CN101173213A - 高脂杜氏藻的诱变选育方法 - Google Patents
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Abstract
高脂杜氏藻的诱变选育方法，涉及一种杜氏藻。提供一种采用紫外线诱变，并经乙醚等试剂提取筛选，获得脂类含量高的高脂杜氏藻的诱变选育方法，高脂杜氏藻为巴氏杜氏藻HL。将灭菌后的培养液冷却接种杜氏藻得杜氏藻藻液，光照培养再测定OD630值；将原出发株涂在培养基上，置紫外灯下照射诱变后培养；挑取诱变处理的单藻落培养，离心弃培养液，收集鲜藻烘干，抽提，烘干提取物并称重，选出突变藻株，与原出发株接种培养，离心收集藻细胞，烘制成藻粉，测藻粉总脂含量，确定总脂含量高于原出发株的突变藻株；复筛所得高脂突变株藻粉中的脂类，验证突变藻株为高脂杜氏藻突变株。
Description
技术领域
本发明涉及一种杜氏藻(或称盐藻)，尤其是涉及一种采用紫外线诱变，并经乙醚等试剂提取筛选，获得脂类含量高的杜氏藻(盐藻)的方法。
背景技术
杜氏藻(Dunaliella sp.国内常称为盐藻)是单细胞真核绿藻，属于绿藻纲(Chlorophyceae)，团藻目(Volvocales)，杜氏藻科(Dunaliellaceae)。杜氏藻具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短和生物产量高等特点。杜氏藻富含β-胡萝卜素、甘油和蛋白质，其总脂含量占干重的15％左右(包括各类脂肪酸及其衍生物和化合物)。如果能通过诱变获得总脂含量比原出发株显著升高的突变株，那么高脂杜氏藻将可为热解制备生物质油和可燃气提供廉价的原始材料。
由于化石能源日益枯竭，世界各国，尤其是发达国家都在竞相开发可再生能源，其中生物质能源以其可再生和污染小等优点而获得各国政府和科学家的青睐。生物质能源的原材料可以来自以下几方面：
1.从餐馆使用过的泔水，即所谓的“地沟油”中回收油脂；
2.以植物淀粉为原料进行发酵生产乙醇；
3.栽种植物收获其高脂种子；
4.以粉碎的植物秸秆为原料进行热解。
综上分析可以看到，“地沟油”制备生物质油是比较方便的，但它的来源有限；以植物为材料制取生物质油受到生长周期、气候、土地、水源、肥料、农药和人力等因素的制约，成本较高。因此在中国人多地少淡水紧缺的特定条件下，寻找生长快、成本低、不占用农田和淡水的廉价高脂植物成了发展生物质能源的“瓶颈”。
目前以生物质为原料制取生物质油的工艺已经基本成熟，关键在于其原材料的成本过高而影响生物质油的销售和使用。
杜氏藻细胞微小，生长迅速，在适宜条件下一天就可以分裂一次，使生物量翻一番。它利用浓缩海水、阳光、CO2和少量无机盐进行生长，成本很低。收获干燥后不需要任何前处理工序和复杂的仪器设备就可进行热解处理。因此，利用杜氏藻生产可再生生物能源具有良好的发展前景。虽然已有用紫外线诱变低等生物，包括杜氏藻的资料，但至今未见有关通过诱变、筛选获得高脂杜氏藻的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用紫外线诱变，并经乙醚等试剂提取筛选，获得脂类含量高的高脂杜氏藻的诱变选育方法，高脂杜氏藻为巴氏杜氏藻HL(Dunaliella bardawil var.HL)，已于2007年06月13日由中国典型培养物保藏中心登记入册，保藏编号为CCTCC NO：M207081。
本发明包括以下步骤：
1)配制培养液；
2)将培养液分装封口；
3)把封装好的培养液灭菌；
4)取出灭菌过的培养液，冷却至室温，接种杜氏藻，得杜氏藻藻液；
5)将杜氏藻藻液置于光照培养箱中培养；
6)每1～3天取杜氏藻藻液测定OD630值，绘制其生长曲线；
7)将处于指数生长期的杜氏藻原出发株，涂在琼脂人工海水培养基上，置超净工作台中紫外灯下照射进行诱变后，于无光暗处培养；
8)按照步骤5培养10～25天；
9)挑取诱变处理的20～100个单藻落于装有2～6mL培养液的试管中，按照步骤5培养5～20天；
10)将试管中的杜氏藻培养液转入装有15～30mL培养液的50mL锥形瓶，锥形瓶应塞上棉花塞或封好纱布，培养10～20天；
