WO2017209510A1 - 두나리엘라 변이주 및 이를 이용한 색소 생산 방법 - Google Patents

두나리엘라 변이주 및 이를 이용한 색소 생산 방법 Download PDF

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dunaliella
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진언선
김민재
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한양대학교 산학협력단
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    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present invention relates to an alga having a pigment producing ability, a dye composition comprising the alga, and a method for producing the dye.
  • Macular degeneration is a disease that causes visual acuity disorder due to degeneration of the macular tissue, which is located in the center of the inner retina of the eye, and most of the cells are collected in the macula and the image of the object is also the center of the macula. Is in charge of. The most common causes of macular degeneration are age-related macular degeneration and are known to be associated with family history, race, and smoking. Because the macula is responsible for central vision, degeneration occurs in this area, such as decreased vision, central dark spots, and schizophrenia. Macular degeneration is largely divided into non-exudative (dry) and exudative (wet).
  • macular degeneration does not significantly affect visual acuity.
  • the exudative phase which is visible, subretinal hemorrhage, subretinal fluid, or pigmented epithelial detachment, visual acuity develops initially when the location of the lesion is directly under or under the macula.
  • Exudative macular degeneration accounts for about 10-20% of the total macular degeneration, but if left untreated without exudative macular degeneration, visual acuity quickly deteriorates, leading to blindness within two years after diagnosis.
  • Macular pigment is a carotenoid-based oxycarotenoid pigment produced by oxygenation of carotenoids.
  • Xanthophyll examples include lutein or zeaxanthin. Lutein acts as an antioxidant that protects the interior of the eye, which is damaged by the oxygen free radicals that are naturally produced in the body, and kills cancer cells by reducing the growth of blood vessels that supply cancer tumors, breast, colon, and lungs. It is known to have some effects on the prevention of ovarian cancer and skin cancer. Animals cannot produce xanthophyll, and can only obtain it through ingestion of food. These xanthophylls are present with chlorophyll and carotene in the green part of plants, leaves and flowers. Recently, health functional foods for eye health, including xanthophylls, have been in the spotlight.
  • Exemplary marigold flowers are typical sources of zeaxanthin and lutein, and other extracts from higher plants have been studied.
  • the bacteria genetically alter the mechanism of pigment synthesis to produce zeaxanthin and lutein.
  • Research into obtaining these pigments from microalgae has also been conducted.
  • Marigold flower of the conventional raw materials has a disadvantage that it takes a long time to breed the flowers for production, there is a problem that the production cost is high because the production amount is not large compared to the land area for production.
  • the conventional microalgae is a wild type that has not been improved, but the lutein content is constant, but the zeaxanthin content is very low depending on the amount of light.
  • An object of the present invention is to provide a raw material that can replace the xanthophyll used as a raw material of the conventional food or a method that can replace the conventional raw material production method, specifically, xanthophyl production capacity, in particular lutein and zeaxanthin production
  • a composition comprising the same and a method for producing xanthophyll using the same.
  • the present inventors have developed an algae that can solve the insufficient productivity of wild type or existing microalgae by using a variant other than the genetic recombination method which may be a problem in the food industry.
  • the present invention was developed by identifying a mutant strain having a higher yield of macular pigment than a conventional genus of Dunariella, and identifying an optimal pigment production method using the same.
  • the present invention provides an algae of Dunaliella sp. Macular pigment 3 (MP3), KCTC 12990BP.
  • the MP3 algae of the genus Dunariella may have the ability to produce xanthophyll.
  • the MP3 algae of the genus Dunariella are lutein (lutein) and zeaxanthin; And chlorophyll b (chlorophyll b), chlorophyll a (chlorophyll a) and beta-carotene ( ⁇ -carotene) may have the ability to produce one or more pigments selected from the group.
  • the present invention provides a culture of algae ( Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae genus Dunariella.
  • the present invention provides a pigment composition comprising one or more selected from the group consisting of Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP algae, a culture of the algae, dried products thereof and extracts thereof. .
  • the present invention also provides Dunalella spp. MP3 ( Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae, oral administration composition comprising one or more selected from the group consisting of the culture of the algae, dried products and extracts thereof. to provide.
  • Dunalella spp. MP3 Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP
  • oral administration composition comprising one or more selected from the group consisting of the culture of the algae, dried products and extracts thereof. to provide.
  • the present invention Dunaliella spp. MP3 ( Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae (algae), the culture of the algae, its dried products and extracts containing one or more selected from the group consisting of extracts for To provide a composition.
  • Dunaliella spp. MP3 Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP
  • algae algae
  • the culture of the algae its dried products and extracts containing one or more selected from the group consisting of extracts for To provide a composition.
  • the present invention is a food or food additive comprising one or more selected from the group consisting of Dunaliella sp. MP3 ( Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae, the culture of the algae, dried products thereof and extracts thereof To provide a composition.
  • Dunaliella sp. MP3 Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP
  • the present invention provides a method for producing pigments comprising culturing Dunaliella sp. MP3 (Dungaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae.
  • the present invention provides a method of producing a raw material of food or feed comprising culturing Dunaliella sp. MP3 (Dungaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae.
  • the composition of the present invention can be applied as a raw material of food, health functional foods and pharmaceuticals containing zeaxanthin and lutein pigment.
  • seawater considering the physiological characteristics of Dunariella, a photo-inflammatory microalgae, and the geographical characteristics of Korea, which is a three-sided ocean, seawater can be used as a culture medium, which can be expected to reduce costs and related industrial development.
  • 1A is a micrograph of Dunaliella sp. Algae, wild type (WT) mutant of the present invention, Zea 1 (Zea1), and MP3 mutant strain of the mutant strain of the present invention (magnification 1000x).
  • the bar in the picture represents 10 ⁇ m.
  • 1B is a photograph showing the culture state when wild-type algae, Jia 1, and MP3 mutants were the same number of cells (500 ⁇ 10 4 cells / mL).
  • the upper part shows the culture state in agar containing agar, and the lower part shows the culture state in a liquid culture solution.
  • Figure 3 is a graph showing the cell density (Cell Density) increase pattern of wild type Dunariella genus alga, Jia 1, and MP3 mutant strain of the present invention.
  • the horizontal axis represents the incubation time (day)
  • the vertical axis represents the cell density (x10 4 cells / mL)
  • the number represents the processed light intensity ( ⁇ mol photons / m 2 s), respectively.
  • Figure 4a shows the dry weight per 100 x 10 4 cells (g) of wild-type algae, Jia 1, MP3 mutant strains
  • Figure 4b measures the biomass in dry weight (g) per (L) of wild-type algae, Jia 1, MP3 mutant strains One graph.
  • FIG. 5 is an HPLC analysis graph showing pigment profiles of wild type Dunariella genus algae and Jia 1, MP3 mutant strains (1: neoxanthin, 2: violaxanthin, 3: antheraxanthin, 4: lutein, 5: zeaxanthin, 6: chlorophyll b, 7: chlorophyll a, 8: beta-carotene.
  • FIG. 6a shows the amount of zeaxanthin contained in wild type Dunariella algae, Jia 1, and MP3 mutants, which measured the pigment content of the cells harvested on the 2nd day after incubation at 100 ⁇ mol photons / m 2 s.
  • A shows the content of zeaxanthin per 1 x 10 6 cells ( ⁇ g)
  • B shows the content of zeaxanthin per mg of dry cell weight (mg).
  • Figure 6b shows the pigment content by using HPLC after culturing for 2 days at a luminous intensity of 100 ⁇ mol photons / m 2 s, and measured the pigment content using HPLC, zeaxanthin and lutein contained in wild type Dunariella alga, Jia 1, MP3 mutants, respectively
  • a graph comparing the amount of. shows the content of zeaxanthin and lutein ( ⁇ g) per 1 x 10 6 cells, (B) shows the content of zeaxanthin and lutein (mg) per 1g dry cell weight.
  • Figure 7a is a graph showing the content (wt%) of each pigment in the total amount of pigments produced from wild type Dunariella algae, Jia 1, MP3 mutant strains.
  • 7b is a graph showing the content of zeaxanthin (mg / g DCW) per 1g dry cell weight of Jia 1 and MP3 mutant strains cultured for 14 days.
  • Figure 8a is a diagram showing the PCR results using the primer information and primers of ITS1 -F and ITS2 -R for phylogeny in Dunariella genus.
  • 8B shows a schematic of Dunaliella sp. Strains.
  • the present invention relates to a two Canary in Ella Macular pigment 3 (MP3) (Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae (algae).
  • MP3 Canary in Ella Macular pigment 3
  • KCTC 12990BP Canary in Ella Macular pigment 3
  • the birds of the genus Dunariella is a single-celled algae with two flagella of isotonic cells, fusiform, and the size is 7 ⁇ 25 ⁇ m in length depending on the type, has a congenital chloroplast. Can grow in environments with high salt concentrations.
  • mutant strains were prepared by general mutagenesis and were isolated using subculture and identified using conventional methods.
  • the mutation treatment can be carried out using common mutagens, and in one embodiment of the invention treated with chemicals to cause the mutation.
  • Dunariella MP3 mutant strain of the present invention has a pigment producing ability, specifically xanthophyll producing ability. More specifically, at least one selected from the group consisting of lutein and zeaxanthin and having chlorophyll b, chlorophyll a and beta-carotene Can produce.
  • the mutant strains were significantly higher in production of zeaxanthin per cell than conventional wild type Dunariella birds, and Dunaliella sp. Zea1, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING , VOL. 81, NO.1 Compared with), the accumulation amount of zeaxanthin per cell is 20 to 30% or more, which can be effectively used as an algae for producing xanthophyll.
  • the MP3 mutant of the present invention is the best accumulation of zeaxanthin per unit cell number and dry weight compared to wild-type and Jia 1 algae of the same genus (Fig. 6b), the mutant strain of the present invention It can be seen that the production ability of xanthophyll, in particular, zizatin has very good bacteriological properties, and it can be effectively used as a source of xanthophyll pigment by using this.
