KR102666211B1 - 미세먼지로부터 피부 방어 효능을 갖는 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인삼 추출물에 유기산을 첨가하여 산 가수분해 반응시킨 후 알코올계 용매를 이용하여 분획하는 것, 및 상기 분획에 의해 수득된 알코올 층을 회수하여 농축하는 것을 포함하는, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 인삼 추출물로부터 진세노사이드 Rh1이 강화된 분획물을 수득할 수 있다. 이로써 우수한 품질의 진세노사이드 Rh1이 강화된 분획물을 안정적으로 소비자에게 제공할 수 있으며, 이와 같은 진세노사이드 Rh1 강화 분획물은 특히 미세먼지에 의한 세포 손상을 방지하는 효능이 우수하므로 미세먼지에 의한 세포 손상 방지용 식품 조성물, 화장료 조성물, 약학적 조성물 등의 다양한 제품에 활용될 수 있다.
본 발명에 따르면 인삼 추출물로부터 진세노사이드 Rh1이 강화된 분획물을 수득할 수 있다. 이로써 우수한 품질의 진세노사이드 Rh1이 강화된 분획물을 안정적으로 소비자에게 제공할 수 있으며, 이와 같은 진세노사이드 Rh1 강화 분획물은 특히 미세먼지에 의한 세포 손상을 방지하는 효능이 우수하므로 미세먼지에 의한 세포 손상 방지용 식품 조성물, 화장료 조성물, 약학적 조성물 등의 다양한 제품에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 미세먼지로부터 피부 방어 효능을 갖는 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
인삼은 식물 분류학상으로 오갈피나무과(Araliaceae)의 인삼속(Panax)에 속하는 다년생 음지성 초본식물로서 오래 전부터 한방에서 중요한 약재로 사용되었다. 인삼의 사포닌은 항암 작용, 항산화 작용, 동맥경화 및 고혈압 예방, 간기능 개선, 항피로, 항스트레스 작용, 노화 방지, 두뇌 활동 촉진, 항염 활성, 알레르기성 질환 치료 및 단백질 합성 능력의 촉진 등의 생리 활성이 있으며, 고려 홍삼은 항산화, 혈압 강하, 알코올성 고지혈증 개선, 혈당 강하 작용 등의 우수한 생리활성을 보유하는 것으로 알려져 있다.
인삼은 일반적으로 가공 방법에 따라 백삼과 홍삼으로 구분되며, 백삼은 밭에서 채굴한 가공되지 아니한 인삼 즉, 수삼을 그대로 건조한 것을 지칭하며 홍삼은 수삼을 증숙하여 건조 가공한 것으로 제조과정에서 사포닌 변형과 아미노산 변화 등 여러 화학적인 변화가 수반된다. 홍삼은 제조 과정에서 가해지는 열에 의해 인삼에 존재하지 않는 진세노사이드 Rg2, Rg3, Rh1, Rh2 등의 사포닌 성분이 생성되며, 홍삼 특유의 유효 성분은 암 예방 작용, 암세포 성장억제 작용, 혈압 강하 작용, 뇌신경세포 보호 및 학습 능력 개선 작용, 항혈전 작용, 항산화 작용 등이 우수하여 탁월한 약리 효능을 기대할 수 있다.
이와 같은 효과는 주로 인삼 또는 홍삼 내에 함유된 진세노사이드에 의한 것이며, 특히 진세노사이드 Rh1은 간보호, 항종양 작용, 혈소판 응집억제 효과가 있다고 보고되어 있다.
진세노사이드 성분들은 각각 다양한 약효를 나타내고, 그 구조에 따라 약효의 종류와 강도가 다르게 나타나므로, 원하는 진세노사이드를 강화하는 방법이 시도되어 왔다. 예를 들면 특허문헌 1에는 인삼 또는 홍삼 추출물에 오존을 처리하여 진세노사이드 Rg3가 강화된 인삼 또는 홍삼 추출물을 수득하는 방법이 개시되어 있다.
