CN101168728A

CN101168728A - 一株产苝醌化合物的竹黄菌株

Info

Publication number: CN101168728A
Application number: CNA2007101325104A
Authority: CN
Inventors: 蔡宇杰; 廖祥儒; 梁晓辉; 金大勇; 王蕾; 丁彦蕊; 孟强; 张大兵
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangsu bamboo Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2007-09-30
Filing date: 2007-09-30
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2027-09-30
Also published as: CN100526451C

Abstract

一株产苝醌化合物的竹黄菌株，属于生物工程技术领域。本发明菌株分类命名为竹黄菌(Shiraia sp.)SUPER－H168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 207104。该菌株由通过对生长于江苏无锡马山短蕙竹上的竹黄子实体进行分离筛选，得到了性状稳定，产苝醌类化合物的竹黄菌菌株，可通过固态或液态发酵生产苝醌化合物。

Description

一株产苝醌化合物的竹黄菌株

技术领域

一株产苝醌化合物的竹黄菌株，属于生物工程技术领域。本发明涉及一种高产苝醌化合物的竹黄菌株，该菌株对于苝醌化合物的工业化生产有着重要意义。

背景技术

在自然界中不同种属的许多真菌都能产生具有苝醌骨架的代谢产物(李聪，谢金伦.肉座菌科三种药用真菌的化学成分分析比较.中草药.2000，31(4)：250.)，而近年来研究工作多集中在竹红菌素，尾孢素和金丝桃蒽酮等的光动力学和立体化学上。其中竹红菌素具有稳定性好，口服无明显副作用，代谢快，溶于众多有机溶剂而不溶于水等一系列特点。作为一种重要的天然光敏色素，竹红菌素在医药和食品领域等有着巨大的潜在应用价值。在野生的竹黄菌和竹红菌等子实体中均含有竹红菌素。竹红菌素包括如下结构式所示的竹红菌甲素和竹红菌乙素。

专利CN01135155.1介绍了一种采用竹红菌Hypocrella bambusae产苝醌类化合物的方法。刘为忠(《苝醌类化合物产生菌固态发酵工艺研究》，云南大学学报，2000，225(5)389-391)和李聪(《一株产苝醌类化合物的真菌成分分析》，菌物系统，2000，19(1)：122-127)等报导了产苝醌类化合物的真菌。

陈佳佳(《竹黄无性株的液态发酵工艺研究》，中药材，2005，(12).1049-1051)、石贵阳(《竹黄菌液体培养条件下生成竹红菌素的研究》药物生物技术，2004，(5)，299-301)、李达旭(《一种竹寄生真菌的分离鉴定及其有效成分发酵的初步研究》四川大学学报(自然科学版)，2003，(1)，139-143)和发明人(《竹黄菌固态发酵竹红菌素条件的研究》生物技术，2004，(4)，46-47)也曾采用野生竹黄菌进行了竹红菌素的发酵研究。

但已报导的菌种竹红菌素产量低而不稳定，这些报导均未开展后续的进一步的研究，无法应用于工业化的生产。本发明经过从天然的竹黄菌子实体中筛选得到了性状稳定，产苝醌类化合物的竹黄菌新菌株Shiraia sp.SUPER-H168。

发明内容

本发明的目的是提供一株产苝醌化合物的竹黄菌株，得到了性状稳定，产苝醌类化合物的竹黄菌菌株，可通过固态或液态发酵生产苝醌化合物。

本发明的技术方案：一种产苝醌化合物的竹黄菌株，其分类命名为竹黄菌(Shiraia sp.)SUPER-H168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 207104。

该菌株的分子生物学18S rDNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

该菌株的分子生物学ITS 5.8S rDNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

该菌株经过生物学手段改造后的18S rDNA和ITS 5.8S rDNA与出发菌株CCTCC M 207104同源性达95％以上的菌株，仍可产竹红菌素，仍视为该菌株的权利范围。

该菌株其主要代谢产物为竹红菌甲素和竹红菌乙素。

该菌株还产生Shiraia sp.SUPER-H168代谢物母核的苝醌化合物。

该菌株可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清、木薯、玉米、甜菜、纤维素或大米。

该菌株可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆或豆饼粉。

清明前后采集江苏无锡马山地区着生于短蕙竹上的竹黄子实体。要求个体肥大，表面呈浅粉红色，没有龟裂、无胶质分泌的幼嫩子实体作为分离材料。将大小合适的竹黄子实体首先用无菌水洗涤干净，然后用预先配置好的75％浓度的酒精溶液浸泡1-2分钟，待酒精挥发干后，将竹黄子实体进行表面灭菌，然后用无菌的解剖刀将其内部组织切割成绿豆大小的颗粒植于分离琼脂平板表面，在无菌条件下将其轻轻压入琼脂中培养。经培养后真菌以植入点为中心向四周扩散生长而分离。分离用培养基为：马铃薯200g、葡萄糖10g、琼脂20g、水1000mL、青霉素20mg，竹叶汁20g，pH值自然。26℃恒温，培养4-5天。

