不断增长的人口生活所需的资源日益增加，因此已将使用如此大量的土地、食品和/或水来养殖用于消费的动物视为是有问题的。此外，已注意到在为人类供应食品的过程中，大量屠宰动物，从而影响平衡的生态系统(例如，导致温室气体排放增加，动物群体减少等)。因此，对于能够以成本有效且容易的方式生产营养且适口的食品成分的其它食品来源的需求日益增加。
最近，已将真菌、藻类、浮游植物、浮游动物等鉴别为食品、生物燃料、化妆品、药物或营养制剂成分、用于化学应用等的潜在资源。例如，藻类是简单的不开花植物，它们的培养仅需要水、日光和少量营养物。藻类可以在微型藻类(或“微藻类”，如浮游植物)至多细胞藻类(或“大型藻类”，如海藻)的范围内。传统上，已将大型藻类，如海藻和海草灰用作人和动物两者消费的食品来源。
除大型藻类之外，微藻类也已被鉴别为必需营养物的潜在来源，其提供了几种其它益处。绿色微藻类，小球藻，已被鉴别为超级食品，并且由于“在1997年5月15日前作为食品或食品成分上市且已有显著程度的消费[在EU内]”(作为整体食品或作为成分对于人和动物两者的食用安全)并且作为完整细胞和作为提取物出现在CIRS中国化妆品成分列表上并且包括在欧洲化妆品成分列表中，因此它从EU新型食品法规(EU)2015/2283中免除。
尽管有所提供的优势，但是小球藻的使用至少部分受限于特定市场应用，包括作为常规食品来源被接受以及广泛用作化妆品和/或个人护理成分。小球藻的有限使用很大程度上是由于深绿色颜色以及通常与野生型小球藻中的叶绿素的正常水平(通常在这种生物小球藻的细胞干重的1-2％之间)有关的不希望的香味和风味所造成的。
为了克服这些问题，为了促进它们在食品中或者作为食品成分的使用，将小球藻生物质用于其中尽管颜色、外观和/或味道和气味不太吸引人，但是将更期望接受的特定产品和市场，或者以极低掺入率使用，或者通过与具有不同颜色、更强香味和/或风味的其它组分(食品或食品成分)混合，或者完全从某些产品/市场中去掉。然而，后几种技术可能仍不能克服与小球藻有关的不希望的颜色、香味和/或风味。因此，这些微藻类不具有作为食品、化妆品和/或个人护理成分的最希望的性质。
仍需要克服与小球藻微藻有关的上述缺点以及它们对于人消费及其它市场需要的使用。
发明内容
本发明克服了突出缺点并且提供了具有极低叶绿素含量的小球藻的改良菌株。
小球藻的新菌株具有极低的叶绿素含量。此外，新的菌株克服了通常与野生型微藻类并且具体地与小球藻有关的不期望的感官性质问题，并且对于人消费和作为食品、化妆品和个人护理成分以及其它应用的使用是安全且适合的。另外，本发明的菌株不仅具有极低的叶绿素含量，而且还是活性异养生物(competent heterotroph，胜任异养生物，感应异养生物，感受态异养生物)(即它们在不存在光的情况下仅靠有机碳源可培养)。此外，本发明的新菌株具有稳定的着色表型(即色素含量(pigment content)，并因此每个菌株的颜色是其基因型的性质)。
本发明还提供了小球藻的改良菌株，当在相同条件下生长时，小球藻的改良菌株的叶绿素含量小于小球藻的野生型菌株的叶绿素含量，改良菌株来源于野生型菌株。
本公开还设法提供了生产具有极低叶绿素含量的小球藻的改良菌株的方法。
本公开还设法提供了生产小球藻的改良菌株的方法，当在相同条件下生长时，小球藻的改良菌株的叶绿素含量小于小球藻的野生型菌株的叶绿素含量，改良菌株来源于野生型菌株。
根据一个方面，本公开的实施方式提供了小球藻的改良菌株，其叶绿素含量在0.001至0.5mg/g细胞干重(DCW)的范围内。
根据另一个方面，本公开的实施方式提供了小球藻的改良菌株，当在相同条件下生长时，其叶绿素含量小于小球藻的野生型菌株的叶绿素含量，改良菌株来源于野生菌株。改良菌株的叶绿素含量为0.5至0.001mg/gDCW。
小球藻的改良菌株具有显著降低的叶绿素含量并因此，与和叶绿素有关的使人不愉悦的颜色、气味和/或味道无关，这使其适合于在食品中或者作为食品产品、营养制剂、化妆品、个人护理产品等中的成分使用。值得注意地，小球藻的改良菌株是遗传稳定的并且可以在从最优到应激条件(optimal to stressful condition)的广泛条件下随时间生长，而并不仅限于光(日光或人造光)的使用。
本发明的小球藻的改良菌株是异养生物。任选地，本发明提供了小球藻的改良菌 株，当在相同条件(优选异养条件)下生长时，其叶绿素含量小于它所来源的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量，其中小球藻的改良菌株的叶绿素含量在0.001至0.5mg/g DCW的范围内。
任选地，小球藻的改良菌株的叶绿素含量在比在相同条件下生长时，小球藻的野生型菌株的叶绿素含量低至少90％至99.9％的范围内。优选地，小球藻的改良菌株的叶绿素含量在比在相同条件下生长时，小球藻的野生型菌株的叶绿素含量低至少95％至98％的范围内。
任选地，小球藻的改良菌株的叶绿素含量低于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的10％，更任选地低于5％，更任选地低于2％，更任选地低于1％，更任选地低于0.5％并且更任选地至多达0.1％。
在另一个方面，本发明的小球藻的改良菌株具有0.50至0.25mg/gDCW，优选地0.25至0.10mg/g DCW，并且最优选地0.1至0.001mg/gDCW的叶绿素含量。
任选地，小球藻的改良菌株具有白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色(lime colour)中的至少一种。任选地，小球藻的改良菌株具有与选自白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色中的至少一种颜色有关的色素组成。通常，可以通过关键色素的相对水平来定义每种颜色。
任选地，小球藻的改良菌株通过实施小球藻的亲代菌株的诱变(mutagenesis，突变)而得自小球藻的亲代菌株。亲代菌株可以是小球藻的野生型菌株或者小球藻的野生型菌株的变种(variation，变体)。小球藻的野生型菌株的变种可以是遗传突变体。
任选地，小球藻的改良菌株通过实施小球藻的野生型菌株的诱变而得自小球藻的野生型菌株。
更任选地，诱变剂是化学或物理的。优选地，诱变剂是化学的。更优选地，诱变剂是烷基化剂。由于对于植物育种、对于人消费，使用烷基化剂的化学诱变不被认为产生了如当前EU法规所定义的基因修饰生物(GMO)，因此这是有利的。这是由于使用该技术的历史所造成的。任选地，在存在诱变剂的情况下培养小球藻的野生型菌株的变种，然后在异养生长培养基上生长后，基于外观目视选择颜色变体。
任选地，在存在诱变剂的情况下培养小球藻的野生菌株或野生型菌株的变种，然后在固体培养基上生长后，基于外观目视选择颜色变体。
优选地，通过将小球藻的菌株暴露于诱变化学剂(mutagenic chemical，诱变性化学品，化学诱变剂)来实施诱变。更任选地，诱变化学剂是甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate，甲烷磺酸乙酯)。
任选地，诱变化学剂的量在0.1至1.0M的范围内。
任选地，通过将小球藻的野生型菌株暴露于非致死量的诱变化学剂来实施诱变。更任选地，诱变化学剂是甲磺酸乙酯。
任选地，诱变化学剂的非致死量在0.1至1.0M的范围内。
任选地，降低的叶绿素含量与叶绿素a(α-叶绿素)和/或叶绿素b(β-叶绿素)中的至少一种有关，并且总体而言，叶绿素含量的降低在与相同条件下生长的小球藻的野生型菌株相比至少90％至99.9％的范围内。优选地，叶绿素含量的降低在至少95％至98％的范围内。优选地，叶绿素含量为0.5至0.25mg/g DCW，更优选地，0.25至0.1mg/g DCW，并且最优选地，0.1至0.001mg/g DCW。
任选地，在异养生长模式下培养后获得小球藻的改良菌株。
任选地，在培养后获得小球藻的改良菌株：
-在20至35℃的范围内的特定温度下，
-培养预定时间段，通常1至5周的一段时间，
-在不存在光的条件下，和
-在存在有机碳能源的情况下。
更任选地，特定温度在25至30℃的范围内，优选地在25至28℃的范围内，最优选地大于28℃。
任选地，预定时间段在1至3周的范围内。
任选地，有机碳能源为葡萄糖或乙酸盐。
任选地，当非自养生长时，小球藻的改良菌株的叶黄素含量小于小球藻的野生型菌株的叶黄素含量，通常在3至10mg/g细胞干重(DCW)的范围内。
任选地，小球藻的改良菌株的叶黄素含量小于9mg/g DCW，更任选地小于8mg/gDCW，更任选地小于7mg/g DCW，更任选地小于6mg/gDCW，更任选地小于5mg/g DCW，更任选地小于4mg/g DCW，更任选地小于3mg/g DCW，更任选地小于2mg/g DCW，更任选地小于1mg/gDCW，并且更任选地至多达0.1mg/g DCW。