본 발명자들은 인삼 추출물로부터 진세노사이드 Rh1을 특히 강화할 수 있는 방법을 연구하던 중에, 유기산을 이용하여 인삼 추출물을 산 가수분해 처리한 후 알코올계 용매로 분획을 수행함으로써 진세노사이드 Rh1이 특히 강화된 분획물을 수득할 수 있고, 이러한 진세노사이드 Rh1 강화 분획물이 미세먼지로부터 피부 손상을 방지하는 효능이 매우 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인삼 추출물로부터 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 이용하여 미세먼지에 의한 세포 손상 방지 효능이 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는 인삼 추출물에 유기산을 첨가하여 산 가수분해 반응 후 알코올계 용매를 이용하여 분획하는 것, 및 상기 분획에 의해 수득된 알코올 층을 회수하여 농축하는 것을 포함하는, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 세포 손상 방지용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 인삼 추출물로부터 진세노사이드 Rh1이 강화된 분획물을 수득할 수 있다. 이로써 우수한 품질의 진세노사이드 Rh1이 강화된 분획물을 안정적으로 소비자에게 제공할 수 있으며, 이와 같은 진세노사이드 Rh1 강화 분획물은 미세먼지에 의한 세포 손상을 방지하는 효능이 우수하므로 미세먼지에 의한 세포 손상 방지용 식품 조성물, 화장료 조성물, 약학적 조성물 등의 다양한 제품에 활용될 수 있다.
도 1은 제조예 1의 산 가수분해 반응시 전환 진세노사이드를 확인한 결과이다.
도 2는 산 가수분해 반응에 이용된 산 종류(홍삼초, 아세트산, 시트르산, 염산)에 따른 진세노사이드 Rh1 강화 효과의 차이를 확인한 결과이다.
도 3은 수불용성 물질 제거에 따른 진세노사이드 Rh1 강화 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 인간 각질형성세포 HaCaT에서 미세먼지 처리에 의해 증가된 TNF-α 의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 뚜렷하게 감소함을 보여주는 그래프이다.
도 5는 인간 각질형성세포 HaCaT에서 미세먼지 처리에 의해 증가된 CYP1A1의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 감소함을 보여주는 그래프이다.
도 6은 인간 각질형성세포 HaCaT에서 미세먼지 처리에 의해 활성화되고 분해된 AhR의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 회복됨을 보여주는 그래프이다.
도 7은 인간 각질형성세포 HaCaT에서 미세먼지 처리에 의해 활성화된 자가포식 관련 단백질 p62, LC3-Ⅱ의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 감소함을 보여주는 그래프이다.
도 2는 산 가수분해 반응에 이용된 산 종류(홍삼초, 아세트산, 시트르산, 염산)에 따른 진세노사이드 Rh1 강화 효과의 차이를 확인한 결과이다.
도 3은 수불용성 물질 제거에 따른 진세노사이드 Rh1 강화 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 인간 각질형성세포 HaCaT에서 미세먼지 처리에 의해 증가된 TNF-α 의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 뚜렷하게 감소함을 보여주는 그래프이다.
도 5는 인간 각질형성세포 HaCaT에서 미세먼지 처리에 의해 증가된 CYP1A1의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 감소함을 보여주는 그래프이다.
도 6은 인간 각질형성세포 HaCaT에서 미세먼지 처리에 의해 활성화되고 분해된 AhR의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 회복됨을 보여주는 그래프이다.
도 7은 인간 각질형성세포 HaCaT에서 미세먼지 처리에 의해 활성화된 자가포식 관련 단백질 p62, LC3-Ⅱ의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 감소함을 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법은 인삼 추출물에 유기산을 첨가하여 산 가수분해 반응 후 알코올계 용매를 이용하여 분획하는 것을 포함한다.
본 발명에서 인삼 추출물은 인삼으로부터 통상의 방식으로 수득된 것일 수 있다. 상기 인삼은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 인삼은 인삼의 잎, 어린 새싹, 줄기, 줄기 껍질, 뿌리, 뿌리 껍질, 종자, 열매, 미숙과, 완숙과, 과육, 과피, 꽃, 수술군(androecium), 암술군(gynoecium), 꽃받침, 수술, 꽃잎, 꽃받침 조각, 심피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하며, 바람직하게는 인삼의 뿌리를 의미한다.
