CN110215467B - 一种厚网地藻Dictyota coriacea抗氧化提取物、应用及药物组合物 - Google Patents

一种厚网地藻Dictyota coriacea抗氧化提取物、应用及药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种来源于厚网地藻Dictyota coriacea的具有抗氧化作用的提取物及其制备方法和在制备药物中的应用，属于天然药物提取物领域。该提取物是指厚网地藻乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚/乙酸乙酯（v/v,9:1和3:1）进行梯度洗脱，收集石油醚/乙酸乙酯3:1洗脱液所得组分（B），以及该组分用Sephadex LH‑20凝胶色谱柱（洗脱剂：二氯甲烷/甲醇1:1）洗脱至无色后再次洗脱得到的组分(B‑2)。细胞实验表明，组分B与B‑2能够有效抑制H2O2对神经元样PC12细胞产生的氧化损伤，为优良的抗氧化剂，可以用于预防或治疗脑缺血再灌注损伤。

Description

一种厚网地藻Dictyota coriacea抗氧化提取物、应用及药物 组合物
技术领域
本发明属于天然药物提取物领域，具体是指一种厚网地藻Dictyota coriacea抗氧化提取物、应用及药物组合物。
背景技术
缺血性脑中风是危害人类健康的重要疾病。溶栓是缺血性脑中风的主要治疗手段，但在恢复血流供应时由于氧化应激易导致脑缺血再灌注损伤。因此使用抗氧化剂清除活性氧能够发挥神经保护作用，是防治脑缺血再灌注损伤的重要策略。然而，目前临床上仍然缺乏靶点明确、治疗效果显著的脑神经保护用抗氧化药物。因此，研发新型抗氧化剂具有重要的现实意义。
厚网地藻Dictyota coriacea从分类学上隶属于褐藻门，褐藻纲，网地藻目，网地藻科，网地藻属，主要分布于热带和亚热带沿海海域，是我国东南沿海低潮带常见物种。网地藻属海藻能够代谢产生大量骨架类型多样、结构新颖的二萜类化合物，部分化合物具有较显著的抗病毒、抗菌和肿瘤细胞毒等活性，有望从中筛选得到新药先导化合物。因此，网地藻属海藻一直受到天然药物化学家的广泛关注。目前，国外海域的厚网地藻D. coriacea已有化学成分研究报道，从中发现了pachylactone 和dictyolactone等20余种二萜，但我国海域的厚网地藻仍无化学成分报道。
关于网地藻属海藻的抗氧化活性研究，Costa等人在“Biological activities ofsulfated polysaccharides from tropical seaweeds，Biomedicine &Pharmacotherapy，2010, 64(1):21-28”中报道了从网地藻D. cervicornis中分离得到的水溶性硫酸多糖总提取物显示出良好的抗氧化作用，具有较好的超氧阴离子自由基清除活性。Ayyad等人在“Cytotoxic and protective DNA damage of three new diterpenoidsfrom the brown alga Dictoyota dichotoma，European Journal of MedicinalChemistry，2011, 46(1):175-182”中报道了从网地藻D. dichotoma中分离得到的2个二萜类化合物amijiol acetate与amijiol-7,10-diacetate显示有较好的抗氧化活性，具有较显著的ABTS（2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐）自由基清除能力。整体而言，目前未见有网地藻属海藻脂溶性提取物抗氧化活性报道，且无厚网地藻D. coriacea单体化合物及提取物抗氧化作用的文献报道。
近期，我们从温州南麂岛海域的厚网地藻D. coriacea中制备得到一种具有显著抗氧化作用的脂溶性提取物。该提取物所含成分复杂，且从中未检测到网地藻属海藻中已知的2个具抗氧化作用的二萜amijiol acetate和amijiol-7,10-diacetate，因此推测其抗氧化作用可能是由于含有其它未知的抗氧化活性化合物，或者由于所含多种化合物之间的协同增效作用。该提取物能够有效抑制H2O2对神经元样PC12细胞产生的氧化损伤，即具有神经细胞保护作用，可用于预防或治疗脑缺血再灌注损伤。基于此，提出本项发明申请。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种厚网地藻Dictyota coriacea抗氧化提取物、应用及药物组合物。
作为本发明的第一个方面，本发明提供一种厚网地藻D. coriacea的抗氧化提取物，其提取过程如下：
（1）取厚网地藻D. coriacea的干燥粗粉，95%乙醇室温浸泡提取，过滤，收集滤液；
（2）将滤液减压浓缩至无醇味，加蒸馏水混悬均匀，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯萃取液得浸膏；
（3）将浸膏用减压硅胶柱色谱分离，依次用体积比为·9:1的石油醚/乙酸乙酯和体积比为·3:1的石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，分别得到A、B两个个组分，得到的组分B为抗氧化提取物。
步骤（1）所述的厚网地藻的干燥粗粉是厚网地藻全藻阴干后粉碎得到，料液比为1g : 16 mL，提取次数为3次，每次4 h。
步骤（2）中所述的乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1:3，萃取次数为3次。