任选地，小球藻的改良菌株的最低蛋白质含量为至少25％、30％、35％、40％、45％或50％w/w。
任选地，在黑暗中培养小球藻的改良菌株。
相对于所观察到的颜色表型，本发明的小球藻的改良菌株是遗传稳定的。
任选地，小球藻的改良菌株来源于以下中的任一种：小球藻的野生型菌株或者小球藻的野生型菌株的变种，叶绿素含量小于以下中的任一种的叶绿素含量的改良菌株：当在相同条件(优选地异养条件)下生长时，它所来源的小球藻的野生型菌株或者小球藻的野生型菌株的变种，并且其中改良菌株的叶绿素含量为0.001至0.5mg/g DCW。
根据另一个方面，本公开的实施方式提供了生产小球藻的改良菌株的方法，小球藻的改良菌株的叶绿素含量在0.5至0.001mg/g DCW的范围内，其特征在于所述方法包括：
a)获得小球藻的亲代菌株，并使用分类学鉴别的分子方法，如18S和16S核糖体RNA基因序列的PCR扩增、测序以及比对，将菌株在遗传学上定义为小球藻；
b)对小球藻的亲代菌株实施诱变；
c)在特定温度，在黑暗中并且在存在有机碳能源的情况下将小球藻的突变菌株培育预定时间段；和
d)将表型不同于小球藻的亲代菌株的小球藻的突变菌株集落鉴别为小球藻的改良菌株。
本公开的另一个实施方式提供了生产小球藻的改良菌株的方法，所述小球藻的改良菌株的叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量，其特征在于所述方法包括：
a)获得小球藻的野生型菌株，并使用分类学鉴别的分子方法，如18S和16S核糖体RNA基因序列的PCR扩增、测序以及比对，将菌株在遗传学上定义为小球藻；
b)对小球藻的野生型菌株实施诱变；
c)在特定温度，在黑暗中并且在存在有机碳能源的情况下将小球藻的突变菌株培育预定时间段；和
d)将表型不同于小球藻的野生型菌株的小球藻的突变菌株集落鉴别为小球藻的改良菌株。
任选地，生产叶绿素含量在0.001至0.5mg/g DCW的范围内的小球藻的改良菌株的方法包括：
a)获得小球藻的野生型菌株，并使用分类学鉴别的分子方法，如18S和16S核糖体RNA基因序列的PCR扩增、测序以及比对，将菌株在遗传学上定义为小球藻；
b)对小球藻的野生型菌株实施诱变；
c)在特定温度，在黑暗中并且在存在有机碳能源的情况下培养小球藻的突变菌株；和
d)将表型不同于小球藻的野生型菌株的小球藻的突变菌株集落鉴别为小球藻的改良菌株。
任选地，小球藻的改良菌株是异养生物。
任选地，通过对小球藻的亲代菌株实施诱变从小球藻的亲代菌株获得了小球藻的改良菌株，其中亲代菌株是小球藻的野生型菌株或者小球藻的野生型菌株的变种(即遗传变体)中的任一种。任选地，通过将小球藻的野生型菌株暴露于非致死量的诱变化学剂来实施诱变。更任选地，诱变化学剂是甲磺酸乙酯。
任选地，诱变化学剂的非致死量在0.1至1.0M的范围内。
任选地，通过将小球藻的野生型菌株暴露于物理诱变剂来实施诱变，其中物理诱变剂包括以下中的至少一种：UV光、γ射线、X-射线。
任选地，本发明的小球藻的改良菌株的鉴别包括通过流式细胞术分选细胞。
任选地，基于所期望的蛋白质含量选择小球藻的改良菌株，其中所期望的蛋白质含量基于使用选自：SYPRO、钙黄绿素AM和ViaFluor SE的组的染料通过流式细胞术的细胞分选所获得的相对信号。
任选地，所述方法还包括选择小球藻的改良菌株的健康集落(或者过滤掉不健康的集落)，优选地通过在不允许的或应激条件(non-permissive or stressful condition)下培养。
任选地，所述方法还包括重复实施步骤(b)至(d)以基于所期望的性状选择小球藻的改良菌株的健康集落，其中所期望的性状包括颜色、色素含量、蛋白质含量和对处理条件改善的耐受性。
任选地，通过流式细胞术选择小球藻的改良菌株的健康集落。
任选地，特定温度在20至35℃的范围内，优选地大于28℃。
任选地，预定时间段在1至3周的范围内。
任选地，有机碳能源是葡萄糖或乙酸盐。
任选地，d)中的表型是颜色或另一种可打分的目视表型。
任选地，表型是以下中的至少一种：颜色、气味、味道或纹理(texture)。
任选地，小球藻的改良菌株是以下中的一种：白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色。通常，可以通过菌株的目视检查来决定颜色。其它方法还可以用于确定和测量菌株的颜色。
任选地，使用以下中的一种或多种培养小球藻的改良菌株：液体或固体生长培养基、混合营养生长培养基或异养生长培养基。
根据其它方面，本公开的实施方式提供了组合物，其包含来源于小球藻的改良菌株的藻类生物质，所述改良菌株的叶绿素含量在0.001至0.5mg/g DCW的范围内。通常，小球藻的改良菌株是异养生物。
本文还公开了小球藻的改良菌株，它是混合营养生物并且通过本文所述的方法获得。
任选地，组合物包含藻类生物质，所述藻类生物质来源于叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株，或者通过实施生产叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株的方法获得。
在另一个方面，本发明的组合物包含来源于小球藻的改良菌株的藻类生物质，所述小球藻的改良菌株的叶绿素含量为0.50至0.25mg/g DCW，优选地0.25至0.10mg/g DCW，并且最优选地0.1至0.001mg/g DCW。
任选地，组合物为食品或食品成分。
任选地，组合物为化妆品或化妆品成分。
任选地，在以下中的至少一种中使用所述组合物：人类食品、人类营养制备物或制剂、动物饲料、药物组合物(pharmaceutical compositions，药物成分)，包括疫苗、化妆品、个人护理组合物(personal care compositions，个人护理成分)、个人护理产品(personalcare devices，个人护理装置)或者纺织品、染料或油墨。
根据另一个方面，本公开的实施方式提供了使用上述组合物作为以下中的至少一种的成分的方法：人类食品、人类营养制备物或制剂、动物饲料、药物组合物，包括疫苗、化妆品、个人护理组合物、个人护理产品或者纺织品、染料或油墨。
本公开的另一个实施方式提供了包含来源于小球藻的改良菌株的微藻生物质的匀浆的微藻产品或粉末，所述改良菌株的叶绿素含量为0.5至0.001mg/g DCW。
任选地，微藻产品或粉末包含微藻生物质匀浆，所述微藻生物质来源于叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株，或者通过实施生产叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株的方法获得。
本公开的另一个实施方式提供了来源于小球藻的改良菌株的藻类生物质，小球藻的改良菌株的叶绿素含量为0.5至0.001mg/g DCW。
任选地，藻类生物质来源于叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株，或者通过实施生产叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株的方法获得。
根据随后的结合所附权利要求所解释的附图和说明性实施方式的详细说明，本公开的其它方面、优势、特征和目标将是显而易见的。
将理解在不背离如所附权利要求所定义的本公开的范围的情况下，本公开的特征将易于以多种组合合并。
附图说明
当结合附图阅读时，将会更好地理解以上发明内容和以下具体实施方式。出于说明本公开的目的，在附图中显示了本公开的示例性构造。然而，本公开不局限于本文所公开的具体方法和仪器。此外，本领域的技术人员将理解附图不是按比例的。只要可能，通过相同数字表示类似元件。
现将仅通过举例，参考以下附图，描述本公开的实施方式，其中：
图1是根据本公开的实施方式，生产叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株的方法的步骤的图示；
图2显示了根据本公开的实施方式，在一组野生型和颜色突变体中色素的薄层色谱分析；
图3显示了根据本公开的实施方式，在液体培养中培养的野生型(WT)、黄色(YC01)和绿黄色(YC02)小球藻菌株的比较。
图4显示了根据本公开的实施方式，在液体培养中培养的多种小球藻的改良菌株的比较，即YC06、YC03、YC10、YC18、YC24、YC14和YC20；
