CN101597569B - 经甲基磺酸乙酯诱变选育获得的高生长速率杜氏藻 - Google Patents

经甲基磺酸乙酯诱变选育获得的高生长速率杜氏藻 Download PDF

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Abstract

本发明采用甲基磺酸乙酯(EMS)对Dunaliella tertiolecta进行化学诱变的方法，在正常培养条件下以微藻生长速度为指标进行筛选，最终获得较野生株生长速度更快的诱变藻株ENN0001-7。本发明得到的诱变藻株经与野生型菌株比较，其叶绿素含量(OD680)较野生株提高了8.9％，生物量(OD750)较野生株提高了5.9％。本发明获得的具有稳定高生长速率的藻株为大规模生产提供了珍贵的种质资源。

Description

经甲基磺酸乙酯诱变选育获得的高生长速率杜氏藻
技术领域
本发明涉及微生物工程领域，具体而言，本发明涉及使用甲基磺酸乙酯诱变选育杜氏藻的方法，以及由所述方法得到的一株具有高生长速率的杜氏藻诱变株ENN0001-7。
背景技术
杜氏藻(Dunaliella)是一类无纤维素外壁的单细胞真核绿藻。它们基本上分布在盐湖及海洋中，尽管有人报道在淡水中曾发现过它们。杜氏藻酷似衣藻，国内学者将它们归入真绿藻纲、团藻目、盐藻科、杜氏藻属。杜氏藻细胞十分微小。从目前已报道的十几种杜氏藻看。细胞最大的为D.salina，体积约为2600μm3(24～25×12～16μm)，最小的为D.minuta仅为约42μm3(9×3μm)，其大小仅相当于一般植物细胞的几分之一到百分之一。此外，由于长期适应高渗压的环境(可在饱和盐水中生存)，杜氏藻胞外形成一层坚韧的以糖蛋白为主的弹性外被，使得细胞不易破碎。可能是由于上述原因，自上世纪30年代法国科学家Dunal发现杜氏藻以来，科学家们对这些微小单胞藻的奇特生理生化性质进行了大量研究。杜氏藻(Dunaliella)以其独特的渗透压调节机制著称，能积累甘油、β-胡萝卜素，近年来成为国际上藻类研究的重点之一。杜氏藻及其制品在食品、药品和化工市场上有巨大潜力，开发前景诱人。
诱变育种是指通过物理(射线照射等)和化学(诱变剂等)方法使藻类发生变异，从中选育出具有优良性状的藻种，是微藻育种中使用最多也是最有效的一种方法。诱变育种既能诱发基因突变，又能促进遗传基因重新组合，在短时间内获得大量优良突变体作为新品种直接利用或作为种质资源间接利用，具有选择育种难以替代的优点。
甲基磺酸乙酯(EMS)作为一种强烈的化学诱变剂在藻类诱变育种中经常使用。早在20世纪80年代Riccardi等就利用EMS处理螺旋藻获得了抗氨基酸类似物的突变株；90年代张学成等利用EMS处理螺旋藻选出了2株耐低温的突变株；崔海瑞等研究发现，经过EMS处理的钝顶螺旋藻在生长和形态等方面受到了很大影响；汪志平等采用0.6％的EMS和2.4kGy的60Coγ射线处理钝顶螺旋藻，并用7.0kGy左右的γ射线为筛选压力，得到4株高多糖含量的突变株。有关盐藻诱变育种的报道并不多，Eon Seon等利用EMS处理盐藻获得了高玉米黄素突变株，突变株的玉米黄素含量是出发藻株的30倍，且藻细胞的生长未受到影响。目前，盐藻遗传方面的研究主要是筛选盐藻突变体，进行原生质体融合、基因克隆与遗传转化等，然而在盐藻诱变育种中基本都是采用紫外线进行诱变，紫外线诱变获得突变株的几率很小，且费时费工。本发明利用EMS诱变杜氏藻，针对生长速率筛选快速生长的藻株还未见报道。
本发明待解决的技术问题：
杜氏藻富含β-胡萝卜素、VC、VE，油脂含量高，是迄今为止发现的少数极端耐盐的真核生物之一，具有很高的利用价值，因此成为人类主要的养殖藻类之一。而针对其生长速率的育种研究却较少。目前，杜氏藻的诱变育种主要利用紫外线诱变，但紫外诱变存在费时费工、诱变获得突变株几率小的缺点。甲基磺酸乙酯(EMS)作为一种强烈的化学诱变剂，在藻类育种中主要应用于螺旋藻的诱变育种，而其针对生长速率筛选快速生长的藻株还未见报道。本研究利用EMS诱变杜氏藻，并以OD750值作为衡量生长速率的指标，具有快速便捷的特点，保证了在一定数量的筛选量；而通过多步逐级筛选的方法进一步保证了微藻优良性状的稳定性，即最终获得的优良藻株是在不同规模的培养体积和容器中均有较高的生长速率。
基于此，本发明的一个目的是提供利用甲基磺酸乙酯(EMS)对Dunaliella tertiolecta野生株进行化学诱变的方法，及利用多步逐级筛选方法确保突变株优良性状的稳定表达，摒除在一次筛选得到突变株回复突变的可能性。
本发明的又一个目的是提供具有高生产速率的杜氏藻藻株。
发明内容
在第一个方面中，本发明提供一种诱变育种方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