11)离心弃培养液，收集杜氏藻鲜藻，烘干，加入2～4mL的无水乙醚进行抽提，烘干乙醚提取物并称重，选出比杜氏藻原出发株脂类含量高，通过显微镜观察藻和测定藻液的OD630值，能正常生长的突变藻株；
12)将步骤11筛选出的突变藻株以及杜氏藻原出发株接种于装有2～3L培养液的敞口瓶或光生物反应器中，按步骤5培养10～20天；
13)离心收集藻细胞，烘制成藻粉，冷冻保存；
14)按照通行的索氏脂类检测法(参考文献1)测定步骤11第二次扩大培养所得藻粉的总脂含量，即复筛，比较步骤11筛选和复筛所得的结果，确定总脂含量高于杜氏藻原出发株的突变藻株；
15)以氯仿替换乙醚抽提复筛所得高脂突变株藻粉中的脂类，比较所得氯仿沥青质A(相当于原油)的含量，验证所得突变藻株为高脂杜氏藻突变株；
16)对高脂杜氏藻突变株进行10聚寡核苷酸引物随机扩增多态性分析(RAPD)(参考文献2)，统计扩增出的总条带和共有条带数，计算高脂杜氏藻突变株和原出发株之间的遗传相似性系数。
培养液的组成及其含量如表1所示，在配制培养液时，将各成份事先配成50～1000倍的母液，使用时再按需稀释配制成培养液。
表1培养基的组成及其含量
| 成分 | 浓度 |
| KNO3NaNO3K2HPO4·3H2OTris·HCl pH7.4CaCl2·2H2OMgSO4·7H2OMgCl2·6H2OH3BO3FeCl3·6H2OMnCl2·4H2OZnCl2CoCl2CuCl2·2H2OEDTA·Na2NaClpH | 1mmol/L4mmol/L0.1mmol/L10mmol/L10mmol/L24mmol/L20mmol/L0.185mmol/L1.5μmol/L7.0μmol/L0.8μmol/L0.02μmol/L0.2μmol/L30μmol/L1.5mol/L7.4 |
将培养液分装封口时，可将培养液分装在100～250mL的锥形瓶中，每瓶装量20～50mL，棉花塞塞紧或用8层纱布封口，包上牛皮纸。
把封装好的培养液灭菌时，可把包装好的培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15～20min。
取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取1～5mL杜氏藻藻液接种在无菌培养基中，轻轻摇匀，塞上棉花塞或封好纱布。
将培养液置于光照培养箱中培养时，可将培养液置于光照培养箱中，光照强度3000～15000lux，培养温度15～32℃，每日光照时间12～24h。旋转摇动，90～120rpm；或静止培养，每天轻摇1～3次，每次10～20s。
所述的取杜氏藻培养液测定OD630值，可取出3.5mL藻液，以人工海水培养液作为空白对照，用分光光度计测定取样藻液的OD630，重复计数3次，取平均值。
在步骤7中，可取处于指数生长期的杜氏藻(OD630值为0.4～0.8)，均匀涂在含琼脂0.7％～1.0％的杜氏藻培养基上，每个平皿50～100μL藻液；也可以将原培养基中的NaCl浓度提高到2.0～3.0mol/L，再制成琼脂平皿，因为高盐平皿有助于筛选出高脂杜氏藻突变株；还可以直接在无菌平皿内注入1～5mL处于指数生长期的杜氏藻。将备好的平皿置于超净工作台中30W紫外灯下10～17cm处，分别照射60～100s进行诱变。关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好，在15～32℃暗培养48～72h。琼脂培养基要倒扣培养防止水珠产生。所用超净工作台应事先擦净并以紫外线杀菌15～20min。
在步骤8中，按照步骤5培养10～25天可将培养皿应用封口膜封好防止培养基水分逃逸，静置培养10～25天。水分逃逸会导致琼脂培养基中盐份析出，藻落生长不好。
在步骤9中，将单藻落分别接种到装有4～6mL培养液的小试管。小试管应该斜放于培养箱中，增加受光面积。培养5～20天，应每天轻摇1～3次，以防藻细胞附着于试管壁上。