图5-8显示了根据本公开的多种实施方式，与对于亲代菌株(4TC3/16)以及在使用乙酸盐或葡萄糖作为主要碳源的异养条件下培养的比较性、良好鉴定的小球藻的培养物保藏菌株(culture collection strain)(CCAP211/11b)的野生型细胞中所产生的叶绿素含量相比，叶绿素缺陷型颜色变体中的叶绿素含量；
图9和图10显示了根据本公开的多种实施方式，表示为在使用乙酸盐或葡萄糖作为主要碳源的异养条件下培养的野生型细胞中所产生的叶绿素的百分比的叶绿素缺陷型颜色变体中的叶绿素含量；和
图11-14显示了根据本公开的多种实施方式，在相同条件下生长的，表示为3次测量的平均值并且以微克表示的小球藻颜色变体和野生型细胞的叶绿素含量表。
图15显示了基于色素组成，使用流式细胞术鉴别细胞亚群(白色YC20菌株和黄色YC03菌株)的实例。黑色轮廓线显示了来自白色YC20菌株的代表性群体。灰色轮廓线显示了来自黄色YC03菌株的代表性细胞群体。
具体实施方式
在概述中，本公开的实施方式涉及小球藻的改良菌株，其叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量。此外，本公开的实施方式涉及生产小球藻的改良菌株的方法。
图1显示了根据本公开的实施方式，生产小球藻的改良菌株的方法100的步骤，所述小球藻的改良菌株的叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量。在整个本公开中，如本文所使用的术语“小球藻”是指单细胞绿藻。藻类(微藻类和/或大型藻类)是在多样的生境中生长的光合生物，所述生境在具有不同的硬度、湿度、盐度、光照和温度的区域的范围内，如陆地、河流、池塘、湖泊、海洋、微咸水、废水等。小球藻物种是快速生长的微藻类(或微观单细胞生物)。也可以通过常规农业技术使小球藻在不适于培养植物的区域中生长，并且可以每天收获，例如以用作天然食品来源以满足人和/或动物的营养需求。
在整个本公开中，如本文所使用的术语“叶绿素”是指包含在绿色植物细胞中的一组绿色色素。叶绿素对于光合作用至关重要并使得光合生物能够从日光吸收能量。具体地，叶绿素使得光合生物能够从电磁光谱的可见区吸收蓝光和红光。然而，来自电磁光谱的可见区的绿光的吸收相对较差(并因此被反射)，因此赋予光合生物含有叶绿素的组织绿色。将理解叶绿素含量与以下中的至少一种有关：叶绿素a(α-叶绿素或Chl-a)和/或叶绿素b(β-叶绿素或Chl-b)。具体地，叶绿素a(或α-叶绿素)存在于所有维管和非维管植物中，而叶绿素b(或β-叶绿素)存在于藻类和绿色植物中。更具体地，叶绿素a是主要光合色素，而叶绿素b是辅色素，其可操纵地从日光的绿色部分收集能量并将其传递至吸收日光的叶绿素a。
小球藻的野生型菌株中的叶绿素含量通常在生物干重的0.1和1.5％之间的范围内。此外，培养条件，具体地光的存在与否强烈影响叶绿素含量。在黑暗中，叶绿素含量天然地被抑制至低至0.1％的生物干重，而在光下，叶绿素含量可以高达1.5％的生物干重。
小球藻的野生型菌株通常包含以约4:1的比率分布的叶绿素a(Chl-a)和叶绿素b(Chl-b)。
此外，小球藻的野生型菌株可以产生多代小球藻。在这种情况下，将小球藻的野生型菌株用作小球藻的后续代的亲代菌株。此外，亲代菌株可以是小球藻的野生型菌株(如上文所提及的)或者小球藻的野生型菌株的变种(即改良形式)。如本文所使用的术语“亲代菌株”是指小球藻的遗传变体或亚型，优选地前代。亲代菌株的特征在于与来源于亲代菌株的后续代相比不同的基因组成。后续代中的基因组成的差异可以是由突变所造成的。小球藻的亲代菌株可以得自其常规生长地点，如陆地、河流、池塘、湖泊、微咸水、废水等，或者来自人工地点，如实验室等。如本文所使用的术语“野生型菌株的变种”是指由于野生型菌株的基因修饰所产生的野生型菌株的修饰形式。将理解野生型菌株的变种包含不同于其亲代菌株，即野生型菌株的基因组成并且显示出不同于正常的亲代菌株的表型。以下列对于野生型菌株所述的相同方式，使用18S和16S核糖体RNA基因序列的PCR扩增、测序以及比对，将小球藻的野生型菌株的变种在遗传学上定义为小球藻。
在步骤102，获得小球藻的野生型菌株并使用18S和16S核糖体RNA基因序列的PCR扩增、测序以及比对，将所述菌株在遗传学上定义为小球藻。如本文所使用的术语“野生型菌株”是指如它在自然界中所存在的典型生物形式。将理解野生型菌株包含其亲代菌株的基因组成，即等位基因在基因座的正常出现，并且显示出与正常亲代菌株有关的表型。小球藻的野生型菌株可以得自其常规生长地点，如陆地、河流、池塘、湖泊、微咸水、废水等。天然存在的小球藻的野生型菌株通过实施光合作用自养生长。在光合作用过程期间，小球藻的野生型菌株利用日光、二氧化碳、水和少量营养物来产生藻类生物质。然而，还可以使用异养和/或混合营养生长模式培养小球藻的野生型菌株。小球藻的野生型菌株在它们的正常生长期内是单倍体，即仅具有一个基因组拷贝，借此使小球藻特别服从使用遗传学的表型性状改善方法，因为对于一些性状，单一基因改变可以产生所期望的表型。此外，作为单倍体，这些菌株可能是遗传稳定的，因为突变菌株基本不存在易于修正或回复为野生型状态的能力；此外，不存在可以与有利于该过程的修正模板起作用的其它DNA基因拷贝。小球藻的野生型菌株与深绿色、特殊气味(如水生、鱼样、土腥或霉味)以及令人不愉悦的味道有关。小球藻的野生型菌株具有有助于其不吸引人的深绿色、令人不愉悦的气味和味道的叶绿素含量。将野生型叶绿素含量降低至小于90％，并且更优选地小于99.9％的野生型水平与不吸引人的深绿色、令人不愉悦的气味和味道的失去有关。
使用18S和16S核糖体RNA基因序列的PCR扩增、测序以及比对，将所获得的小球藻的野生型菌株在遗传学上定义为小球藻。具体地，使用所考虑的物种的基因材料、核和/或叶绿体DNA和/或核糖体RNA(如16SrRNA、18S rRNA和23S rRNA)的PCR扩增和测序实现了小球藻的野生型菌株的鉴别。PCR扩增使用了与特定生物的基因组的适当区域有关的引物。随后，将所来源的基因组DNA和/或RNA序列与所定义的小球藻的完整基因组序列和/或部分基因组序列相比较，其中序列比对显示出对限定区域99.8％或更大的序列同一性，从而将菌株的身份确认为小球藻物种，以用于本发明中的进一步使用。具体地，可以扩增保守基因组DNA和/或16S rRNA、18S rRNA和/或23S rRNA区并与那些优选物种的相应区域相比较。更具体地，本发明选择了对得自正式鉴别为小球藻物种的分离菌株的序列中的至少一种或多种显示出至少99.5％或更大的核苷酸同一性的小球藻物种。因此，使用序列比对(比较)算法，如Smith&Waterman和Needleman&Wunsch同源性算法和/或Pearson&Lipman相似法，相对于所鉴别的(参考)序列的测试序列的测序使得能够确定核苷酸或氨基酸同一性百分比。然后，序列比较算法计算了每条测试序列的序列同一性百分比。在实例中，使用18S和16S核糖体RNA基因序列的PCR扩增、测序以及比对，对小球藻的鉴别排除了对除真实小球藻以外的小球藻的其它物种的选择。例如，样品的18S rRNA序列的比对将小球藻鉴别为与所定义的小球藻的完整(或部分)基因组序列具有99.9％的同一性，而耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)与所定义的小球藻的完整(或部分)基因组序列仅具有接近99.2％的同一性。
在步骤104，实施小球藻的野生型菌株的诱变，其中通过将小球藻的野生型菌株暴露于非致死量的诱变化学剂来实施诱变。如本文所使用的，术语“诱变”涉及通过自发自然过程或者通过使用实验室方法将生物人工暴露于诱变剂，在生物中引起突变的技术。对小球藻的野生型菌株进行诱变以生产显示出与小球藻的野生型菌株所显示的不同的表型，如颜色的小球藻的突变菌株。通常，通过将小球藻的野生型菌株暴露于诱变化学剂来进行小球藻的野生型菌株的诱变。任选地，诱变化学剂选自N-甲基-N-亚硝基脲(NMU)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)和甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸(NA)、双环氧丁烷(DEB)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、2-甲氧基-6-氯-9(3-[乙基2-氯乙基]-氨基丙基氨基)-吖啶二盐酸盐(ICR-170)、2-氨基嘌呤(2AP)和羟胺(HA)。优选地，诱变化学剂是甲磺酸乙酯(EMS)。EMS有利于某些类型的染色体突变，而不是常规诱变谱。已知EMS在对其暴露的生物的基因组成中产生随机突变，如核苷酸替换、转换性突变、单核苷酸多态性(SNP)等。EMS的使用可以由于鸟嘌呤烷基化而导致在DNA中产生突变的乙基鸟嘌呤碱基。这种突变DNA的重复复制可以导致产生转换性突变，其中原始的G:C碱基对改变为A:T碱基对，借此显著改变生物的基因组成。在此情况下，这种突变DNA的复制可以在编码序列内产生错义突变或无义突变，或者通过损害调控序列功能性而影响基因表达或基因功能，包括剪接位点突变。