상기 인삼은 다양하게 가공된 것을 포함하며, 예를 들면 수삼, 미삼, 흑삼, 산삼, 장뇌삼, 산양삼, 호정화 인삼, 효소 처리된 미삼, 발효 인삼, 홍삼 및 발효 홍삼으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 수삼은 말리지 아니한 인삼을 말하고, 미삼은 머리와 몸통에서 분리된 다리부분과 세미를 말한다. 여기서 세미란 본삼을 제외한 잔뿌리를 말한다. 홍삼은 생인삼을 쪄서 익혀 건조한 것으로 건조 과정에서 갈변 반응이 일어나 담황갈색 내지 적갈색을 띄는 것이다. 흑삼은 홍삼을 더 여러 번 찌고 건조하여 흑색으로 변화한 인삼을 말한다. 산삼은 자생 인삼을 말하며, 장뇌삼은 심어서 기른 산삼을 말한다. 산양삼은 산간의 삼림 하에서 인위적으로 종자나 묘삼을 파종 이식하여 재배한 인삼이다. 또한, 상기 인삼 추출물은 인삼을 찌는 증삼 과정에서 인삼의 표면에서 생성되는 증삼액을 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 증삼액은 인삼의 표면에 존재하는 유효성분 또는 진세노사이드를 포함한다.
본 발명에서 추출물은 인삼으로부터 임의의 방법으로 추출된 물질을 의미하며, 이렇게 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한 없이 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 추출물은 인삼 또는 이의 건조물로부터 추출하여 얻을 수 있으며, 상기 인삼 또는 이의 건조물의 분말로부터 추출할 수도 있다.
상기 추출물을 인삼으로부터 추출하여 수득할 때, 추출 방법으로는 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 통상적인 추출 방법을 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용함으로써 제조할 수 있다. 상기 추출 과정은 수회 반복할 수 있으며, 이후에 농축 또는 동결건조 등의 단계를 추가적으로 거칠 수 있다. 구체적으로, 수득한 추출물을 감압 농축하여 농축액을 얻고, 상기 농축액을 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 고농도의 추출 분말을 제조할 수 있다. 추출물은 추출물을 추가적으로 분획하여 얻은 분획물도 포함한다.
상기 인삼으로부터 추출물을 수득할 때, 물, 유기용매, 초임계 유체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 추출용매로 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 알코올, 바람직하게는 C1-C4의 저급 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 벤젠 및 이들의 혼합용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 에탄올일 수 있다. 예를 들어, 물 및 유기용매의 혼합물을 추출 용매로 사용하는 경우, 물 및 유기용매의 혼합물은 바람직하게는 물 및 C1-C4의 저급 알코올의 혼합물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 물일 수 있다.
인삼 추출물 제조시, 추출은 20℃ 내지 130℃, 또는 30℃ 내지 120℃에서 실시될 수 있고, 바람직하게는 50℃ 내지 110℃, 또는 70℃ 내지 105℃에서 실시될 수 있으며, 더 바람직하게는 85℃ 내지 100℃에서 실시될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 추출은 2시간 내지 12시간 동안 실시될 수 있고, 바람직하게는 5시간 내지 10시간 동안 실시될 수 있으며, 더 바람직하게는 6시간 내지 8시간 동안 실시될 수 있다. 추출은 1회 내지 7회 실시될 수 있고, 바람직하게는 1회 내지 4회 실시될 수 있으며, 더 바람직하게는 1회 내지 2회 실시될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서는, 인삼 추출물에 유기산을 첨가하여 산 가수분해 반응을 수행하는 것을 특징으로 하며, 이와 같은 산 가수분해 반응에 의해 진세노사이드 Re가 진세노사이드 Rg1으로 전환되고, 진세노사이드 Rg1은 진세노사이드 Rh1으로 다시 전환됨으로써 1차적으로 진세노사이드 Rh1이 강화 효과를 달성할 수 있다.