步骤（3）中所述的减压柱色谱所用硅胶为硅胶H，且与浸膏的质量比为10:1，浸膏与洗脱剂的质量体积比为1 g : 60 mL。
作为本发明的第二个方面，提供了另一种厚网地藻D. coriacea抗氧化提取物，其提取过程如下：
（1） 取厚网地藻D. coriacea的干燥粗粉，95%乙醇室温浸泡提取，过滤，收集滤液；
（2） 将滤液减压浓缩至无醇味，加蒸馏水混悬均匀，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯萃取液得浸膏；
（3） 将浸膏用减压硅胶柱色谱分离，依次用体积比为·9:1的石油醚/乙酸乙酯和体积比为·3:1的石油醚/乙酸乙酯、纯甲醇进行梯度洗脱，分别得到A、B、C三个组分；
（4） 将组分B用Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷/甲醇1:1为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液为无色得到第一次洗脱液，然后再收集洗脱液得到第二次洗脱液洗脱，减压浓缩得组分B-2，为抗氧化提取物。
步骤（1）所述的厚网地藻的干燥粗粉是厚网地藻全藻阴干后粉碎得到，料液比为1g : 16 mL，提取次数为3次，每次4 h。
步骤（2）中所述的乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1:3，萃取次数为3次。
步骤（3）中所述的减压柱色谱所用硅胶为硅胶H，且与浸膏的质量比为10:1，浸膏与洗脱剂的质量体积比为1 g : 60 mL。
作为本发明的第三个方面，提供了一种上述厚网地藻D. coriacea抗氧化提取物在制备神经保护药物中的应用。
作为本发明的第四个方面，提供了一种上述厚网地藻D. coriacea抗氧化提取物在制备具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能药物的应用。
此外，本发明还提供一种具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能的药物组合物，含有治疗有效量的活性组分和药学上可接受的药用辅料，所述活性组分包括上述的厚网地藻D. coriacea抗氧化提取物。
进一步设置是所述的活性组分还包括有药学上可接受且已上市的抗氧化药物，该抗氧化药物包括且不限于依达拉奉、维生素C和维生素E中的一种及其组合。
进一步设置是所述的药物组合物具有如下制剂形式：注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂和纳米制剂。
本发明中所述“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；稀释剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇等，填充剂如淀粉、蔗糖等；湿润剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮和干淀粉等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如聚山梨酯、脂肪酸山梨坦和脂肪酸甘油酯等；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；润滑剂如氢化植物油、滑石粉和聚乙二醇等。包衣材料如丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、聚维酮、纤维醋法酯等；另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、滴剂、滴丸剂及纳米制剂等。本发明可以组合物的形式通过经胃肠道给药，注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药和腔道给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
本发明的有益之处是：（1）提供的厚网地藻D. coriacea抗氧化提取物抗氧化活性优良，可应用于预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病；（2）制备工艺简单、易行、重现性好；（3）提取物产率高，组分B和B-2的产率最高可达到6.2%和3.2%。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1 提取物B和B-2对H2O2诱导的神经元样PC12细胞氧化损伤的抑制作用的验证图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1 厚网地藻抗氧化提取物的制备
称取温州南麂岛厚网地藻干燥粗粉100 g，用95%乙醇1.6 L浸泡提取3次，每次4h。过滤，收集滤液，减压浓缩至干，再加600 mL蒸馏水充分分散，用乙酸乙酯200 mL萃取3次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液至干，得浸膏8.1 g。将浸膏用减压硅胶柱色谱（硅胶H，81 g）分离，依次用石油醚/乙酸乙酯9:1（486 mL）、石油醚/乙酸乙酯3:1（486 mL）、纯甲醇（486mL）进行梯度洗脱，将各洗脱液减压浓缩至干，分别得到A（2.3 g）、B（6.2 g）、C（1.5 g）三个组分。组分B经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，以二氯甲烷/甲醇1:1洗脱，洗脱至无色得到第一次洗脱液，减压浓缩至干，得组分B-1（3.0 g）；再用二氯甲烷/甲醇1:1洗脱得到第二次洗脱液，减压浓缩至干，得组分B-2（3.2 g）。组分B及B-2经细胞实验证实为抗氧化活性提取物，产率分别为6.2%和3.2%。