如上文所提及的，非致死量的诱变化学剂可以用于实施诱变。在本发明的背景中，术语“非致死量”表示不杀死100％的菌株群体(一种或多种亲代菌株)的诱变化学剂的量。本方法使得能够选择能够在诱变中存活的突变菌株。
任选地，诱变化学剂的量在0.1至1.0M的范围内。将理解用于实施诱变的诱变化学剂的量可以决定生物所经历的突变的量。此外，生物的严重诱变细胞积累了基因材料的多个突变，通常导致生物有害的改变。这在其中仅存在每种编码基因的单一拷贝的单倍体生物中特别重要。常规地，在诱变菌株的基因组中发生多个突变。使用大量EMS来进行诱变可以与小球藻的野生型菌株相比，导致在小球藻的突变菌株中引起产生强畸变的点突变，或者可以导致小球藻的突变菌株死亡。因此，使用0.1至1.0M的诱变化学剂，如EMS，使得能够相对于可能降低细胞健康、阻碍生长或导致生物死亡的不希望的性状的过量积累，实现所期望的表型。此外，通过已在稍高于理想培养温度下暴露于诱变剂的细胞的培养，已有效应用了“应激”过滤器，从而仅其中积累的突变尚未产生虚弱或不健全的生物的更稳健的菌株可以在琼脂上产生集落。通过在过滤温度下生长，整体上集落生长较少，但是对于生长/生物质生产，确实生长的那些在生物学和遗传学上是更健康的。因此，还应预期叶绿素色素减少的在这些条件下生长并且基于初始颜色评分的那些菌株对于最终可缩放的生物过程中的应用是更稳健的。
任选地，实施小球藻的野生型菌株的诱变包括将小球藻的野生型菌株暴露于物理诱变剂，其中物理诱变剂包括以下中的至少一种：UV光、γ射线、或X-射线。这些诱变剂引起小球藻的野生型菌株的基因型的改变以导致产生小球藻的突变菌株。在这种情况下，作为通过暴露于化学诱变剂实施小球藻的野生型菌株的诱变的替代，可以实施通过暴露于物理诱变剂的诱变以获得小球藻的突变菌株。
任选地，在存在诱变剂的情况下培养小球藻的野生菌株，然后在固体培养基上生长后，基于外观目视选择颜色变体。
在步骤106，在特定温度，避光并且在存在有机碳能源的情况下将小球藻的突变菌株培养预定时间段。值得注意地，藻类，如小球藻可以在最优至极端的范围内的条件下并在多种生境中生长。通常，在恒定温度条件下，将小球藻的野生型菌株暴露于化学诱变剂(如EMS)或者任选地暴露于物理诱变剂。通常，将小球藻的野生型菌株暴露于化学诱变剂或者任选地暴露于物理诱变剂预定时间段。小球藻的野生型菌株在特定温度条件下并且相对于预定时间段的这种暴露使得能够获得小球藻的改良(或突变)菌株。任选地，特定温度在20至35℃的范围内，优选地，大于28℃，并且暴露后的预定时间段在1至3周的范围内。在实例中，将小球藻的野生型菌株在25℃暴露于甲磺酸乙酯2小时。
优选地，小球藻的突变菌株得自可以在不存在光的情况下培养的小球藻的野生菌株。如本文所使用的术语“不存在光的情况下”是指在黑暗中或不存在光的情况下培养。在此情况下，举例来说，可以将含有小球藻样品的培养皿单独用基本不透明的片材，如箔片包裹，然后可以将包裹的培养皿放置在培育箱中的纸板盒内。可以使用在黑暗中或不存在光的情况下培养的其它适合的方法。
任选地，本发明的小球藻的突变菌株得自在存在少量光的情况下培养的小球藻的野生菌株。将理解突变菌株可以在存在光的情况下生长，只要存在外源碳源，如乙酸盐或葡萄糖，但是一些突变和所产生的菌株可以使其对光超敏感，从而高于极低光水平，例如，5微摩尔/m2/秒的培养对生长具有抑制或毒性作用。任选地，限定了诱变期间所使用的光的特征(例如，光强度、光色、色强度等)。更任选地，光强度范围和质量可以是即白光LED、白色荧光、日光荧光、红光LED或者白光和红光或其它LED的混合，其光强度值在5微摩尔/m2/s至300微摩尔/m2/s，最优选地2至25微摩尔/m2/s的白光LED的范围内。
任选地，小球藻的突变菌株得自使用以下一种或多种培养的小球藻的野生菌株：液体或固体生长培养基，包括含有所添加的碳源，如葡萄糖的发酵培养基，或者含有乙酸盐的混合营养生长培养基或异养生长培养基。在实例中，小球藻的突变菌株得自使用固体培养基培养的小球藻的野生菌株。这种固体培养基可以是常规琼脂板。在这种情况下，将小球藻的突变菌株的细胞在琼脂板上以适当的细胞铺板密度铺板以在琼脂板的表面上实现致密的集落分布。重要地，注意简单碳源，如但不限于葡萄糖(右旋糖)、乙酸盐或其它简单碳化合物的添加使细胞能够以异养生长模式避光生长。固体培养基可以是高盐培养基-葡萄糖琼脂板，其中高盐培养基-葡萄糖琼脂板包含：生长培养基，如High Salt MediumTM(HSMTM)、葡萄糖(例如，1％w/v)和琼脂。
在另一个实例中，使用液体培养基培养小球藻的突变菌株。这种液体培养基可以是以下中的至少一种：TAP(Tris-乙酸盐-磷酸盐)、High Salt MediumTM(HSMTM)、葡萄糖(例如，具有一致的1％w/v)等。发酵培养基包含氮源(如蛋白或硝酸盐，或者更通常地，铵)、矿物质(包括镁、磷、钾、硫、钙和铁)、痕量元素(锌、钴、铜、硼、锰、钼)、任选的pH缓冲剂、碳源和能量(如葡萄糖、乙酸盐)等。任选地，在发酵罐中培养小球藻的野生型菌株。
优选地，以异养生长模式培养小球藻的突变菌株。换言之，小球藻的突变菌株是异养生物。例如，以异养生长模式在不存在任何光的情况下(即在黑暗中)培养小球藻的突变菌株。在该实例中，在适合的无菌条件下实现了小球藻的突变菌株的异养生长。可以通过使用碳源和能量，如葡萄糖，在不存在光的情况下使小球藻的突变菌株生长来实施异养生长。作为另外一种选择，以混合营养生长模式，在部分存在光的情况下，如通过每天将小球藻的突变菌株对光暴露有限时间或者以最低设置的光强度暴露，培养小球藻的突变菌株。在该实例中，通过同时使用不同能源培养小球藻的突变菌株来实施混合营养生长。此外，小球藻以不同的用于生长的组合使用不同的能源，以及光。
在步骤108，将表型不同于小球藻的野生型菌株的小球藻突变菌株集落鉴别为小球藻的改良菌株。例如，当使用琼脂板培养小球藻的突变菌株时，将显示出不同于小球藻的野生型菌株的表型的琼脂板上的小球藻的突变菌株集落鉴别为小球藻的改良菌株。任选地，表型是以下中的至少一种：颜色、气味、味道、纹理等。优选地，将颜色用作从小球藻的野生型菌株中筛选小球藻的改良菌株的主要方法。在这种情况下，目视筛选小球藻的突变菌株的集落以鉴别不同于小球藻的野生型菌株的表型的表型。任选地，小球藻的改良菌株的颜色为以下中的一种：白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色，其中颜色还与气味和味道强烈相关。例如，小球藻的突变菌株不能产生或具有显著降低的产生叶绿素色素(包括叶绿素a和/或叶绿素b)的能力以及可变但基因决定的产生其它色素的能力。将这些具有不同颜色，如白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色的小球藻的突变菌株的集落鉴别为小球藻的改良菌株。
任选地，小球藻的改良菌株的叶绿素含量在比在相同条件下生长时，小球藻的野生型菌株的叶绿素含量小至少90％至99.9％的范围内。更任选地，小球藻的改良菌株的叶绿素含量比相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量小90％，更任选地小95％，更任选地小98％，并且更任选地小99.9％。任选地，小球藻的改良菌株的叶绿素含量低于相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的10％，更任选地低于5％，更任选地低于2％，更任选地低于1％，并且更任选地至多达0.1％。优选地，小球藻的改良菌株的叶绿素含量为0.50至0.25mg/g DCW，更优选地，0.25至0.10mg/g DCW，并且最优选地，0.1至0.001mg/g DCW。值得注意地，小球藻的改良菌株的较低叶绿素含量使得小球藻的改良菌株商业上更可接受。例如，与叶绿素含量为0.10mg/g DCW的小球藻的改良菌株相比，叶绿素含量为0.001mg/g DCW的小球藻的改良菌株在其最终工业产品中不需要颜色的行业中将是商业上更可接受的。
将理解小球藻的改良菌株包含显著降低或可忽略的叶绿素a和/或叶绿素b含量。小球藻的改良菌株的这种减少的叶绿素含量导致与小球藻的野生型菌株相比小球藻的改良菌株中绿色色素淀积减少。将理解这种与小球藻的野生型菌株相比叶绿素含量降低并因此绿色色素淀积减少的小球藻的改良菌株将与不同于小球藻的野生型菌株的绿色的颜色相关。有利地，叶绿素含量降低的小球藻的改良菌株是多种食品和个人护理应用中的潜在成分。此外，当在食品和个人护理应用中使用时，小球藻的改良菌株的叶绿素含量的降低还与和小球藻的野生型菌株有关的令人不愉悦的气味和味道的减少有关。