在步骤10中，选择在小试管中接种成活的突变株藻液，将其转移到装有15～30mL培养液的50mL锥形瓶，锥形瓶应塞上棉花塞或封好纱布，小量扩大培养10～20天。
在步骤11中，所说的小剂量乙醚抽提法过程如下：①准确称取已干燥的离心管A质量(W1)；②取3～5mL小量扩大培养的藻液于离心管A中，离心收集藻细胞。将含藻离心管A于60～80℃烘干后称重(W2)；③往离心管A中加入2～4mL的无水乙醚，充分震荡，静置0.5～1.5h，离心去上清，重复1次。观察上清是否无色，如果还有颜色，说明没有抽提完全，需要再重复1次；④将离心管A和管内的藻残渣烘干后称重(W3)；⑤按照公式[藻株的总脂含量＝(W2-W3)/(W2-W1)×100％]，可以初步判断出不同藻株总脂含量的高低。小剂量乙醚抽提法难以准确测出藻细胞的总脂含量，但是可以将实际总脂含量差距在3～5％以上的藻株区分开，即以上述简易乙醚抽提法比较各藻株脂类含量是基本可行的。对藻株生长情况的观测，需要分别取样，通过显微镜观察藻细胞形态和其游动情况，同时根据紫外分光光度计测定取样藻液的OD630值，删除诱变后生理机能受损较为严重、不能正常生长的藻株。步骤11的最后结果就是从为数众多的突变株中初步筛选出总脂含量较高而且生长良好的藻株。
在步骤12中，将初步筛选出的脂类含量较高的藻株以及诱变出发株(对照)，接种于装有2～5L培养液的5～10L敞口玻璃缸或光生物反应器中进一步扩大培养10～20天。培养过程中每个敞口瓶的位置应随机交换，以保持培养条件的一致性，而且每天要用玻棒搅拌1～3次，以防藻细胞附着于容器壁，或用小型充气泵打气。光生物反应器应缓慢搅拌或通气搅拌。温度设为15～32℃。培养过程中可每天或隔天取样测定OD630，以监控不同藻株的生长情况。
在步骤13中冷冻保存藻粉，是以3000～4000r/min，8～15min离心收集藻细胞，去上清。加入200～300mL，0.3～0.5mol/L的NaCl溶液清洗澡沉淀一次，离心收集，50～80℃烘制成藻粉，冷冻保存。用0.3～0.5mol/L的NaCl溶液清洗可以大量去除培养液残留在藻细胞表面的盐分，并且还可以减小藻细胞的破碎程度。
所述的复筛是利用步骤12～13培养所得藻粉为样品，按照脂类检测的索氏提取法测定第二次扩大培养藻株的总脂含量。索氏提取法需要样品1～5g，精确称量藻粉应使用高度灵敏的电子天平。样品一定要干燥，否则影响抽提效果，抽提时间4～8h。比较复筛所得的结果(表2)，选出总脂含量高于原出发株的藻株，即获得杜氏藻高脂突变株。在表2中，H-42为杜氏藻诱变的原出发株，即对照；HL、HL-2～HL-6为各杜氏藻高脂突变株。
表2.杜氏藻出发株及其高脂突变株的总脂含量
| 藻株 | 总脂含量(％，占干重) |
| HLHL-2HL-3HL-4HL-5HL-6H-42 | 21.120.518.917.919.218.716.1 |
在步骤15中，以氯仿替换乙醚抽提各藻粉中的脂类，是因为虽然乙醚和氯仿二者都能抽提脂类，但所得组分还是有所差异。因此若氯仿提取物的含量也比较高，则从另一个侧面验证所得突变藻株为高脂含量藻株。
在步骤16中，所述的10聚寡核苷酸引物随机扩增多态性分析(RAPD)，是指以20～40条随机合成的由10个脱氧核糖核苷酸组成的引物对多脂杜氏藻突变株和原出发株的总DNA进行PCR扩增。扩增反应的参数如下：94℃解链1min，36℃退火1min，72℃延伸2min。上述反应经25个循环后72℃保温7min。反应结束后取5～15μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中扫描并记录电泳图像。统计扩增出的总条带和两者之间的共有条带数，计算突变藻株和原出发株之间的遗传相似性系数I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后显示的总带数，Nij为两样品共有的显示带数。
通过本方法获得的高脂杜氏藻突变株，其总脂含量可以达到细胞干重的18.7％～21.1％，比原出发株提高16.1％～31.1％。显然，本方法的建立将对廉价开发大量的杜氏藻可再生能源具有重大意义。
附图说明
