CN110225968B - 杜氏藻突变体和使用其生产色素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有改进的色素产量的新型藻类突变体。根据本发明的突变体可以通过使用少量能量用于生产基于类胡萝卜素的色素，特别是叶黄素，因此可以在工业水平上有效地生产色素。此外，本发明可以用作含有色素的食品、保健功能食品和药物的来源。此外，考虑到广盐性微藻杜氏藻的生理特征和韩国的地质特征，韩国三面与海接触，海水可以用作培养基，期望降低生产成本并带动相关工业的发展。

Description

杜氏藻突变体和使用其生产色素的方法
技术领域
本发明涉及具有色素生产能力的藻类、包含其的色素组合物以及生产该色素的方法。
背景技术
黄斑变性是一种疾病，其可以导致由黄斑变性引起的视觉障碍，黄斑是位于眼睛视网膜内部中心的神经组织。黄斑是大多数感光细胞聚集的地方，并且由于物体的图像也是黄斑的中心，因此黄斑在视敏度中扮演着非常重要的角色。黄斑变性的最常见原因可能是衰老(与年龄相关的黄斑变性)，并且已知与家族史、种族和吸烟有关。由于黄斑负责中枢视觉，当黄斑发生变性时，会出现视物变形、视力丧失、中央暗点形式的视觉扭曲。黄斑变性主要分为非渗出性(干性)黄斑变性和渗出性(湿性)黄斑变性。虽然除了晚期视网膜和脉络膜萎缩外，非渗出性黄斑变性对视敏度几乎没有影响，并且在黄斑中有称为玻璃疣的黄色沉积物；但是由于渗出性黄斑变性病变的位置在早期阶段处于黄斑下或与黄斑直接接触，因此其中出现视网膜下出血、视网膜下积液和色素上皮脱离的渗出性黄斑变性降低了视敏度。渗出性黄斑变性占黄斑变性总病例的约10至20％，如果渗出性黄斑变性未得到治疗，在大多数情况下，视敏度在诊断后两年内迅速下降并导致失明。为了预防黄斑变性，通过定期的眼底检查早期发现黄斑异常并减少诸如肥胖、吸烟、高血压等可控因素是非常重要的。吸烟损害脉络膜循环，使血液抗氧化物质减少并且发生脉络膜血管收缩，导致缺氧损伤，因此，有黄斑变性风险的患者必须戒烟。此外，由于黄斑色素(黄体素或玉米黄质)有助于减少年龄引起的损伤以保持黄斑健康，因此可以通过食用足够的蔬菜和水果或服用市售维生素来帮助预防黄斑变性。
黄斑色素可减少衰老引起的视网膜中心区域视敏度降低，并防止亮光对视网膜组织造成损害，该色素的代表性实例是类胡萝卜素色素，称为叶黄素，其包含在类胡萝卜素组中并通过类胡萝卜素的氧合作用产生。叶黄素包括黄体素和玉米黄质。黄体素是一种抗氧化剂，可以保护被体内天然存在的氧自由基损伤的眼睛内部，并且已知它可以通过抑制供应肿瘤的血管的生长来杀死癌细胞，并且在预防乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌以及皮肤癌方面具有一些作用。动物不能产生叶黄素，因此只能通过摄取食物来获得。这些叶黄素存在于植物的叶子、花和果实中，还含有叶绿素和类胡萝卜素。最近，包括叶黄素在内的用于眼睛健康的保健功能食品正在引起关注。
传统上使用万寿菊花瓣作为玉米黄质和黄体素的原料，并且还研究了从其他高等植物中提取这些色素。此外，玉米黄质和黄体素也通过遗传修饰色素合成机制在细菌中生产。还进行了研究以从微藻中获得这些色素。在这些传统使用的原料中，万寿菊花瓣的缺点在于培育用于生产的植物需要很长时间，并且生产成本高，因为与生产用地面积相比产量不高。
为了解决这些问题，已经尝试开发生产玉米黄质和黄体素的藻类，其中插入了使用替代高等植物系统的细菌系统的色素合成机制，但是从细菌获得的色素最终被确定为不适合用作食品添加剂。此外，由于在韩国，使用基因插入技术的转基因生物(GMO)不是优选的，因此这种细菌生长的色素在消费者的意识很重要的食品添加剂市场中具有致命的缺点，并且细菌培养基、生物反应器的维护等以及高等植物系统需要高成本。
在从微藻中获得这些色素的方法的情况下，传统的微藻是野生型，未经修饰。它们含有一定量的黄体素，但根据光照量的玉米黄质的含量非常低，因此它们在最佳生产中的使用具有局限性。
因此，持续需要生产或替代食品原料的方法的开发。
发明内容
技术问题
本发明旨在提供一种可以替代传统上用作食品原料的叶黄素的原料，或者一种可以替代传统的原料制造方法的方法，并且具体地，一种具有优异的叶黄素生产能力具体地优异的生产黄体素和玉米黄质的能力的微生物、一种包含其的组合物、以及使用其生产叶黄素的方法。
技术解决方案
为了达到上述目的，本发明人尝试使用诱变开发了可以提高野生型或现有微藻的生产力的藻类，而不是使用可能引起食品工业问题的遗传重组，并开发出具有比传统的杜氏藻属(Dunaliella sp.)藻类更高的黄斑色素产量的突变体和使用其生产最佳色素的方法。因此，本发明已经完成。
