WO2022158814A1 - 제아잔틴 및 루테인의 생산성이 높은 신규 미세조류 - Google Patents

제아잔틴 및 루테인의 생산성이 높은 신규 미세조류 Download PDF

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WO2022158814A1
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chlorella
zeaxanthin
lutein
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김희식
이용재
박수빈
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Definitions

  • the present invention relates to microalgae of the genus Chlorella characterized by excellent growth rate and high productivity of zeaxanthin and lutein.
  • Zeaxanthin is a type of carotenoid alcohol commonly found in nature and plays an important role in the circulation of xanthophylls and is mainly synthesized in plants.
  • Zeaxanthin is one of the carotenoid components contained in the retina of the eye and is found in the center of the macula and is known to play an important role in eye health.
  • Zeaxanthin acts as an antioxidant and protects the eye, and is known to be effective in improving eye diseases such as cataracts and macular degeneration, and is one of the pigments with high economic value.
  • lutein is one of the pigments widely known to be beneficial to eye health. It is known that lutein can help eye health by maintaining the density of macular pigment, which can be reduced due to aging.
  • An object of the present invention is to provide a novel microalgae capable of producing large amounts of zeaxanthin and lutein pigments, which have been extracted and produced from plants such as marigold, and their use for zeaxanthin and lutein production.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing zeaxanthin or lutein using the novel microalgae as described above.
  • one aspect of the present invention provides a Chlorella genus HS-LZ ( Chlorella sp. HS-LZ) microalgae deposited with accession number KCTC 14308BP.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of culturing Chlorella genus HS-LZ ( Chlorella sp . HS-LZ) microalgae deposited with accession number KCTC 14308BP; And it provides a method for producing zeaxanthin or lutein, comprising the step of obtaining a pigment from the culture medium of the microalgae.
  • compositions for producing zeaxanthin or lutein comprising microalgae of the genus Chlorella HS-LZ deposited with accession number KCTC 14308BP .
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases, comprising Chlorella genus HS-LZ ( Chlorella sp . HS-LZ) microalgae or extracts thereof deposited with accession number KCTC 14308BP.
  • Another aspect of the present invention provides a health functional food for preventing or improving eye diseases, comprising Chlorella genus HS-LZ ( Chlorella sp . HS-LZ) microalgae or an extract thereof deposited with accession number KCTC 14308BP.
  • Chlorella genus HS-LZ Chlorella sp . HS-LZ
  • KCTC 14308BP accession number
  • the novel Chlorella genus HS-LZ microalgae of the present invention can grow in seawater, freshwater and brackish water and exhibits a high growth rate. have.
  • the HS-LZ microalgae have the characteristic of being able to produce zeaxanthin, unlike the conventional HS2 microalgae of the genus Chlorella, and the pigment produced by the HS-LZ microalgae is mostly zeaxanthin and lutein, so other types of microalgae including chlorophyll a Since it contains almost no pigment, there is an advantage that the process for separating and purifying zeaxanthin and lutein can be greatly simplified.
  • the method for producing zeaxanthin or lutein using microalgae of the present invention omits a harvesting process that requires a separate labor, and Since microalgae are single-celled organisms, the product has the advantage of being able to produce stable pigments because of the homogeneous characteristics.
  • the HS-LZ microalgae of the present invention has the advantage that under certain conditions, the productivity of zeaxanthin and lutein is remarkably increased, so that stable pigment production is possible with high efficiency.
  • 1 is a mutation induced by EMS treatment on HS2 microalgae of the genus Chlorella and smeared on a solid medium, confirming the color change of the medium for each microalgal colony.
  • Figure 2 is a HS2 microalgal mutant colony in Chlorella genus in which the solid medium is changed to a color other than green by treatment with EMS, while culturing in a liquid medium again, the condition in which light is not given (dark) and the condition in which light is given (light) ) is the result of incubation.
  • Figure 3 is an HPLC result of analyzing the pigment components produced in the wild-type Chlorella genus HS2 microalgae (Wild), variants M2 to M7 and the Chlorella genus HS-LZ of the present invention.
  • FIG. 4 shows wild-type Chlorella genus HS2 microalgae (Wild), variants M2 to M7, Chlorella genus HS-LZ of the present invention, and culturing the HS-LZ under stress conditions in which an organic carbon source does not exist (LZ-st ) is a graph comparing the content of each component (lutein, zeaxanthin, etc.) in the pigment produced from
  • the present invention provides a novel Chlorella genus microalgae.
  • the microalgae of the present invention are Chlorella genus HS-LZ ( Chlorella sp. HS-LZ) microalgae deposited with accession number KCTC 14308BP.
  • the Chlorella genus HS-LZ is a novel microalgae made by improving the Chlorella genus HS2 microalgae (Accession No. KCTC 13108BP), and the Chlorella genus HS2 microalgae has high growth in environments given various carbon sources or in freshwater, seawater and brackish environments. Since it indicates the speed and has excellent biomass, pigment, and lipid productivity, the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella of the present invention may also exhibit the advantages and characteristics of the genus HS2 microalgae of the chlorella genus.
  • the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may include a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, specifically, 18s rDNA of the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 it could be
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is the same as the 18s rDNA sequence of the HS2 microalgae of the genus Chlorella, and accordingly, it can be identified that the microalgae of the genus Chlorella HS-LZ of the present invention are classified into the genus Chlorella.
  • the Chlorella genus HS-LZ microalgae can produce zeaxanthin. Unlike conventional Chlorella microalgae, for example, Chlorella genus HS2 microalgae cannot produce zeaxanthin, the Chlorella genus HS-LZ microalgae of the present invention can produce zeaxanthin.
  • Chlorella genus HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may produce lutein.
  • Chlorella genus HS-LZ microalgae of the present invention may have higher productivity of lutein compared to conventional Chlorella microalgae, such as Chlorella genus HS2 microalgae.
  • the zeaxanthin and lutein are known to have an activity to help eye health and are pigments with high economic value, and the microalgae of the present invention are characterized by being able to produce the pigments with high purity, to produce zeaxanthin or lutein It can be usefully used for the purpose of preventing, treating, or improving eye health.
  • the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may produce the zeaxanthin or lutein and accumulate in the cell, or may be released to the outside of the cell.
  • the pigment produced by the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may contain at least one of zeaxanthin and lutein in an amount of 90 parts by weight or more with respect to 100 parts by weight of the pigment.
  • the dye contains 92 parts by weight or more, 95 parts by weight or more, 96 parts by weight or more, 97 parts by weight or more, 98 parts by weight or more, 99 parts by weight or more, or 99.5 parts by weight or more, based on 100 parts by weight of the pigment. It may be contained in an amount greater than or equal to parts by weight, and may not contain other pigments other than zeaxanthin and lutein.
  • the pigment produced by the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may not contain at least one selected from the group consisting of chlorophyll a, chlorophyll b, neoxanthin and violaxanthin.