实施例2 提取物对H2O2诱导的神经元样细胞PC12氧化损伤的抑制作用测定
取对数生长期的PC12细胞以3000个细胞/孔接种于96孔培养板，每孔100 µL培养基，在37℃含5% CO2的培养箱中过夜。每孔加入乙酸乙酯萃取物（EtOAc Ex.），组分A~C，B-1, B-2（50 µg/mL）或TBHQ（阳性对照，10 μM）预培养18 h，再给予一定浓度的H2O2（450 μM）刺激24 h，最后加入MTT溶液（5 mg/mL）20 µL放入培养箱中继续培养。4 h后吸走各个孔中的液体，加入DMSO（120 µL/孔），振荡混匀10 min，用酶联免疫检测仪于490 nm波长处测定其吸光度（A值），DMSO组为空白对照B。计算细胞生存率（实验组A值/对照组B值×100%），本实验重复三次，计算平均值和误差值。
实验结果如图1所示，450 μM H2O2可明显导致PC12细胞氧化损伤，细胞存活率为52%，而厚网地藻乙酸乙酯萃取物、组分B与B-2对PC12细胞具有明显保护作用，使细胞存活率分别提升至69%、76%和85%，厚网地藻乙酸乙酯萃取物的抗氧化作用与阳性对照TBHQ相当，而组分B与B-2的抗氧化作用明显优于TBHQ组，且组分B-2的抗氧化损伤作用优于组分B。组分B和B-2均可用于脑缺血再灌注损伤的预防或治疗。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种厚网地藻（Dictyota coriacea）抗氧化提取物，其特征在于，其提取过程如下：
（1）取厚网地藻（Dictyota coriacea）的干燥粗粉，95%乙醇室温浸泡提取，过滤，收集滤液；
（2）将滤液减压浓缩至无醇味，加蒸馏水混悬均匀，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯萃取液得浸膏；
（3）将浸膏用减压硅胶柱色谱分离，依次用体积比为9:1的石油醚/乙酸乙酯和体积比为3:1的石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，分别得到A、B两个组分，得到的组分B为抗氧化提取物。
2.一种厚网地藻（Dictyota coriacea）抗氧化提取物，其特征在于，其提取过程如下：
（1）取厚网地藻（Dictyota coriacea）的干燥粗粉，95%乙醇室温浸泡提取，过滤，收集滤液；
（2）将滤液减压浓缩至无醇味，加蒸馏水混悬均匀，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯萃取液得浸膏；
（3）将浸膏用减压硅胶柱色谱分离，依次用体积比为9:1的石油醚/乙酸乙酯和体积比为3:1的石油醚/乙酸乙酯、纯甲醇进行梯度洗脱，分别得到A、B、C三个组分；
（4）将组分B用Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷/甲醇1:1为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液为无色得到第一次洗脱液，然后再收集洗脱液得到第二次洗脱液，减压浓缩第二次洗脱液得组分B-2，为抗氧化提取物。
3.根据权利要求1或2所述的厚网地藻（Dictyota coriacea）抗氧化提取物，其特征在于：步骤（1）所述的厚网地藻的干燥粗粉是厚网地藻全藻阴干后粉碎得到，料液比为1g :16 mL，提取次数为3次，每次4 h。
4.根据权利要求1或2所述的厚网地藻（Dictyota coriacea）抗氧化提取物，其特征在于：步骤（2）中所述的乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1:3，萃取次数为3次。
5.根据权利要求1或2所述的厚网地藻（Dictyota coriacea）抗氧化提取物，其特征在于步骤（3）中所述的减压柱色谱所用硅胶为硅胶H，且与浸膏的质量比为10:1；浸膏与每一种洗脱剂的质量体积比为1 g : 60 mL。
6.一种如权利要求1或2所述的厚网地藻（Dictyota coriacea）抗氧化提取物在制备神经保护药物中的应用。
7.一种如权利要求1或2所述的厚网地藻（Dictyota coriacea）抗氧化提取物在制备具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能药物的应用。
8.一种具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能的药物组合物，其特征在于：含有治疗有效量的活性组分和药学上可接受的药用辅料，所述活性组分包括权利要求1或2所述的厚网地藻（Dictyota coriacea）抗氧化提取物。
9.根据权利要求8所述的一种具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能的药物组合物，其特征在于：所述的活性组分还包括有目前药学上可接受且已上市的抗氧化药物。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物具有如下制剂形式：注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂和纳米制剂。
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