  • the mutant strains of the present invention are viable in dim light and specifically can be cultured under luminous conditions in the range of 10 to 2,000 ⁇ mol photons / m 2 s. Photosynthesis is not possible at complete darkness where the mutant strain is below the weak light condition, and cells may be damaged by light stress at too high light conditions.
  • culturing the mutant strain of the present invention under the above conditions there is an advantage of having an excellent growth rate while increasing the xanthophyll content in the mutant strain.
  • the MP3 mutant strain can grow appropriately within the growth environment (luminosity, temperature, salinity conditions, etc.) of the algae of the genus Dunariella. In addition, it has an excellent ability to accumulate zeaxanthin even at low luminosity (Fig. 6), and can be used industrially effectively as a xanthophyll pigment-producing microorganism due to such excellent xanthophyll production ability, compared to other algae in the density under high brightness. Therefore, it is relatively low, and the pigment
  • the MP3 mutant strain may be cultured in a seawater environment, and specifically, may be cultured in a culture medium including seawater. Variants of the present invention can be cultured at salinity conditions of 0.05M to 5.5M based on NaCl concentration.
  • the culture medium may further include Tris in addition to NaCl.
  • the culture medium may contain a nutritional substance required by the microorganism to be cultured, that is, the culture medium in order to cultivate a specific microorganism, and may be mixed with an additional material for a special purpose.
  • the medium may also be referred to as an incubator or a culture medium, and is a concept that includes all natural, synthetic, or selective media.
  • the Dunaliella mutant strain may be cultured according to a conventional culture method. In one embodiment, in the culture composition of Table 1, it was confirmed that the MP3 mutant strain of the present invention has excellent zeaxanthin production capacity.
  • the pH of the culture medium is not particularly limited as long as the algae in the Dunariella can survive and grow, for example, pH 6 or more, specifically pH 7 to pH 9, and can be optimal at pH 8.0 or more below pH 9.0 It can have a growth rate of.
  • Dunaliella genus 1 (The MP3 variant) sp. Zea1, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING , VOL. 81, NO. It was developed through chemical mutation using 1) as an aid, and identified as Dunaliella sp. By the ITS sequence analysis.
  • ITS1 ITS1 -F: TCCGTAGGTGAACCTGCGG, ITS1 -R: GCTGCGTTCTTCATCGATGC
  • ITS2 ITS1 -F: GCATCGATGAAGAACGCAGC, ITS2 -R: TCCTCCGCTTATTGATATG
  • UPGMA unweighted pair group method with arithmetic mean
  • the selected mutant of the present invention was named Dunaliella sp. Macular pigment 3 (MP3) in Dunariella genus, and the mutant strain was the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC). ) was granted March 16, 2016 and was granted accession number KCTC 12990BP on March 23, 2016.
  • MP3 Macular pigment 3
  • KCTC Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
  • the MP3 mutant strain of the present invention can accumulate pigments, especially xanthophyll pigments, in a cell at a high content, and may contain a higher content of zeaxanthin, thereby cultivating the algae, such as food, feed, pharmaceuticals, etc. It can be effectively used as a raw material.
  • the present invention relates to a culture of algae of Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP.
  • culture means a medium in which a specific microorganism is cultured, that is, a culture medium, and the culture includes MP3 of the genus Dunariella.
  • the culture is meant to include both the concentrate of the culture or the dried product of the culture in which the culture medium, such as concentrated and dried after the culture.
  • the culture may include by-products thereof, and the formulation is not limited, and may be, for example, liquid or solid.
  • the medium may contain a nutritional substance required by the microorganism to be cultured, that is, the culture medium in order to cultivate the specific microorganism, and may be mixed with an additional material for a special purpose.
  • the medium may also be referred to as an incubator or a culture medium, and is a concept that includes all natural, synthetic, or selective media.
  • the pH of the medium may be a range capable of growing MP3 algae in Dunariella, for example pH 6 or more, preferably pH 7 to pH 9.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising one or more selected from the group consisting of Dunaliella sp. MP3 of the present invention, Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP algae, a culture of the algae, dried products thereof and extracts thereof. .
  • composition can be used for the purpose of promoting the health of humans and animals.
  • the variant strain of the present invention has a property of generating and accumulating xanthophyll pigments including zeaxanthin and lutein in the body.
  • the composition may be a pigment composition or a xanthophyll pigment composition.
  • the pigment composition may be that containing 10% by weight to 15% by weight of zeaxanthin relative to the total amount of the pigment contained in the composition.
  • the content of zeaxanthin in total pigments per cell of Dunariella wild type algae, Gia 1 algae and MP3 mutant strains was determined. It was confirmed that the content of zeaxanthin was remarkably high (Fig. 7a).
  • the pigment composition may be used as a raw material for food or feed, and may be used as a preparation for oral administration.
  • the pigment composition or the xanthophyll pigment composition containing the composition or extract may be a composition for oral administration in that it can be supplied orally in food, medicine or feed.
  • compositions for oral administration include powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions, and the like, oral formulations formulated using methods known in the art.
  • oral preparations can be obtained by tablets or tablets of sugars by combining the active ingredients with solid excipients and then grinding them and adding suitable auxiliaries and then processing them into granule mixtures.
  • excipients examples include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol and starch, cellulose, including starch, corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, etc. Fillers such as cellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like, including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylmethyl-cellulose, and the like. In addition, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate and the like may optionally be added as a disintegrant.
  • the composition may be added to food or feed to achieve a particular purpose use, in this aspect it may be a food composition, a composition for food additives, a feed composition or a composition for feed additives.
  • the body's health can be maintained or strengthened by the xanthophyll pigments produced by Dunariella genus MP3 algae and accumulated in the cells, in particular zeaxanthin and lutein.
  • the zeaxanthin and lutein may be used as a macular pigment to prevent or improve the degeneration of the macula, and is effective in preventing or improving eye diseases associated with macular degeneration.
  • the zeaxanthin and lutein may be used to enhance or maintain eye health; Macular degeneration prevention or improvement; Preventing or improving deterioration of the eye; Improving or preventing damage to the retina; Anti-aging; Maintaining retinal health; Reduced risk of developing macular degeneration; Or since there is an effect of preventing or improving macular degeneration, the feed or food composition may be used for the prevention or improvement of the symptoms, or for the purpose of the effect.
  • additives is included if all the ingredients are added to the food or feed in addition to the main ingredients, for example, food and pharmaceutical safety is added to the coloring, preservation, etc. in the active active material or processed foods having functionality in the food or feed It may be a food additive as defined by the department.
  • the food may be a health functional food. More specifically, it may be a health functional food for eye health.
  • the food, food additives, feed or feed additives composition does not harm the activity of Dunaliella sp. MP3 (Kalid sp. MP3, KCTC 12990BP) algae of the present invention, the culture of the algae, dried products thereof and extracts thereof. It may further include other active ingredients in a range that does not. In addition, additional components such as a carrier may be further included.
  • Feed composition in the present invention may be prepared in the form of fermented feed, compound feed, pellet form and silage (silage) and the like.
  • the fermented feed includes the MP3 algae of the genus Dunariella of the present invention, the dry cells of the algae, the culture of the algae and extracts thereof, and may be prepared by additionally including various microorganisms or enzymes.
  • the blended feed may be prepared by mixing various kinds of general feed and the Dunariella MP3 algae of the present invention, the dry cells of the algae, the culture of the algae and extracts thereof.
  • Pellet feed may be prepared by formulating the fermented feed or blended feed into a pellet machine.
  • Silage may be prepared by mixing the green feed and Dunariella MP3 algae, the dry cells of the algae, the culture of the algae and / or extracts thereof, but the use of the composition of the present invention is not limited thereto.
  • the composition may be mixed with carriers and flavorings commonly used in the food or pharmaceutical field to form tablets, troches, capsules, elixir, syrups, powders. It may be prepared and administered in the form of a suspension or granules.
  • binders, suspending agents, disintegrating agents, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents and the like can be used.
  • the mode of administration may be oral, parenteral or application, but preferably oral administration.
  • the dosage may be appropriately selected according to the absorbency, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body, age, sex, condition of the recipient.
  • the pH of the composition can be easily changed according to the manufacturing conditions, such as a drug, food, etc. in which the composition is used.
  • the composition is 0.001 to 99.99 weight of any one selected from the group consisting of Dunaliella sp. MP3 (KCTC 12990BP) algae, a culture of the algae, a dried product thereof and an extract thereof based on the total weight of the composition. %, Preferably 0.1 to 99% by weight, and the content of the active ingredient can be appropriately adjusted according to the method of use and purpose of use of the composition.
  • Dunaliella sp. MP3 (KCTC 12990BP) algae may be included in the composition itself or in dried form, and the culture of the algae may be included in the composition in concentrated or dried form.
  • the dried means the dried form of the algae or its culture, it may be in the form of powder prepared by lyophilization and the like.
  • the extract refers to an extract obtained by extracting from MP3 algae, its culture solution or dried product thereof, includes an extract using a solvent or the like, and obtained by crushing the MP3 algae of the present invention.
  • the pigment accumulated in the cells of Dunaliella sp. MP3 (KCTC 12990BP) alga of the present invention may be extracted and separated by physical or chemical methods.
  • the extraction process may be performed by a conventional method, for example, by adding an extraction solvent and homogenizing, pulverizing the cells can be extracted the target pigment.
  • the algae crushed material is removed by centrifugation, and the extraction solvent can be removed by distillation under reduced pressure. It may also further comprise a conventional purification process. Since the pigment has a property of being insoluble in water, it can be more easily extracted from the algae of the present invention.
  • Dunariella MP3 mutant of the present invention has excellent production capacity of xanthophyll, in particular zeaxanthin at low brightness, the composition comprising the mutant and its by-products have the effect of improving physical activity, maintaining body function and preventing degradation.
  • the composition of the present invention is for maintaining physical health, specifically, maintaining and preventing deterioration of body function in which the xanthophyll pigment is involved. Or it can be used as a raw material contained in food, medicine or feed for the purpose of improvement.
