CN103352035A - 高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的复合诱变育种方法 - Google Patents
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Abstract
一种高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的复合诱变育种方法，属于高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的诱变育种方法。醋酸杆菌经斜面培养基活化、基础培养基液体摇床培养获得菌悬液；将稀释的菌悬液置于无菌培养皿中于30W紫外灯下辐射诱变1-3min；紫外诱变后的菌悬液涂布于含有0.01-0.02%的氯化锂诱变培养基上；选出氯化锂诱变培养基上透明圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株，经斜面培养，发酵培养基培养后，收集菌体，破碎细胞，采用分光光度法测定上清液中乙醇脱氢酶活力。优点：1、采用紫外线-氯化锂复合诱变的方法获得高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌，操作程序简单，所用仪器设备少，成本低。2、突变率高，收效显著，获得的高产醋酸杆菌的遗传性状稳定。
Description
技术领域
本发明属于一种高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的诱变育种方法，具体是涉及一种高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的紫外线-氯化锂复合诱变育种方法。
背景技术
乙醇脱氢酶（ADH）属于氧化还原酶第一亚类，作用于—CHOH基团，是以NAD+、NADP+或PQQ为辅酶，催化伯醇和醛之间可逆反应的一种含锌金属酶，已经广泛应用于化工、医药和食品等工业领域。此酶在人和哺乳动物的肝脏、植物组织及微生物细胞中都有发现。目前，商品的乙醇脱氢酶多来源于动物肝脏，提取纯化工业也比较成熟，但其资源毕竟有限并且价格昂贵，远远不能满足市场的需要。
微生物发酵的生产周期短，培养基价格低廉，酶制剂可以实现大规模、低成本的工业化生产，因此从微生物细胞中提取ADH并制成酶制剂具有广阔的市场前景。醋酸杆菌中含有大量的乙醇脱氢酶，醋酸杆菌品质的好坏直接影响到产品的产量和质量，因而应对菌种进行改良，提高其生产乙醇脱氢酶的能力，为微生物来源的乙醇脱氢酶实现工业化生产奠定一定基础。
诱变育种是利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法。诱变剂包括物理诱变剂如：各种射线，紫外线、X射线、γ射线等；化学诱变剂如：烷化剂(包括EMS、EI、NEU等)、天然碱基类似物、氯化锂、亚硝基化合物、吖啶等嵌入染料。诱变剂的处理方式，可分为单因子处理和复合因子处理。目前对于高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的选育多采用单一因子处理，即采用单一的诱变剂处理，其突变率比复合因子要低，而且突变类型也较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的复合诱变育种方法，解决目前采用单一的诱变剂处理，其突变率比复合因子要低，而且突变类型也较少的问题。
本发明的技术方案如下：该诱变育种方法的醋酸杆菌经斜面培养基活化、基础培养基液体摇床培养获得菌悬液；将稀释的菌悬液置于无菌培养皿中于30W紫外灯下辐射诱变1-3min；紫外诱变后的菌悬液涂布于含有0.01-0.02%的氯化锂诱变培养基上；选出氯化锂诱变培养基上透明圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株，经斜面培养，发酵培养基培养后，收集菌体，破碎细胞，采用分光光度法测定上清液中乙醇脱氢酶活力。
具体步骤如下：
（1）将待诱变的醋酸杆菌接种于斜面培养基上，置于32℃恒温培养箱中培养48-72 h，后取斜面活化的醋酸杆菌2-3环接入基础培养基中，置于120 r/min、32℃恒温摇床中培养24 h得菌悬液；
（2）紫外诱变处理前，开启超净工作台紫外灯，预热20min，使光波稳定；取稀释至10-3-10-4的菌悬液10mL置于灭好菌的直径为90mm的培养皿中，培养皿放置在磁力搅拌器的载物台上，打开皿盖，在紫外灯垂直下方20 cm处进行紫外照射，照射时间为2-3min；
（3）取紫外诱变后的菌悬液0.1mL涂布于含有0.01-0.02%的氯化锂诱变培养基上，用黑色塑料袋包裹，放入32℃培养箱中培养72 h；