图1为对照(原出发株)H-42、高脂杜氏藻HL和高脂杜氏藻HL-2的RAPD扩增图谱。在图1中，M代表DNA分子量Markers，从上至下依次为3530bp(碱基对，下同)、2027bp、1375bp、947bp和564bp；S262、S264、S266、S267、S270、S273和S274为各引物的代号，各引物之下各自有3个泳道，从左到右依次分别为：对照(原出发株)H-42、高脂杜氏藻HL和高脂杜氏藻HL-2。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步说明。
实施例1：
杜氏藻的紫外线诱变及选育高脂杜氏藻的具体步骤如下：
1.配制培养杜氏藻的人工海水培养液；
2.将上述人工海水培养液分装在100mL的锥形瓶中，每瓶装量20mL，棉花塞塞紧，包上牛皮纸；
3.把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15min；
4.取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，接种1mL杜氏藻藻液，轻轻摇匀，塞上棉花塞；
5.将培养液置于光照培养箱中，光照强度8000lux，培养温度28℃，每日光照24h，旋转摇动，90rpm；
6.每天取出3.5mL藻液，以人工海水培养液作为空白对照，用分光光度计测定取样藻液的OD630值，重复计数3次，取平均值，绘制杜氏藻的生长曲线；
7.取处于指数生长期的杜氏藻(OD630值为0.605)，均匀涂在杜氏藻琼脂培养基上(每个平皿涂50μL藻液)，共涂50个平皿。将这些平皿(不加盖)依次置于超净工作台中30W紫外灯下12cm处，照射70s进行诱变。关闭紫外灯，盖上培养皿盖，立即用不透光的纸包好，在28℃暗培养48h。所用的杜氏藻琼脂培养基，是在原有液体培养液中添加琼脂1.0％配制而成；
8.将暗培养后的培养皿用封口膜封好，置于光照培养箱中倒扣培养，光照强度8000lux，培养温度28℃，每日光照24h，静止培养15天；
9.挑选上述培养基上生长出的单藻落，分别接种到装有5mL杜氏藻培养液的15mL小试管中，棉塞封口。斜放于培养箱中，光照强度8000lux，培养温度28℃，每日光照24h，旋转摇动，90rpm，培养15天；
10.选择在小试管中接种成活的突变株藻液转移到装有30mL培养液的50mL锥形瓶，塞上棉花塞，光照强度8000lux，28℃每日光照24h，旋转摇动，90rpm，培养15天；
11.4000rpm离心上述藻液15min，弃培养液，收集杜氏藻，烘干。加入2mL的无水乙醚，充分震荡，静置1.5h，离心去上清，重复1次。干燥，称重。通过比对小剂量乙醚抽提法的结果以及对上述小量扩大培养藻株生长情况的显微观测，初步筛选出总脂含量较高而且生长良好的突变株；
12.将初步筛选出的突变株以及诱变出发株，分别接种于装有3L培养液的5L敞口玻璃瓶，进一步扩大培养15天，每天分别用玻棒搅拌1～3次；
13.将藻液倒入1L的离心管，3000rpm离心15min，去上清液，再注入200mL的NaCl溶液(0.3mol/L)，轻轻荡洗，再次3000rpm离心10min，去上清液。将收集的鲜藻转移到坩埚内，烘箱内60℃烘制成藻粉，冷冻保存；
14.按照脂类检测的索氏提取法测定经初筛获得各突变株的总脂含量，比较所得的数据。由于这次所测样品量大(约1g干藻粉)，采用标准脂类检测法，因此所得数据可信。重复检测一次，取两次检测数据的平均值，即为该藻的脂类含量。与对照杜氏藻的脂类含量比较，获得杜氏藻高脂突变株；
15.以氯仿替换乙醚抽提各藻粉中的脂类，进一步检验上述检出的高脂杜氏藻的脂类含量，最终确定高脂杜氏藻，即为巴氏杜氏藻HL(Dunaliella bardawil var.HL)，简称HL；