  • Another object of the present invention is to provide a pigment production method using Dunaliella sp. MP3 (Dungaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae.
  • Another object of the present invention is to provide a food or feed material production method comprising the step of culturing Dunaliella sp. MP3 (Dungaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae.
  • Dunaliella spp. MP3 (KCTC 12990BP) algae of the present invention can increase the amount of xanthophyll accumulation in the cultured Dunariella algae, thereby efficiently supplying industrially used raw materials. Can be done.
  • the production method may include culturing Dunaliella spp. MP3 ( Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae.
  • the production method may further include, after the culturing step, separating the Dunaliella genus (sp.) MP3 algae of the present invention from the culture.
  • the separated algae may be further subjected to processing steps including drying.
  • the production method is a step of extracting pigments from Dunaliella sp. MP3 (Dungaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) algae, the culture of the algae, the concentrate of the culture or the dried product of the culture; It may include.
  • the culture may be performed in a medium of salinity condition of 0.05M to 5.5M based on NaCl concentration. It may also be carried out under light conditions, in particular light conditions in the range of 10 to 2,000 ⁇ mol photons / m 2 s.
  • Dunariella MP3 mutant strain of the present invention is excellent in pigment production ability even at low brightness, can increase the content of xanthophyll in the body, it is possible to achieve excellent xanthophyll accumulation without administering high brightness energy, effectively used industrially Can be.
  • the extraction may be performed by a conventional method for extracting a pigment from a microorganism, and examples thereof include an enzyme method, an ultrasonic extraction, a mechanical extraction method, and the like.
  • the production method may further include a concentration step of increasing the content of algae after the cultivation, and drying to further reduce the moisture of the algae after the concentration step.
  • concentration step or the drying step is not necessarily required, and in general, it may be performed using a concentration and drying method or machine commonly used in the field to which the present invention belongs.
  • the production method may be carried out by further comprising a purification step after the extraction step, which may be performed by a conventional purification method in the art.
  • Xanthophyll prepared through the concentration or drying step may be used as a raw material for food, health functional food, cosmetics or drugs.
  • the xanthophyll production method may be performed by employing another method within a range that does not impair the effects of the present invention.
  • the information on the alga and the composition may be mutatis mutandis also for the production method of the present invention.
  • Cells were harvested by centrifugation and then resuspended to give a cell density of 8 ⁇ 10 6 to 10 ⁇ 10 6 cells / mL. Ethylmethane sulphonate) was treated to a final concentration of 0.2 ⁇ M. After incubation for two hours, the EMS used for treatment was washed with liquid medium and centrifuged to harvest only cells. This was again resuspended in a liquid medium and cultured in a dark state for one day, and then transferred to a solid medium added only one thousand to the same composition as the liquid medium of Table 1 and plated. After one week, colonies formed on a solid medium were separated, and a single colony was transferred to the liquid medium of Table 1, and cultured in a liquid. Mutants were selected by characterizing each colony.
  • colonies having a lighter green color than wild-type and algae were selected first, and the relative zeaxanthin content was increased through HPLC analysis of algae of the first selected colonies. High algae were secondary selected.
  • the color of the mutant strain is lighter green and yellow than the wild type Dunariella algae and Jia 1, it was confirmed that the color of the mutant strain is lighter green and yellow in the liquid culture solution at the bottom. .
  • each algae was inoculated at a cell density of 1 ⁇ 10 6 cells / mL in each of the media shown in Table 1, followed by 50 , 100 and 300 ⁇ mol photons / m 2 s at different intensities.
  • the temperature was 25 to 26 ° C., and shaking culture was performed at a speed of 90 rpm.
  • 0.5 mL of the culture solution was taken on each of the first, second, third, fourth, and fifth days after the start of the culture, and the number of cells per milliliter was counted under a microscope using a hemocytometer. The density of cells at different intensities was measured at each time of counting, and the results are shown in FIG. 3.
  • MP3 mutant strains of the cell number was small compared to the wild type and Jia 1 as the culture period elapsed. Comparing the time to reach the same cell number, wild-type algae grew faster by 1 to 1.5 days compared to the MP3 mutant strain, but the final cell density was found to reach a similar level.
  • dry weight is also an important part of industrial use of microalgae, so dry weight was measured to compare their final biomass.
  • samples were inoculated at 100 ⁇ 10 4 cells / mL and harvested on log 2nd day.
  • 1 mL and 2 mL of the incubating suspension were harvested by filtration through a microfilter (filter paper) and dried for 24 hours in a dry oven at 65 ° C. for 1 x 10 6
  • the dry weights of the wild type, Jia 1 and mutant strains of the cells were measured, respectively. Because Dunariella grows in a high-salt liquid medium, the remaining salt remains after harvesting through centrifugation to nourish the dry weight of the cells, so the filter paper was filtered to remove salt.
  • Figure 4a The results are shown in Figure 4a.
  • Colonies generated after mutant treatment were separated into single colonies, continued to incubate, and chromatographic analysis was performed using HPLC for each colony.
  • isolated single colonies were incubated for 5 days at 100 ⁇ mol photons / m 2 s conditions in a liquid medium, specific culture conditions were carried out as in the culture conditions of Example 1.
  • the harvested algae were extracted using 80% acetone, the centrifuged supernatant was filtered again using a nylon filter, and then analyzed by injection into HPLC.
  • the total flow rate of the solvent was 1.2 mL per minute, and uniformly decreased Tris of pH 8.0 to 14%, acetonitrile to 84% to 0%, respectively, from 0 minutes to 15 minutes, Methanol and ethyl acetate started at 2% and increased by 68% and 32%, respectively, by the 15th minute.
  • the solvent ratio is then maintained for 3 minutes (15-18 minutes), then for 1 minute (18-18 minutes), return to the rate at which each solvent was started and then for the remaining 6 minutes. It was kept post-run.
  • the pump was used for Shimadzu LC-20A Prominence, the column was Watera Spherisorb TM S5 (DS1 4.6 x 250 mm, 5 ⁇ m Cartridge Column, USA), the column temperature was maintained at 40 °C.
  • the detector analyzed the data using a photodiode array detector (SPD-M20A, Shimadzu).
  • SPD-M20A photodiode array detector
  • the carotenoid pigments such as zeaxanthin were detected at 445 nm and chlorophyll a at 670 nm. , Denmark) was used as a standard to determine the concentration was determined by using a standard curve for the determination of zeaxanthin and chlorophyll a.
  • FIG. 5 shows an HPLC analysis graph showing a pigment profile in each alga, and a graph quantitatively analyzing the zeaxanthin and lutein content of each algae grown under 100 ⁇ mol photons / m 2 s using a chromatogram. .
  • each bird was counted as 1 ⁇ 10 6 cells or After harvesting only the cells in the culture, the results of comparing the content of zeaxanthin on the basis of 1 g of dry cell weight (DCW: Dry cell weight) are shown in FIG. 6a, and the results of comparing xiaxanthin and lutein content.
  • DCW Dry cell weight
  • the pigment content per DCW is obtained by dividing the pigment content (mg / L) obtained by HPLC by the number of cells per ml (1 ⁇ 10 6 cells / ml) (mg / 1 ⁇ 10 6 cells). a, is calculated in a manner to impart to 1 x 10 6 cells per dry weight (mg / 1 x 10 6 cells ).
  • the MP3 mutant strain of the present invention had a higher zeaxanthin peak (No. 5) compared to wild type algae and algae Jia 1.
  • Jia 1 is a zeaxanthin accumulation mutant, when compared with the MP3 mutant of the present invention, it can be seen that the mutant of the present invention has a higher zeaxanthin production capacity.
  • the MP3 mutant strain accumulated more than 20-fold increased zeaxanthin compared to wild-type, and compared to the original animal, zi-1, increased zeaxanthin by about 40% or more. Accumulating. Therefore, it can be seen that the MP3 mutant strain of the present invention has a significantly higher zeaxanthin production capacity compared with the conventional Dunariella species.
  • the amount of zeaxanthin accumulated in the mutant strains isolated by visual observation and quantitative analysis by HPLC was compared with the amount accumulated in the algae (Jia 1, Zea1).
  • Mutants grown under the same luminosity conditions did not show significant differences in the size of the wild-type Dunariella algae and the algae (Jia 1, Zea1) and the cells themselves (FIG. 1A).
  • MP3 mutant strains were yellower than wild type when inoculated into solid medium and liquid medium at 500 ⁇ 10 4 cells / mL.
  • the mutant strains of the present invention can also be visually confirmed to continuously accumulate zeaxanthin even at relatively low luminous intensities of 100 ⁇ mol photons / m 2 s. These luminous conditions generally do not require a lot of energy. It suggests that there is an advantage to obtain the desired product with high energy efficiency.
  • the mutant strains of the present invention have a high content of accumulated xiaxanthin in algae per unit cell number, even though the growth rate is slower than that of wild-type and zi-algae algae under the same luminous conditions. This means that it can be used as an xanthophyll algae. Therefore, experiments were conducted to determine whether the production capacity of zeaxanthin accumulated in the mutant strains of the present invention can be maintained after culture.
  • the culture was performed by inoculating 1 ⁇ 10 6 cells / mL in a 500 mL volume of the culture medium. Brightness and shaking culture conditions are the same as above. After inoculation, the cells were cultured for 14 days (11-12 days after entering a stationary state), and the cells were harvested to determine the content of zeaxanthin in the total pigment. The results are shown in Figures 7a and 7b.
  • the zeaxanthin production of the mutant strain (MP3) of the present invention is 8.3mg / gDCW 30% more than the 6mg / gDCW of the conventional aid jia 1.
  • Jia 1 which is a wild type and an original animal
  • the content of zeaxanthin in the total pigment was significantly higher, and the yield of zeaxanthin per dry weight was also significantly higher than that of the conventional Aid Jia 1. You can see that it is high. Therefore, it was confirmed that the MP3 mutant strain of the present invention had remarkably excellent zeaxanthin production capacity.
  • microorganisms were identified by analyzing the ITS gene sequence (gene sequencing).