상기 유기산은 상기 인삼 추출물 대비 0.01%(v/v) 이상, 또는 0.02%(v/v) 내지 10%(v/v), 또는 0.025%(v/v) 내지 7%(v/v), 또는 0.03%(v/v) 내지 5%(v/v), 또는 0.035%(v/v) 내지 4.5%(v/v) 농도로 첨가될 수 있다. 상기 수치범위를 충족하는 경우 진세노사이드 Rh1으로의 진세노사이드 전환이 충분히 일어날 수 있다.
상기 산 가수분해 반응은 25℃ 내지 97℃, 35℃ 내지 95℃, 45℃ 내지 93℃, 50℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 85℃에서 수행될 수 있다. 상기 수치범위를 충족하는 경우 진세노사이드 Rh1으로의 진세노사이드 전환이 충분히 일어날 수 있다.
상기 산 가수분해 반응은 5시간 내지 35시간, 또는 7시간 내지 33시간, 또는 9시간 내지 31시간, 또는 11시간 내지 29시간, 또는 13시간 내지 27시간, 또는 15시간 내지 25시간, 또는 17시간 내지 24시간, 또는 18시간 내지 24시간, 또는 18시간 내지 23시간, 또는 18시간 내지 22시간 동안 수행될 수 있다. 상기 수치범위를 충족하는 경우 진세노사이드 Rh1으로의 진세노사이드 전환이 충분히 일어날 수 있다.
상기 유기산은 젖산, 아세트산, 포름산, 시트르산, 옥살산, 아스코르브산, 요산, 부티르산, 스테아르산 및 프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 아세트산 및 시트르산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다.
상기 산 가수분해 반응은 pH 2.0~6.0, 또는 pH 2.5~5.0, 또는 pH 3.0~4.7에서 수행될 수 있다. 상기 수치범위를 충족하는 경우 진세노사이드 Rh1으로의 진세노사이드 전환이 충분히 일어날 수 있다.
상기 산 가수분해물은 pH가 4.5 이하로 낮기 때문에 이후 반응에서 반응물의 불안정성이 증가하는 경향이 있고, 이후 공정에서 의도하지 않은 침전물이 발생할 수 있으므로, 상기 산 가수분해물을 중화하는 단계를 추가로 수행하는 것이 바람직하다. 중화를 위해서 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 수산화칼륨, 암모니아, 탄산수소나트륨, L-아르기닌, 트로메타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기성 성분을 첨가할 수 있으며, 이로써 산 가수분해물의 산도를 pH 6.0 내지 6.5 범위로 조정할 수 있다.
본 발명에서는, 상기 산 가수분해물을 알코올계 용매로 분획함으로써 2차적으로 진세노사이드 Rh1 강화 효과를 달성할 수 있다.
상기 분획은 통상의 분획 공정을 통해 이루어질 수 있고, 진세노사이드 Rh1 강화 효과를 극대화하기 위해 2차 이상 분획이 이루어질 수 있으며, 이와 같은 추가의 분획 공정을 통해서 얻어진 분획물도 본 발명에 포함된다. 또한, 인삼 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 통과시켜 얻은 분획물, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등으로 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획물도 본 출원의 분획물에 포함된다. 여러 성분이 혼합되어 있는 분획물을 농도 구배 컬럼 크로마토그래피 등을 통하여 활성 성분의 성질에 따라 분리하여서 진세노사이드 Rh1이 더욱 강화된 분획물을 제조할 수 있다.
정제시, 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 실리카겔, 세파덱스, LH-20, ODS 겔, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용하여 활성 분획물을 분리 및 정제할 수 있다. 상기 크로마토그래피를 사용함에 있어 용출 용매, 용출 속도 및 용출 시간은 본 기술 분야에서 일반적으로 사용하는 용매, 속도 또는 시간을 적용할 수 있다.