16.用20条10聚寡核苷酸引物对高脂杜氏藻突变株和原出发株的总DNA进行PCR扩增。扩增反应的参数如下：94℃解链1min，36℃退火1min，72℃延伸2min。上述反应经25个循环后72℃保温7min。反应结束后取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳，在凝胶成像系统中扫描并记录电泳图像。统计扩增出的总条带和两者之间的共有条带数，计算突变藻株和原出发株之间的遗传相似性系数I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后显示的总带数，Nij为两样品共有的显示带数(参见图1)。实验结果，巴氏杜氏藻HL与原出发株的遗传相似性系数为0.797，符合种内突变株的遗传相似性范畴。
实施例2：
与实施例1类似，其区别在于：
将人工海水培养液分装在250mL的锥形瓶中，每瓶装量50mL，用8层纱布封口，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌20min。取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取5mL杜氏藻藻液接种在无菌培养基中，轻轻摇匀，封好纱布。将培养液置于光照培养箱中，光照强度10000lux，培养温度30℃，每日光照24h，静止培养，每天轻摇1～3次，每次10～20s。
取处于指数生长期的杜氏藻(OD630值为0.545)，均匀涂在琼脂培养基上(所用的杜氏藻琼脂培养基的NaCl浓度提高至2.5mol/L，每个平皿涂100μL藻液)。将涂好的平皿置于超净工作台中30W紫外灯下14cm处，照射100s进行诱变。关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好，在30℃暗培养60h。
将暗培养好后的培养皿用封口膜封好，置于光照培养箱中倒扣培养，光照强度10000lux，培养温度30℃，每日光照24h，静止培养20天。
挑选琼脂培养基上生长出的单藻落，分别接种到装有4mL培养液的15mL小玻璃试管，斜放于培养箱中，光照强度10000lux，30℃全天光照，静止培养10天，每天轻摇1～3次，每次10～20s。
将小试管中成活的突变株藻液转移到装有20mL培养液的50mL锥形瓶，锥形瓶应以8层纱布封口，光照强度10000lux，30℃全天光照，静止培养10天，每天轻摇1～3次。
5000rpm离心上述藻液12min，弃培养液，收集杜氏藻，烘干。加入4mL的无水乙醚充分震荡，静置0.5h，离心去上清，重复1次。干燥，称重。综合分析小剂量乙醚抽提的结果和藻株生长情况，初步筛选出总脂含量较高而其生长良好的突变株。扩大培养该突变株于装有3L培养液的10L光生物反应器中，通入空气搅拌。光照强度10000lux，30℃全天光照，静止培养10天，每天用玻棒搅拌1～3次。
将藻液倒入1L的离心管，4000rpm离心8min，去上清，再注入300mL的NaCl溶液(0.3mol/L)荡洗，再次4000rpm离心8min，去上清。将收集的鲜藻转移到坩埚内，80℃烘箱中烘制成藻粉，冷冻保存。
按照脂类检测的索氏提取法测定藻粉中的总脂含量(所用干藻粉约2g)，比较所得的结果，获得1株高脂杜氏藻突变株。以氯仿替换乙醚抽提各藻粉中的脂类，进一步检验上述检出的高脂杜氏藻的脂类含量，最终确定为高脂杜氏藻，命名为巴氏杜氏藻HL-2(Dunaliellabardawil var.HL-2)，简称HL-2(参见表2)。
用40条10聚寡核苷酸引物对高脂杜氏藻突变株和原出发株的总DNA进行PCR扩增。扩增反应的参数与实施例1相同。反应结束后取15μL扩增产物进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳，在凝胶成像系统中扫描并记录电泳图像。统计和计算突变藻株和原出发株之间的遗传相似性系数I的方法与实施例1相同。实验结果，巴氏杜氏藻HL-2与原出发株的遗传相似性系数为0.718，符合种内突变株的遗传相似性范畴。
实施例3：
与实施例1类似，其区别在于：