  • the amplified portion was cut out from the agarose gel, and DNA was separated using a gel extraction kit of Cosmo genetech Co., Ltd. Then, Macrogen Co., Ltd. was commissioned to analyze the sequence.
  • the analyzed sequences were compared with the ITS of several strains of Dunaliella, registered at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • the ITS sequences of each strain were compared using the clustalW program, and the compared sequences were plotted using the UPGMA algorithm (unweighted pair group method with arithmetic mean) in the MEGA6 program to draw a phylogenetic tree. Comparative analysis.
  • the ITS sequence of Dunariella was compared from the gene bank of NCBI, and the details are as follows (indicated by the gene bank code in parentheses).
  • D.tertiolecta A2 U66956
  • D.tertiolecta UTEX999 AF313434, AF313434
  • D.salina UTEX1644 AF313428, AF313429
  • D.salina CONC006 AF313424, AF313425
  • D.salina CONC007 AF313426, AF313427
  • D. bardawil strain ATCC30861 AF313430, AF313431
  • D. lateralis AF313444, AF313445
  • C. reinhardtii U66954.
  • the selected mutant strain of the present invention (Dunariella genus) Dunaliella sp.), Macular Pigment 3 (MP3) in Dunariella Dunaliella sp. It was named Macular pigment 3 (MP3) and was assigned the accession number KCTC 12990BP from KCTC.

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Abstract

본 발명은 색소 향상된 색소 생산능을 갖는 새로운 조류에 관한 것으로, 본 발명의 변이주를 이용하면 적은 에너지를 소모하여, 카로티노이드계 색소, 구체적으로 잔토필을 생산하는 것이 가능하므로 산업 수준에서 효율적으로 색소를 생산할 수 있다. 또한, 색소가 포함되는 식품, 건강기능식품 및 의약품의 원료로 적용이 가능하다. 또한, 광염성 미세조류인 두나리엘라의 생리적 특성과 삼면이 바다인 우리나라의 지리적 특성을 고려해서 해수를 배양배지로 이용하여 비용절감과 관련 산업 발전의 효과도 기대할 수 있다.

Description

두나리엘라 변이주 및 이를 이용한 색소 생산 방법
본 발명은 색소 생산능을 갖는 조류, 상기 조류를 포함하는 색소 조성물 그리고 상기 색소를 생산하는 방법에 관한 발명이다.
황반변성이란 눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직인 황반에 변성이 일어나 시력장애를 일으키는 질환으로, 시세포의 대부분이 황반에 모여있고 물체의 상이 맺히는 곳도 황반의 중심이므로 황반은 시력에 대단히 중요한 역할을 담당하고 있다. 황반변성을 일으키는 가장 많은 원인은 연령증가(연령관련 황반변성)를 들 수 있고, 가족력, 인종, 흡연과 관련이 있다고 알려져 있다. 황반부는 중심 시력을 담당하는 곳이므로, 이 이곳에 변성이 생기면 시력감소, 중심암점, 사물이 찌그러져 보이는 증상인 변시증 등이 나타난다. 황반변성은 크게 비삼출성(건성)과 삼출성(습성)으로 구분하게 되는데 비삼출성인 경우 망막 및 맥락막 위축이 나타나는 후기를 제외하고는 대부분 시력에 큰 영향을 주지 않고, 망막 하에 드루젠이라는 노란 침착물이 보이는 단계이나, 망막 하 출혈이나 망막 하액, 색소상피박리 등이 나타나는 삼출성의 경우에는 이러한 병변의 위치가 황반 아래 또는 황반에 바로 연하여 있는 경우에는 초기부터 시력저하가 나타난다. 삼출성 황반변성의 경우 전체 황반변성의 10~20% 정도를 차지하지만, 만일 삼출성 황반변성을 치료하지 않고 그대로 방치해두면, 시력이 빠르게 저하되어 많은 환자들이 진단 후 2년 내에 실명에 이르게 된다. 황반변성을 예방하기 위해서는 정기적인 안저검사를 통해 황반부의 이상을 초기에 발견과 비만, 흡연, 고혈압 등의 조절 가능한 인자를 줄이도록 애쓰는 것이 중요하다. 흡연은 맥락막 순환에 손상을 주어 혈중 항산화 인자를 떨어뜨리고, 맥락막 혈관수축을 야기하여 저산화 손상을 야기하므로, 황반변성의 위험성이 있는 환자는 반드시 금연이 필요하다. 또한, 황반색소(lutein, zeaxanthin)는 노화에 의한 손상을 감소시켜 망막을 건강하게 유지하는 역할을 하므로, 야채와 과일을 통해 충분히 섭취하거나, 상용화된 비타민제를 복용함으로써 황반변성의 예방에 도움을 줄 수 있다.
황반색소는 망막의 중앙부분에서 기인한 노인성 시력감퇴를 줄여주고, 밝은 광선에 의한 망막조직의 손상을 막아주는 역할을 하는 것으로 대표적인 예로 카로티노이드의 산소화에 의해 생산되는 카로티노이드계의 옥시카로티노이드 색소로 잔토필(크산토필, xanthophyll)가 있다. 잔토필류에 속하는 색소로는 루테인(lutein) 또는 지아잔틴(zeaxanthin) 등이 있다. 루테인은 몸속에서 자연적으로 생성되는 산소 자유라디칼(free radical)에 의해서 손상되는 눈의 내부를 보호하는 항산화제로서 활동하며, 암종양을 공급하는 혈관의 성장을 줄여 암세포를 죽이고, 유방, 결장, 폐, 난소암, 피부암 예방에 약간의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 동물은 잔토필을 생성할 수 없고, 음식의 섭취를 통해서만 얻을 수 있는데, 이러한 잔토필은 식물의 잎사귀, 꽃, 과실 등의 녹색부에 엽록소, 카로틴과 같이 존재한다. 최근 잔토필류를 포함하는 눈 건강을 위한 건강기능식품 등이 각광받고 있다.
지아잔틴과 루테인의 원료로는 기존의 마리골드 꽃이 대표적이며, 다른 고등식물에서 추출하는 것도 연구되어 있다. 그뿐만 아니라, 박테리아에서 색소 합성 기작을 유전적으로 변이시켜 지아잔틴과 루테인을 생산하기도 한다. 미세조류로부터 이들 색소를 얻는 연구도 진행된 바 있다. 이러한 종래의 원료물질 중 마리골드 꽃은 생산을 위해 화초를 육종하기까지 시간이 오래 걸리는 단점이 있고, 생산을 위한 토지 면적에 비해서 생산량이 많지 않아 생산 단가가 높은 문제가 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 고등식물 시스템을 대체하기 위한 박테리아 시스템을 이용해 색소 합성 기작을 삽입한 지아잔틴과 루테인 생산 조류 개발이 이루어졌지만, 박테리아에서 얻어지는 색소는 궁극적으로 식품첨가물로 이용되기에는 부적합하다는 문제점이 있다. 또한, 유전자 삽입 기술 등을 이용한 유전자 재조합 식품(GMO; genetically modified organism)은 국내에서 선호되고 있지 않기 때문에 소비자들의 인식이 중요한 식품첨가물 시장에는 치명적 단점으로 작용하며, 고등식물 시스템과 마찬가지로 박테리아 배양액이나 바이오 리액터 등을 유지하는 비용이 많이 요구될 수 있는 문제가 있다.
미세조류로부터 이들 색소를 얻는 방법의 경우, 종래의 미세조류는 개량이 되지 않은 야생형으로 루테인의 함량은 일정량 있지만 지아잔틴의 함량이 광량에 따라 매우 낮기 때문에 최적의 생산 조류로 이용하기에는 한계가 있었다.
따라서, 식품의 원료물질을 생산하거나 원료물질을 대체할 수 있는 방법의 개발의 요구가 지속적으로 계속되고 있다.
본 발명의 목적은 종래 식품의 원료로 사용되는 잔토필을 대체할 수 있는 원료 또는 종래의 원료 생산방법을 대체할 수 있는 방법을 제공하는 것으로, 구체적으로 잔토필 생산능, 특히 루테인 및 지아잔틴 생산능이 우수한 미생물, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 잔토필(xanthophyll)의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 식품 산업에서 문제가 될 가능성이 있는 유전적 재조합 방법이 아닌 다른 변이를 이용하여 야생형 또는 종래 존재하던 미세조류의 부족한 생산성을 해결할 수 있는 조류를 개발하기 위해 노력한 결과, 종래의 두나리엘라 속 조류보다 황반색소 생산량이 높은 변이주를 개발, 이를 이용한 최적의 색소 생산 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이러한 측면에서 본 발명은 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3)(Dunaliella sp. Macular pigment 3(MP3), KCTC 12990BP) 조류(algae)를 제공한다.
상기 두나리엘라 속 MP3 조류는 잔토필 생산능을 가질 수 있다.
상기 두나리엘라 속 MP3 조류는 루테인(lutein)과 지아잔틴(zeaxanthin); 그리고 엽록소 b(chlorophyll b), 엽록소 a(chlorophyll a) 및 베타-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 색소의 생산능을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)의 배양물을 제공한다.
또한, 본 발명은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 색소 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경구 투여용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 사료 또는 사료첨가제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 또는 식품첨가제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)를 배양하는 것을 포함하는색소 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)를 배양하는 것을 포함하는 식품 또는 사료의 원료 생산방법을 제공한다.
본 발명의 변이주를 이용하면 적은 에너지 대비 다량의 지아잔틴과 루테인을 생산하는 것이 가능하므로 산업 수준에서 효율적으로 지아잔틴과 루테인을 제조 및 공급 할 수 있다. 본 발명의 조성물은 지아잔틴과 루테인 색소가 포함되는 식품, 건강기능식품 및 의약품의 원료로 적용할 수 있다. 또한, 광염성 미세조류인 두나리엘라의 생리적 특성과 삼면이 바다인 우리나라의 지리적 특성을 고려해서 해수를 배양배지로 이용할 수 있어 비용절감과 관련 산업 발전의 효과도 기대할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 변이주의 야생형(WT)인 두나리엘라 속(Dunaliella sp.) 조류, 본 발명의 변이주의 원조류인 지아 1(Zea1), 그리고 MP3 변이주의 현미경 사진이다(배율 1000x). 사진에 있는 선(bar)은 10μm를 나타낸다.