  • Conventional Chlorella microalgae for example, HS2 microalgae of the genus Chlorella cannot produce zeaxanthin, or produce zeaxanthin, but other pigments in addition to zeaxanthin and lutein (the chlorophyll a, chlorophyll b, neoxanthine, violaxanthin, etc.) are also produced in large amounts.
  • a pigment other than zeaxanthin and lutein may be included in an amount of more than 10 parts by weight of the total pigment.
  • the pigment produced by the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella of the present invention contains at least one of zeaxanthin and lutein in the above range, and zeaxanthin and/or lutein occupy most of it to obtain zeaxanthin or lutein. In order to do this, there is an advantage that the process of separating and purifying them can be simplified or omitted.
  • the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may be to produce 1 mg/g to 5 mg/g of zeaxanthin per dry weight of the microalgal culture, specifically 1.2 mg/g to 4.5 mg/g, 1.5 mg/g to 4 mg/g, 1.9 mg/g to 3.6 mg/g, 1.8 mg/g to 2.2 mg/g, 1.9 mg/g to 2 mg/g, 3 mg/g to 4 mg/g, 3.3 mg/g to 3.8 mg/g or 3.5 mg/g to 3.7 mg/g of zeaxanthin may be produced.
  • the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may be to produce 0.2 mg/g to 3 mg/g of lutein per dry weight of the microalgal culture, specifically 0.5 mg/g to 2.5 mg/g, 0.6 mg/g to 2 mg/g, 0.7 mg/g to 1.5 mg/g, 0.5 mg/g to 1 mg/g, 0.6 mg/g to 0.9 mg/g, 0.7 mg/g to 0.9 mg/g, 1.2 mg/g to 1.5 mg/g or 1.3 mg/g to 1.4 mg/g of lutein may be produced.
  • the present invention provides a method for producing zeaxanthin or lutein.
  • the production method of the zeaxanthin or lutein of the present invention is Chlorella genus HS-LZ ( Chlorella ) deposited with accession number KCTC 14308BP. sp . HS-LZ) culturing microalgae; and obtaining a pigment from the culture solution of the microalgae.
  • the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella of the present invention have the characteristics of being able to produce zeaxanthin or lutein with high purity. High content of zeaxanthin or lutein can be produced. Most of the components of the pigment produced by the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella are zeaxanthin and lutein, and other pigments such as chlorophyll a, chlorophyll b, neoxanthin, and violaxanthin are hardly contained. Therefore, only zeaxanthin or lutein can be produced with high purity. There are advantages that can be
  • the step of culturing the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may be culturing under conditions in which light is given or conditions in which light is not given.
  • the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella of the present invention can produce zeaxanthin or lutein regardless of the presence or absence of light, and unlike other chlorella microalgae that are generally cultured under light conditions, cancer that does not receive light There is an advantage that the production of zeaxanthin or lutein is possible even under conditions.
  • the step of culturing the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may be culturing in a conventional chlorella culture medium, for example, culturing in a medium containing sugars, amino acids, organic acids, and the like.
  • the medium may include glucose, dextrose, sucrose, fructose, maltose, lactose, molasses, glutamic acid, malic acid, citric acid, and the like.
  • the Chlorella genus HS-LZ microalgae may be cultured in a medium further containing a nitrogen source and an inorganic salt.
  • the nitrogen source is nitrate, nitrite, urea, ammonium chloride, ammonia, peptone, tryptone, yeast extract, beef extract, malt extract, potato extract or NPK fertilizer.
  • the inorganic salt may be Na+, K+, Mg2+ or Ca2+, but is not limited thereto.
  • the medium may be a commonly used complex fertilizer for plants, a complex medium for microbial fermentation, BG11 medium, and the like.
  • the water contained in the medium for culturing the Chlorella genus HS-LZ microalgae may be seawater, brackish water or fresh water, for example, but may be fresh water, but is not limited thereto, and the type of water contained in the medium is zeaxanthin or lutein. It can be appropriately selected in consideration of the process for producing HS-LZ microalgae of the genus Chlorella, and the like.
  • the step of culturing the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella may include culturing the microalgae for 3 to 14 days in a condition in which an organic carbon source does not exist, for example, 3 to 10 days. It may be cultured for days, 4 to 9 days, or 5 to 8 days.
  • the pigment production of the microalgae may be increased, and the production of zeaxanthin and lutein may be increased.
  • the step of culturing the HS-LZ microalgae in the genus Chlorella is to increase the number of cells by culturing in a medium in which an organic carbon source is present, and then to increase the production of zeaxanthin and lutein remarkably by culturing in a condition in which there is no organic carbon source.
  • the step of obtaining the pigment may include disrupting the microalgal cells in the culture medium.
  • the method of disrupting the microalgal cells may be any method as long as the cells are disrupted so as not to destroy or lose activity of intracellular pigment components, specifically zeaxanthin or lutein, for example, by treating the cells with ultrasonic waves (sonication) to disrupt them. may be doing
  • Obtaining the pigment may include extracting the pigment from the microalgae.
  • any extraction method known to those skilled in the art may be used, and as the extraction method, all conventional extraction methods known in the art such as solvent extraction (including extraction under low temperature and dark conditions), ultrasonic extraction, filtration, and reflux extraction may be used. and specifically, it can be prepared by using a solvent extraction method or a reflux extraction method.
  • the extraction process may be repeated several times, and thereafter, a step such as concentration or freeze-drying may be additionally performed. Specifically, the obtained extract is concentrated under reduced pressure to obtain a concentrate, and after freeze-drying the concentrate, a high concentration extract powder can be prepared using a grinder.
  • Extraction solvents include hexane, benzene, toluene, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran, acetone, acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetic acid, methanol, Alcohols having 1 to 4 carbon atoms, including ethanol, propylene glycol, propyl alcohol, butylene glycol, butyl alcohol, glycerin, and the like may be used, but is not limited thereto.
  • the method for producing zeaxanthin or lutein of the present invention may not include the step of removing chlorophyll a, chlorophyll b, neoxanthin and violaxanthin. That is, it may not include the step of separately separating only zeaxanthin and lutein.
  • the pigment produced by the HS-LZ microalgae in the genus Chlorella does not contain other pigments other than zeaxanthin and lutein, or may be contained in very small amounts. It can be obtained by producing zeaxanthin and lutein with high purity without going through a process.
  • a step of separating zeaxanthin and lutein may be further performed if necessary, and in this case, high performance liquid chromatography (HPLC) may be used, but limited thereto it is not
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • a step of separating zeaxanthin or lutein may be further performed.
  • Chlorella genus HS-LZ Chlorella sp . HS-LZ
  • Chlorella sp . HS-LZ provides a use for the production of zeaxanthin or lutein of microalgae.
  • composition for zeaxanthin or lutein production of the present invention includes microalgae of the genus Chlorella HS-LZ deposited with accession number KCTC 14308BP.