任选地，小球藻的改良菌株的叶黄素含量小于小球藻的野生型菌株的叶黄素含量。叶黄素(lutein)是绿色微藻，如小球藻中的主要叶黄素类(xanthophyll)(类胡萝卜素)。叶黄素使得微藻能够吸收蓝光并反射黄光或橙红色光。此外，叶黄素在小球藻中起光能调制剂的作用并且在光合作用期间用作保护小球藻细胞避免由高强度的光所引起的光化学损伤的非光化学淬灭剂。在我们的野生型菌株中叶黄素的平均正常量为5mg/g细胞干重(DCW)。
此外，通过遗传学确定小球藻中的叶黄素含量并通过小球藻所经受的生长条件调控，包括但不限于温度、生长培养基的pH、对光的暴露、生长培养基或大气中的含氮量、生长培养基的盐度、生长速度等。在实例中，小球藻对极高温度和/或极高光强度的暴露降低了小球藻的叶黄素含量。
任选地，当在异养条件下生长时，小球藻的改良菌株的叶黄素含量在3至10mg/gDCW的范围内。
任选地，当非自养生长时，小球藻的改良菌株的叶黄素含量小于小球藻的野生型菌株的叶黄素含量，通常在3至10mg/g DCW的范围内。例如，小球藻的改良菌株的叶黄素含量可以为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5mg/g DCW至多达3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/g DCW。任选地，小球藻的改良菌株的叶黄素含量低于小球藻的野生型菌株的叶黄素含量的9mg/g DCW，更任选地低于8mg/g DCW，更任选地低于7mg/g DCW，更任选地低于6mg/g DCW，更任选地低于5mg/g DCW，更任选地低于4mg/gDCW，更任选地低于3mg/g DCW，更任选地低于2mg/g DCW，更任选地低于1mg/g DCW，并且更任选地至多达0.1mg/g DCW。值得注意地，小球藻的改良菌株的较低叶黄素含量使得小球藻的改良菌株商业上更可接受。例如，与叶黄素含量为1mg/g DCW的小球藻的改良菌株相比，叶黄素含量为0.01mg/g DCW的小球藻的改良菌株在其最终工业产品中不需要颜色的行业中将是商业上更可接受的。
小球藻的改良菌株的减少的叶黄素含量导致与小球藻的野生型菌株相比小球藻的改良菌株中橙红色色素淀积减少。与某些菌株中叶绿素含量降低一致，当在与野生型菌株相同的条件下生长时，这可以导致产生具有绿黄色、浅绿色或甚至白色外观的小球藻的基因决定的颜色形式。有利地，叶黄素含量降低的小球藻的改良菌株是多种食品和个人护理应用中的潜在成分。
可以使用技术人员已知的分析方法，例如，色谱或分光光度技术确定小球藻的改良菌株中的叶绿素a、叶绿素b和/或叶黄素和/或其它色素的含量。
此外，小球藻的改良菌株维持了25％，或者任选地30％，或者任选地35％的蛋白，或者任选地40％w/w，或者任选地45％w/w，并且更任选地50％w/w的最低蛋白质含量。例如，小球藻的改良菌株的蛋白质含量可以为25％、30％、35％、40％或45％至多达30％、35％、40％、45％或50％w/w。将理解，可能的是一些菌株可以用于生产蛋白质含量大于50％w/w的生物质。
简要地，使小球藻菌株在含有葡萄糖或乙酸盐的20毫升(ml)液体培养基中以2×106个细胞/ml的起始细胞密度生长。使细胞在26℃避光生长6天。除去10ml等份并离心(4500×g，10分钟)以收集细胞；将颗粒在1ml双蒸(dd)H2O中清洗并再次离心(4500×g，10分钟)。通过冷冻干燥，将所产生的生物质颗粒在预称重的管中干燥。一旦干燥，在实施提取前确定细胞干重(DCW)。
为了提取叶绿素，将1ml甲醇:丙酮(1:1)加入至每个样品，然后通过涡旋使样品混合并成粒(4500×g，5分钟)。将上清液收集到单独的管中。将该过程对每个样品重复4次，并将每个上清液与之前的上清液混合，直至对每个样品收集5ml。为了完成提取，将1ml二氯甲烷:甲醇(1:3)加入至所述颗粒并重复先前步骤并将1ml上清液添加至先前5ml。然后，添加1ml二氯甲烷以获得总计7ml总上清液。为了在已实施所有上述提取步骤后提取生物质颗粒中保留的任何残余色素，将1ml二氯甲烷:甲醇(1:1)加入至具有500微米(μm)玻璃珠的样品中并超声处理10分钟，将上清液再次添加至先前7ml中。在低光照条件下进行提取-在处理步骤之间将样品用箔片包裹以保护任何色素避免光降解或者光催化的化学反应。
将所提取的色素通过蒸发在60℃干燥，并将干燥的颗粒在80％的丙酮中再混悬。通过分光光度法在647、664和750纳米(nm)测量吸光度。
如Porra等人(1989)所述，将下式用于估计叶绿素含量。
叶绿素a＝(12.25×(A664-A750))-(2.55*(A647-A750))
叶绿素b＝(20.31×(A647-A750))-(4.91*(A664-A750))
总叶绿素＝(17.76×(A647-A750))+(7.43*(A664-A750))
以三个生物学重复分析所有菌株。
任选地，方法100引入了薄层色谱法来分离和显示不同菌株中的色素组成。使小球藻菌株在20ml含有1％的葡萄糖的液体生长培养基中生长。使细胞在26℃避光生长6天。除去10ml等份并通过离心(4500×g，10分钟)收集细胞。
为了提取色素，将0.5ml二氯甲烷:甲醇(1:1)加入至每个样品，然后通过涡旋使样品混合并再次离心(21000×g，5分钟)。在单独的收集管中收集含有所提取的色素的上清液。对颗粒重复该提取2次并且对每个样品，每次将其混合在相同的收集管中。
在少量光的实验室条件(<50μmol/m2/s)下进行整个提取过程，并且在处理步骤之间将样品包裹在铝箔中。
将少量样品沉积在TLC Alu箔板上的硅胶上(91835-50EA,Sigma-Aldrich(RTM))并用5:3:2的己烷:乙酸乙酯:丙酮的溶剂溶液展开。将所得的板成像以记录每种样品的分离和相对色素组成。
任选地，方法100引入通过流式细胞术的细胞分选作为富集步骤以基于自身荧光的相对信号强度来将叶绿素缺陷型细胞与野生型细胞分选开。通常，将含有细胞的样品混悬在流体中并注入流式细胞仪，其中将样品流动设置为每次一个细胞。流式细胞仪的流速可以是任何适合的速度。任选地，流式细胞仪的流速为60.000至500.000个事件每分钟。流速还可以小于60.000或大于500.000个事件每分钟。流式细胞仪使用不同波长的激光器用于异种细胞群体中细胞的多参数分析。细胞散射的光是其中的细胞和组分的特征。通常，用荧光标志物标记细胞以使得能够首先吸收光，并且随后在波长带中发射。任选地，将457/530或670/680nm激光器用于从活细胞混合物中引发强叶绿素自身荧光(Hyka等人,2013)。作为富集步骤，将显示出强自身荧光的细胞群体与具有零或显著减少的信号的那些细胞分选开以富集具有敲低或消除叶绿素信号的积累的突变的总群体内的那些细胞。可以任选地在对诱变剂暴露后2-7天之间应用该步骤并在液体培养中应用。将零位细胞，包括叶绿素含量降低的那些所期望的细胞扩增并通过另外一轮进行再次分选以确认叶绿素缺陷型表型的稳定性。然后，它们可以在液体培养中进一步扩增或者在琼脂加葡萄糖板上铺板以用于相对于其它突变体对颜色打分。作为校准细胞计数法的对照，使用90％的丙酮提取野生型细胞以除去叶绿素，然后使用强光进行光漂白20-30分钟。然后，对于叶绿素缺陷型颗粒，将这些叶绿素零位细胞(chlorophyll null cell)用于校准分选仪。此外，流式细胞术使得能够进行细胞计数、细胞分选、确定细胞特征和功能、检测微生物、生物标志物检测、蛋白质工程检测等。
任选地，一旦扩增，可以应用在特定波长进行激发的不同激光，并同时检测激光束的偏转以及来自细胞化合物的更高波长的光子的特定荧光发射(其可以用于区分最终将影响来源于携带特定基因型的特定细胞群体或单细胞的给定生物质的所产生的稳定生物质颜色的具体色素组合)，将积极生长的叶绿素缺陷型细胞群体分选成子群或单细胞。
任选地，方法100还包括过滤掉小球藻的改良菌株的不健康集落。将理解在小球藻的野生型菌株的诱变期间，小球藻的改良菌株的细胞可以在基因组内的多个位点获得突变，包括作为造成所期望的表型的原因的突变。然而，小球藻的改良菌株的一些集落可以另外例如在重要基因中获得对应于一种或多种不期望的表型的有害突变。在这种情况中，必须过滤掉与有害突变有关的小球藻的改良菌株的这些不健康的集落以确保仅选择稳健并且能够在所期望的培养条件下良好生长的那些集落。这可以通过在应激或不太允许(或不允许)的条件下，例如，在正常培养温度上限或稍高的温度下并且在不存在光但存在葡萄糖的情况下，在暴露于化学或物理诱变剂后马上的一段时间内培养生物来实现。仅稳健的菌株能够在这些条件下增殖。这种方法富集了其复制能力未受损的菌株。此外，在避光培养后，可以对与颜色有关的所期望的表型打分。在该实例中，小球藻的改良菌株的所期望的表型与白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色有关。不期望的集落将与其它颜色，包括野生型深绿色有关，并且不选择所述集落。换言之，将它们过滤掉。任选地，将在一系列代内显示出所期望的表型的小球藻的改良菌株集落选择为健康集落。更任选地，在稍高于微藻菌株的理想培养温度(如高于28℃)的温度下培养小球藻的突变菌株以仅选择小球藻的改良菌株的健康集落。