도 1b는 야생형 조류, 지아 1, MP3 변이주가 동일한 수의 세포(500 x 104세포/mL)일 때의 배양 상태를 나타내는 사진이다. 상단은 한천이 들어간 고체배지에서 배양상태를 나타내고, 하단은 액체 배양액에서 배양상태를 나타낸다.
도 2는 100 μmol photons/m2s 광도 조건 하에서 성장의 비교를 나타낸 액체배지의 플라스크 사진이다.
도 3은 야생형 두나리엘라 속 조류, 지아 1, 그리고 본 발명의 MP3 변이주의 세포 수(Cell Density) 증가 패턴을 나타내는 그래프이다. 가로축은 배양시간(day), 세로축은 세포 밀도(x104 cells/mL), 숫자는 각각 처리 된 광도를 의미한다(단위: μmol photons/m2s).
도 4a는 야생형 조류, 지아 1, MP3 변이주의 100 x 104세포당 건조 중량(g), 도 4b는 야생형 조류, 지아 1, MP3 변이주의 (L)당 건조 중량(g)으로 바이오 매스를 측정한 그래프이다.
도 5는 야생형 두나리엘라 속 조류와 지아 1, MP3 변이주의 색소 프로파일을 나타내는 HPLC 분석 그래프이다(1: 네오잔틴(neoxanthin), 2: 비올라잔틴(violaxanthin), 3: 안테라잔틴(antheraxanthin), 4: 루테인(lutein), 5: 지아잔틴(zeaxanthin), 6: 엽록소 b(chlorophyll b), 7: 엽록소 a(chlorophyll a), 8: 베타-카로틴(β-carotene)).
도 6a는 100 μmol photons/m2s의 광도에서 배양 후 2일 째 수확한 세포들을 HPLC로 색소 함량을 측정한 야생형 두나리엘라 속 조류, 지아 1, MP3 변이주가 각각 함유하고 있는 지아잔틴의 양을 비교하는 그래프이다. (A)는 1 x 106세포 당 지아잔틴의 함량(μg), (B)는 세포 건조 중량 1g 당 지아잔틴의 함량(mg)를 보여준다.
도 6b는 100 μmol photons/m2s의 광도에서 2일간 배양 후 수확하여 HPLC를 이용하여 색소 함량을 측정하여, 야생형 두나리엘라 속 조류, 지아 1, MP3 변이주가 각각 함유하고 있는 지아잔틴 및 루테인의 양을 비교하는 그래프이다. (A)는 1 x 106세포 당 지아잔틴 및 루테인의 함량(μg), (B)는 세포 건조 중량 1g 당 지아잔틴 및 루테인의 함량(mg)을 보여준다.
도 7a는 야생형 두나리엘라 속 조류, 지아 1, MP3 변이주로부터 생산된 색소 총량 중 각 색소의 함량(중량%)을 나타내는 그래프이다. 7b는 14일간 배양한 지아 1 및 MP3 변이주의 세포 건조 중량 1g 당 지아잔틴의 함량 (mg/g DCW)을 나타내는 그래프이다.
도 8a는 두나리엘라 속의 계통 확인을 위한 프라이머 정보 및 ITS1-F와 ITS2-R의 프라이머를 이용한 PCR 결과를 나타내는 도이다. 도 8b은 두나리엘라 속 (Dunaliella sp.) 균주들의 계통도를 나타낸다.
다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 두나리엘라 속 Macular pigment 3(MP3)(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)에 관한 것이다.
상기 두나리엘라 속 조류는 등장의 2편모가 있는 단세포 녹조로, 세포는 방추형이며, 크기는 종류에 따라 길이 7~25㎛이고, 배상엽록체를 갖는다. 염분농도가 높은 환경에서 생육할 수 있다.
상기 변이주는 일반적인 돌연변이 처리에 의하여 제작되었고, 계대배양을 이용하여 분리 및 통상의 방법을 이용하여 동정되었다. 상기 돌연변이 처리는 일반적인 변이원을 사용하여 수행될 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 화학물질을 처리하여 변이를 유발하였다.
본 발명의 두나리엘라 MP3 변이주는 색소 생산능, 구체적으로 잔토필 생산능을 갖는다. 더욱 구체적으로, 루테인(lutein)과 지아잔틴(zeaxanthin) 생산능을 가지며, 엽록소 b(chlorophyll b), 엽록소 a(chlorophyll a) 및 베타-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 생산할 수 있다.
상기 변이주는 세포당 지아잔틴의 생산능이 종래 야생형 두나리엘라 속 조류와 비교해서 현저하게 높고, 원조류인 두나리엘라 속 지아 1(Dunaliella sp. Zea1, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 81, NO.1)와 비교해도 세포당 지아잔틴의 축적량이 20 ~ 30% 이상 많아, 잔토필 생산을 위한 조류로 효과적으로 사용될 수 있는 장점이 있다.
구체적인 일 실시예에서, 본 발명의 MP3 변이주가 동일 속의 야생형 및 지아 1 조류와 비교해서, 단위 세포수 및 건조중량 당 지아잔틴의 축적량이 가장 우수한 것을 확인 하였는바(도 6b), 본 발명의 변이주는 잔토필, 특히 지아자틴의 생산능이 매우 우수한 균학적 성질을 가짐을 알 수 있고, 이를 활용하여 잔토필 색소의 생산원으로 효과적으로 활용될 수 있음을 확인 하였다.
본 발명의 변이주는 약광(dim light)에서 생존 가능하고, 구체적으로 10 내지 2,000 μmol photons/m2s 범위의 광도 조건 하에서 배양될 수 있다. 상기 변이주가 약광조건 이하인 완전한 어둠에서는 광합성을 할 수 없고, 너무 높은 광조건에서는 광 스트레스에 의해 세포가 데미지를 입을 수 있다. 상기 조건에서 본 발명의 변이주를 배양하는 경우, 변이주 내 잔토필 함량을 높이면서도, 우수한 생장률을 갖는 장점이 있다.
상기 MP3 변이주는 통상의 두나리엘라 속 조류의 생장환경(광도, 온도, 염도 조건 등) 내에서 적절한 성장을 할 수 있다. 또한, 낮은 광도에서도 우수한 지아잔틴의 축적능을 갖는바(도 6), 이런 우수한 잔토필 생상능에 의하여 잔토필 색소 생산 미생물로 산업적으로 효과적으로 사용될 수 있고, 고광도 하에서도 군집 내의 밀도가 다른 조류와 비교해서 상대적으로 낮아, 단일 세포 내 광합성에 의한 색소 생산 효율이 우수한 효과를 갖는다. 구체적으로 종래 지아잔틴 개선 균주로 알려진 지아 1 조류보다 세포당 지아잔틴 함유량이 약 40% 이상 더 높다.
상기 MP3 변이주는 해수 환경에서 배양될 수 있고, 구체적으로 해수를 포함하는 배양배지에서 배양될 수 있다. 본 발명의 변이주는 NaCl 농도를 기준으로 0.05M 내지 5.5M의 염도 조건에서 배양될 수 있다. 상기 배양배지는 NaCl외에 Tris를 더 포함할 수 있다. 상기 배양배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 두나리엘라(Dunaliella) 변이주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 표 1의 배양액 조성환경에서, 본 발명의 MP3 변이주가 우수한 지아잔틴 생산능을 가짐을 확인하였다.
상기 배양배지의 pH는 두나리엘라 속 조류가 생존 및 성장 가능한 범위라면 특별히 제한되지 않고, 일 예로 pH 6 이상, 구체적으로 pH 7 내지 pH 9에서 생존가능하며, pH 8.0 이상 내지 pH 9.0 미만에서 최적의 성장률을 가질 수 있다.
상기 MP3 변이주는 두나리엘라 속 지아 1(Dunaliella sp. Zea1, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 81, NO. 1)을 원조류로 하여 화학 돌연변이를 통해 개발되었고, ITS 서열 분석을 통하여 동정한 결과 두나리엘라(Dunaliella) 속(sp.) 조류로 동정되었다.
구체적으로, 염기서열을 증폭시키는 프라이머로 ITS1(ITS1-F: TCCGTAGGTGAACCTGCGG, ITS1-R: GCTGCGTTCTTCATCGATGC)과 ITS2(ITS1-F: GCATCGATGAAGAACGCAGC, ITS2-R: TCCTCCGCTTATTGATATGC)를 사용하여, 두나리엘라 균주(야생형, 지아 1, 원조류) 그리고 변이주 MP3의 ITS1과 ITS2 염기서열 분석결과를 종합하여 clustalW 프로그램을 이용하여 비교(align)하고, MEGA6 프로그램에서 UPGMA 알고리즘(unweighted pair group method with arithmetic mean)을 이용하여 계통도로 나타내었다 (도 8b).
위상학적인 측면에서 계통도를 보면, 본 발명의 변이주가 원조류인 지아 1과 거리가 가깝고, 이 둘은 야생형인 Dunaliella 속(sp.)과 가까운 것을 확인하였다. 또한, Dunaliella tertiolecta A2와 계통학적으로 연관이 있는 것을 확인할 수 있다.
상기 분석결과를 토대로, 본 발명의 선발된 변이주는 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3)(Dunaliella sp. Macular pigment 3(MP3))로 명명하였으며, 상기 변이주는 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2016년 3월 16일자로 기탁되어, 2016년 3월 23일자로 수탁번호 KCTC 12990BP를 부여 받았다.
본 발명의 MP3 변이주는 세포 내에 색소, 특히 잔토필계 색소를 고함량으로 축적할 수 있고, 그 중 지아잔틴의 함량을 더욱 높게 포함할 수 있어, 상기 조류를 배양하여 식품, 사료, 의약품 등의 원료로 효과적으로 사용될 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)의 배양물에 관한 것이다.