본 발명에서 알코올계 용매를 이용한 분획시, 상기 산 가수분해물에 알코올계 용매를 혼합하고 정치시킨 후 층이 분리되면 분별함으로써, 진세노사이드 Rh1이 강화된 알코올계 용매층 분획물을 수득할 수 있다.
상기 알코올계 용매는 상기 산 가수분해물 대비 중량 기준으로 0.1배 이상, 또는 0.1배 내지 30배, 또는 0.2배 내지 30배, 또는 0.3배 내지 25배, 또는 0.5배 내지 20배, 또는 0.7배 내지 10배, 또는 1배 내지 5배, 또는 1배 내지 1.5배로 포함될 수 있다. 알코올계 용매의 양이 하한값 미만일 경우에는 산 가수분해물 내의 유효성분들이 충분히 분획되지 않을 수 있다. 알코올계 용매의 양이 상한값을 초과할 경우에는 잔류 용매를 제거한 처리를 1회~수회 반복해야 하는 단점이 있다.
상기 알코올계 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 중에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있고, 바람직하게는 부탄올을 포함한다.
본 발명의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법은 상기 분획에 의해 수득된 알코올 층을 회수하여 농축하는 것을 포함한다. 이와 같이 상기 알코올 층을 감압농축하고 및/또는 희석함으로써 원하는 농도의 알코올 층 분획물을 제조할 수 있다. 그런데, 상기 알코올 층의 분획물에는 진세노사이드 Rh1이 강화되어 있는 한편, 수불용성 물질 또한 다량으로 포함되어 있을 수 있다.
따라서, 상기 알코올 층의 분획물로부터 수불용성 물질을 제거하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 구체적으로는, 수불용성 물질의 제거를 위해, 35℃ 내지 90℃, 또는 55℃ 내지 85℃, 또는 60℃ 내지 80℃, 또는 62℃ 내지 79℃, 또는 65℃ 내지 75℃에서 가열을 수행할 수 있다. 이후, 실온으로 냉각시키고 원심분리 또는 여과를 통해 침전물을 제거함으로써 수불용성 물질이 제거된 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 깨끗이 수득할 수 있다.
이처럼 상기 알코올 층의 분획물에는 다량의 수불용성 물질이 포함되어 있기 때문에 이를 제거하기 위해서 상기한 바와 같은 가열, 원심분리 또는 여과 단계를 추가적으로 수행하게 된다. 그런데, 본 발명자들은 상기 중화된 산 가수분해물을 알코올계 용매로 분획하는 단계 전 또는 후에, 비양자성 유기용매를 이용하여 분획을 추가로 수행하고 이렇게 수득된 분획물을 제거함으로써 다량의 수불용성 물질을 효율적으로 제거할 수 있음을 확인하였고, 이 경우에는 상기 알코올 층의 분획물로부터 수불용성 물질을 제거하기 위한 추가적인 공정이 생략되어도 되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법은 상기 중화된 산 가수분해물을 알코올계 용매로 분획하는 단계 전 또는 후에, 비양자성 유기용매를 이용하여 분획을 수행하고 이렇게 수득된 분획물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이로써 공정 효율성이 증대될 수 있다.
구체적으로는, 상기 산 가수분해물에 비양자성 유기용매를 혼합하고 정치시킨 후 층이 분리되면 분별함으로써, 수불용성 물질이 함유된 비양자성 유기용매 층 분획물을 제거할 수 있다.
또는, 상기 알코올 층의 분획물에 비양자성 유기용매를 혼합하고 정치시킨 후 층이 분리되면 분별함으로써, 수불용성 물질이 함유된 비양자성 유기용매 층 분획물을 제거할 수 있다.
상기 비양자성 유기용매는 상기 산 가수분해물 또는 상기 알코올 층의 분획물 대비 중량 기준으로 0.1배 이상, 또는 0.1배 내지 30배, 또는 0.5배 내지 30배, 또는 0.5배 내지 25배, 또는 0.7배 내지 20배, 또는 0.7배 내지 10배, 또는 1배 내지 5배, 또는 1배 내지 3배로 포함될 수 있다. 비양자성 유기용매의 양이 하한값 미만일 경우에는 산 가수분해물 또는 상기 알코올 층의 분획물 내의 수불용성 물질들이 충분히 분획 및 제거되지 않을 수 있다. 비양자성 유기용매의 양이 상한값을 초과할 경우에는 이후 잔류 용매를 제거하기 위해 시간 및 비용이 소요되므로 비경제적일 수 있다.