  • the description of the HS-LZ microalgae in the genus Chlorella is described above in '1. It is the same as described in 'New Chlorella genus microalgae'.
  • the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella are microalgae capable of producing zeaxanthin or lutein, and hardly produce other pigments except zeaxanthin and lutein among the produced pigments, so the separation and purification process of separate zeaxanthin or lutein is simplified It can be omitted or can be omitted, so that high-purity zeaxanthin or lutein can be easily produced.
  • lutein produced from HS-LZ microalgae in the genus Chlorella has the advantage that fatty acids are not connected to both ends of the lutein molecule, so the removal process is not involved.
  • the composition containing the microalgae can be usefully used to produce zeaxanthin or lutein.
  • Chlorella HS-LZ Chlorella sp . HS-LZ
  • the composition can be used for various purposes depending on the physiological activity exhibited by zeaxanthin or lutein, specifically, to treat eye diseases It can be used to prevent, treat or ameliorate.
  • the ocular diseases include macular degeneration (eg, age-related macular degeneration), vision loss, cataract, glaucoma, ocular peroxidation, retinal damage, dry eye, diabetic retinopathy, non-exudative age-related macular degeneration and exudative senile macular degeneration.
  • fibrosis including macular degeneration, choroidal neovascularization, retinopathy, acute and chronic macular neuroretinopathy, central serous chorioretinopathy, macular edema, acute multifocal plaque pigmentosa, Birdshot retinopathy, posterior scleritis, tortuous choroiditis, Subretinal fibrosis, uveitis syndrome, retinal artery occlusion, central retinal vein occlusion, disseminated intravascular coagulation, branched retinal vein occlusion, hypertensive fundus change, ophthalmic ischemia syndrome, retinal microvascular aneurysm, Coats' disease, central fovea Peripheral telangiectasia, hemilateral retinal vein occlusion, papillary phlebitis, central retinal artery occlusion, branched retinal artery occlusion, unbranched vasculitis, sickle cell retinopathy, vascular pattern
  • proliferative diabetic retinopathy proliferative diabetic retinopathy, tumor-associated retinal disease, congenital thickening of the retinal pigment epithelium (RPE), posterior uveal melanoma, choroidal hemangioma, choroidal osteoma, choroidal metastasis, complex hamartoma of the retina and retinal pigment epithelium, retinoblastoma, fundus
  • RPE retinal pigment epithelium
  • posterior uveal melanoma posterior uveal melanoma
  • choroidal hemangioma choroidal osteoma
  • choroidal metastasis complex hamartoma of the retina and retinal pigment epithelium, retinoblastoma, fundus
  • fundus may be at least one selected from the group consisting of angioproliferative tumors, retinal astrocytoma, intraocular lymphoid tumors, myopic retinal degeneration,
  • prophylaxis is meant reducing the risk of contracting a disease or disorder, such that one or more clinical signs of a disease do not progress in a subject that is exposed to or susceptible to the disease but does not yet have the disease or exhibit symptoms of the disease. It means any action that inhibits or delays the onset of a disease.
  • the treatment means alleviating a disease or disorder, and refers to any action that improves or beneficially alters the symptoms of a disease by stopping or reducing the progression of the disease or one or more clinical symptoms thereof.
  • the improvement refers to any action that causes the symptoms of a disease or disorder to be improved or to be beneficial.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered orally or parenterally to mammals including livestock and humans, for example, intravenously and intra-arterially, intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally, mucosal or topical (eg, eye drops), ocular, It can be applied transdermally, etc.
  • the pharmaceutical composition is a formulation for oral administration, for example, tablets, troches, lozenges, aqueous or oily suspensions, powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, syrups or elixirs. and the like.
  • binders such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin for formulation into dosage forms such as tablets and capsules; excipients such as dicalcium phosphate; disintegrating agents such as corn starch or sweet potato starch; Lubricating oils such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax may be contained.
  • the capsule formulation may contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned substances.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is administered parenterally, it is applied by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrathoracic injection injection method and mucous membrane, or topically, dispersants, suppositories, powders, aerosols (nasal sprays or inhalants), eye drops , gels, suspensions (aqueous or non-aqueous liquid suspensions, oil-in-water emulsions or water-in-oil emulsions), and liquid dosage forms suitable for parenteral administration, such as solutions.
  • the composition In order to formulate a formulation for parenteral administration, the composition is mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution, which may be formulated as a unit dosage form of an ampoule or a vial.
  • the effective dosage of the Chlorella genus HS-LZ microalgae or its extract of the present invention depends on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity. Although it may vary by various factors, it is generally 1 to 20 mg/day per 1 kg of body weight of an adult patient, specifically 5 to 10 mg/day, several times a day at regular intervals according to the judgment of a doctor or pharmacist, Specifically, it may be administered in divided doses 2 to 3 times a day.
  • the health functional food of the present invention can be used in the range of 0.01 to 50% (w/w), specifically 1 to 30% (w/w) of the total weight of the HS-LZ microalgae or extract thereof of the genus Chlorella.
  • Chlorella genus HS-LZ microalgae or extracts thereof are added to conventional palatable foods, that is, noodles, tofu, cereals, breads, chewing gum, candy, confectionery, etc.
  • Food can be prepared and can be applied as an edible food additive, and can also be formulated in general formulations such as tablets, granules, pills, hard capsules, soft capsules or liquid formulations, raw juice, pouch, beverage, or It can be prepared as a tea, and other ingredients other than the above-mentioned ingredients can be appropriately selected and formulated by a person skilled in the art according to the formulation.
  • Chlorella genus HS-LZ Chlorella sp. HS-LZ microalgae of the present invention was prepared by artificially mutating Chlorella genus HS2 ( Chlorella sp. HS2) microalgae, through which zeaxanthin and lutein ( lutein) was able to produce microalgae with excellent productivity.
  • the Chlorella HS2 microalgae used as the parent strain for improvement can grow in both freshwater, seawater and brackish environments, and exhibits excellent growth rates, and has excellent biomass, pigment and lipid productivity compared to other microalgae.
  • the HS2 microalgae of the genus Chlorella were deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology under the accession number KCTC 13108BP.
  • the Chlorella genus HS2 microalgae were cultured in dark conditions and then subcultured continuously for 3 days to obtain cells with the lowest possible cell age. 10 7 HS2 microalgal cells were inoculated in 10 ml of culture medium, and 1% (w/v) of EMS (ethyl methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. M0880) was treated at a concentration of 40 mM. After incubation for 2 hours, the mutation was induced.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • BD Difco TM Yeast mold Agar solid medium (271210, BD Difco, USA) By smearing 10 3 cells per each, selecting colonies having a color change in a total of 50 solid media and re-streaking, candidate mutant microalgal colonies were selected (FIG. 1).
  • the existing HS2 microalgae medium it is dark green, and the color of the medium is also changed to light green to yellow due to the change in the composition of the produced pigment.