在一个方面，本发明提供了杜氏藻属黄斑色素3(MP3)(KCTC 12990BP)藻类。
杜氏藻属MP3藻类可以具有生产叶黄素的能力。
杜氏藻属MP3藻类可以具有生产一种或多种色素的能力，所述一种或多种色素选自由黄体素和玉米黄质；叶绿素b、叶绿素a和β-胡萝卜素组成的组。
在另一方面，本发明提供了一种杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类的培养物。
在另一方面，本发明提供了一种色素组合物，其包括选自由杜氏藻属MP3(KCTC12990BP)藻类、所述藻类的培养物、所述培养物的干燥产物和所述培养物的提取物组成的组中的一种或多种。
在另一方面，本发明提供了一种用于口服给药的组合物，其包括选自由杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类、所述藻类的培养物、所述培养物的干燥产物和所述培养物的提取物组成的组中的一种或多种。
在另一方面，本发明提供了一种用于饲料或饲料添加剂的组合物，其包括选自由杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类、所述藻类的培养物、所述培养物的干燥产物和所述培养物的提取物组成的组中的一种或多种。
在另一方面，本发明提供了一种用于食品或食品添加剂的组合物，其包括选自由杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类、所述藻类的培养物、所述培养物的干燥产物和所述培养物的提取物组成的组中的一种或多种。
在另一方面，本发明提供了一种生产色素的方法，其包括培养杜氏藻属MP3(KCTC12990BP)藻类。
在另一方面，本发明提供了一种生产食品或饲料的原料的方法，其包括培养杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类。
有益效果
使用本发明的突变体能够以低能量生产大量的玉米黄质和黄体素，因此玉米黄质和黄体素可以在工业水平上有效地生产和提供。本发明的组合物可以用作食品、保健功能食品和含有玉米黄质和黄体素色素的药物的原料。此外，考虑到广盐性微藻杜氏藻(Dunaliella)的生理特征和韩国的地质特征，韩国三面与海接触，海水可以用做培养基，因此有望降低生产成本和发展相关工业。
附图说明
图1A是本发明的突变体、野生型(WT)杜氏藻属藻类、本发明突变体的基础藻类(Zea1)和MP3突变体的一组显微镜图片(放大倍数：1000倍)。这些图片中的标尺表示10μm。
图1B是显示当野生型藻类、Zea1和MP3突变体生长至相同细胞密度(500×104个细胞/mL)时的培养状态的一组图片。上图显示了含琼脂的固体培养基中的培养状态，下图显示了液体培养基中的培养状态。
图2是含有液体培养基的烧瓶的一组图片，用于比较光强度为100μmol光子/m2s下的生长。
图3是显示野生型杜氏藻属藻类、Zea1和本发明的MP3突变体的细胞密度增加的模式的图。横轴表示培养时间(天)，纵轴表示细胞密度(×104个细胞/mL)，数字表示处理每组时的光强度(单位：μmol光子/m2s)。
图4A是显示每100×104个细胞的野生型藻类、Zea1和MP3突变体的干细胞的重量(g)的一组图，并且图4B是以每升(L)野生型藻类、Zea1和MP3突变体的干细胞重量(g)来测量生物量的一组图。
图5是显示野生型杜氏藻属藻类、Zea1和MP3突变体的色素谱的一组HPLC分析图(1：新黄素，2：紫黄质，3：抗黄素，4：黄体素，5：玉米黄质，6：叶绿素b，7：叶绿素a，和8：β-胡萝卜素)。
图6A是通过测量在100μmol光子/m2s的光强度下培养后第二天收获的细胞中的色素含量来比较野生型杜氏藻属藻类、Zea1和MP3突变体中含有的玉米黄质的量的一组HPLC图。(A)显示每1×106个细胞中的玉米黄质含量(μg)，和(B)显示每1g干细胞重量中的玉米黄质含量(mg)。
图6B显示在100μmol光子/m2s的光强度下培养2天并收获后通过HPLC测量色素含量来比较野生型杜氏藻属藻类、Zea1和MP3突变体中包含的玉米黄质和黄体素水平的图。(A)显示每1×106个细胞中的玉米黄质和黄体素含量(μg)，和(B)显示每1g干细胞重量中的玉米黄质和黄体素含量(mg)。
图7A是显示野生型杜氏藻属藻类、Zea1和MP3突变体的总重量中色素含量(wt％)的图。图7B是显示培养14天的Zea1或MP3突变体每1g干细胞重量中玉米黄质含量(mg/gDCW)的图。