将人工海水培养液分装在200mL的锥形瓶中，每瓶装量40mL，用棉花塞封口，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15min。取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取3mL杜氏藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，塞好棉花塞。将培养液置于光照培养箱中，光照强度15000lux，培养温度25℃，每日光照12h，黑暗12h，静止培养，每天轻摇1～3次，每次10～20s。
取处于指数生长期的杜氏藻藻液(OD630值为0.485)1mL，直接注入无菌平皿内。将平皿置于超净工作台中30W紫外灯下13cm处，照射60s进行诱变。关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好，在25℃暗培养48h。
暗培养后分别取100μL诱变藻液涂布在杜氏藻琼脂(1％)培养基上，各培养皿用封口膜封好，置于光照培养箱中倒扣培养，光照强度15000lux，培养温度25℃，每日光照12h，黑暗12h，静止培养25天。
挑选琼脂培养基上长出的单藻落，分别接种到装有6mL培养液的试管中。试管侧放培养箱中，光照强度15000lux，25℃每日光照12h，黑暗12h，静止培养20天，每天轻摇1～3次，每次10～20s。
将试管中成活的突变株藻液转移到装有25mL培养液的50mL锥形瓶，锥形瓶应塞上棉花塞，光照强度15000lux，25℃每日光照12h，黑暗12h，静止培养20天，每天轻摇1～3次。
取3mL上述小量扩大培养的藻液3000rpm离心15min，弃培养液，收集杜氏藻，烘干。加入3mL的无水乙醚充分震荡，静置1h，离心去上清，重复1次。干燥，称重。综合分析小剂量乙醚抽提的结果和藻株生长情况，初步筛选出总脂含量较高而其生长良好的突变株。扩大培养该突变株于装有2.5L培养液的5L敞口玻璃瓶中，用小型充气泵打气。光照强度15000lux，25℃每日光照12h，黑暗12h，培养18天。
将藻液倒入1L的离心管，4000rpm离心12min，去上清，再注入300mL的NaCl溶液(0.3mol/L)荡洗，4000rpm离心12min，去上清。将收集的藻体转移到坩埚内，置于烘箱内，70℃烘制成藻粉，冷冻保存。
精确称取上述干藻粉2.530g，按照脂类检测的索氏提取法测定其总脂含量。抽提时间8h。将本结果与初筛数据进行比较，选出总脂含量高于原出发株的藻株，即获得杜氏藻高脂突变株；另外称取该藻质量相当的干藻粉(2.473g)，以氯仿替换乙醚再一次抽提藻粉中的脂类，进一步检验上述杜氏藻突变株的脂类含量，最终确定为高脂杜氏藻，命名为巴氏杜氏藻HL-3(Dunaliella bardawil var.HL-3)，简称HL-3(参见表2)。
用30条10聚寡核苷酸引物对高脂杜氏藻突变株和原出发株的总DNA进行PCR扩增。扩增反应的参数与实施例1相同。反应结束后取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳，在凝胶成像系统中扫描并记录电泳图像。统计和计算突变藻株和原出发株之间的遗传相似性系数I的方法与实施例1相同。实验结果，巴氏杜氏藻HL-3与原出发株的遗传相似性系数为0.838，符合种内突变株的遗传相似性范畴。
实施例4：
与实施例1类似，其区别在于取处于指数生长期的杜氏藻藻液(OD630值为0.589)5mL，直接注入无菌平皿内。将平皿置于超净工作台中30W紫外灯下10cm处，照射80s进行诱变。经系列培养、小剂量乙醚提取初筛、氯仿提取复筛和RAPD检测，最终确定为高脂杜氏藻，命名为巴氏杜氏藻HL-4(Dunaliella bardawil var.HL-4)，简称HL-4(参见表2)。
实施例5：
与实施例1类似，其区别在于取处于指数生长期的杜氏藻藻液(OD630值为0.712)80μL，涂抹在含NaCl2.0mol/L的杜氏藻琼脂平皿上。将平皿置于超净工作台中30W紫外灯下17cm处，照射90s进行诱变。经系列培养、小剂量乙醚提取初筛、氯仿提取复筛和RAPD检测，最终确定为高脂杜氏藻，命名为巴氏杜氏藻HL-5(Dunaliella bardawil var.HL-5)，简称HL-5(参见表2)。