상기 비양자성 유기용매는 헥산(n-헥산), 에테르, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 벤젠 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 헥산(n-헥산), 에틸아세테이트, 디클로로메탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
이와 같이 비양자성 유기용매 층이 제거된 산 가수분해물에 대해서 상술한 바와 같이 알코올계 용매를 이용한 분획을 수행함으로써 알코올 층 분획물을 수득할 수 있다.
또는, 상기 산 가수분해물로부터 알코올 층의 분획물을 수득한 후, 비양자성 유기용매 층을 제거함으로써 공정 효율적으로 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 수득할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 최종 진세노사이드 Rh1 강화 분획물은 진세노사이드 Rh1을 100 ㎍/㎖ 이상, 또는 100 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖, 또는 120 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 또는 140 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖을 포함할 수 있다.
이와 같이 제조된 진세노사이드 Rh1 강화 분획물은 미세먼지에 의한 세포 손상을 방지하는 효능이 우수하므로 미세먼지에 의한 세포 손상 방지용 식품 조성물, 화장료 조성물, 약학적 조성물 등의 다양한 제품에 활용될 수 있다.
상기 미세먼지(particulate matter, PM)는 입자 지름이 10㎛ 이하인 것으로 외부로부터 세포 내에 유입되어 세포의 성장과 정상적인 대사 과정을 방해할 수 있는 화합물이라면 어느 것이든 포함할 수 있고, 예를 들어 다환방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)를 포함할 수 있다.
상기 다환방향족 탄화수소는 세포 내부로 유입되면 AhR과 결합하여 여러 유전자군의 발현을 유도할 수 있고, 이에 따라 CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, COX-2, TNF-α, MMPs 등의 발현이 증가되어 나타날 수 있는바, 상기와 같은 유전자들의 발현량의 변화를 확인함으로써 상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 미세먼지에 대한 세포 보호 효과를 확인할 수 있다.
상기 "미세먼지에 의한 세포 손상"은 미세먼지에 의해 유도된 활성 산소종 또는 독성물질에 의해 유도될 수 있으며, 이에 따라 세포 성장 억제나 세포사멸이 진행될 수 있고 피부세포에서 이를 구성하는 각종 섬유 단백질의 합성이 저해되고 분해 효소의 발현이 증가될 수 있다.
상기 "세포 손상"은 피부 세포, 호흡기 세포 또는 각막 세포의 손상일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물이 가지는 미세먼지에 의한 세포 손상 방지 효과를 확인하기 위하여, 각질형성세포에 미세먼지와 함께 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 처리하여 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현 수준을 확인한 결과, 미세먼지에 의해 증가된 염증성 사이토카인의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 뚜렷하게 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 미세먼지에 의한 세포 손상 방지의 작용 기전을 확인하기 위하여, 각질형성세포에 미세먼지와 함께 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 처리하여 CYP1A1의 발현량을 확인한 결과, 미세먼지에 의해 증가된 CYP1A1의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 미세먼지에 의한 세포 손상 방지의 작용 기전을 확인하기 위하여, 각질형성세포에 미세먼지와 함께 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 처리하여 AhR의 단백질 수준을 확인한 결과, 미세먼지에 의해 활성화된 이후 분해됨으로써 감소되었던 AhR의 단백질 수준이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 회복되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 미세먼지에 의한 세포 손상 방지의 작용 기전을 확인하기 위하여, 각질형성세포에 미세먼지와 함께 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 처리하여 자가포식 관련 단백질 p62, LC3-Ⅱ의 단백질 수준을 확인한 결과, 미세먼지 처리에 의해 활성화되었던 p62, LC3-Ⅱ의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물은 미세먼지의 세포 내 유입에 의한 염증 반응을 억제함으로써 세포의 손상을 방지하고, 미세먼지의 직접적인 작용 기전을 억제할 수 있는 활성을 가짐이 분명하므로, 상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 미세먼지에 의한 세포 손상 방지를 위한 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 세포 손상 방지용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 미세먼지에 의한 피부 세포의 손상은 예컨대 피부노화, 피부 주름의 증가, 피부 탄력의 손상, 피부 색의 손상, 색소 과형성, 기미, 주근깨, 피부의 건조, 피부 염증, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 또는 건선을 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 피부 노화, 피부 주름의 증가, 피부 탄력의 손상, 피부 색의 손상, 색소 과형성, 기미, 주근깨, 피부의 건조, 피부 염증, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 또는 건선의 개선을 위한 용도로 사용할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
상기 "화장품학적 유효량"은 본 발명의 조성물이 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 방지 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 이용할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 유효성분으로서의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물과 상기 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 "예방"은 미세먼지에 의해 유발되는 질환으로 인한 증상 또는 이의 합병증으로 인한 증상의 발생의 억제를 의미한다.