图8A是使用引物信息和ITS1-F和ITS2-R引物鉴定杜氏藻属菌株的PCR结果。图8B是杜氏藻属菌株的系统发生分析。
本发明的模式
然而，本发明可以以多种形式被修改和实现，因此，将仅详细描述特定实施方案。此外，本发明不限于特定的公开内容，并且应该理解，本发明包括本发明的技术构思和范围中包括的所有修改、等同物和替代物。
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明涉及杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类。
杜氏藻属藻类是单细胞绿藻，具有两个相等长度的鞭毛，它们的细胞是纺锤形的，根据的不同它们的尺寸为7至25μm长，并且具有叶绿体。杜氏藻属藻类可以在高盐浓度的环境中生长。
通过一般诱变构建突变体，并通过使用传代培养和传统方法分离鉴定。可以使用一般诱变剂进行诱变，并且在本发明的一个示例性实施方案中，突变是通过化学品的处理来诱导的。
本发明的杜氏藻MP3突变体具有生产色素的能力，具体地，生产叶黄素的能力。更具体的，该杜氏藻MP3突变体具有生产黄体素和玉米黄质的能力，并且可以进一步生产选自由叶绿素b、叶绿素a和β-胡萝卜素组成的组中的一种或多种。
该突变体每个细胞具有比传统野生型杜氏藻属藻类显著更高的生产玉米黄质的能力，并且每个细胞的玉米黄质积累比基础藻类杜氏藻属Zea1高20至30％(BIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,VOL.81,NO.1)，并且因此它可以有效地用作生产叶黄素的藻类。
在一个示例性实施方案中，由于证实了与相同的野生型和Zea1藻类相比，本发明的MP3突变体具有最高的每单位细胞密度和每干重的玉米黄质积累(图6B)，已经发现本发明的突变体具有非常高的真菌学特征，诸如生产叶黄素具体地玉米黄质的能力高，并因此证实该突变体可以被有效地用作叶黄素色素的生产来源。
本发明的突变体可以在昏暗的光线下存活，具体地，可以在10至2,000μmol光子/m2s的光强度下培养。在低于昏暗光照条件的完全黑暗下，突变体不能进行光合作用，并且在非常高的光照条件下细胞会受到光压力的破坏。当在上述条件下培养突变体时，突变体中的叶黄素含量可以增加，并且可以表现出优异的生长速率。
该MP3突变体可以在杜氏藻属藻类的传统生长环境(光强度、温度、盐度等)下适当生长。另外，由于该MP3突变体在低光强度下具有优异的玉米黄质积累(图6)，因此其可以因叶黄素生产能力高而在工业上有效地用作生产叶黄素色素的微生物；在高光强度下的组中，其与其他藻类相比具有相对较低的密度，因此具有优异的通过单细胞光合作用的色素生产效率。具体地，该MP3突变体的每个细胞的玉米黄质含量比被认为是传统的玉米黄质改善菌株的Zea1藻类高约40％或更多。
该MP3突变体可以在海水环境中具体地在含有海水的培养基中培养。本发明的突变体可以在基于氯化钠浓度的0.05M至5.5M的范围的盐度条件下培养。培养基可以进一步包括Tris以及氯化钠。培养基含有待培养的微生物所必需的，即培养特定微生物所必需的营养物，并且还含有用于特定目的的材料。该培养基(medium)被称为生长培养基或培养基(culture medium)，是一个包含天然培养基、合成培养基和选择培养基的概念。该杜氏藻突变体可以根据常规培养方法培养。在一个示例性实施方案中，证实了本发明的MP3突变体在表1的培养基组合物环境中具有优异的玉米黄质生产能力。
培养基的pH值没有特别限制，只要杜氏藻属藻类可以存活和生长，并且杜氏藻属藻类可以在pH 6或更高，具体地，在pH 7至pH 9下存活，并且可以在从pH8.0或更高到低于pH 9.0范围内具有最佳生长速率。
该MP3突变体是通过使用杜氏藻属Zea1(BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,VOL.81,NO.1)作为基础藻类的化学突变而开发的，并且通过ITS测序鉴定为杜氏藻属藻类。
具体地，使用ITS1(ITS1-F:TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS1-R:GCTGCGTTCTTCATCGATGC)和ITS2(ITS1-F:GCATCGATGAAGAACGCAGC，ITS2-R:TCCTCCGCTTATTGATATGC)作为扩增碱基序列的引物，汇总杜氏藻菌株(野生型、Zea1和基础藻类)和突变体MP3的ITS1和ITS2测序结果并使用clustalW程序进行比对，然后在MEGA6程序中使用非加权组平均法(UPGMA)算法构建一个系统发生图(图8B)。