初筛后发现，产竹红菌素的能力相差很大。选择菌落色泽较深的菌落进行复筛培养。最终得到产竹红菌素能力最强的竹黄新菌株Shiraia sp.SUPER-H168。

本发明涉及到的菌种有如下特征

1.竹黄菌(Shiraia sp.)SUPER-H168培养条件

该菌种的培养常规条件是好气培养。用于培养菌种的糖质原料碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清、木薯、玉米、甜菜、纤维素或大米等材料。培养用氮源可以是无机铵盐、无机硝酸盐或蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆、豆饼粉等有机氮源。该菌种的生长温度范围为15℃-32℃，最佳生长温度为26℃-28℃。pH范围为5-8，最佳pH范围为5.5-7.3。在菌种培养过程中还可添加磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸钙、氯化钠等无机盐类。培养后竹红菌素产量可达20mg/g(干菌体)

2.竹黄菌(Shiraia sp.)SUPER-H168的形态描述

平板培养形态：Shiraia sp.SUPER-H168在PDA培养基上生长良好，培养4d，菌落呈圆形，干燥，疏松，边缘较平整，直径平均为3.8cm；气生菌丝白色，绒毛状，中间的气生菌丝较边缘发达；菌落基部培养基呈红色，外缘白色；菌落边缘较平整；背面培养基中间部分呈红色，系菌体分泌的色素。色素在培养基上呈暗红色，可形成环状同心圆(有时不形成同心圆)，中间颜色较深，边缘颜色较浅。色素圈的直径约占菌落直径的1/3～2/3。显微镜下可见菌丝有隔，间距不等，呈管状，直径3～4.5μm，有分支。孢子约1μm左右。

3.竹黄菌新菌株Shiraia sp.SUPER-H168的分子生物学特征见序列表。

4.竹黄菌(Shiraia sp.)SUPER-H168的产物说明

Shiraia sp.SUPER-H168的主要代谢产物为以如下所示的三种母核为基本结构的苝醌类化合物。其中主要以竹红菌甲素和竹红菌乙素为主。同时该菌可产生以此三种母核结构进行基团修饰的多种苝醌类化合物。可在2，3，6，7，11，12，17，18，26，28，29，30，32，36，37，45，46，53，55，56，58，62，63，71，72位置修饰上各种化学基团，如CH₃，OCH₃，COCH3，CH(OH)CH3，CHO，OH，H等，这些化学基团之间还可以进一步形成更为复杂的结构。随着发酵条件的不同，各苝醌类化合物的产量的比例会有所不同。

Shiraia sp.SUPER-H168代谢物母核

5.竹黄菌(Shiraia sp.)SUPER-H1 68的生物工程改造后的性质该菌经500-800Gy⁶⁰Co辐射、紫外诱变、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NG)等常规诱变的手段处理后，与出发菌株18SrDNA相似度达95％或ITS 5.8SrDNA相似度达95％以上的菌株仍有良好的产竹红菌素的能力。经原生质体融合得到的菌株同样具有很好的产苝醌类化合物的能力。

6可采用常规的固态和液态发酵方法，利用上述菌种产生苝醌类化合物。培养基可用含有不同碳源、氮源、无机离子等普通培养基。

培养基中也添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物。一般情况，这些营养物存在于上述的天然营养源中。

该菌株固态发酵过程中，1天后开始产苝醌类化合物，10天后产量达最高峰。液态发酵过程中，1天后开始产苝醌类化合物，3天后产量达最高峰。

本发明的有益效果：Shiraia sp.SUPER-H168的主要代谢产物为以如下所示的三种母核为基本结构的苝醌类化合物。其中主要以竹红菌甲素和竹红菌乙素为主。同时该菌可产生以此三种母核结构进行基团修饰的多种苝醌类化合物。该菌经500-800Gy⁶⁰Co辐射、紫外诱变、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NG)等常规诱变的手段处理后，与出发菌株18S rDNA相似度达95％或ITS 5.8S rDNA相似度达95％以上的菌株仍有良好的产竹红菌素的能力。经原生质体融合得到的菌株同样具有很好的产苝醌类化合物的能力。

该菌株固态发酵过程中，1天后开始产苝醌类化合物，10天后产量达最高峰。液态发酵过程中，1天后开始产苝醌类化合物，3天后产量达最高峰。生物材料祥品保藏

竹黄菌(Shiraia sp.)SUPER-H168，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为CCTCC M 207104，保藏日期为2007年7月12日。

具体实施方式

实施例1

发酵菌株为竹黄菌(Shiraia sp.)SUPER-H168，采用固态发酵，培养基组成(重量％)：60目的玉米粉68.7，麸皮10，米糠20，葡萄糖1，KH₂PO₄0.25，MgSO₄7H₂O0.05；加水拌料润湿，装入广口瓶中，0.1MPa灭菌45-60min，冷却后接入液体种子拌均。发酵温度30℃，pH6，10天发酵结束后，苝醌类化合物产量达0.8％左右，其中竹红菌甲素为40％，竹红菌乙素为55％。