实施例6：
与实施例1类似，其区别在于取处于指数生长期的杜氏藻藻液(OD630值为0.774)90μL，涂抹在含NaCl 3.0mol/L的杜氏藻琼脂平皿上。将平皿置于超净工作台中30W紫外灯下16cm处，照射75s进行诱变。经系列培养、小剂量乙醚提取初筛、氯仿提取复筛和RAPD检测，最终确定为高脂杜氏藻，命名为巴氏杜氏藻HL-6(Dunaliella bardawil var.HL-6)，简称HL-6(参见表2)。
Claims (10)
1.高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于高脂杜氏藻为巴氏杜氏藻HL(Dunaliellabardawil var.HL)，已于2007年06月13日由中国典型培养物保藏中心登记入册，保藏编号为CCTCC NO：M207081；包括以下步骤：
1)配制培养液；
2)将培养液分装封口；
3)把封装好的培养液灭菌；
4)取出灭菌过的培养液，冷却至室温，接种杜氏藻，得杜氏藻藻液；
5)将杜氏藻藻液置于光照培养箱中培养；
6)每1～3天取杜氏藻藻液测定OD630值，绘制其生长曲线；
7)将处于指数生长期的杜氏藻原出发株，涂在琼脂人工海水培养基上，置超净工作台中紫外灯下照射进行诱变后，于无光暗处培养；
9)按照步骤5培养10～25天；
9)挑取诱变处理的20～100个单藻落于装有2～6mL培养液的试管中，按照步骤5培养5～20天；
10)将试管中的杜氏藻培养液转入装有15～30mL培养液的50mL锥形瓶，锥形瓶应塞上棉花塞或封好纱布，培养10～20天；
11)离心弃培养液，收集杜氏藻鲜藻，烘干，加入2～4mL的无水乙醚进行抽提，烘干乙醚提取物并称重，选出比杜氏藻原出发株脂类含量高，通过显微镜观察藻和测定藻液的OD630值，能正常生长的突变藻株；
12)将步骤11筛选出的突变藻株以及杜氏藻原出发株接种于装有2～3L培养液的敞口瓶或光生物反应器中，按步骤5培养10～20天；
14)离心收集藻细胞，烘制成藻粉，冷冻保存；
14)按照通行的索氏脂类检测法测定步骤11第二次扩大培养所得藻粉的总脂含量，即复筛，比较步骤11筛选和复筛所得的结果，确定总脂含量高于杜氏藻原出发株的突变藻株；
15)以氯仿替换乙醚抽提复筛所得高脂突变株藻粉中的脂类，比较所得氯仿沥青质A的含量，验证所得突变藻株为高脂杜氏藻突变株；
16)对高脂杜氏藻突变株进行10聚寡核苷酸引物随机扩增多态性分析，统计扩增出的总条带和共有条带数，计算高脂杜氏藻突变株和原出发株之间的遗传相似性系数。
2.如权利要求1所述的高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于培养液的组成及其含量如表1，在配制培养液时，将各成份事先配成50～1000倍的母液，使用时再按需稀释配制成培养液。
表1培养基的组成及其含量
3.如权利要求1所述的高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于将培养液分装封口时，将培养液分装在100～250mL的锥形瓶中，每瓶装量20～50mL，棉花塞塞紧或用8层纱布封口，包上牛皮纸；把封装好的培养液灭菌时，把包装好的培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15～20min；取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取1～5mL杜氏藻藻液接种在无菌培养基中，轻轻摇匀，塞上棉花塞或封好纱布。
4.如权利要求1所述的高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于将培养液置于光照培养箱中培养时，将培养液置于光照培养箱中，光照强度3000～15000lux，培养温度15～32℃，每日光照时间12～24h，旋转摇动，90～120rpm；或静止培养，每天轻摇1～3次，每次10～20s；所述的取杜氏藻培养液测定OD630值，可取出3.5mL藻液，以人工海水培养液作为空白对照，用分光光度计测定取样藻液的OD630，重复计数3次，取平均值。