  • Mutant microalgae selected through color change in solid medium were again cultured in BD Difco TM Yeast mold liquid medium (271120, BD Difco, USA) with glucose added as a carbon source, under light conditions and dark conditions. ) conditions were set, and the color change of the medium was additionally observed.
  • the productivity of zeaxanthin and lutein of HS-LZ microalgae in Chlorella was confirmed.
  • the HS-LZ microalgae of the present invention, the mutants M2 to M7, and the wild-type Chlorella genus culture solution of HS2 microalgae were dried, and then, based on each dye content analyzed in Example 2, the content per dry weight of the cell culture solution The amount of the dye was calculated and compared.
  • the components and content of the pigment are measured under stress conditions, and, similarly, the amount of pigment per dry weight of the cell culture medium. The amounts were calculated and compared (FIG. 4).
  • the HS-LZ microalgae and the M2 to M7 variants of the present invention produced only zeaxanthin and lutein as a component of the pigment and contained almost no other pigments, and in particular, it was confirmed that the production of zeaxanthin was excellent.
  • the HS-LZ microalgae of the present invention can produce 1.94 mg/g of zeaxanthin and 0.79 mg/g of lutein per dry weight of the culture medium.
  • the HS-LZ microalgae of the genus Chlorella of the present invention unlike the HS2 microalgae of the genus Chlorella, have a characteristic capable of producing zeaxanthin, and a large amount of the produced pigment is zeaxanthin, so zeaxanthin It was confirmed that the productivity of In addition, by confirming that HS-LZ microalgae can produce lutein together with zeaxanthin, but not other pigments such as neoxanthin and violaxanthin, including chlorophyll a, the process of separately separating and purifying zeaxanthin and lutein is It was confirmed that there is an advantage that it is not necessary or can be simplified.
  • HS-LZ of the genus Chlorella of the present invention has the feature of being able to produce up to 3.56 mg/g of zeaxanthin and up to 1.35 mg/g of lutein per dry weight of the culture medium.

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Abstract

본 발명은 제아잔틴 및 루테인을 생산할 수 있는 특징이 있는 신규한 미세조류인 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

제아잔틴 및 루테인의 생산성이 높은 신규 미세조류
본 발명은 성장률이 우수하고, 높은 제아잔틴 및 루테인 생산성을 특징으로 하는 클로렐라 속 미세조류에 관한 것이다.
제아잔틴(zeaxanthin)은 자연계에서 흔히 발견되는 카로티노이드 알코올의 일종으로 크산토필의 순환에서 중요한 역할을 하며 주로 식물에서 합성된다. 제아잔틴은 안구의 망막에 포함된 카로티노이드 성분 중 하나로 황반의 중심에서 발견되며 안구 건강에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 제아잔틴은 항산화 작용을 하여 안구를 보호하는 기능을 하며 백내장, 황반 변성 등의 안질환을 개선하는 효과가 있는 것으로 알려져 경제적 가치가 높은 색소 중 하나이다. 루테인(lutein)도 제아잔틴과 마찬가지로 안구 건강에 도움이 되는 것으로 널리 알려진 색소 중 하나로, 식물의 엽록체와 같은 색소체 속에 다량 존재하며 안구의 황반이나 수정체에도 집중되어 존재한다. 루테인은 노화로 인해 감소될 수 있는 황반색소밀도를 유지하여 안구 건강에 도움을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다.
상기 제아잔틴 및 루테인의 효능과 활용성 덕분에 이들은 고부가 가치를 갖는데, 이를 산업적으로 생산하기 위해 종래에는 메리골드(marigold) 꽃잎으로부터 제아잔틴 및 루테인을 추출하는 방법을 이용해 오고 있다. 그런데, 메리골드는 화훼작물로서 성장기간이 길고 개방된 경작지에서 자라면서 기후나 환경의 재해로부터 영향을 받아 생산성이 저하될 가능성이 높다는 단점이 있다. 또한, 세계 각지에서 재배되는 메리골드는 재배지역마다 그 품종들이 다양하고, 지역의 기후, 재배요건, 수확방법 및 추출 방법에 따라 꽃잎으로부터 얻어지는 색소의 양의 편차가 심한 문제점이 있다. 심지어 원료품에 명시된 루테인 등 색소의 함량이 2% ~ 100%까지 서로 달라 편차가 극심한 편이다(Miroslav Sivel et al., "Lutein Content in Marigold Flower (Tagetes erecta L.) Concentrates used for Production of Food Supplements", Czech J. Food Sci., Vol. 32, 2014, No. 6:521-525 (2014)). 따라서 제아잔틴 및 루테인을 산업적으로 생산함에 있어 안정적인 원료 공급이 어렵고 원료인 파우더나 펠릿의 품질이 균일하지 못하다는 문제점이 발생한다.
이에 따라, 환경의 영향을 크게 받지 않아 배양이 쉬우며 생산되는 색소의 품질이 상대적으로 균일하며 연중 계속적으로 안정적인 색소의 생산을 가능케 하는, 미세조류를 이용한 제아잔틴 및 루테인의 생산 방법에 관한 연구가 계속되어 오고 있다. 그러나, 미세조류가 생산해 내는 색소에는 제아잔틴이 함유되어 있지 않거나, 제아잔틴 또는 루테인 이외에도 다른 종류의 색소가 너무 많이 함유되어 있어 다시 제아잔틴, 루테인을 분리하고 정제해야만 하는 단점이 있어, 보다 높은 효율로 제아잔틴 또는 루테인을 생산해 낼 수 있는 특징이 있는 신규한 미세조류를 개발해야 할 필요성이 높아지고 있는 실정이다.
본 발명은 종래 메리골드와 같은 식물로부터 추출하여 생산해 왔던 제아잔틴(zeaxanthin) 및 루테인(lutein) 색소를 다량 생산할 수 있는 신규한 미세조류와 이의 제아잔틴 및 루테인 생산 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 신규한 미세조류를 이용하여 제아잔틴 또는 루테인을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류의 배양액으로부터 색소를 얻는 단계를 포함하는, 제아잔틴 또는 루테인의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류를 포함하는, 제아잔틴 또는 루테인 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류 또는 이의 추출물을 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류 또는 이의 추출물을 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 신규한 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는, 일반적인 클로렐라들과는 달리 해수, 담수 및 기수에서 모두 성장이 가능하며 높은 성장속도를 나타내는바, 바이오매스 생산성이 높고 색소나 지방의 생산량이 우수한 특징이 있다. 상기 HS-LZ 미세조류는 종래 클로렐라 속 HS2 미세조류와는 달리 제아잔틴을 생산할 수 있는 특징이 있으며, HS-LZ 미세조류가 생산하는 색소는 제아잔틴 및 루테인이 대부분을 차지하고 있어 엽록소 a를 비롯한 다른 종류의 색소는 거의 함유되어 있지 않아, 제아잔틴 및 루테인을 분리, 정제하기 위한 과정이 대폭 간소화될 수 있다는 장점이 있다.