任选地，将与所期望的表型有关的小球藻的改良菌株的集落分离并在固体培养基上顺序且反复划线以获得纯集落并评价在更接近商品化培养方案的条件下的颜色表型的稳定性。使用液体培养基进一步接种纯集落。任选地，液体培养基可以是以下中的至少一种：TAP(Tris-乙酸盐-磷酸盐)、High Salt MediumTM(HSMTM)加葡萄糖(例如，具有1％w/v葡萄糖)。更任选地，将纯集落在25℃(或者20至35℃之间)的特定温度下避光条件培养1-3周并对连续多代监测稳定表型。这种稳定表型可以与小球藻的改良菌株的纯集落内的绿色缺少和/或白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色表型的存在有关。
小球藻的改良菌株可以经受另外轮次的诱变。任选地，所述方法还包括重复实施步骤(b)至(d)以基于所期望的性状选择小球藻的改良菌株的健康集落，其中所期望的性状包括颜色、色素含量、蛋白质含量和对处理条件(选自由温度、pH、剪切应力和渗透压组成的组)改善的耐受性。此外，小球藻菌株在多代内稳定。
可以在小球藻的多次诱变后在不存在光并且在存在有机碳能源的情况下，在特定温度下，将小球藻的突变菌株培养预定时间段，并鉴别具有不同于小球藻的亲代菌株的表型(或所期望的性状)的小球藻的突变菌株的集落。任选地，所述方法引入了通过流式细胞术的细胞分选以基于所期望的性状分选细胞。然而，可以使用本领域技术人员可用的任何所公开的方法实现对所期望的性状的选择。所期望的性状包括但不限于色素含量、颜色、蛋白质含量和对处理条件，包括但不限于培养温度、pH、剪切应力和渗透压的改善的耐受性。
此外，本发明的小球藻的改良菌株是遗传稳定的。如本文所使用的术语“遗传稳定的”是指物种或菌株/分离菌株耐受变化并且在多代或多次细胞分裂，理想地数百至数千次内维持其基因型的特征。在实例中，在遗传学上确定小球藻的遗传稳定菌株产生以下之一：白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色，通过小球藻的改良菌株中叶绿素和/或其它色素的缺乏或产生减少，并且在一些情况下，通过由于潜在的遗传变化所造成的中间体色素或新色素化学产物的产量增加来确定。此外，小球藻的遗传稳定菌株即使在交替生产条件下并且随时间(如，培养数百代)也不回复至与小球藻的野生型菌株有关的特征。小球藻的野生型菌株为单倍体。这是重要的，因为据观察当将其它小球藻物种或密切相关的物种的二倍体菌株用于获得颜色表型突变体时，在培养几代内观察到了表型变化，例如，从所期望的黄色回复回到绿色。这表明除所确认的单倍体小球藻菌株以外，菌株中所期望的表型的相对不稳定性。任选地，相对于所观察到的颜色表型，小球藻的改良菌株是遗传稳定的。值得注意地，在琼脂上和在液体培养中维持的小球藻的菌株的目视检查足以推断表型，如颜色在小球藻的改良菌株中是遗传稳定的。
本公开的另一个实施方式提供了藻类生物质，其来源于叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株，或者是通过实施生产叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株的方法获得的。
此外，公开了组合物，其包含来源于小球藻的改良菌株的藻类生物质，所述改良菌株的叶绿素含量在0.001至0.5mg/g DCW的范围内。还公开了组合物，其包含来源于叶绿素含量小于相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的小球藻的改良菌株的藻类生物质，或者通过实施生产小球藻的改良菌株的方法所获得的藻类生物质。在这方面，如本文所使用的术语“藻类生物质”是指来源于非自养培养的藻类(微藻或大型藻)的生物质。作为另外一种选择，叶绿素含量为5％或更低的小球藻的改良菌株仍可以混合营养生长。藻类生物质得自叶绿素含量在0.001至0.5mg/gDCW的范围内小球藻的改良菌株。此外，可以通过实施生产小球藻的改良菌株的方法来获得这种藻类生物质(如上文详细解释的)。任选地，藻类生物质可以在现代优良制造规范(cGMP)条件下得自小球藻的改良菌株。任选地，来源于小球藻的改良菌株的藻类生物质具有0.50至0.25mg/gDCW，优选地0.25至0.10mg/gDCW，并且最优选地0.1至0.001mg/gDCW的叶绿素含量。
任选地，组合物可以是食品或食品成分。术语“食品”是指人和/或动物可以直接或间接(如，制备后)消费的可食用产品。术语“食品成分”是指在食品的以下过程之一期间引入食品的物质：生产、加工、处理、包装、运输、分销、防腐、储存等。任选地，将食品成分引入食品以改善和/或维持食品的新鲜度、营养价值、外观、纹理、味道和安全性。
任选地，组合物为化妆品或化妆品成分。术语“化妆品”是指通过直接或间接应用在身体(人和/或动物)上来用于提高或改变身体部分(如面部或皮肤)的外貌或纹理或者香味的物质或产品。化妆品通常是来源于天然来源(如草本植物)、合成来源(如化学品)或其混合物的化合物的混合物。化妆品包括但不限于口红、睫毛油、眼影粉、眼睑膏、眼影膏、粉底、腮红、高光剂、古铜色化妆品、乳膏和香水。术语“化妆品成分”是指在化妆品的以下过程之一期间引入化妆品的物质：生产、加工、处理、包装、运输、分销、防腐、储存等。任选地，将化妆品成分引入化妆品以改善和/或维持其新鲜度、产品价值、外观、纹理、香味、香气和安全性。
任选地，将包含来源于上述小球藻的改良菌株的或者通过实施上述方法所获得的藻类生物质的组合物用作以下中的至少一种中的成分：人类食品、人类营养制备物或制剂、动物饲料、药物组合物、化妆品、个人护理组合物、个人护理产品或纺织品、染料或油墨。将理解减少的叶绿素含量和任选地，减少的叶黄素含量为小球藻的改良菌株提供了一个或多个参数，如有吸引力的外观、令人愉悦的气味和/或味道。因此，小球藻的改良菌株的这一个或多个参数使得能够在人和/或动物使用或消费的多种产品中使用。例如，得自小球藻的改良菌株的藻类生物质可以用作人类食品、动物饲料、人类营养制备物和制剂、药物组合物、化妆品、个人护理组合物、个人护理产品、纺织品、染料或油墨等中的成分。人类食品可以包括但不限于焙烤食品、意大利面、谷物、谷物棒、蜜饯、果酱、汤、冷冻甜食、冰淇淋、奶酪、植物基肉、酸奶、水果羹、奶油、涂抹食品、沙拉调味料、蛋黄酱、食品配菜和调料、冰糖、口香糖、果冻、烟油(vape liquid)等。营养制备物和制剂包括例如营养补充剂、激素片剂、消化胶囊、片剂、粉末剂、油剂等。化妆品制剂可以在例如口红、脂粉、乳膏、去角质粉、面膜(facial pack)等中使用藻类生物质或由此获得的特定提取物。个人护理组合物和个人护理产品包括牙膏、嗽口水、洗手液、沐浴露、身体皂、洗发水、油剂、防晒霜、晒后润肤膏、防晒剂等。药物组合物包括技术人员对于药剂，包括生物活性剂、疫苗及其它重组蛋白和酶的递送已知的任何类型的组合物。
任选地，提供了使用本发明的藻类生物质作为以下中的至少一种中的成分的方法：人类食品、人类营养制备物或制剂、动物饲料、药物组合物、化妆品、个人护理组合物、个人护理产品、纺织品和染料或油墨。使用方法包括作为以下中的任一种使用包含小球藻的改良菌株的藻类生物质成分：干燥的粉末、干燥的薄片、冷冻的膏剂、提取物(水或多糖提取物)、溶液、混悬液、溶液预浓缩物、乳液、乳液预浓缩物、调合物、片剂、丸剂、颗粒、胶囊、锭剂、浓缩物、颗粒剂等。此外，可以在人类食品、人类营养制备物或制剂、动物饲料、药物组合物、化妆品、个人护理组合物、个人护理产品、纺织品、染料或油墨的制备中使用小球藻的改良菌株的干燥、新鲜或冷冻部分、来源于小球藻的改良菌株的油、匀浆、完整细胞、裂解细胞等。此外，提供了使用本发明的藻类作为多种食品、个人护理、药物和营养应用中的成分的方法，其包括将食品或食品成分与一种或多种其它可食用或适合的成分，如牛奶、油、奶油、水、香料、草本植物、矿物质、蛋白、一种或多种化合物、防腐剂、芳香汁等合并以获得所期望的人类食品、人类营养制备物或制剂、动物饲料、药物组合物、化妆品、个人护理组合物、个人护理产品、纺织品、染料或油墨。
小球藻的改良菌株可以用于以技术人员已知的任何方式制备组合物。