从拓扑学的观点来看，当观察系统发生图时，证实本发明的突变体接近基础藻类Zea1，并且两者都接近野生型杜氏藻。此外，可以证实本发明的突变体在系统发生上与特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)A2有关。
基于分析结果，将所选择的本发明突变体命名为杜氏藻属MP3，并于2016年3月16日存入韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，并于2016年3月23日收到保藏号KCTC 12990BP。
高含量的色素，特别是基于叶黄素的色素可以积聚在本发明的MP3突变体的细胞中，并且在这些色素中，可以含有较高量的玉米黄质，因此可以培养MP3突变体藻类以有效地用作食物、饲料、药物等的原料。
就此而言，本发明涉及杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类的培养物。
本文使用的“培养物”是指培养特定微生物的培养基，换言之，培养后获得的培养基。该培养物包括杜氏藻属MP3。另外，培养物包括通过培养和加工诸如浓缩和干燥培养基而获得的培养物的浓缩和干燥产物的全部。培养物可以包括培养物的副产物，并且培养物的类型可以是但不限于液体或固体。
培养基含有待培养的微生物所必需的，即培养特定微生物所必需的营养物，并且还含有用于特定目的的材料。该培养基被称为生长培养基或培养基，是一个包含天然培养基、合成培养基和选择培养基的概念。培养基的pH可以在杜氏藻属MP3藻类可以生长的范围内，例如，pH 6或更高，优选pH 7至pH 9。
另外，本发明涉及一种组合物，其包括选自由本发明的杜氏藻属MP3(KCTC12990BP)藻类、所述藻类培养物、其干燥产物和其提取物组成的组中的一种或多种。
该组合物可用于改善人类或动物健康。
本发明的突变体生产包括玉米黄质和叶黄素的基于叶黄素的色素，然后将它们积聚在体内，就此而言，该组合物可以是一种色素组合物或一种叶黄素色素组合物。
该色素组合物可包含相对于该组合物中所包含的色素的总含量的10wt％至15wt％的玉米黄质。根据本发明的一个示例性实施方案，从杜氏藻野生型藻类、Zea1藻类和MP3突变体中的每一种的每个细胞的总色素中的玉米黄质含量的测量结果，可以证实在总色素中该MP3突变体的玉米黄质含量显著高于野生型和Zea1(图7A)。
该色素组合物可以用作食品或饲料的原料，或用作口服给药的制剂。
因此，包含其提取物的组合物、或色素组合物或叶黄素色素组合物可以是用于口服给药的组合物。
用于口服给药的组合物可以包含在通过本领域已知的方法配制的口服制剂中，其形式为粉末、颗粒、片剂、丸剂、糖衣片剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液或悬浮液。例如，口服制剂可以通过将活性成分与固体赋形剂混合，研磨混合物，加入合适的补充剂并将所得混合物加工成颗粒状混合物而作为片剂或糖衣片剂获得。合适的赋形剂的实例可包括糖类，诸如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇和麦芽糖醇，淀粉，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉，纤维素，诸如纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素，和填料诸如明胶、聚乙烯吡咯烷酮。在某些情况下，可以进一步加入交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠作为崩解剂。
当使用该组合物时，由杜氏藻属MP3藻类生产并积聚在细胞中的叶黄素色素，具体地，玉米黄质和黄体素可以维持或增强身体的健康。具体地，玉米黄质和黄体素是黄斑色素并且可以预防或改善黄斑变性，因此可有效预防或改善黄斑变性相关的眼病。更具体地，由于玉米黄质和叶黄素可有效地增强或维持眼睛健康；预防或改善黄斑变性；预防或改善眼睛功能；改善或预防视网膜受损；抑制衰老；保持视网膜健康；降低黄斑变性发生的风险；或者预防或改善视敏度下降，因此该组合物可用于预防或改善症状，或用于上述效果。
本文使用的“用于添加剂”的组合物包括添加到食品或饲料中的任何组分以及主要成分，具体地，可以是在食品或饲料中具有功能的活性成分，或添加用于加工食品着色、保存等的食品添加剂，这是由食品药品安全部(MFDS)定义的。
该食品可以是一种保健功能食品，更具体地，是一种用于眼睛健康的保健功能食品。