종래 제아잔틴 또는 루테인을 생산하기 위해 이용하던 방법인 메리골드 꽃잎으로부터 색소를 추출하는 방법과 비교할 때, 본 발명의 미세조류를 이용한 제아잔틴 또는 루테인의 생산방법은 별도의 노동력이 필요한 수확과정이 생략되며 상기 미세조류가 단세포 생물이므로 이에 의한 산물이 균질한 특징이 있어 안정적인 색소 생산이 가능하다는 장점이 있다.
나아가, 본 발명의 HS-LZ 미세조류는 일정 조건 하에서는 제아잔틴 및 루테인의 생산성이 현저하게 높아져 높은 효율로 안정적인 색소 생산이 가능하다는 장점이 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 클로렐라 속 HS2 미세조류에 EMS를 처리하여 돌연변이를 유도하고 고체배지에 도말한 것으로, 미세조류 집락 별로 배지의 색상 변화를 확인한 것이다.
도 2는 EMS를 처리하여 고체배지가 녹색이 아닌 다른 색으로 변화한 클로렐라 속 HS2 미세조류 돌연변이체 집락을, 다시 액체배지에서 배양하면서 빛이 주어지지 않는 조건(dark)과 빛이 주어지는 조건(light)으로 배양한 결과이다.
도 3은 야생형의 클로렐라 속 HS2 미세조류(Wild), 변이체 M2 내지 M7 및 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ에서 생산되는 색소 성분을 분석한 HPLC 결과이다.
도 4는 야생형의 클로렐라 속 HS2 미세조류(Wild), 변이체 M2 내지 M7, 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ, 그리고 상기 HS-LZ를 유기탄소원이 존재하지 않는 스트레스 조건에서 배양한 것(LZ-st)으로부터 생산되는 색소 내 각 성분(루테인, 제아잔틴 등)의 함량을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 신규 클로렐라 속 미세조류
본 발명은 신규 클로렐라 속 미세조류를 제공한다.
본 발명의 상기 미세조류는 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류 이다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ는 클로렐라 속 HS2 미세조류(수탁번호 KCTC 13108BP)로부터 개량되어 만들어진 신규한 미세조류로, 상기 클로렐라 속 HS2 미세조류는 다양한 탄소원이 주어진 환경이나 담수, 해수 및 기수 환경에서도 높은 성장속도를 나타내고 바이오매스, 색소, 지질 생산성이 우수한 특징이 있는 것이므로, 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류도 상기 클로렐라 속 HS2 미세조류의 장점과 특성을 나타낼 수 있다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류의 18s rDNA가 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1의 염기서열은 클로렐라 속 HS2 미세조류의 18s rDNA 염기서열과 동일한 것으로, 이에 따라 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류를 클로렐라 속으로 분류되는 것으로 동정할 수 있다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 제아잔틴(zeaxanthin)을 생산할 수 있다. 종래의 클로렐라 미세조류, 예컨대 클로렐라 속 HS2 미세조류는 제아잔틴을 생산하지 못하는 것과는 달리, 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 제아잔틴을 생산할 수 있다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 루테인(lutein)을 생산할 수 있다. 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 종래의 클로렐라 미세조류, 예컨대 클로렐라 속 HS2 미세조류와 비교할 때 루테인의 생산성이 더 높은 것일 수 있다.
상기 제아잔틴 및 루테인은 안구 건강에 도움을 주는 활성이 있는 것으로 알려져 높은 경제적 가치를 가지는 색소로, 본 발명의 미세조류는 상기 색소들을 높은 순도로 생산할 수 있는 특징이 있는바, 제아잔틴 또는 루테인을 생산하기 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있으며 나아가 안질환의 예방, 치료나 눈 건강의 개선을 위한 용도로 이용될 수 있다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 상기 제아잔틴 또는 루테인을 생산하여 세포 내에 축적하거나, 세포 외부로 방출할 수 있다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류가 생산하는 색소는, 색소 100 중량부에 대하여 제아잔틴 및 루테인 중 적어도 하나를 90 중량부 이상의 함량으로 함유하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 색소는 색소 100 중량부에 대하여 제아잔틴 및/또는 루테인을 92 중량부 이상, 95 중량부 이상, 96 중량부 이상, 97 중량부 이상, 98 중량부 이상, 99 중량부 이상, 또는 99.5 중량부 이상의 함량으로 함유하는 것일 수 있으며, 제아잔틴 및 루테인 이외에 다른 색소는 함유하지 않는 것일 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류가 생산하는 색소는, 엽록소 a, 엽록소 b, 네오잔틴(neoxanthin) 및 비올라잔틴(violaxanthin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하지 않는 것일 수 있다. 종래의 클로렐라 미세조류, 예컨대 클로렐라 속 HS2 미세조류는 제아잔틴을 생산하지 못하거나, 제아잔틴을 생산하더라도 제아잔틴 및 루테인 이외에 다른 색소들(상기 엽록소 a, 엽록소 b, 네오잔틴, 비올라잔틴 등)도 다량으로 생산하여 전체 색소 중 제아잔틴 및 루테인 이외의 색소가 10 중량부 초과의 함량으로 포함될 수 있다. 이와는 달리, 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류가 생산하는 색소는 제아잔틴 및 루테인 중 적어도 하나를 상기 범위의 함량으로 함유하고 있는바, 제아잔틴 및/또는 루테인이 대부분을 차지하여 제아잔틴 또는 루테인을 수득하기 위해 이를 분리, 정제하는 과정이 간소화되거나 생략될 수 있다는 장점이 있다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는, 상기 미세조류 배양액 건조 중량 당 제아잔틴을 1 ㎎/g 내지 5 ㎎/g 생산하는 것일 수 있으며, 구체적으로 1.2 ㎎/g 내지 4.5 ㎎/g, 1.5㎎/g 내지 4 ㎎/g, 1.9 ㎎/g 내지 3.6 ㎎/g, 1.8 ㎎/g 내지 2.2 ㎎/g, 1.9 ㎎/g 내지 2 ㎎/g, 3 ㎎/g 내지 4 ㎎/g, 3.3 ㎎/g 내지 3.8 ㎎/g 또는 3.5 ㎎/g 내지 3.7 ㎎/g의 제아잔틴을 생산하는 것일 수 있다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는, 상기 미세조류 배양액 건조 중량 당 루테인을 0.2 ㎎/g 내지 3 ㎎/g 생산하는 것일 수 있으며, 구체적으로 0.5 ㎎/g 내지 2.5 ㎎/g, 0.6 ㎎/g 내지 2 ㎎/g, 0.7 ㎎/g 내지 1.5 ㎎/g, 0.5 ㎎/g 내지 1 ㎎/g, 0.6 ㎎/g 내지 0.9 ㎎/g, 0.7 ㎎/g 내지 0.9 ㎎/g, 1.2 ㎎/g 내지 1.5 ㎎/g 또는 1.3 ㎎/g 내지 1.4 ㎎/g의 루테인을 생산하는 것일 수 있다.