5.如权利要求1所述的高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于在步骤7中，取处于指数生长期的杜氏藻，OD630值为0.4～0.8，均匀涂在含琼脂0.7％～1.0％的杜氏藻培养基上，每个平皿50～100μL藻液；或将原培养基中的NaCl浓度提高到2.0～3.0mol/L，再制成琼脂平皿；或直接在无菌平皿内注入1～5mL处于指数生长期的杜氏藻，将备好的平皿置于超净工作台中30W紫外灯下10～17cm处，分别照射60～100s进行诱变，关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好，在15～32℃暗培养48～72h，琼脂培养基要倒扣培养防止水珠产生，所用超净工作台应事先擦净并以紫外线杀菌15～20min。
6.如权利要求1所述的高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于在步骤8中，按照步骤5培养10～25天，将培养皿应用封口膜封好防止培养基水分逃逸，静置培养10～25天，水分逃逸会导致琼脂培养基中盐份析出，藻落生长不好。
7.如权利要求1所述的高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于在步骤11)中，所述的小剂量乙醚抽提法过程如下：1)准确称取已干燥的离心管A，质量W1；2)取3～5mL上述藻液于离心管A中，3000～5000rpm离心8～15min，弃上清，收集藻细胞；将离心管A置60℃烘干后称重，质量W2；3)往离心管A中加入2mL的无水乙醚，充分震荡，静置0.5～1.5h，离心去上清，重复1次，观察上清是否是无色，如果还有颜色，再重复1次；4)将离心管A和管内的藻残渣烘干后称重，质量W3；5)按照公式，藻株的总脂含量＝(W2-W3)/(W2-W1)×100％，分别取样，通过显微镜观察藻细胞形态和游动情况，同时用分光光度计测定取样藻液的OD630，初步判断出不同藻株的生长情况，放弃生理机能受损较为严重、不能正常生长的藻株；综合评价小剂量乙醚抽提法所得数据的高低以及藻株的生长情况，初步筛选出总脂含量较高而且生长良好的藻株。
8.如权利要求1所述的高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于在步骤13)中，离心收集藻细胞，烘制成藻粉，冷冻保存是以3000～4000r/min，8～15min离心收集藻细胞，去上清；加入200～300mL，0.3～0.5mol/L的NaCl溶液清洗澡沉淀一次，离心收集，50～80℃烘制成藻粉，冷冻保存。
9.如权利要求1所述的高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于在步骤15)中，以氯仿替换乙醚抽提各藻粉中的脂类，进一步检测上述检出的高脂杜氏藻的脂类含量，最终确定脂类含量比原出发株高的杜氏藻突变株。
10.如权利要求1所述的高脂杜氏藻的诱变选育方法，其特征在于在步骤16)中，再用20～40条10聚寡核苷酸引物对高脂杜氏藻突变株和原出发株的总DNA进行PCR扩增，扩增反应的参数如下：94℃解链1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，反应经25个循环后72℃保温7min，反应结束后取5～15μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中扫描并记录电泳图像，统计扩增出的总条带和两者之间的共有条带数，计算突变藻株和原出发株之间的遗传相似性系数I，I＝2Nij/(Ni+Nj)，式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后显示的总带数，Nij为两样品共有的显示带数。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080507 |