该食品、食品添加剂、饲料或饲料添加剂组合物可进一步包括其它活性成分而不损害本发明的杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类、所述藻类的培养物、其干燥产物和其提取物的活性。另外，可以进一步包含包括载体的其他组分。
在本发明中，该饲料组合物可以制备成发酵饲料、复合饲料或颗粒饲料或青贮饲料(silage)。发酵饲料可以通过包括本发明的杜氏藻属MP3藻类、该藻类的干细胞、其培养物和其提取物，并且还包括各种微生物或酶来制备。复合饲料可以通过将各种类型的一般饲料与本发明的杜氏藻属MP3藻类、所述藻类的干细胞、其培养物和其提取物混合来制备。颗粒型饲料可以通过使用造粒机配制发酵饲料或复合饲料来制备。青贮饲料可以通过将绿色饲料与杜氏藻属MP3藻类、所述藻类的干细胞、所述藻类的培养物和/或其提取物混合来制备，并且本发明的组合物的用途不限于此。
该组合物可以通过与传统上用于药物领域的载体和调味剂混合来制备，并以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、糖浆、粉末、悬浮液或颗粒的形式给药。作为载体，可以使用粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂或悬浮剂。作为给药方法，可以使用口服给药、肠胃外给药或包衣方法，但优选口服给药。另外，可以根据活性成分在体内的吸收程度、失活率和排泄率，受试者的年龄、性别或状况适当选择剂量。根据制备含有该组合物的药物的条件，可以容易地调节该组合物的pH值。
所述组合物可包括选自由杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类、所述藻类的培养物、其干燥产物及其提取物组成的组中的任意一种，其相对于化合物总重量为0.001至99.99wt％，优选0.1至99wt％，并且根据使用该组合物的方法和该组合物的预期用途，可以适当地调节活性成分的含量。
该杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类可以原样或以干燥形式包含在组合物中，并且藻类培养物可以以浓缩或干燥的形式包含在组合物中。另外，干燥产物是指藻类或其培养物的干燥形式，或通过冷冻干燥制备的粉末形式。
另外，提取物是指通过提取MP3藻类、其培养物或其干燥产物而获得的提取物，并且包括使用溶剂获得的提取物，以及通过破坏本发明的MP3藻类获得的提取物。具体地，可以通过物理或化学方法提取和分离积累在本发明的杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类细胞中的色素来获得提取物。
提取过程可以通过传统方法进行，例如，可以通过向细胞中添加提取溶剂，使细胞均质化并破坏细胞来提取目标色素。提取后，可以通过离心除去藻类裂解物，并且可以通过诸如真空蒸馏的方法除去提取溶剂。此外，提取过程还可包括传统的纯化过程。由于色素不溶于水，因此可以更容易地从本发明的藻类中提取。
由于本发明的杜氏藻MP3突变体在低光强度下具有优异的叶黄素特别是玉米黄质生产能力，因此包括突变体及其副产物的组合物可有效改善身体活动、维持身体功能和防止身体功能退化。具体地，已知叶黄素色素具有黄斑变性抑制作用、抗氧化作用和抗癌作用，因此，本发明的组合物可以用作药物中包含的原料以维持身体健康，具体地，保持叶黄素色素参与的身体功能，或防止或增强身体功能的退化。
另外，本发明提供了使用杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类生产色素的方法。
另外，本发明提供了一种生产食品或饲料的原料的方法，其包括培养杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类的操作。
当使用本发明的杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类时，可以增加培养的杜氏藻藻类中的叶黄素积累，因此可以有效地进行工业上使用的原料的供应。
生产方法可以包括培养杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类的操作。
另外，在培养操作之后，制备方法还可以包括从培养物中分离本发明的杜氏藻属MP3藻类的操作。可以进一步对分离的藻类进行包括干燥的加工操作。
另外，制备方法还可包括从杜氏藻属MP3(KCTC 12990BP)藻类、所述藻类的培养物或所述培养物的浓缩或干燥产物中提取色素的操作。