2. 제아잔틴 또는 루테인의 생산방법
본 발명은 제아잔틴 또는 루테인을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 제아잔틴 또는 루테인의 생산방법은, 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류의 배양액으로부터 색소를 얻는 단계를 포함한다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류에 대한 설명은 앞서 '1. 신규 클로렐라 속 미세조류'에서 이에 대해 설명한 것과 동일하다.
본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 제아잔틴 또는 루테인을 고순도로 생산할 수 있는 특징이 있는바, 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류를 배양하는 단계를 거쳐 이로부터 색소를 추출하는 단계를 거칠 경우, 고함량의 제아잔틴 또는 루테인을 생산할 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류가 생산하는 색소의 성분은 제아잔틴 및 루테인이 대부분이며 엽록소 a, 엽록소 b, 네오잔틴, 비올라잔틴 등 다른 색소는 거의 함유되어 있지 않으므로, 제아잔틴 또는 루테인만을 높은 순도로 생산할 수 있는 장점이 있다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류를 배양하는 단계는, 빛이 주어지는 조건 또는 빛이 주어지지 않는 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 빛의 존재 유무와 무관하게 제아잔틴 또는 루테인을 생산할 수 있는바, 빛이 주어지는 조건에서 배양하는 것이 일반적인 다른 클로렐라 미세조류와는 달리, 빛이 주어지지 않는 암조건에서도 제아잔틴 또는 루테인의 생산이 가능하다는 장점이 있다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류를 배양하는 단계는, 통상적인 클로렐라의 배양 배지에서 배양하는 것일 수 있으며, 예컨대 당류, 아미노산, 유기산 등이 함유된 배지에서 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 글루코오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 과당, 말토오스, 락토오스, 당밀(molasses), 글루탐산, 말산, 시트르산 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 질소원 및 무기염을 더 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. 상기 질소원은 질산염, 아질산염, 요소, 암모늄 클로라이드, 암모니아, 펩톤, 트립톤, 효모 추출물(yeast extract), 비프 추출물(beef extract), 맥아 추출물(malt extract), 감자 추출물(potato extract) 또는 NPK 비료일 수 있고 상기 무기염은 Na+, K+, Mg2+ 또는 Ca2+일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배지는 통상적으로 사용될 수 있는 식물용 복합비료, 미생물 발효용 복합배지, BG11 배지 등일 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류를 배양하기 위한 배지에 포함되는 물은 해수, 기수 또는 담수일 수 있으며 예를 들어 담수일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 배지에 포함되는 물의 종류는 제아잔틴 또는 루테인을 생산하기 위한 공정, 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류의 배양 조건 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다.
또한, 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류를 배양하는 단계는, 상기 미세조류를 유기탄소원이 존재하지 않는 조건에서 3일 내지 14일 동안 배양하는 것을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어 3일 내지 10일, 4일 내지 9일, 또는 5일 내지 8일 동안 배양하는 것일 수 있다. 상기 미세조류를 유기탄소원이 존재하지 않는 스트레스 조건에서 배양하는 경우, 상기 미세조류의 색소 생산량이 증가될 수 있으며 제아잔틴 및 루테인의 생산량이 증가될 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류를 배양하는 단계는 유기탄소원이 존재하는 배지에서 배양하여 세포 수를 증가시킨 후, 다시 유기탄소원이 존재하지 않는 조건에서 배양함으로써 제아잔틴 및 루테인의 생산량을 현저하게 증가시킬 수 있다.
상기 색소를 얻는 단계는, 상기 배양액 내 미세조류 세포를 파쇄하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 미세조류 세포를 파쇄하는 방법은 세포 내 색소 성분, 구체적으로 제아잔틴 또는 루테인이 파괴되거나 활성을 잃지 않도록 세포를 파쇄하는 것이라면 어떤 방법이든 이용될 수 있으며, 예컨대 세포에 초음파를 처리(sonication)하여 파쇄하는 것일 수 있다.
상기 색소를 얻는 단계는, 상기 미세조류로부터 색소를 추출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 색소의 추출은, 당업자에게 공지된 임의의 추출 방법을 이용할 수 있으며, 추출 방법으로는 용매 추출법(저온 암조건 추출 포함), 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 통상적인 추출 방법을 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용함으로써 제조할 수 있다. 상기 추출 과정은 수회 반복할 수 있으며, 이후에 농축 또는 동결건조 등의 단계를 추가적으로 거칠 수 있다. 구체적으로, 수득한 추출물을 감압 농축하여 농축액을 얻고, 상기 농축액을 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 고농도의 추출 분말을 제조할 수 있다. 추출 용매로는 헥산, 벤젠, 톨루엔, 디에틸에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌 클로라이드, 1,4-디옥산, 테트라하이드로퓨란, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 아세트산, 메탄올, 에탄올, 프로필렌글라이콜, 프로필알코올, 부틸렌글라이콜, 부틸알코올, 글리세린 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올류 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 제아잔틴 또는 루테인의 생산방법은, 엽록소 a, 엽록소 b, 네오잔틴(neoxanthin) 및 비올라잔틴(violaxanthin)을 제거하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다. 즉, 제아잔틴 및 루테인만을 별도로 분리하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류가 생산하는 색소에는 제아잔틴 및 루테인 이외의 다른 색소가 함유되어 있지 않거나 매우 미량으로 함유될 수 있는바, 엽록소 a, 엽록소 b, 네오잔틴, 비올라잔틴 등의 색소를 제거하는 과정을 거치지 않고도 제아잔틴 및 루테인을 높은 순도로 생산하여 수득할 수 있다. 다만, 상기 색소로부터 제아잔틴 및 루테인을 더 높은 순도로 수득하기 위한 경우, 필요에 따라 제아잔틴 및 루테인을 분리하는 단계를 더 거칠 수 있으며, 이 경우 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 제아잔틴 및 루테인 중 어느 하나만을 생산하고자 하는 경우, 제아잔틴 또는 루테인을 분리하는 단계를 더 거칠 수 있다.
3. 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류의 용도
본 발명은 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp . HS-LZ) 미세조류의 제아잔틴 또는 루테인의 생산 용도를 제공한다.
본 발명의 제아잔틴 또는 루테인 생산용 조성물은, 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류를 포함한다.
상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류에 대한 설명은 앞서 '1. 신규 클로렐라 속 미세조류'에서 이에 대해 설명한 것과 동일하다. 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 제아잔틴 또는 루테인을 생산할 수 있는 미세조류이며, 생산하는 색소들 중 제아잔틴 및 루테인을 제외한 다른 색소는 거의 생산하지 않으므로, 별도의 제아잔틴 또는 루테인의 분리, 정제 과정이 간소화되거나 생략될 수 있어 고순도의 제아잔틴 또는 루테인을 간편하게 생산할 수 있다. 또한, 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류로부터 생산되는 루테인은, 메리골드에 의해 생산되는 루테인과는 달리 루테인 분자의 양쪽 말단에 지방산이 연결되어 있지 않으므로 이를 제거하는 과정이 수반되지 않는다는 장점이 있다. 이러한 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류의 특징을 고려할 때, 상기 미세조류를 포함하는 조성물은 제아잔틴 또는 루테인을 생산하기 위해 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp . HS-LZ) 미세조류 또는 이의 추출물의 안질환의 예방, 치료 또는 개선 용도를 제공한다.