此外，公开了包含微藻生物质的匀浆的微藻产品或粉末，所述微藻生物质来源于本发明的小球藻的改良菌株或者通过实施生产小球藻的改良菌株的方法获得。术语“微藻粉末”用于表示包含多个藻类生物质颗粒的可食用组合物。任选地，多个藻类生物质颗粒为以下中的任一种：完整细胞、裂解细胞或其混合物。更任选地，微藻粉末包含以下中的一种或多种：大量可消化蛋白、膳食纤维含量、相关水结合属性、健康油递送属性、香料、草本植物、助流剂、抗氧化剂等。可以理解微藻粉末缺少明显的油并且优选地处于粉末形式。微藻粉末包含来源于小球藻的改良菌株的微藻生物质的匀浆。此外，通过实施生产小球藻的改良菌株的方法来获得微藻粉末(如上文详细描述的)。可以在现代优良制造规范(cGMP)条件下生产微藻粉末。
此外，微藻粉末作为食品或食品成分在多种焙烤食品，如面包、卷、卷饼、玉米粉圆饼、意大利面等、蜜饯，如蛋糕、糕点、巧克力、果冻、口香糖等、乳制品或不含奶的代用品，如酸奶、奶油、酸奶油和其它食品，如汤、果酱、调料等中获得应用。有利地，本发明的微藻粉末不会将与小球藻的野生型菌株有关的绿色、令人不愉悦的气味或味道带给加工食品产品。有利地，本公开的小球藻的改良菌株是天然的而非基因修饰的(非GM)食品来源。另外，小球藻的改良菌株是长期可持续的，营养的(包含高蛋白和纤维含量)，不含谷蛋白且不含动物性食品(素食和/或严格素食)。
此外，小球藻的改良菌株随时间遗传稳定并且可以在异养生长条件下生长且具有适合于人和/或动物消费的所期望的表型，包括改善的颜色、气味和味道参数。因此，由于市场占有率/接纳度(market uptake/acceptance)的提高，这类小球藻的改良菌株可以作为完整食品或作为成分在人(和动物)食品、营养制备物、化妆品制剂、药物、个人护理等中具有潜在应用。
参考图2，显示了一组野生型和颜色突变体中的色素的薄层色谱分析。WT显示了4TC3/16亲代菌株，其中WT是小球藻的野生型菌株(亲代菌株)(4TC3/16)，而YC03、YC06、YC18、YC10和YC24显示了小球藻的多种改良菌株。YC03显示了黄色菌株，YC06显示了红色、YC18显示了绿色/橙色、YC10显示了棕色/橙色，YC24显示了绿黄色。值得注意地，WT菌株显示了类胡萝卜素、脱镁叶绿素a、叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和叶黄素类和/或叶黄素含量的存在。然而，小球藻的改良菌株显示叶绿素a(Chlα)和叶绿素b(Chlβ)含量的不存在或显著降低，并且还可以显示类胡萝卜素、叶黄素类和/或脱镁叶绿素水平的稳定不存在或显著降低。
参考图3，显示了在液体培养中培养的野生型(WT)、黄色(YC01)和绿黄色(YC02)小球藻菌株的比较。如所示的，对小球藻的改良菌株鉴别了从红色(最左侧；最深)至白色(最右侧；最浅)的颜色变体谱。将理解在每个烧瓶下方作为近似的RGB值标注了颜色，并且所述颜色仅作为实例显示并且不意欲将颜色组库仅限于这些确切颜色，即WT的R9G20B6，YC01的R13G193B0和YC02的R178G179B77。此外，对每菌株所示的颜色是遗传稳定的，其中本文所提供的颜色是达到静止期之后培养2周的产物。颜色是稳定的并且代表了每种变体菌株的培养条件以及遗传学。
参考图4，显示了在液体培养中培养的多种小球藻的改良菌株的比较，即YC06、YC03、YC10、YC18、YC24、YC14和YC20。如所示的，对不同的小球藻改良菌株YC06、YC03、YC10、YC18、YC24、YC14和YC20鉴别了颜色变体谱。将理解在每个烧瓶下方作为近似的RGB值标注了颜色，即YC06的R109G48B27、YC03的R240G129B50、YC10的R181G96B70、YC18的R199G144B60、YC24的R157G140B72、YC14的R177G151B147和YC20的R213G174B206。此外，对每菌株所示的颜色是遗传稳定的，其中本文所提供的颜色是达到静止期之后培养2周的产物。
参考图5，显示了与对于亲代菌株(4TC3/16)以及在相同条件下培养的比较性、良好鉴定的小球藻的培养物保藏菌株(CCAP 211/11b)的野生型细胞中所产生的叶绿素含量相比，叶绿素缺陷型颜色变体中的叶绿素含量。当使用乙酸盐作为主要碳源，在异养条件下生长时，将所计算的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的相对量表示为mg/g DCW。
参考图6，显示了与对于亲代菌株(4TC3/16)以及在相同条件下培养的比较性、良好鉴定的小球藻的培养物保藏菌株(CCAP 211/11b)的野生型细胞中所产生的叶绿素含量相比，叶绿素缺陷型颜色变体中的叶绿素含量。当使用乙酸盐作为主要碳源，在异养条件下生长时，将所计算的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的相对量表示为％DCW。
参考图7，显示了与对于亲代菌株(4TC3/16)以及在相同条件下培养的比较性、良好鉴定的小球藻的培养物保藏菌株(CCAP 211/11b)的野生型细胞中所产生的叶绿素含量相比，叶绿素缺陷型颜色变体中的叶绿素含量。当使用葡萄糖作为主要碳源，在异养条件下生长时，将所计算的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的相对量表示为mg/g DCW。
参考图8，显示了与对于亲代菌株(4TC3/16)以及在相同条件下培养的比较性、良好鉴定的小球藻的培养物保藏菌株(CCAP 211/11b)的野生型细胞中所产生的叶绿素含量相比，叶绿素缺陷型颜色变体中的叶绿素含量。当使用葡萄糖作为主要碳源，在异养条件下生长时，将所计算的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的相对量表示为％DCW。
参考图9，显示了表示为相同条件下培养的野生型细胞中所产生的叶绿素的百分比的叶绿素缺陷型颜色变体中的叶绿素含量。相对于在使用乙酸盐作为主要碳源的异养条件下生长的亲代(野生型)菌株4TC3/16所产生的量表示所计算的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的相对量。
参考图10，显示了表示为相同条件下培养的野生型细胞中所产生的叶绿素的百分比的叶绿素缺陷型颜色变体中的叶绿素含量。相对于在使用葡萄糖作为主要碳源的异养条件下生长的亲代(野生型)菌株4TC3/16所产生的量表示所计算的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的相对量。
参考图11、12、13和14，显示了小球藻颜色变体和在相同条件下生长的野生型细胞的叶绿素含量表，并将其表示为3次测量的平均值并以微克单位表示。SEM，平均标准误差。
参考图15，显示了基于色素组成，使用流式细胞术鉴别细胞亚群(白色YC20菌株和黄色YC03菌株)的实例。如所示的，Y轴显示了在用特定波长(2)激发后来自特定波长发射窗(2)的荧光强度，而X轴显示了在用特定波长(1)激发后来自特定波长发射窗(1)的荧光强度。以黑色轮廓线显示来自白色YC20菌株的代表性群体，而以灰色轮廓线显示来自黄色YC30菌株的代表性细胞群体。
由于提供了叶绿素含量小于在相同条件下生长的小球藻的野生型菌株的叶绿素含量的遗传稳定的小球藻的改良菌株，因此本发明是有利的。此外，所述方法确保现有亲代菌株(或者小球藻的野生型菌株)中绿色的减少，同时鉴别了其中所述遗传变化不会对商业规模培养条件下的生长产生不利影响的那些小球藻的改良菌株。此外，过滤掉可以显示出所期望的颜色变化，但是同时可能获得有害突变的小球藻的改良菌株的任何集落，因此提供了具有所期望的表型的稳健、商业上可缩放的小球藻的改良菌株。此外，诱变条件包括非致死(最小剂量)的量的诱变化学剂的使用，因此使得能够在小球藻的改良菌株中获得所期望的表型，同时对降低其细胞健康性的不期望的突变的过量积累保持平衡。另外，有利地，所述方法提供了其中改善了菌株在所期望的发酵条件下的活力和可缩放性的所述菌株的获得。
另外，有利地，已将绿色微藻，小球藻，鉴别为超级食品，并且由于它在1997年5月15日前作为食品或食品成分在欧洲上市且已有显著程度的消费，因此它不受新型食品法规(EC)号258/97的影响。因此，认为该生物作为整体食品或作为成分对于人和动物两者的食用是安全的。此外，小球藻作为完整细胞和作为提取物包括在CIRS中国化妆品成分列表内并且包括在欧洲化妆品成分列表中。这与其它相关微藻，具体地耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)和目前的原壳小球藻(Auxenochlorella protothecoides)(先前的原壳小球藻(Chlorella protothecoides))相反，两物种均未出现在新型食品目录，并且它们也没有出现在中国或欧洲批准的化妆品成分列表中。