培养可以在基于氯化钠浓度的0.05M至5.5M的盐度条件下在培养基中进行。另外，培养可以在昏暗的光照条件下进行，具体地，光强度条件在10至2,000μmol光子/m2s的范围内。由于本发明的杜氏藻MP3突变体即使在低光强度下也具有优异的色素生成能力，因此在不提供高强度光能的情况下，体内的叶黄素含量可能增加，并且叶黄素可以高度积累，因此该方法可以在工业水平上有效地使用。
上述提取可以通过从微生物中提取色素的传统方法进行，例如酶法、超声提取或机械提取，但是本发明不限于此。
除了培养操作之外，生产方法还可以包括用于增加培养后藻类含量的浓缩操作，和用于进一步降低已经进行浓缩操作的藻类的水分的干燥操作。然而，浓缩或干燥操作并非必需，并且通常使用本领域传统使用的浓缩和干燥方法和机器进行。
生产方法还可以包括提取操作后的纯化操作，其可以通过本领域中使用的传统纯化方法进行。
通过浓缩或干燥操作制备的叶黄素可以用作食品、保健功能食品、化妆品或药物的原料。
生产叶黄素的方法可以通过采用不同的方法进行而不损害本发明的效果。
藻类和组合物的含量也可以应用于本发明的生产方法。
在下文中，将详细描述本发明的制备实施例和实验实施例。仅提供以下实施例和实验实施例以说明本发明，但本发明的范围不限于此。
【实施例1】诱变、突变体的选择和形态特征的分析
在本实验中将来自杜氏藻属的含有高量玉米黄质藻类的Zea1(杜氏藻属Zea1)用作基础藻类，在具有下表1所示组成的液体培养基中培养。在包括约100μmol光子/m2s的光强度、25至26℃的温度和90rpm的速度的条件下进行振荡培养。
【表1】
培养基础藻类Zea1直至其达到指数期，然后收获细胞并重新悬浮至细胞密度为8×106至10×106个细胞/mL，然后用诱导化学突变的材料甲基磺酸乙酯(EMS)处理，使其达到最终浓度0.2μM。孵育2小时后，用液体培养基洗涤处理过的EMS，然后通过离心收获细胞。将细胞用液体培养基重悬浮，在黑暗中孵育一天，然后转移到固体培养基(其中进一步将琼脂加至与表1的液体培养基相同的组成)中并在其上铺板。一周后，分离在固体培养基上形成的菌落，将单个菌落转移到表1的液体培养基中并在液体中培养。通过分析每个菌落的特征来选择突变体。
具体地，通过目视观察，首先筛选出看起来比野生型和基础藻类(Zea1)更亮的淡绿色菌落，然后通过HPLC分析第一次选择的藻类菌落筛选具有相对较高的玉米黄质含量的藻类。
为了比较突变体的形态特征，图1A中显示了野生型杜氏藻属藻类、本发明的基础藻类Zea1和本发明中获得的MP3突变体(黄斑色素突变体3，下文称为突变体或MP3突变体)的显微镜图像。
如图1A所示，证实在相同的光强度条件下，杜氏藻属野生型、Zea1和突变体藻类以相似的形态生长，并且证实了本发明的突变体具有与野生型藻类相同的形态，并且仅在细胞颜色的亮度上有差异。
如图1B所示，证实突变体的颜色是比野生型杜氏藻属藻类和Zea1的颜色更亮的绿色和黄色，在下方图片中的液体培养物中，突变体的颜色也显示出更亮的绿色和黄色。
另外，如图2所示，在含有为了比较100μmol光子/m2s下的生长而培养的液体培养基的烧瓶的图像中，与野生型相比，本发明的基础藻类Zea1在生长速率上没有显著差异，但与野生型和Zea1藻类相比，该MP3突变体确实根据密度具有颜色差异。这可以理解为，上述结果是由野生型和Zea1藻类的生长速度差异引起的，实际上，如下面图3所示，由于本发明的突变体具有1至1.5天的生长速率差异，与Zea1相比，证实了即使在图像中也显示出根据密度的颜色差异。
【实施例2】分离突变体的生长特征的确认
2-1.生长速率的确认
为了比较野生型杜氏藻藻类、Zea1和MP3突变体的细胞生长速率和最终生长水平，将每种类型的藻类以1×106个细胞/mL的细胞密度接种在表1所示组成的培养基中，并在50、100和300μmol光子/m2s的不同光强度下培养。在对照实验中，温度为25至26℃，并且以90rpm进行振荡培养。培养开始后，取0.5mL培养物，使用血细胞计数器在显微镜下在第1、2、3、4或5天测量每mL的细胞密度。在每个测量日测量根据光强度的细胞密度，结果显示在图3中。
如图3所示，随着培养期的推移，MP3突变体的细胞密度增加小于野生型和Zea1。作为比较达到相同细胞密度的时间的结果，证实野生型藻类的生长速率比MP3突变体快约1至1.5天，但最终细胞密度达到相似水平。
2-2.干重的测量
实际上，为了在工业水平上使用微藻，由于干细胞重量也是重要部分，因此测量干重以比较其最终生物量。
具体地，样品以100×104个细胞/mL接种，并在第2天收获，其处于指数期。为了比较最终的藻类生物量，通过微过滤器(滤纸)过滤1mL或2mL培养物的悬浮液，将滤液在65℃的干燥烘箱中干燥24小时，然后称重1×106个野生型、Zea1和突变体细胞以测量干细胞重量。由于杜氏藻在高盐度液体培养基中生长，因此通过离心收获细胞后残留的盐仍然存在，并且可以影响细胞的干细胞重量。因此，在通过滤纸过滤滤液以除去尽可能多的盐的同时进行实验。结果显示于图4A中。