본 발명에서 "배양물"이란 특정 미생물이 배양된 배지, 즉 배양 후 배지를 의미하는 것으로, 상기 배양물은 상기 두나리엘라 속 MP3를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 상기 배양물은 배양 후 배양배지를 농축, 건조 등의 가공을 한 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물을 모두 포함하는 의미이다. 상기 배양물은 그의 부산물을 포함할 수 있고, 그 제형이 한정되지 아니하며, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다.
상기 배지는 특성 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 배지의 pH는 두나리엘라 속 MP3 조류가 생장가능한 범위일 수 있고, 일 예로 pH 6 이상, 바람직하게는 pH 7 내지 pH 9 일 수 있다.
또한, 본 발명의 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택 된 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 변이주는 지아잔틴 및 루테인을 포함하는 잔토필계 색소를 생성하여 체내 축적하는 특성을 가지는바, 이러한 측면에서 상기 조성물은 색소 조성물 또는 잔토필 색소 조성물일 수 있다.
상기 색소 조성물은 조성물에 포함된 총 색소의 함량에 대하여 지아잔틴이 10 중량% 내지 15 중량%로 포함된 것 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따라, 두나리엘라 야생형 조류, 지아 1 조류 및 MP3 변이주 각 세포당 총 색소 내 지아잔틴의 함량을 측정한 결과, MP3 변이주의 경우 야생형 및 지아 1과 비교해서도 색소 중 지아잔틴의 함량이 현저하게 높은 것을 확인 할 수 있었다(도 7a).
상기 색소 조성물은 식품 또는 사료의 원료로 사용될 수 있고, 경구투여를 위한 제제로 사용될 수 있다.
따라서, 상기 조성물 또는 추출물을 포함하는 색소 조성물 또는 잔토필 색소 조성물은 식품, 의약품 또는 사료 등에 포함되는 경구로 공급될 수 있다는 점에서 경구 투여용 조성물 일 수 있다.
경구 투여용 조성물의 경우, 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화된 경구용 제제에 포함될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제물를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 또는 사료에 특별한 목적 용도를 달성하기 위하여 첨가 될 수 있으므로, 이러한 측면에서 식품 조성물, 식품첨가제용 조성물, 사료 조성물 또는 사료첨가제용 조성물 일 수 있다. 상기 조성물이 사료 또는 식품에 사용되는 경우, 두나리엘라 속 MP3 조류에 의해 생산되고 세포에 축적된 잔토필 색소, 특히 지아잔틴 및 루테인에 의하여 체내 건강을 유지 또는 강화 할 수 있다. 구체적으로, 상기 지아잔틴 및 루테인은 황반 색소로서 황반의 변성 등을 예방 또는 개선할 수 있어, 황반변성과 관련된 눈질환의 예방 또는 개선에 효과적이다. 더욱 구체적으로 상기 지아잔틴 및 루테인은 눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선 효과가 있으므로, 상기 사료 또는 식품 조성물은 상기 증상의 예방 또는 개선, 또는 상기 효과를 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "첨가제용"은 식품 또는 사료에 주원료가 외에 첨가되는 구성이라면 모두 포함되며, 구체적인 예로 식품 또는 사료에서 기능성을 갖는 유효 활성물질 또는 가공식품에서 착색, 보존 등을 위해 첨가되는 식품 의약품 안전처에서 정의하고 있는 식품첨가물 일 수 있다.
상기 식품은 건강 기능성 식품 일 수 있다. 보다 구체적으로, 눈 건강을 위한 건강 기능성 식품 일 수 있다.
상기 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제용 조성물은 본 발명의 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물의 활성을 해치지 않는 범위에서 다른 유효성분을 더 포함할 수 있다. 또한, 담체 등의 부가 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료 는 본 발명의 두나리엘라 속 MP3 조류, 상기 조류의 건조 균체, 상기 조류의 배양물 및 이의 추출물을 포함하고, 추가적으로 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 포함하여 제조할 수 있다. 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 두나리엘라 속 MP3 조류, 상기 조류의 건조 균체, 상기 조류의 배양물 및 이의 추출물을 포함하여, 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있다. 사일레지는 청예사료와 두나리엘라 속 MP3 조류, 상기 조류의 건조 균체, 상기 조류의 배양물 및/또는 이의 추출물을 혼합하여 제조될 수 있으나, 본 발명의 조성물의 사용이 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 식품 또는 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제 (powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따 라 적절히 선택할 수 있다. 상기 조성물의 pH는 조성물이 사용되는 약제, 식품 등의 제조조건 등에 따라서 용이하게 변경 가능하다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 상기 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
상기 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)는 그 자체 또는 건조된 형태로 조성물에 포함될 수 있고, 상기 조류의 배양물은 농축 또는 건조된 형태로 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 상기 건조물은 상기 조류 또는 그 배양물의 건조된 형태를 의미하는 것으로, 동결건조 등에 의해 제조된 분말 형태일 수 있다.
또한, 상기 추출물은 MP3 조류, 이의 배양액 또는 이의 건조물로부터 추출하여 얻어진 것을 추출물을 의미하는 것으로, 용매 등을 이용한 추출물, 본 발명의 MP3 조류를 파쇄하여 얻어진 것을 포함한다. 구체적으로 본 발명의 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류의 세포 내에 축적된 색소를 물리적 또는 화학적 방법으로 추출 및 분리한 것 일 수 있다.
상기 추출과정은 통상의 방법에 의하여 수행될 수 있고, 일 예로 추출용매를 가하고 균질화한 후, 균체를 파쇄하여 목적 색소를 추출할 수 있다. 추출 후에는 원심분리하여 조류의 파쇄물을 제거하고, 추출용매는 감압증류 등의 방법으로 제거할 수 있다. 또한 통상의 정제공정을 더 포함할 수 있다. 상기 색소의 경우 물에 녹지않는 성질을 가지므로, 본 발명의 조류로부터 더욱 용이하게 추출될 수 있다.
본 발명의 두나리엘라 MP3 변이주는 낮은 광도에서 잔토필, 특히 지아잔틴의 우수한 생산능을 가지므로, 상기 변이주 및 이의 부산물을 포함하는 조성물은 신체 활성 향상, 체기능성 유지 및 저하 예방 효과를 가진다. 구체적으로, 상기 잔토필 색소는 황반변성 억제 효과, 항산화, 항암효과 등이 있는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 조성물은 신체건강 유지용, 구체적으로 상기 잔토필 색소가 관여하는 신체 기능의 유지, 저하 예방 또는 향상을 용도로 식품, 의약품 또는 사료 등에 포함되는 원료로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)를 이용한 색소 생산방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)를 배양하는 단계를 포함하는 식품 또는 사료 원료 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)를 이용하는 경우 배양되는 두나리엘라 조류 내의 잔토필 축적량을 높일 수 있어, 산업적으로 사용되는 원료의 공급 등을 효율적으로 수행할 수 있다.
상기 생산방법은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 생산방법은 상기 배양 단계 이후에, 배양물로부터 본 발명의 두나리엘라(Dunaliella) 속(sp.) MP3 조류를 분리하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 분리된 조류는 건조를 포함한 가공 단계를 더 거칠 수 있다.
또한, 상기 생산방법은 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물로부터 색소를 추출하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 배양은 NaCl 농도를 기준으로 0.05M 내지 5.5M의 염도 조건의 배지에서 수행될 수 있다. 또한, 약광 조건, 구체적으로 10 내지 2,000 μmol photons/m2s 범위의 광도 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 두나리엘라 MP3 변이주의 경우 낮은 광도에서도 색소 생산능이 우수하여, 체내 잔토필 함량을 높일 수 있는바, 고광도의 에너지를 투여하지 않고도 우수한 잔토필 축적을 달성 할 수 있어, 산업적으로 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 이러한 추출은 미생물로부터 색소를 추출하는 방법에 대한 통상적인 방법으로 수행할 수 있고, 일 예로 효소법, 초음파 추출, 기계 추출법 등이 있으며 이에 한정되지 않는다.
상기 생산방법은 배양 단계 외에, 배양 후 조류의 함량을 높이는 농축 단계, 농축 단계를 거친 조류의 수분을 더욱 감소시킴으로써 건조시키는 건도 단계를 더 포함할 수 있다. 그러나 농축단계 또는 건조 단계가 반드시 필요한 것이 아니며, 일반적으로 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 농축 및 건조 방법, 기계를 사용하여 수행할 수 있다.
상기 생산방법은 상기 추출 단계 이후 정제단계를 더 포함하여 수행할 수 있고, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 정제방법에 의하여 수행될 수 있다.
상기 농축 또는 건조 단계를 거쳐 제조된 잔토필은 식품, 건강기능성 식품, 화장품 또는 약제 등의 원료로 사용될 수 있다.
상기 잔토필 생산방법은 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위 내에서 다른 방법을 채용하여 수행될 수 있다.
상기 조류 및 조성물에 대한 내용은 본 발명의 생산방법에도 준용될 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 돌연변이 유도, 변이주 선발 및 형태적 특성 분석
두나리엘라 속(Dunaliella sp.)에서 유래되었고, 본 실험에서 원조류로 사용한 지아잔틴 고함량 조류인 지아 1(Dunaliella sp. Zea1)을 하기 표 1에 표기한 조성의 액체배지에서 배양하였다. 배양 조건은 광도 약 100 μmol photons/m2s, 온도는 25 ~ 26 ℃로 하였고, 90 rpm의 속도로 진탕 배양하였다.