在不背离所附权利要求所限定的本发明的范围的情况下，上述本发明的实施方式的改变是可能的。表达，如“包括”、“包含”、“引入”、“由...组成”、“具有”、“是”用于描述和要求保护本发明旨在以非排它方式解释，即还允许未明确描述的项目、组件或元件存在。对单数的提及还应解释为与复数相关。包括在所附权利要求中的括号内的数字旨在辅助理解权利要求并且不应以任何方式视为对这些权利要求所要求保护的主题的限制。

Claims (38)

1.一种小球藻(Chlorella vulgaris)的改良菌株，所述改良菌株具有在0.001至0.5mg/g细胞干重范围内的叶绿素含量。
2.根据权利要求1所述的小球藻的改良菌株，其中，所述小球藻的改良菌株是异养生物。
3.根据权利要求1或2所述的小球藻的改良菌株，其中，所述小球藻的改良菌株具有在0.25至0.50mg/g细胞干重、0.10至0.25mg/g细胞干重或0.001至0.1mg/g细胞干重范围内的叶绿素含量。
4.根据前述权利要求中任一项所述的小球藻的改良菌株，其中，所述小球藻的改良菌株具有以下中的至少一种：白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色。
5.根据前述权利要求中任一项所述的小球藻的改良菌株，其中，通过实施诱变，从小球藻的野生型菌株获得所述小球藻的改良菌株。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的小球藻的改良菌株，其中，通过实施诱变，从小球藻的野生型菌株的变种获得所述小球藻的改良菌株。
7.根据任一前述权利要求所述的小球藻的改良菌株，其中，诱变通过将所述小球藻的野生型菌株或所述小球藻的野生型菌株的变种暴露于非致死量的诱变化学剂来实施，优选地其中，所述诱变化学剂是甲磺酸乙酯。
8.根据权利要求7所述的小球藻的改良菌株，其中，所述诱变化学剂的所述非致死量在0.1至1.0M的范围内。
9.根据权利要求1至5所述的小球藻的改良菌株，其中，当在相同条件下生长时，所述小球藻的改良菌株的叶绿素含量小于所述小球藻的野生型菌株的叶绿素含量，所述改良菌株来源于所述野生型菌株；并且任选地其中，与在相同条件下生长的所述小球藻的野生型菌株的叶绿素含量相比，所述小球藻的改良菌株的叶绿素含量在低至少90％至99.9％的范围内。
10.根据前述权利要求中任一项所述的小球藻的改良菌株，其中，降低的叶绿素含量与以下中的至少一种有关：叶绿素a(α-叶绿素)和/或叶绿素b(β-叶绿素)，并且总体而言，所述叶绿素含量在0.001至0.5mg/g细胞干重范围内。
11.根据前述权利要求中任一项所述的小球藻的改良菌株，其中，所述小球藻的改良菌株具有在3至10mg/g细胞干重范围内的叶黄素含量。
12.根据权利要求11所述的小球藻的改良菌株，其中，所述小球藻的改良菌株的叶黄素含量低于9mg/g细胞干重，更任选地低于8mg/g细胞干重，还更任选地低于7mg/g细胞干重，还更任选地仍低于6mg/g细胞干重，还更任选地仍低于5mg/g细胞干重，还更任选地仍低于4mg/g细胞干重，还更任选地仍低于3mg/g细胞干重，还更任选地仍低于2mg/g细胞干重，还更任选地仍低于1mg/g细胞干重，并且还更任选地至多达0.1mg/g细胞干重。
13.根据权利要求1所述的小球藻的改良菌株，其中，所述小球藻的改良菌株的最低蛋白质含量为至少25％、30％、35％、40％、45％或50％w/w。
14.根据前述权利要求中任一项所述的小球藻的改良菌株，其中，所述小球藻的改良菌株在异养条件下生长。
15.根据前述权利要求中任一项所述的小球藻的改良菌株，其特征在于，在以下条件下培养所述小球藻的改良菌株：
-在特定温度下，
-持续预定时间段，
-不存在光，和
-存在有机碳能源。
16.根据权利要求15所述的小球藻的改良菌株，其特征在于，所述特定温度在20至35℃的范围内，优选地高于28℃。
17.根据权利要求15所述的小球藻的改良菌株，其特征在于，所述预定时间段在1至3周的范围内。
18.根据权利要求15所述的小球藻的改良菌株，其特征在于，所述有机碳能源为葡萄糖或乙酸盐。
19.根据前述权利要求中任一项所述的小球藻的改良菌株，其特征在于，所述小球藻的改良菌株是遗传稳定的。
20.一种生产小球藻的改良菌株的方法，所述改良菌株具有在0.001至0.5mg/g细胞干重范围内的叶绿素含量，其中，所述方法包括：
a)获得小球藻的亲代菌株；
b)对所述小球藻的亲代菌株实施诱变；
c)在特定温度下，在不存在光下并且在存在有机碳能源的情况下，将所述小球藻的突变菌株培养预定时间段；以及
d)将具有不同于所述小球藻的亲代菌株的表型的所述小球藻的突变菌株集落鉴别为所述小球藻的改良菌株。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述小球藻的亲代菌株是小球藻的野生型菌株或小球藻的野生型菌株的变种，并且其中，通过将所述小球藻的亲代菌株暴露于非致死量的诱变化学剂来实施所述诱变，优选地其中，所述诱变化学剂是甲磺酸乙酯。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述诱变化学剂的所述非致死量在0.1至1.0M的范围内。
23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，通过将所述小球藻的亲代菌株暴露于物理诱变剂来实施诱变，其中，所述物理诱变剂包括以下中的至少一种：UV光、γ射线、X-射线。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其特征在于，所述小球藻的改良菌株的鉴别包括通过流式细胞术分选细胞。
25.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法还包括选择所述小球藻的改良菌株的健康集落。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法还包括重复实施权利要求20的步骤(b)至(d)。
27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，其特征在于，所述特定温度在20至35℃的范围内，优选地高于28℃。
28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其特征在于，所述预定时间段在1至3周的范围内。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其特征在于，所述有机碳能源为葡萄糖或乙酸盐。
30.根据权利要求20至29中任一种所述的方法，其特征在于，所述表型为以下中的至少一种：颜色、气味、味道、纹理。
31.根据权利要求20至30中任一项所述的方法，其特征在于，所述小球藻的改良菌株的颜色为以下中的一种：白色、乳白色、浅黄色、黄色、浅绿色、金色、焦糖色、橙色、红色或绿黄色。
32.一种包含藻类生物质的组合物，所述藻类生物质来源于权利要求1至19中任一项所述的小球藻的改良菌株。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中，来源于所述小球藻的改良菌株的所述藻类生物质具有在0.25至0.50mg/g细胞干重、优选0.10至0.25mg/g细胞干重、并且最优选0.001至0.1mg/g细胞干重范围内的叶绿素含量。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中，所述组合物是食品或食品成分。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中，所述组合物是化妆品或化妆品成分。
36.根据权利要求33所述的组合物，其特征在于，在以下中的至少一种中使用所述组合物：人类食品；人类营养制备物或制剂；动物饲料；药物组合物，包括疫苗；化妆品；个人护理组合物；个人护理产品或纺织品；染料或油墨。
37.一种使用权利要求33所述的组合物作为以下中的至少一种中的成分的方法：人类食品；人类营养制备物或制剂；动物饲料；药物组合物，包括疫苗；化妆品；个人护理组合物；个人护理产品或纺织品；染料或油墨。
38.一种微藻粉末，包含微藻生物质的匀浆，所述微藻生物质来源于根据权利要求1至19中任一项所述的小球藻的改良菌株或通过实施根据权利要求20至31中任一项所述的方法获得的所述小球藻的改良菌株。
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