（4）挑选长势良好、透明圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株于斜面培养基，32℃恒温培养箱中培养72 h，接种2-3环入发酵培养基中，置于120 r/min、32℃恒温摇床中培养72h；
（5）取培养液离心，弃上清液得到菌体沉淀，用蒸馏水洗涤2～3次；每克湿菌体加入3mL 20mmoI/L的 Tris-HCl缓冲溶液、2mL 10% 的TritonX-100溶液，置室温下反应10min，离心，收集上清液，采用分光光度法测定乙醇脱氢酶的活力，筛选得到高产乙醇脱氢酶的菌株；Tris-HCl缓冲溶液的pH=8.0；
（6）高产菌株放甘油保藏管中，-20℃保藏，一年传代一次。
所述的斜面培养基为：葡萄糖1g，酵母膏1g，琼脂2g，CaCO3 1g，无水乙醇3mL，水100mL，pH 4.5；所述的基础培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，无水乙醇3 mL，水100mL，pH 4.5；所述的发酵培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，无水乙醇4 mL，水100mL，pH 6.0；所述的氯化锂诱变培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，琼脂2g，CaCO3 2g，氯化锂0.01-0.02g，无水乙醇3 mL，水100mL，pH 4.5。
有益效果，由于采用了上述方案，采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂氯化锂这两种诱变因子共同诱发菌体突变，紫外线在DNA分子之间形成嘧啶二聚体，氯化锂对碱基产生氧化作用，改变碱基的结构或引起碱基链的断裂；通过这两种作用机制，导致菌株较大的突变；解决了目前采用单一的诱变剂处理，其突变率比复合因子要低，而且突变类型也较少的问题，达到了本发明的目的。
优点：1、采用紫外线-氯化锂复合诱变的方法获得高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌，开拓了高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的诱变育种新途径；操作程序简单，所用仪器设备少，成本低，是一种易于推广的醋酸杆菌的育种方法。2、突变率高，收效显著，获得的高产醋酸杆菌的遗传性状稳定。
具体实施方式
实施例1：将待诱变的醋酸杆菌接种于斜面培养基上，置于32℃恒温培养箱中培养72 h后，取斜面活化的醋酸杆菌2环接入基础培养基中，置于120 r/min、32℃恒温摇床中培养24 h得菌悬液。紫外诱变处理前，开启超净工作台30W的紫外灯，预热20min，使光波稳定。取稀释至10-3的菌悬液10mL置于灭好菌的直径为90mm的培养皿中，培养皿放置在磁力搅拌器的载物台上，打开皿盖，在紫外灯垂直下方20cm处进行紫外照射，照射时间为3min。取紫外诱变后的菌悬液0.1mL涂布于含有0.01% 的氯化锂诱变培养基上，用黑色塑料袋包裹，放入32℃培养箱中培养72 h。挑选长势良好、透明圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株于斜面培养基，于32℃恒温培养箱中培养72 h，接种2环入发酵培养基中，置于120 r/min、32℃恒温摇床中培养72h。取培养液于6000 r/min离心5 min，弃上清液得到菌体沉淀，用蒸馏水洗涤3次，每克湿菌体加入3mL 20mmoI/L的 Tris-HCl缓冲溶液，2mL 10% 的TritonX-100溶液，置室温下反应10min，离心，收集上清液，采用分光光度法测定乙醇脱氢酶的活力；Tris-HCl缓冲溶液的pH=8.0。经测定，诱变后醋酸杆菌的乙醇脱氢酶活比原始菌株提高34.75％，且传代5次，乙醇脱氢酶活基本保持稳定。诱变菌株用甘油管保藏。
所述的斜面培养基为：葡萄糖1g，酵母膏1g，琼脂2g，CaCO3 1g，无水乙醇3mL，水100mL，pH 4.5；基础培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，无水乙醇3 mL，水100mL，pH 4.5；所述的发酵培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，无水乙醇4 mL，水100mL，pH 6.0；氯化锂诱变培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，琼脂2g，CaCO3 2g，氯化锂0.01-0.02g，无水乙醇3 mL，水100mL，pH 4.5。