본 발명의 안질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 안질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품은, 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류 또는 이의 추출물을 포함한다.
앞서 기재한 것처럼, 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류 또는 이의 추출물은 제아잔틴 또는 루테인을 포함하고 있으므로, 상기 조성물은 제아잔틴 또는 루테인이 나타내는 생리적 활성에 따라 다양한 용도로 이용될 수 있으며, 구체적으로 안질환을 예방, 치료 또는 개선하기 위해 이용될 수 있다.
상기 안질환은 시력 감퇴(예를 들어, 노화에 의한 시력 감퇴), 시력 상실, 백내장, 녹내장, 안구의 과산화, 망막 손상, 안구 건조증, 당뇨망막증, 비-삼출성 노인성 황반 변성 및 삼출성 노인성 황반 변성을 포함하는 황반 변성, 맥락막 혈관신생, 망막증, 급성 및 만성 황반성 신경망막병증, 중심성 장액성 맥락망막병증, 황반 부종, 급성 다발성 판상색소 상피증, 버드샷 망막맥락막증, 후공막염, 사행성 맥락막염, 망막하 섬유화, 포도막염 증후군, 망막동맥폐색병, 중심성 망막 정맥 폐색, 파종성 혈관내응고증, 분지성 망막 정맥 폐색, 고혈압성 안저변화, 안허혈 증후군, 망막동맥 미세혈관류, 코우츠 병, 중심오목부근 모세혈관확장증, 반측 망막정맥폐색, 유두정맥염, 중심성 망막 동맥 폐색, 분지성 망막 동맥 폐색, 언가지모양혈관염, 겸상세포 망막증, 혈관무늬 망막증, 가족성 삼출 유리체망막증, 일스 병, 증식성 유리체 망막증, 증식성 당뇨병성 망막증, 종양과 관련된 망막 질환, 망막 색소 상피(RPE)의 선천성 비후, 후부 포도막 흑색종, 맥락막 혈관종, 맥락막 골종, 맥락막 전이, 망막 및 망막 색소 상피의 복합 과오종, 망막아세포종, 안저의 혈관증식성 종양, 망막별아교세포종, 안내 림프성 종양, 근시성 망막 변성 및 급성 망막 색소상피염 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 제아잔틴 또는 루테인에 의해 예방, 치료 또는 개선되는 것으로 알려진 어떠한 안구 관련 질환, 장애이든 적용될 수 있다.
상기 예방은 질환 또는 장애에 걸릴 위험을 감소시키는 것을 의미하며, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기는 쉽지만 아직 질환에 걸리거나 질환의 증후를 나타내지 않는 대상에서 질병의 1종 이상의 임상적 증후가 진행되지 않도록 하여 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 치료는 질환 또는 장애를 경감시키는 것을 의미하며, 질환 또는 이의 1종 이상의 임상적 증후의 진행을 저지 또는 감소시켜 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 개선은 질환 또는 장애의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 및 동맥 내, 근육 내, 피하, 복강 내, 점막 또는 국소(예, 점안), 안구, 경피 등에 적용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs) 등으로 제제화될 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 비경구 투여시에는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사, 흉부 내 주사 주입 방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 점안제, 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이는 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류 또는 이의 추출물의 유효투입량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 성인 환자 체중 1 ㎏ 당 1 내지 20 ㎎/일이고, 구체적으로 5 내지 10 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 구체적으로 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류 또는 이의 추출물을 총 중량 중 0.01 내지 50 %(w/w), 구체적으로 1 내지 30 %(w/w) 범위로 사용할 수 있다. 예를 들면, 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류 또는 이의 추출물을 통상적인 기호성 식품, 즉 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품을 제조할 수 있고, 식용가능한 식품 첨가물로서 적용할 수 있고, 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류로 제조될 수 있고, 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 본 기술 분야의 통상의 기술자가 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
[ 실시예 1] 클로렐라 속 HS- LZ ( Chlorella sp . HS- LZ ) 미세조류의 제조
본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류는 클로렐라 속 HS2(Chlorella sp. HS2) 미세조류를 대상으로 인위적인 돌연변이를 유발시킴으로써 제조하였으며, 이를 통해 제아잔틴(zeaxanthin) 및 루테인(lutein)의 생산성이 우수한 특징이 있는 미세조류를 제조할 수 있었다.
개량을 위한 모균주로 사용된 상기 클로렐라 속 HS2 미세조류는 담수, 해수 및 기수 환경 모두에서 성장이 가능하며 우수한 성장속도를 나타내 바이오매스, 색소 및 지질의 생산성이 다른 미세조류에 비해 우수한 특징이 있다. 상기 클로렐라 속 HS2 미세조류는 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC 13108BP로 기탁된 것을 이용하였다.
상기 클로렐라 속 HS2 미세조류를 암(dark) 조건에서 배양한 후 3일 동안 연속으로 계대배양하여 최대한 세포 연령이 낮은 세포들을 수득하였다. 10 ㎖의 배양 배지에 107개의 HS2 미세조류 세포를 접종하고, 여기에 1%(w/v)의 EMS(ethyl methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. M0880)를 40 mM의 농도로 처리한 후 2시간 동안 배양하여 돌연변이를 유도하였다. 그 후, BD DifcoTM Yeast mold Agar 고체배지(271210, BD Difco, 미국) 각 1개당 103개의 세포를 도말하고 총 50개의 고체배지에서 색 변화가 발생한 콜로니를 선별하여 다시 스트리킹 함으로써, 후보 변이체 미세조류 집락들을 선별하였다(도 1). 기존 HS2 미세조류 배지의 경우 짙은 녹색을 나타내는데, 생산하는 색소의 조성이 변화되어 배지의 색상도 함께 옅은 녹색 내지 황색으로 변화된 배지를 선별한 것이다.
고체배지에서의 색상 변화를 통해 선별한 변이체 미세조류들을 다시 탄소원으로 포도당을 첨가한 BD DifcoTM Yeast mold 액체배지(271120, BD Difco, 미국)에서 다시 배양하면서, 광(light)조건과 암(dark)조건을 각각 모두 설정하여 배지의 색상 변화를 추가로 관찰하였다.
그 결과, 빛이 주어진 광조건과 빛을 차단한 암조건에서 모두, 액체배지의 색상이 짙은 황색으로 변화된 7개의 돌연변이체를 선별할 수 있었으며(도 2), 이를 통해 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류 및 다른 변이체 M2 내지 M7 미세조류를 제조해 수득할 수 있었다.