a)以杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)野生株为出发藻株；将其接种在培养基中在光照培养箱中进行培养；
b)用一定浓度的甲基磺酸乙酯诱变处理步骤a)中培养的野生藻株培养物；
c)在正常培养条件下培养经步骤b处理的藻株至生长出单藻落，将单藻落挑取并于平板上保存，得到诱变藻株；
d)具高生长速率藻株的初步筛选：针对生长速率进行大量诱变藻株的筛选，同时经过多步逐级筛选以确保优良性状的稳定表达；
e)具高生长速率藻株的复筛：经过初筛得到的生长迅速的诱变藻株经过复筛进一步筛选，并经过多步筛选步骤确定其优良性状的稳定表达。
在一个实施方案中，所述出发藻株为杜氏藻野生株UTEX LB 999。
在一个实施方案中，被甲基磺酸乙酯诱变处理的野生藻株培养物处于对数生长期。
在一个实施方案中，所述培养基为Erdschreiber’s Medium(简称EM)培养基。
在一个实施方案中，所述正常培养条件为在光照培养箱中25℃，4000lux，12h L/12h D培养。
在一个实施方案中，所述甲基磺酸乙酯(EMS)终浓度为1％(体积比)。
在一个实施方案中，所述甲基磺酸乙酯的诱变处理方法为：取处于对数生长期的藻液离心浓缩，添加等体积2％浓度的EMS工作液，处理45分钟停止反应，离心去除EMS液体，加入新鲜EM培养基，于正常培养条件下培养一周，所述正常培养条件为在光照培养箱中25℃，4000lux，12hL/12h D培养。
在一个实施方案中，在所述步骤c)中，将培养后的藻液测定OD750值，稀释到一定浓度涂布固体EM培养基平板来得到单藻落。
在一个实施方案中，所述初步筛选的步骤为：从原始保存平板上挑取上述藻落经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种到液体培养基中，在细胞培养板中培养，在传代中调整同样接种数量，再经过一代在细胞培养板和两代透光玻璃容器中的培养，逐级选育在正常培养条件下生长迅速的藻株。
在一个实施方案中，所述复筛步骤为从保存平板上挑取初筛确定具有较高生长速度的藻株经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种到透光玻璃容器中的液体培养基中，培养一段时间后调整同样接种密度传代于新的透光玻璃容器中，培养末期1∶10扩培传代。经过在透光玻璃容器中三代培养，逐级选育确定具有高生长速率的藻株。
在一个实施方案中，所述透光玻璃容器为三角瓶。
在一个实施方案中，其中所述细胞培养板为12孔细胞培养板。
在第二个方面中，本发明提供高生产速率的杜氏藻突变株，其由第一个方面的方法生产。
在一个实施方案中，所述高生产速率的杜氏藻突变株是由杜氏藻野生株UTEX LB 999突变的保藏编号为CGMCC No.2985的藻株ENN0001-7，其特征在于其是所述野生株经由1％(体积比)浓度的甲基磺酸乙酯诱变处理筛选得到的，其具有稳定的高生长速率，在相同条件下其叶绿素含量(OD680)较杜氏藻野生株提高了8.9％，生物量(OD750)较野生株提高了5.9％。
在第三个方面中，本发明提供第二个方面中的突变藻株用于大规模培养杜氏藻，以及用于生产类胡萝卜素、β-胡萝卜素、维生素C、维生素E、甘油、油脂和生物柴油的应用。
下面描述本发明用EMS诱变选育高生长速率杜氏藻的方法的优选实施方案：
1、配制培养杜氏藻的Erdschreiber’s Medium(简称EM)培养基；
所述EM培养基的组成和配制如实施例1所示；
2、将上述EM培养基分装封口并灭菌；
3、取出上述灭过菌的培养基，冷却至室温后，取杜氏藻接种在无菌培养基中；
具体操作步骤如下：
将野生Dunaliella tertiolecta藻株从平板上挑取单藻落接种于灭菌的20ml新鲜EM培养基中；
4、将培养液置于光照培养箱中培养；
具体正常培养条件为：25℃，4000lux，12h L/12h D，以下相同)培养至指数生长期
5、EMS诱变处理过程
取处于对数生长期的杜氏藻，离心浓缩，添加等体积的2％浓度(体积比)的EMS工作液，处理45分钟停止反应，离心去除EMS液体，加入新鲜EM培养基培养于250mL透光玻璃容器中，于正常培养条件下培养一周；
具体操作步骤如下：
1)配置甲基磺酸乙酯(EMS)工作液：配置2％EMS工作液，所述工作液配置方法为将20μl EMS原液加入980μl EM无菌培养基中。
2)甲基磺酸乙酯诱变处理：取预培养至对数生长期的藻液2mL于3000rpm离心5分钟，去除上清培养基1600μl，将剩余400μl藻液混匀，加入预先配好的EMS工作液400μl充分混匀。将处理藻液置于25℃恒温摇床中，120rpm，无光作用45分钟，离心去除上清EMS工作液，用EM培养基多次洗涤藻液，将沉淀藻体加入400μl EM培养基充分混匀，接种到20ml新鲜EM培养基中于250ml三角瓶中，在正常培养条件下培养一周。