实施例2：将待诱变的醋酸杆菌接种于斜面培养基上，置于32℃恒温培养箱中培养48 h后，取斜面活化的醋酸杆菌3环接入基础培养基中，置于120 r/min、32℃恒温摇床中培养24 h得菌悬液。紫外诱变处理前，开启超净工作台30W的紫外灯，预热20min，使光波稳定。取稀释至10-4的菌悬液10mL置于灭好菌的直径为90mm的培养皿中，培养皿放置在磁力搅拌器的载物台上，打开皿盖，在紫外灯垂直下方20cm处进行紫外照射，照射时间为2min。取紫外诱变后的菌悬液0.1mL涂布于含有0.02% 的氯化锂诱变培养基上，用黑色塑料袋包裹，放入32℃培养箱中培养72 h。挑选长势良好、透明圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株于斜面培养基，于32℃恒温培养箱中培养72h，接种3环入发酵培养基中，置于120 r/min、32℃恒温摇床中培养72h。取培养液于6000 r/min离心5 min，弃上清液得到菌体沉淀，用蒸馏水洗涤2次，每克湿菌体加入3mL 20mmoI/L的 Tris-HCl缓冲溶液，2mL 10% 的TritonX-100溶液，置室温下反应10min，离心，收集上清液，测定乙醇脱氢酶的活力，Tris-HCl缓冲溶液的pH=8.0。经测定，诱变后醋酸杆菌的乙醇脱氢酶活比原始菌株提高32.54 %，且传代5次，乙醇脱氢酶活基本保持稳定。诱变菌株用甘油管保藏。
其他与实施例1同。
Claims (3)
1.一种高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的复合诱变育种方法，其特征在于：醋酸杆菌经斜面培养基活化、基础培养基液体摇床培养获得菌悬液；将稀释的菌悬液置于无菌培养皿中于30W紫外灯下辐射诱变1-3min；紫外诱变后的菌悬液涂布于含有0.01-0.02%的氯化锂诱变培养基上；选出氯化锂诱变培养基上透明圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株，经斜面培养，发酵培养基培养后，收集菌体，破碎细胞，采用分光光度法测定上清液中乙醇脱氢酶活力。
2.根据权利要求1所述的高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的复合诱变育种方法，其特征在于：具体育种方法按如下步骤进行：
（1）将待诱变的醋酸杆菌接种于斜面培养基上，置于32℃恒温培养箱中培养48-72 h，取斜面活化的醋酸杆菌2-3环接入基础培养基中，置于120 r/min、32℃恒温摇床中培养24 h得菌悬液；
（2）紫外诱变处理前，开启超净工作台紫外灯，预热20min，使光波稳定；取稀释至10-3-10-4的菌悬液10mL置于灭好菌的直径为90mm的培养皿中，培养皿放置在磁力搅拌器的载物台上，打开皿盖，在紫外灯垂直下方20 cm处进行紫外照射，照射时间为2-3min；
（3）取紫外诱变后的菌悬液0.1mL涂布于含有0.01-0.02%的氯化锂诱变培养基上，用黑色塑料袋包裹，放入32℃培养箱中培养72 h；
（4）挑选长势良好、透明圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株于斜面培养基，于32℃恒温培养箱中培养72 h，接种2-3环入发酵培养基中，置于120 r/min、32℃恒温摇床中培养72h；
（5）取培养液离心，弃上清液得到菌体沉淀，用蒸馏水洗涤2～3次；每克湿菌体加入3mL 20mmoI/L的 Tris-HCl缓冲溶液、2mL 10% 的TritonX-100溶液，置室温下反应10min，离心，收集上清液，采用分光光度法测定乙醇脱氢酶的活力，筛选得到高产乙醇脱氢酶的菌株，Tris-HCl缓冲溶液的pH=8.0。
3.根据权利要求1所述的高产乙醇脱氢酶醋酸杆菌的复合诱变育种方法，其特征在于：所述的斜面培养基为：葡萄糖1g，酵母膏1g，琼脂2g，CaCO3 1g，无水乙醇3mL，水100mL，pH 4.5；所述的基础培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，无水乙醇3 mL，水100mL，pH 4.5；所述的发酵培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，无水乙醇4 mL，水100mL，pH 6.0；所述的氯化锂诱变培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，琼脂2g，CaCO3 2g，氯化锂0.01-0.02g，无水乙醇3 mL，水100mL，pH 4.5。
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