[실시예 2] 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류의 색소 성분 확인
상기 실시예 1을 통해 제조한 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류와 다른 변이체 M2 내지 M7, 그리고 야생형의 클로렐라 속 HS2 미세조류를 대상으로, 이들이 생산하는 색소의 성분과 함량을 분석함으로써, 본 발명의 HS-LZ 미세조류의 제아잔틴, 루테인 생산성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 HS-LZ 미세조류, M2 내지 M7 변이체 및 야생형 HS2 미세조류의 배양액 2 ㎖을 4 ℃에서 분당 10,000 rpm의 속도로 3분 동안 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, 침전된 세포만을 동결건조하였다. 동결건조된 세포 1 g에 100 ㎖의 에탄올을 첨가하여 색소의 추출을 수행하였다. 그리고, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Agilent 1260 Infinity Binary LC system) 를 통해 각 미세조류로부터 생산된 색소의 성분 및 함량을 분석하였다(컬럼: Waters Spherisorb® S5 ODS1 4.6 × 250 ㎜, 5 μm Cartridge Column, 컬럼온도: 40 ℃, 주입량: 20 ㎕, 유속: 1.2 ㎖/min, 이동상 A: acetonitrile 84%, methanol 2%, 0.1 M Tris-HCl 14%, 이동상 B: methanol 68%, ethyl acetate 32%, 검출기: Diode Array Detector).
그 결과, 야생형의 클로렐라 속 HS2 미세조류의 경우, 색소의 성분으로 루테인을 함유하고 있는 것으로 나타났으나 제아잔틴은 확인되지 않았으며, 루테인 이외에도 네오잔틴(neoxanthin), 비올라잔틴(violaxanthin), 엽록소 a 및 엽록소 b 등 다른 색소 성분들을 다량 생산하는 것으로 측정되었다. 이와는 달리, 실시예 1을 통해 선별한 변이체 M2 내지 M7 및 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류의 경우 HPLC 분석 결과 루테인 및 제아잔틴의 피크만이 나타나, 다른 종류의 색소는 거의 생산하지 않고 루테인 및 제아잔틴이 색소 함량의 대부분을 차지함을 확인할 수 있었다(도 3).
[ 실시예 3] 클로렐라 속 HS- LZ 미세조류의 제아잔틴 및 루테인 생산성 확인
클로렐라 속 HS-LZ 미세조류의 제아잔틴 및 루테인 생산성을 확인하였다. 본 발명의 HS-LZ 미세조류, 상기 변이체 M2 내지 M7 및 야생형의 클로렐라 속 HS2 미세조류의 배양액을 건조한 다음, 상기 실시예 2를 통해 분석한 각 색소 함량을 바탕으로 세포 배양액의 건조 중량 당 함유된 색소의 양을 산출하여 비교하였다. 또한, 본 발명의 HS-LZ 미세조류를 유기탄소원인 포도당이 모두 소모된 상태에서 7일간 추가 배양함으로써 스트레스 조건을 가한 상태로 색소의 성분 및 함량을 측정하여, 마찬가지로 세포 배양액의 건조 중량 당 색소의 양을 산출하여 비교하였다(도 4).
그 결과, 본 발명의 HS-LZ 미세조류 및 M2 내지 M7 변이체들은 색소의 성분으로 제아잔틴 및 루테인만을 생산하며 다른 색소들은 거의 함유하지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 제아잔틴의 생산량이 우수함을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 본 발명의 HS-LZ 미세조류는 배양액 건조 중량 당 제아잔틴을 1.94 mg/g, 루테인을 0.79 mg/g 생산할 수 있는 것으로 측정되었다. 이와는 달리, 야생형의 HS2미세조류의 경우, 루테인은 일부 생산하나 제아잔틴은 생산하지 못하며 엽록소 a를 가장 많이 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 실험 결과를 통해, 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는, 기존의 클로렐라 속 HS2 미세조류와는 달리, 제아잔틴을 생산할 수 있는 특성이 있으며 생산된 색소량 중 많은 양이 제아잔틴이므로 제아잔틴의 생산성이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, HS-LZ 미세조류는 제아잔틴과 함께 루테인은 생산할 수 있으나, 그 외 엽록소 a를 비롯한 네오잔틴, 비올라잔틴 등 다른 색소들은 생산하지 않는 것을 확인함으로써, 제아잔틴 및 루테인을 별도로 분리, 정제하는 과정이 필요치 않거나 간소화될 수 있다는 장점이 있음을 확인할 수 있었다.
나아가, 본 발명의 HS-LZ 미세조류는 유기탄소원이 소모된 상태에서 배양하는 것과 같이 스트레스 조건 하에서 배양할 경우, 색소 생산성이 현저하게 향상됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 클로렐라 속 HS-LZ는 배양액 건조 중량 당 제아잔틴을 최대 3.56 mg/g, 루테인을 최대 1.35 mg/g까지 생산할 수 있는 특징이 있어 이들 색소에 대한 생산성이 매우 우수한 미세조류임을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터
수탁번호 : KCTC14308BP
수탁일자 : 20200911

Claims (11)

  1. 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류는 제아잔틴(zeaxanthin)을 생산할 수 있는 것인, 미세조류.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류가 생산하는 색소는, 색소 100 중량부에 대하여 제아잔틴 및 루테인 중 적어도 하나를 90 중량부 이상의 함량으로 함유하는 것인, 미세조류.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 클로렐라 속 HS-LZ 미세조류가 생산하는 색소는, 엽록소 a, 엽록소 b, 네오잔틴(neoxanthin) 및 비올라잔틴(violaxanthin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하지 않는 것인, 미세조류.
  5. 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류를 배양하는 단계; 및
    상기 미세조류의 배양액으로부터 색소를 얻는 단계를 포함하는, 제아잔틴 또는 루테인의 생산방법.
  6. 청구항 7에 있어서,
    상기 미세조류를 배양하는 단계는, 상기 미세조류를 유기탄소원이 존재하지 않는 조건에서 3일 내지 14일 동안 배양하는 것을 포함하는 것인, 제아잔틴 또는 루테인의 생산방법.
  7. 청구항 7에 있어서,
    상기 색소를 얻는 단계는, 상기 배양액 내 미세조류 세포를 파쇄하는 단계 또는 상기 미세조류로부터 색소를 추출하는 단계를 포함하는 것인, 제아잔틴 또는 루테인의 생산방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 방법은 엽록소 a, 엽록소 b, 네오잔틴(neoxanthin) 및 비올라잔틴(violaxanthin)을 제거하는 단계를 포함하지 않는 것인, 제아잔틴 또는 루테인의 생산방법.
  9. 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류를 포함하는, 제아잔틴 또는 루테인 생산용 조성물.
  10. 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류 또는 이의 추출물을 포함하는, 안질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 수탁번호 KCTC 14308BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-LZ(Chlorella sp. HS-LZ) 미세조류 또는 이의 추출물을 포함하는, 안질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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