实施例2

发酵菌株为竹黄菌(Shiraiasp.)SUPER-H168，采用液态发酵，采用标准察氏培养基，发酵温度28℃，发酵过程溶氧量为25％。3天发酵结束后，苝醌类化合物产量达0.07％左右，其中竹红菌甲素为48％，竹红菌乙素为43％。

序列表

SEQ ID NO：1：

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataag caattatacc 60

gtgaaactgc gaatggctca ttaaatcagt tatcgtttat ttgatagtac cttactactt 120

ggataaccgt ggtaattcta gagctaatac atgcttacaa ccccgacttc ggaaggggtg 180

tatttattag ataaaaaacc aacgcccttc ggggcttctt ggtgattcat gataacttta 240

cggatcgcat ggccttgcgc cggcgacggt tcattcaaat ttctgcccta tcaactttcg 300

atggtaaggt attggcttac catggtttca acgggtaacg gggaattagg gttcgattcc 360

ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac 420

ccaatcccaa tacggggagg tagtgacaat aaatactgat acagggctct tttgggtctt 480

gtaattggaa tgagtacaat ttaaacctct taacgaggaa caattggagg gcaagtctgg 540

tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt gcagttaaaa 600

agctcgtagt tgaaccttgg gtctggctgg caggtccgcc tcaccgcgtg tacttgtccg 660

gccgggcctt ccttctggag aacctcatgc ccttcactgg gcgtgttggg gaccaggact 720

tttactttga aaaaattaga gtgttcaaag caggcctttg ctcgaatacg ttagcatgga 780

ataatagaat aggacgtgcg gtcctatttt gttggtttct aggaccgccg taatgattaa 840

tagggacagt cgggggcatc agtattcaat tgtcagaggt gaaattcttg gatttattga 900

agactaacta ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcagtg aacgaaagtt 960

aggggatcga agacgatcag ataccgtcgt agtcttaacc gtaaactatg ccgactaggg 1020

atcgggcgat gttatttttc tgactcgctc ggcaccttac gagaaatcaaagtttttggg 1080

ttctgggggg agtatggtcg caaggctgaa acttaaagaa attgacggaa gggcaccacc 1140

aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc aacacgggga aactcaccag gtccagatga 1200

aataaggatt gacagattga gagctctttc ttgatttttc aggtggtggt gcatggccgt 1260

tcttagttgg tggagtgatt tgtctgctta attgcgataa cgaacgagac cttaacctgc 1320

taaatagcca ggctagcttt ggctggtcgc cggcttctta gagggactat cggctcaagc 1380

cgatggaagt ttgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc 1440

gcgctacact gacagagcca acgagttctt caccttggcc ggaaggtctg ggtaatcttg 1500

ttaaactctg tcgtgctggg gatagagcat tgcaattatt gctcttcaac gaggaatgcc 1560

tagtaagcgc gtgtcatcag catgcgttga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc 1620

gtcgctacta ccgattgaat ggctcagtga ggcgtccgga ctggcttaga gaagttggca 1680

acgactactt tgagttggaa agttcgtcaa actcggtcat ttagaggaag taaaagtcgt 1740

aacaaggttt ccgtaggtga acctgcgga 1769

SEQ ID NO： 2：

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attacctagt 60

agtacggggt tatagcaata tagcccccgt ctgcacccat gtttatgcgt actacatgtt 120

tcctcggctg gttctccagc cgataggatc tcttaaactc attgtaattg caatcagcgt 180

ctgaaaaaat caatatttac aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa 240

gaacgcagcg aaatgcgata agtagtgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt 300

tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattcca tggggcatgc ctgttcgagc gtcatttgta 360

ccctcaagct atgcttggtg ttgggtgttt gtcctatcca ttgcgactgg actcgcctta 420

aagatattgg cagccggcat tttggccttg gagcgcagca caatttgcga gtccaagccg 480

gaatactgac gtccagataa gctttttacc acgtttgacc tcggatcagg tagggatacc 540

cgctgaactt aagcatatca ataagcggag ga 572

Claims

1.一株产苝醌化合物的竹黄菌株，其分类命名为竹黄菌(Shiraiasp.)SUPER-H168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M207104。

2.根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于分子生物学18S rDNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

3.根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于分子生物学ITS 5.8S rDNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

4.根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于经过生物学手段改造后18SrDNA和ITS 5.8S rDNA与出发菌株CCTCC M 207104同源性达95％以上的菌株。

5.根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于其主要代谢产物为竹红菌甲素和竹红菌乙素。

6.根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于还产生Shiraia sp.SUPER-H168代谢物母核的苝醌化合物。

7.根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清、木薯、玉米、甜菜、纤维素或大米。

8.根据权利要求1所述的竹黄菌株，其特征在于可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆或豆饼粉。