另外，在0.5、1和2mL培养物的每一个中计算干细胞重量，由此绘制趋势线以比较1L培养物中的干细胞重量值(图4B)。
如图4A所示，证实了每升干细胞重量与细胞密度成比例存在差异。证实了Zea1藻类中每细胞密度的干细胞重量最高，并且野生型杜氏藻藻类中每升的干细胞重量最高。因此，在相同的光强度条件下，可以看出本发明突变体的生长和增殖速率低于野生型和Zea1藻类的生长和增殖速率。在藻类的情况下，当有太多细胞形成菌落时，通过细胞的光的透射率较低，因此光合作用的速率可能降低。当本发明的突变体的每单位细胞或干细胞重量的色素含量高时，预期更适合作为生产色素的藻类，并且进行了确认色素含量的实验。
【实施例3】突变体的色素分析
从处理诱变材料和连续培养后形成的菌落中分离单菌落，然后通过HPLC对每个菌落进行色素分析。
具体地，将分离的单菌落在液体培养基中在100μmol光子/m2s的条件下培养5天，具体条件与实施例1中使用的相同。使用80％丙酮从收获的藻类细胞中提取色素，并通过尼龙过滤器重新过滤通过离心获得的上清液，然后通过HPLC分析。
具体地，对于色素提取，溶剂的总流速为1.2mL每分钟，从0分钟至15分钟，Tris(pH8.0)为14％，乙腈均匀地从84％降至0％，甲醇和乙酸乙酯在开始时为2％并且最多15分钟分别增加至68％和32％。然后，持续3分钟(从15分钟至18分钟)，保持上述溶剂比例，然后以溶剂的初始比例进行后运行1分钟(从18分钟至19分钟)并再进行6分钟。泵为LC-20AProminence(Shimadzu)，柱为Waters SpherisorbTM S5(DS14.6×250mm,5μm CartridgeColumn,USA)，柱温保持在40℃。通过光电二极管阵列检测器进行数据分析(SPD-M20A,Shimadzu)，使用定量玉米黄质和叶绿素a(购自DHL(AgernAlle,Horsholm,Denmark))的标准曲线测定类胡萝卜素色素的浓度，包括在445nm处检测到的玉米黄质和在670nm处检测到的叶绿素a。
图5显示了各藻类色素谱的HPLC分析图，并且图6显示了使用色谱图定量分析在100μmol光子/m2s下生长的各藻类的玉米黄质和黄体素含量的一组图。
另外，在100μmol光子/m2s的光强度下，在250mL烧瓶中，在100mL培养基中培养后第2天(藻类到达静止期的时间点)，从培养物中收获生长至细胞密度为1×106的藻类或藻类细胞，然后，基于1g干细胞重量(DCW)，玉米黄质含量的比较结果显示于图6A中，玉米黄质和黄体素含量的比较结果显示于图6B中。每DCW的色素含量通过将通过HPLC获得的色素含量(mg/L)除以每mL的细胞密度(1×106个细胞/ml)得到的值(mg/1×106个细胞)除以每1×106个细胞的干细胞重量(mg/1×106个细胞)来计算。
如图5所示，证实了本发明的MP3突变体具有比野生型藻类和基础藻类Zea1更高的玉米黄质峰(第5号)。另外，虽然Zea1是玉米黄质积累突变体，但可以看出，与其相比，本发明的突变体具有更高的玉米黄质生产能力。
如图6A和6B所示，在相同的培养条件下，与野生型相比，MP3突变体包含增加至少20倍的玉米黄质积累，与基础藻类Zea1相比，玉米黄质的积累增加约40％或更多。因此，可以看出，本发明的MP3突变体的玉米黄质生产能力明显高于常规杜氏藻属。
【实施例4】分离的突变体中生产玉米黄质的能力的证实
通过目视观察和HPLC定量分析分离出的突变体中玉米黄质积累量与基础藻类(Zea1)中玉米黄质积累量进行比较。
与野生型杜氏藻藻类和基础藻(Zea1)藻类相比，在相同光强度条件下(μmol光子/m2s)生长的突变体在尺寸上没有很大差异(图1A)，但是如图1B所示，当细胞以500×104个细胞/mL接种于固体培养基和液体培养基中时，与野生型相比，MP3突变体呈现黄色。因此，通过目视观察可以证实，在本发明的突变体中，在相对低的光强度100μmol光子/m2s下，玉米黄质持续积累，并且由于该光强度条件通常不需要太多能量，因此表明可以以较少的能量和高效率获得所需的产品。
具体地，尽管具有较低的生长速率，但是本发明的突变体在相同的光强度条件下在藻类中每单位细胞密度积累的玉米黄质含量高于野生型和Zea1藻类，这表明该突变体可以用作效率远高于传统叶黄素产生藻类的叶黄素生产藻类。因此，进行实验以证实在培养后生产在本发明的突变体中积累的玉米黄质的能力是否可以维持。