6、将培养后的藻液测定OD值，稀释到一定浓度涂布固体EM培养基平板；待该固体EM平板上生长出单藻落，挑取较大的生长迅速的单藻落于新的固体EM培养基平板上保存；
具体操作步骤如下：
测定藻液750nm处OD值，用培养液稀释至OD750为0.001，取100ul稀释藻液涂固体EM培养基平板，于正常培养条件下培养至生长出单藻落，将单藻落挑取并于平板上保存，得到70株诱变藻株。
7、高生长速率的藻株的初筛：
从保存板上挑取上述藻落经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种到液体培养基中，在细胞培养板中培养，在传代中调整同样接种密度，再经过一代在细胞培养板和两代透光玻璃容器中的培养，逐级选育在正常培养条件下生长迅速的藻株；
具体操作步骤如下：
通过12孔细胞培养板(购自Biofil公司)培养可以进行大量藻株的筛选，同时经过多步逐级筛选以确保优良性状的稳定表达。上述经分离后平板保存的70株诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，接种于12孔板中，每孔添加4ml液体培养基EM，在正常培养条件下培养。在12孔细胞培养板中培养10天后，测量OD750值，调整同样OD750值传代接种至新的12孔板中，生长8天后，测量OD750值，挑选OD750值较大的调整相同OD750值传代接种入100mL三角瓶中，每瓶中添加40mL EM培养基。正常条件下培养10天后，测量OD750值，选择OD750值较大的藻株取20mL藻液添加180mL EM培养基接种于500mL三角瓶中。培养10天后，测量OD750值，最终得到生长迅速的32株诱变藻株在固体EM培养基平板上保存。
8、高生长速率的藻株的复筛：
初步筛选确定的高生长速率突变藻株作为复筛的对象，与野生株一起进行一轮复筛，从而确定突变株优良性状稳定表达的藻株。从原始保存板上挑取初筛确定具有较高生长速度的藻株经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种到透光玻璃容器中的液体培养基中，培养一段时间后调整同样接种密度传代于新的透光玻璃容器中，培养末期1∶10扩培传代。经过在透光玻璃容器中三代培养，逐级选育确定具有高生长速率的藻株。
具体操作步骤如下：
经过初筛得到的生长迅速的32株诱变藻株经过复筛进一步筛选，并经过多步筛选步骤确定其优良性状的稳定表达。上述经分离后平板保存的32株诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，接种于添加20ml EM培养基的100ml三角瓶中。于正常培养条件下培养10天，测定OD750值，并调整相同OD750值为0.1接种传代于新的添加20ml EM培养基的100ml三角瓶中，每株设三个平行样。正常培养条件下培养十天后，测量OD750值，并取10ml藻液添加90ml EM培养基(1∶10接种)传代于500ml三角瓶中，每株设立三个平行样。正常培养条件下培养十天，测量OD750值，经过前述三次传代培养，确定诱变株系中生长迅速的突变藻株ENN0001-7。
经过上述筛选方法，本发明得到具有高生长速率的杜氏藻诱变株ENN0001-7，其于2009年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏编号为：CGMCC No.2985。由图1可见诱变株系在复筛培养结束后叶绿素含量(OD680)较野生株提高了8.9％，生物量(OD750)较野生株提高了5.9％。
发明效果
本发明针对单细胞微藻Dunaliella tertiolecta添加甲基磺酸乙酯诱变，在正常培养条件下以微藻生长速度为指标进行筛选，最终获得较野生株生长速度更快的诱变藻株ENN0001-7。其中，利用OD750值为指标衡量单细胞绿藻生长速度具有快速便捷和较为准确的特性，而多步筛选可以进一步确定优良性状的稳定表达。本发明获得的具有稳定高生长速率的藻株为大规模生产提供了珍贵的种质资源。
附图说明
图1为诱变株ENN0001-7经复筛后在筛选、培养结束后的OD值变化(百分比)。横坐标为诱变藻株株系，纵坐标为培养藻株OD值变化，在单细胞绿藻中，OD680代表叶绿素含量的变化，OD750代表生物量的变化。由图1可见诱变株系在复筛培养结束后叶绿素含量(OD680)较野生株提高了8.9％，生物量(OD750)较野生株提高了5.9％。
具体实施方式
实施例1高生长速率的杜氏藻诱变株的筛选