성분 배양액 내 농도
염 및 다량 성분
NaCl 1.5 M
Tris 40 mM
KNO3 5 mM
MgCl2 4.5 mM
MgSO4 0.5 mM
CaCl2 0.3 mM
K2HPO4 0.1 mM
FeCl3 0.002 mM
NaEDTA 0.02 mM
미량 성분
H3BO3 50μM
MnCl2 10μM
ZnSO4 0.8μM
CuSO4 0.4μM
NaMoO4 2μM
NaVO3 1.5μM
CoCl2 0.2μM
탄소원
NaHCO3 25 mM
배양액의 pH 7.4
원조류인 지아 1을 대수기에 이를 때까지 배양한 후 원심분리하여 세포를 수확하고, 8×106 ~ 10×106 cells/mL의 세포 밀도가 되도록 다시 현탁하여 화학적 돌연변이 유도물질인 EMS(Ethylmethane sulphonate)를 최종 농도 0.2μM이 되도록 처리하였다. 두 시간 동안 그대로 인큐베이션한 후, 처리에 사용한 EMS를 액체배지로 세척하고 원심분리하여 세포만 수확하였다. 이를 다시 액체배지로 재현탁하여 하루 동안 암(暗)상태로 배양한 후, 상기 표 1의 액체배지와 동일한 조성에 한천만 더 첨가된 고체배지로 옮겨 도말하였다. 1주일 후, 고체배지상에 생겨난 콜로니들을 분리하여 표 1의 액체배지로 단일 콜로니를 옮기고, 액내 배양하였다. 각 콜로니의 특성을 분석하여 변이주를 선발하였다.
구체적으로, 육안으로 관찰하여, 야생형 및 원조류(지아 1, Zea1)보다 더 연한 녹색을 띠는 콜로니를 1차 선발하였고, 1차 선발된 콜로니의 조류의 HPLC 분석을 통해서 상대적으로 지아잔틴 함량이 높은 조류를 2차 선발하였다.
돌연변이주의 형태적 특징을 비교하기 위해서 야생형 두나리엘라 속 조류와 본 발명의 원조류인 지아 1, 그리고 본 발명에서 얻은 돌연변이주인 MP3 변이주(macular pigment mutant 3, 이하 변이주 또는 MP3 변이주)의 현미경 사진을 도 1a에 나타내었다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 동일한 조건의 광도 하에서 두나리엘라 속 야생형, 지아 1, 그리고 변이주 조류가 서로 유사한 모습으로 자란 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 변이주는 야생형 조류와 동일한 형태를 가지며, 세포 색상의 명도에서만 차이가 있음을 확인하였다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 야생형 두나리엘라 속 조류와 지아 1에 비해 변이주의 색상이 더 연한 녹색과 황색을 띠며, 하단의 액체배양액에서도 변이주의 색상이 더 연한 녹색과 황색을 띠는 것을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 100 μmol photons/m2s하에서 성장을 비교하기 위해 배양한 액체배지의 플라스크 사진에서 본 발명의 원조류인 지아 1은 야생형과 비교해서 성장속도에서 큰 차이가 나지 않지만, MP3 변이주는 야생형 및 지아 1 조류와 밀도에 따른 색상의 차이가 나타났다. 이는 야생형 및 지아 1 조류와 본 발명의 성장 속도의 차이에 따른 것이라 해석하였고, 실제로 하기 도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 변이주가 지아 1과 성장속도가 1 내지 1.5일의 차이가 있기 때문에 사진상에서도 밀도에 따른 색상 차이가 나타나는 것임을 확인하였다.
[실시예 2] 분리된 변이주의 성장 특성 확인
2-1. 성장 속도 확인
야생형 두나리엘라 조류, 지아 1, MP3 변이주의 세포 증식 속도 및 최종 생장량을 비교하기 위해 표 1에 제시된 성분의 배지에 각 조류를 1 x 106세포/mL의 세포 밀도로 접종한 후, 각각 50, 100 및 300 μmol photons/m2s의 서로 다른 광도에서 배양하였다. 비교 실험에서 온도는 25 ~ 26℃로 하였고, 90rpm의 속도로 진탕 배양하였다. 배양 개시 후 제 1, 2, 3, 4, 5일 각각에 배양액을 0.5 mL 채취하여 혈구계수기를 이용해 현미경 하에서 밀리리터 당 세포 수를 계수하였다. 계수 시점마다 광도별 세포의 밀도를 측정하여, 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, MP3 변이주는 배양기간이 경과함에 따라 야생형과 지아 1에 비해 세포수의 증가폭은 작았다. 동일 세포수에 도달하는 시간을 비교해 본 결과 야생형 조류가 MP3 변이주와 비교해서 1일 ~ 1.5일 정도 생장 속도가 빨랐지만, 최종 세포밀도는 비슷한 수준에 도달하는 것을 확인하였다.
2-2. 건조중량 측정
실제적으로 미세조류를 산업적으로 이용하기 위해서는 건조 중량 또한 중요한 부분이므로, 이들의 최종 바이오매스를 비교하기 위해 건조중량을 측정하였다.
구체적으로, 시료는 100 x 104세포/mL로 접종해서 대수기인 2일째에 수확하였다. 각각의 조류의 최종 생물량(바이오매스)을 비교하기 위해 배양 중인 현탁액 1mL, 2mL를 미세필터(거름종이)에 걸러서 수확한 후 65 ℃ 드라이오븐(dry oven)에서 24시간 동안 건조하여 1 x 106 세포의 야생형, 지아 1 및 변이주 각각 건조중량을 측정하였다. 두나리엘라는 고염도의 액체배지에서 키우기 때문에 원심분리를 통해서 수확을 한 후에도 잔존 염분이 남아있어서 세포의 건조 중량에 영양을 미칠 수 있기 때문에, 거름종이에 걸러서 염분을 최대한 제거한 상태로 실시하였다. 그 결과를 도 4a에 나타내었다.
또한, 배양액 0.5 ml, 1 ml, 2 ml에서의 각각의 건조 중량을 계산하고, 이를 통해서 추세선을 그려 배양액 1L에서의 건조 중량을 비교하였다(도 4b).
도 4a에 나타낸 바와 같이, 세포 수에 비례하여 리터 당 건조중량에 차이가 있음을 확인하였다. 세포수당 건조중량은 지아 1 조류가 가장 높았고, 리터당 건조중량은 야생형 두나리엘라 조류가 가장 높음을 확인하였다. 따라서, 동일 광도 조건 하에서 본 발명의 변이주의 성장 및 증식 속도가 야생형, 지아 1 조류보다 느림을 알 수 있다. 조류의 경우 콜로니를 형성하는 세포수가 너무 많은 경우, 세포로 전달되는 빛의 투과량이 낮아져 오히려 광합성률이 낮아질 수 있는데, 본 발명의 변이주가 단위세포 또는 건조 중량 당 색소 함량이 높다면, 색소 생산 조류로 더욱 적합할 것으로 예상하고, 색소 함량을 확인하는 실험을 수행하였다.
[실시예 3] 변이주의 색소 분석
돌연변이 물질 처리 이후 생겨난 콜로니들은 단일 콜로니로 분리 후, 계속 배양하고, 각 콜로니에 대한 HPLC를 이용해 색소분석을 수행하였다.
구체적으로, 분리된 단일 콜로니들을 액체배지에서 100 μmol photons/m2s 조건으로 5일 동안 배양하였고, 구체적인 배양조건은 실시예 1의 배양조건과 같이 수행하였다. 수확된 조류들을 80% 아세톤을 사용하여 색소를 추출하고 원심분리한 상층액을 다시 나일론 필터를 이용하여 여과한 후 HPLC에 주입하여 분석하였다.
구체적으로, 색소를 분리하기 위해 용매의 총 유속은 분당 1.2mL로 하였고, 제 0분 내지 제 15분까지 pH 8.0의 Tris는 14%, 아세토니트릴은 84%로부터 0%까지 각각 균일하게 감소시키고, 메탄올과 에틸아세테이트는 2%로 시작하여 제15분까지 각각 68%, 32%까지 증가시켰다. 이후 3분 동안(제15분 내지 18분) 이 용매 비율을 그대로 유지시킨 다음, 1분 동안(제18분 내지 제19분) 각 용매의 비율을 시작할 때의 비율로 되돌린 다음 나머지 6분간 그대로 유지하며 포스트-런(post-run)을 하였다. 펌프는 Shimadzu사의 LC-20A Prominence를, 컬럼은 Watera SpherisorbTM S5(DS1 4.6 x 250 mm, 5μm Cartridge Column, USA)을 사용하였고, 컬럼의 온도는 40 ℃로 유지하였다. 검출기는 포토다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector: SPD-M20A, Shimadzu)를 사용하여 데이터를 분석하였고, 지아잔틴을 비롯한 카로티노이드 색소들은 445nm에서, 엽록소 a는 670nm에서 검출된 결과를 DHL(Agern Alle, Horsholm, Denmark)에서 구입한 지아잔틴과 엽록소 a를 정량한 표준곡선을 스탠다드로 사용하여 농도를 구하였다.
도 5에 각 조류에 색소 프로파일을 나타내는 HPLC 분석 그래프를 나타내었고, 크로마토그램을 이용해 100 μmol photons/m2s 하에서 자란 각 조류들의 지아잔틴 및 루테인 함량을 정량적으로 분석한 그래프를 도 6에 나타내었다.
또한, 100 μmol photons/m2s 광도조건, 250ml 플라스크 내 배양액 100ml에서 배양 후 2일 째(조류가 정지기(stationary phase)에 돌입하는 시점) 되는 날, 각 조류들을 1 x 106 세포수 또는 배양액에서 세포만을 수확한 후, 건조 세포 중량(DCW: Dry cell weight) 1g을 기준으로 지아잔틴의 함량 비교결과를 도 6a, 지아잔틴 및 루테인 함량 비교결과를 도 6b에 나타내었다. 상기 DCW 당 색소의 함량은 HPLC를 이용하여 얻은 색소의 함량 (mg/L)을 1ml 당 세포의 수(1 x 106 cells/ml)로 나누어 얻은 값(mg/1 x 106 cells)을 대상으로, 1 x 106 cells 당 건조중량 (mg/1 x 106 cells)으로 나누어 주는 방법으로 계산하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 MP3 변이주는 야생형 조류 및 원조류인 지아 1과 비교해서 더 높은 지아잔틴 피크(5번)를 가짐을 확인하였다. 또한, 지아 1이 지아잔틴 축적 돌연변이주 임에도 불구하고, 본 발명의 MP3 변이주와 비교하였을 때, 본 발명의 변이주가 더 높은 지아잔틴 생산능을 가짐을 알 수 있다.