为了证实突变体中玉米黄质生产能力，将1×106个细胞/mL接种到500mL培养基中并培养。光强度和振荡培养条件与上述相同。接种后，将细胞孵育14天(达到静止期后11至12天)，然后收获，接着测量总色素中的玉米黄质含量。结果如图7A和图7B所示。
图7A和图7B所示，可以证实，本发明突变体(MP3)的玉米黄质产量为8.3mg/g DCW，比传统基础藻类Zea1的6mg/g DCW高30％或更多。当将本发明的突变体(MP3)与野生型和基础藻类Zea1进行比较时，可以证实总色素中的玉米黄质含量非常高，并且每干细胞重量的玉米黄质产量也显著高于传统基础藻类Zea1。因此，证实了本发明的MP3突变体具有相当优异的玉米黄质生产能力。
【实施例5】分离突变体的系统发生分析
为了对实施例1中筛选的本发明的MP3突变体进行系统发生分析，通过ITS基因的测序鉴定了一种微生物。
具体地，为了ITS测序，对通过PCR扩增的ITS基因的PCR产物进行电泳(图8A)，并且从琼脂糖凝胶切下扩增部分，用凝胶提取试剂盒(Cosmo Genetech Co.,Ltd.)分离DNA，然后在Macrogen进行测序。
将分析的序列与在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登记的一些杜氏藻菌株的ITS基因进行比对。首先，使用clustalW程序将每个菌株的ITS序列彼此比对，并且在MEGA6程序中使用非加权组平均法(UPGMA)算法从比对序列构建系统发生树，以进行系统发生关系的比较分析。此时，从NCBI基因库获得杜氏藻ITS序列，将其进行比较，详情如下(在括号中，基因库代码)：特氏杜氏藻A2(U66956)、特氏杜氏藻UTEX999(AF313434，AF313434)、盐生杜氏藻(D.salina)UTEX1644(AF313428，AF313429)、盐生杜氏藻CONC006(AF313424，AF313425)、盐生杜氏藻CONC007(AF313426，AF313427)、巴氏杜氏藻(D.bardawil)菌株ATCC30861(AF313430，AF313431)、D.lateralis(AF313444，AF313445)和莱茵衣藻(C.reinhardtii)(U66954)。
如图8B所示，从拓扑学的观点来看，证实了本发明的突变体包括在杜氏藻属中，MP3接近基础藻类Zea1，两者都接近野生型杜氏藻属并且在系统发生上与特氏杜氏藻A2相关。因此，证实了本发明的突变体在遗传上与特氏杜氏藻是非常密切相关的。
基于此，本发明的筛选突变体被鉴定为杜氏藻属，命名为杜氏藻属MP3，并获得韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)的保藏号KCTC12990BP。
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Claims (10)

1.具有叶黄素生产能力和增强的玉米黄质生产能力的杜氏藻属黄斑色素3(MP3)、保藏编号为KCTC 12990BP的藻类。
2.根据权利要求1所述的藻类，其中所述杜氏藻属MP3具有生产以下的能力：
黄体素和玉米黄质；以及
选自由叶绿素b、叶绿素a和β-胡萝卜素组成的组中的一种或多种色素。
3.一种色素组合物，其包含：
杜氏藻属MP3、保藏编号为KCTC 12990BP的藻类；
其中所述色素组合物包含相对于100重量份的总色素的10至15重量份的玉米黄质。
4.一种用于口服给药的组合物，其包含：
杜氏藻属MP3、保藏编号为KCTC 12990BP的藻类。
5.一种饲料或饲料添加剂组合物，包含：
杜氏藻属MP3、保藏编号为KCTC 12990BP的藻类。
6.一种不以疾病预防和治疗为目的的食品或食品添加剂组合物，包含：
杜氏藻属MP3、保藏编号为KCTC 12990BP的藻类。
7.一种生产色素的方法，其包含：
培养根据权利要求1所述的杜氏藻属MP3、保藏编号为KCTC 12990BP的藻类。
8.根据权利要求7所述的方法，其还包含：
从根据权利要求1所述的杜氏藻属MP3、保藏编号为KCTC 12990BP的藻类中提取色素。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述色素是叶黄素色素。
10.一种生产不以疾病预防和治疗为目的的食品或饲料的原料的方法，其包含：培养根据权利要求1所述的杜氏藻属MP3、保藏编号为KCTC 12990BP的藻类。
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