以Dunaliella tertiolecta野生株UTEX LB 999(购自University ofTexas)为出发藻株，添加甲基磺酸乙酯(EMS)(1％终浓度，体积比)诱变，随后分离并传代培养后保存。将上述诱变藻株活化后于人工气候箱中于正常培养条件(25℃，4000lux，12h L/12h D)下经过多步筛选，以OD750值为衡量逐级筛选出具高生长速率的诱变藻株。
培养液的组成及其含量如表1所示。
表1EM培养基的组成及其含量
  #   成分   量   储液浓度   使用时终浓度
  1   Artificial Seawater   3L
  2   P-IV Metal Solution   36mL/3L
  3   NaNO3   10mL/3L   0.7M   2.3mM
  4   Na2HPO4·7H2O   10mL/3L   0.02M   6.7mM
  5   Soilwater：GR+Medium   150mL/3L
  6   Vitamin B12   3mL/3L
Artificial Seawater的组成及其含量
  #   成分   量(g/L)   使用时终浓度
  1   NaCl   49.726   850mM
  2   MgCl2   7.26   76mM
  3   MgSO4   3.248   27mM
  4   CaCl2   1.153   10mM
  5   NaHCO3   0.198   2.4mM
  6   KCl   0.721   10mM
  7   NaBr   0.058   0.56mM
  8   H3BO3   0.058   9.4mM
  9   Na2SiO3   0.0024   0.02mM
  10   H3PO4   0.002   0.02mM
  11   Al2Cl6   0.013   0.0075mM
  12   NH3   0.002   0.12mM
  13   LiNO3   0.0013   0.019mM
  14   Na2SO4   4   28mM
P-IV金属溶液储液的组成及其含量
  #   成分   量   使用时终浓度
  1   Na2EDTA·2H2O   0.75g/L   2mM
  2   FeCl3·6H2O   0.097g/L   0.36mM
  3   MnCl2·4H2O   0.041g/L   0.21mM
  4   ZnCl2   0.005g/L   0.037mM
  5   CoCl2·6H2O   0.002g/L   0.0084mM
  6   Na2MoO4·2H2O   0.004g/L   0.017mM
Soilwater：GR+Medium的组成及其含量
 #   成分   量   使用时终浓度
 1   Green House Soil   1tsp/200mL dH2O
 2   CaCO3(optional)   1mg/200mL dH2O   0.05mM
Vitamin B12的配制
 #   成分   量
 1   HEPES buffer pH 7.8(Sigma H-3375)   2.4g/200mL dH2O
 2   Vitamin B12(cyanocobalamin，Sigma V-6629)   0.027g/200mL dH2O
将野生Dunaliella tertiolecta藻株从平板上挑取单藻落接种于灭菌的20ml新鲜EM培养基中，置于100ml三角瓶中，置于光照培养箱中在正常培养条件(25℃，4000lux，12h L/12h D，以下相同)培养至指数生长期。
配置甲基磺酸乙酯(EMS)工作液：配置2％EMS工作液(体积比)。
甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理：取预培养至对数生长期的藻液2mL于3000rpm离心5分钟，去除上清培养基1600μl，将剩余400μl藻液混匀，加入预先配好的EMS工作液400μl充分混匀。将处理藻液置于25℃恒温摇床中，120rpm，作用45分钟，离心去除上清EMS工作液，将沉淀藻体加入400μl EM培养基充分混匀，接种到20ml新鲜EM培养基中于250ml三角瓶中，在正常培养条件下培养一周。
使用WFZ UV-2102PC型紫外可见分光光度计(购自尤尼柯仪器有限公司)测定藻液750nm处OD值，用培养液稀释至OD750为0.001，取100ul稀释藻液涂固体EM培养基平板，于正常培养条件下培养至生长出单藻落，将单藻落挑取并于平板上保存，得到70株诱变藻株。