도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 동일한 배양 조건에서 MP3 변이주는 야생형에 비해 20배 이상의 증가된 지아잔틴을 축적하고 있었고, 원조류인 지아 1과 비교했을 때도 약 40% 이상의 증가된 지아잔틴을 축적하고 있었다. 따라서, 본 발명의 MP3 변이주는 종래의 두나리엘라 종과 비교해서도 현저하게 높은 지아잔틴 생산능을 가짐을 알 수 있다.
[실시예 4] 분리된 변이주에서의 지아잔틴 생산능 확인
육안 관찰 및 상기 HPLC에 의한 정량분석에 의하여 분리한 변이주에서 축적되는 지아잔틴의 양을 원조류(지아 1, Zea1)에서 축적되는 양과 비교하였다.
서로 같은 광도 조건 하(100 μmol photons/m2s)에서 자란 변이주는 야생형 두나리엘라 조류, 그리고 원조류(지아 1, Zea1)조류와 세포 자체의 크기에서는 큰 차이를 보이지는 않았지만(도 1a), 도 1b에 나타낸 바와 같이 500 x 104세포/mL로 맞추어서 고체배지와 액체배지에 접종하였을 때는 MP3 변이주가 야생형에 비해 황색을 띠는 것을 볼 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이주는 100 μmol photons/m2s의 비교적 낮은 광도에서도 지아잔틴을 지속적으로 축적한다는 것을 육안으로도 확인할 수 있고, 이 광도 조건은 일반적으로 많은 에너지를 요구하지 않는 조건으로, 적은 에너지를 들여 고효율로 목적하는 산물을 얻을 수 있는 이점이 있다는 것을 시사한다.
특히, 본 발명의 변이주는 동일한 광도조건 하에서 야생형 및 지아 1 조류와 비교해서 성장속도가 느림에도, 단위 세포수 당 조류 내 축적 지아잔틴의 함량이 높은바, 이는 종래 잔토필 생산 조류보다 더 우수한 효율로 잔토필 생산조류로 활용될 수 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 변이주에 축적되는 지아잔틴의 생산능이 배양 이후 유지될 수 있는지를 확인하는 실험을 하였다.
변이주의 지아잔틴 생산능을 확인하기 위해서, 500mL 부피의 배양액에서 1x106 세포/mL로 접종하여 배양을 진행하였다. 광도와 진탕 배양 조건은 상기와 동일하다. 접종 후, 14일 동안 배양 (정지기 상태에 돌입 후, 11-12일째)하고, 세포를 수확하여 총 색소 중 지아잔틴의 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 7a 및 7b에 나타내었다.
도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 변이주(MP3)의 지아잔틴 생산량은 종래 원조류인 지아 1의 6mg/gDCW 보다 30% 이상 증가한 8.3mg/gDCW 인 것을 확인할 수 있었다. 본 발명의 변이주 MP3를 야생형, 원조류인 지아 1과 비교하였을 때, 총 색소 중 지아잔틴의 함량이 월등히 높은 것을 확인할 수 있고, 건조 중량 당 지아잔틴의 생산량도 종래 원조류인 지아 1보다도 현저하게 높아졌음을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 MP3 변이주의 경우 현저히 우수한 지아잔틴 생산능을 가짐을 확인하였다.
[실시예 5] 분리된 변이주의 계통 확인
상기 실시예 1에서 선발된 본 발명의 MP3 변이주의 계통을 확인하기 위하여, ITS 유전자 서열을 분석(gene sequencing)하여 미생물을 동정하였다.
구체적으로, ITS 서열을 분석하기 위하여 PCR 을 통해 증폭한 ITS의 PCR 산물을 전기영동 후(도 8a), 증폭된 부분을 아가로즈 겔에서 잘라내어, ㈜ Cosmo genetech의 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리한 뒤 ㈜ 마크로젠에 염기서열의 분석을 의뢰하였다.
분석된 염기서열들을 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 두나리엘라(Dunaliella) 몇몇 균주들의 ITS와 비교(align)하였다. 우선 각 균주들의 ITS 염기서열들을 clustalW 프로그램을 사용하여 비교하고, 비교된 염기서열들을 MEGA6 프로그램에서 UPGMA 알고리즘(unweighted pair group method with arithmetic mean)을 이용하여, 계통도(phylogenetic tree)를 그려 계통학적 관계를 비교 분석하였다. 이때 비교 대상으로 삼은 두나리엘라의 ITS 서열은 NCBI의 gene bank에서 얻었으며, 자세한 내용은 다음과 같다(괄호 안은 gene bank code). D.tertiolecta A2(U66956), D.tertiolecta UTEX999 (AF313434, AF313434), D.salina UTEX1644(AF313428, AF313429), D.salina CONC006(AF313424, AF313425), D.salina CONC007(AF313426, AF313427), D.bardawil strain ATCC30861(AF313430, AF313431), D.lateralis(AF313444, AF313445), C.reinhardtii(U66954).
도 8b에 나타낸 바와 같이, 위상학적인 측면에서 본 발명의 변이주는 Dunaliella 속(sp.)에 포함되는 것임을 확인하였고, MP3(Macular pigment 3)가 원조류인 지아 1과 거리가 가깝고, 이 둘은 야생형 Dunaliella sp.과 가까우며, Dunaliella tertiolecta A2와 계통학적으로 연, 따라서 Dunaliella tertiolecta와 유전적으로 가장 가까운 근연종 임을 확인하였다.
이를 기초로, 본 발명의 선발된 변이주는 두나리엘라 속(Dunaliella sp.)으로 동정되었고, 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3)(Dunaliella sp. Macular pigment 3(MP3)로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)로부터 기탁번호 KCTC 12990BP를 부여 받았다.
Figure PCTKR2017005685-appb-I000001
Figure PCTKR2017005685-appb-I000002

Claims (13)

  1. 잔토필 생산능을 갖는 두나리엘라 속 Macular Pigment 3(MP3)(Dunaliella sp. Macular pigment 3(MP3), KCTC 12990BP) 조류(algae).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 두나리엘라 속 MP3는 루테인(lutein)과 지아잔틴(zeaxanthin); 그리고
    엽록소 b(chlorophyll b), 엽록소 a(chlorophyll a) 및 베타-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 색소의 생산능을 갖는 조류(algae).
  3. 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)의 배양물.
  4. 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 색소 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 색소 조성물은 총 색소 100 중량부에 대하여 지아잔틴을 10 내지 15 중량부로 포함하는 것인, 색소 조성물.
  6. 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경구 투여용 조성물.
  7. 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 사료 또는 사료첨가제용 조성물.
  8. 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 또는 식품첨가제용 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선을 위한 것인, 조성물.
  10. 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)를 배양하는 것을 포함하는 이용한 색소 생산방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae), 상기 조류의 배양물, 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물로부터 색소를 추출하는 것;을 포함하는 색소 생산방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 색소는 잔토필 색소인, 색소 생산방법.
  13. 두나리엘라 속 MP3(Dunaliella sp. MP3, KCTC 12990BP) 조류(algae)를 배양하는 것을 포함하는 식품 또는 사료의 원료 생산방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102157596B1 (ko) * 2018-10-12 2020-09-18 한양대학교 산학협력단 두나리엘라 배양용 조성물 및 이의 배양방법
KR102107539B1 (ko) 2019-12-18 2020-05-07 송성은 침투이행성과 식이유용성이 증진된 아스타잔틴 및 유용지방산을 포함하는 미세조류 마이크로 분말의 제조방법
KR102508306B1 (ko) * 2020-03-24 2023-03-10 한양대학교 산학협력단 루테인 및 제아잔틴의 함량이 증대된 계란 생산방법, 이로부터 생산된 계란, 및 상기 계란으로부터 난황유 또는 난황 분말을 제조하는 방법
KR20220159073A (ko) * 2021-05-25 2022-12-02 한양대학교 산학협력단 신규 두나리엘라 살리나 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060060039A (ko) * 2003-09-17 2006-06-02 니폰 오일 코포레이션 카로티노이드 화합물의 제조방법
KR20100081388A (ko) * 2009-01-06 2010-07-15 한양대학교 산학협력단 신규한 베타-카로틴 생산 균주 및 이를 이용한 베타-카로틴제조방법
CN101597569B (zh) * 2009-05-11 2011-01-05 新奥科技发展有限公司 经甲基磺酸乙酯诱变选育获得的高生长速率杜氏藻

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19838636A1 (de) * 1998-08-26 2000-03-02 Basf Ag Carotinoid-Formulierungen, enthaltend ein Gemisch aus beta-Carotin, Lycopin und Lutein
CN104770424A (zh) * 2008-10-14 2015-07-15 索拉兹米公司 微藻生物质的食品组合物
CN101785854B (zh) * 2010-02-11 2012-10-31 石家庄惠仕医药保健品有限公司 叶黄素多维营养保健药物组合物、其制备方法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060060039A (ko) * 2003-09-17 2006-06-02 니폰 오일 코포레이션 카로티노이드 화합물의 제조방법
KR20100081388A (ko) * 2009-01-06 2010-07-15 한양대학교 산학협력단 신규한 베타-카로틴 생산 균주 및 이를 이용한 베타-카로틴제조방법
CN101597569B (zh) * 2009-05-11 2011-01-05 新奥科技发展有限公司 经甲基磺酸乙酯诱变选育获得的高生长速率杜氏藻

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIN, EONSEON ET AL.: "A Mutant of the Green Alga Dunaliella Salina Constitutively Accumulates Zeaxanthin Under All Growth Conditions", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 81, no. 1, 5 January 2003 (2003-01-05), pages 115 - 124, XP002388742 *
MENDOZA, HECTOR ET AL.: "Characterization of Dunaliella Salina Strains by Flow Cytometry: a New Approach to Select Carotenoid Hyperproducing Strains", ELECTRONIC JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 11, no. 4, 15 October 2008 (2008-10-15), pages 1 - 13, XP055447031 *

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