具高生长速率藻株的初步筛选：通过12孔细胞培养板(购自Biofil公司)培养可以进行大量藻株的筛选，同时经过多步逐级筛选以确保优良性状的稳定表达。上述经分离后平板保存的70株诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，接种于12孔板中，每孔添加4ml液体培养基EM，在正常培养条件下培养。在12孔细胞培养板中培养10天后，测量OD750值，调整同样OD750值传代接种至新的12孔板中，生长8天后，测量OD750值，挑选OD750值较大的调整相同OD750值传代接种入100mL三角瓶中，每瓶中添加40mL EM培养基。正常条件下培养10天后，测量OD750值，选择OD750值较大的藻株取20mL藻液添加180mL EM培养基接种于500mL三角瓶中。培养10天后，测量OD750值，最终得到生长迅速的32株诱变藻株在固体EM培养基平板上保存。
具高生长速率藻株的复筛：经过初筛得到的生长迅速的32株诱变藻株经过复筛进一步筛选，并经过多步筛选步骤确定其优良性状的稳定表达。上述经分离后平板保存的32株诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，接种于添加20ml EM培养基的100ml三角瓶中。于正常培养条件下培养10天，测定OD750值，并调整相同OD750值为0.1接种传代于新的添加20ml EM培养基的100ml三角瓶中，每株设三个平行样。正常培养条件下培养十天后，测量OD750值，并取10ml藻液添加90ml EM培养基(1∶10接种)传代于500ml三角瓶中，每株设立三个平行样。正常培养条件下培养十天，测量OD750值，经过前述三次传代培养，确定诱变株系中生长迅速的突变藻株ENN0001-7。将所述突变藻株ENN0001-7于2009年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏号为：CGMCC No.2985。
实施例2筛选得到的突变藻株ENN0001-7的鉴定特征
突变藻株ENN0001-7的藻细胞呈梨形或椭圆形，长度约6-10μM，具有2根等长的鞭毛，无纤维素质细胞壁，仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜包裹。在EM、F/2等培养基中均能生长。藻体在液体培养基中分散均匀，可游动。在EM固体培养基上生长良好，5-7天即可形成明显的单藻落。藻落成规则的圆形，藻体呈绿色。
实施例3筛选得到的突变藻株ENN0001-7与野生型藻株UTEX LB 999 的生长速率和叶绿素含量比较
由图1可见突变藻株ENN0001-7与野生型藻株UTEX LB 999在复筛完成后的生物量(OD750)和叶绿素含量(OD680)。正常培养条件为：25℃，4000lux，12h L/12h D。复筛步骤为：经过初筛确定的诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，挑取单藻落接种于添加20ml EM培养基的100ml三角瓶中。于正常培养条件下培养10天，测定OD750值，并调整相同OD750值为0.1接种传代于新的添加20ml EM培养基的100ml三角瓶中，每株设三个平行样。正常培养条件下培养十天后，测量OD750值，并取10ml藻液添加90ml EM培养基(1∶10接种)传代于500ml三角瓶中，每株设立三个平行样。正常培养条件下培养十天，使用WFZ UV-2102PC型紫外可见分光光度计(购自尤尼柯仪器有限公司)分别测定藻液750nm和680nm处OD值为衡量指标。
具体如下：
(1)ENN0001-7与野生株在复筛中以相同培养起始浓度接种生长10天后，1∶10传代培养于新鲜EM培养基中生长十天后，生物量(OD750)比野生株高5.9％。
(2)ENN0001-7与野生株在复筛中以相同培养起始浓度接种生长10天后，1∶10传代培养于新鲜EM培养基中生长十天后，叶绿素含量(OD680)比野生株高8.9％。

Claims (2)

1.由杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)野生株UTEX LB 999突变而来的保藏编号为CGMCC No.2985的杜氏藻突变藻株ENN0001-7，其特征在于：所述杜氏藻突变藻株ENN0001-7的拉丁文学名为Dunaliella tertiolecta，其是所述野生株经过1％(体积比)的甲基磺酸乙酯诱变处理步骤筛选得到的，在相同条件下叶绿素含量OD680较杜氏藻野生株提高了8.9％，生物量OD750较野生株提高了5.9％。
2.权利要求1的突变藻株用于大规模培养杜氏藻以及用于生产类胡萝卜素、β-胡萝卜素、维生素C、维生素E、甘油、油脂和生物柴油的应用。
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