상기 용어 "치료"는 이미 발생된 미세먼지에 의해 유발되는 질환 또는 이 질환의 합병증으로 인한 증상의 경감 또는 제거를 의미한다.
상기 미세먼지에 의해 유발되는 질환은 피부 염증, 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 여드름, 피부건조증 및 건선으로 구성되는 군에서 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 치료학적 유효량(therapeutically effective amount); 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
상기 "치료학적 유효량"은 본 발명의 조성물이 미세먼지에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 일일 투여량은 0.0001~100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001~30 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 아울러, 투여 기간은 1일 내지 2개월일 수 있으나, 질환의 예방 또는 치료 효과가 나타날 때까지 제한 없이 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (a)의 제조
1-1. 증삼농축액의 제조
인삼을 수세하고 건조한 후 95℃ 수증기에 3시간 가온 후 방냉시 발생하는 증삼액을 포집하여 농축액 당도가 58 브릭스에 도달할 때까지 52℃에서 감압 농축하여 증삼농축액을 수득하였다. 이때 수득된 증삼농축액의 고형분 함량은 대략 52%였다.
1-2. 진세노사이드 Rh1의 강화
상기 제조예 1-1의 증삼농축액에 아세트산 용액(순도 99.0% 이상, 덕산, 014-00266)을 1%(v/v) 농도로 혼합한 후 80℃ 이상으로 가온하고 21시간 동안 가열하여 산 가수분해 반응을 수행하였다. 산 가수분해물에 수산화나트륨을 가하여 pH 6.0~6.5로 중화하였다.
중화된 산 가수분해물에 중량 기준으로 1.2배의 수포화 부탄올을 첨가한 후 흔들어 혼합하고 충분하게 분리될 때까지 정치하여 수포화 부탄올 층 분획물을 수득하였다. 실온에서 감압농축한 후 고형분 질량의 약 5배수의 정제수에 용해시킨 후 진세노사이드 Rh1 함량을 측정하였다(표 1 참조).
상기 분획물을 70℃로 가온하여 72시간 동안 가열하였다. 이후 실온으로 냉각시키고 원심분리에 의해 침전물을 제거하여 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (a)를 수득하였다.
제조예 2. 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (b)의 제조
상기 제조예 1-2의 진세노사이드 Rh1 강화 단계에서 산 가수분해 반응시 1%(v/v) 아세트산 용액 대신에 시트르산 분말(덕산, 1287)을 1%(w/v) 농도로 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법에 의해 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 수득하였으며, 산 가수분해 반응 시간은 18시간 또는 21시간으로 달리하였다. 각각의 분획물을 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (b) (18h) 및 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (b) (21h)로 나타냈다.
제조예 3. 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (c) 내지 (e)의 제조
상기 제조예 1-1의 증삼농축액에 아세트산 용액(순도 99.0% 이상, 덕산, 014-00266)을 1%(v/v) 농도로 혼합한 후 80℃ 이상으로 가온하고 21시간 동안 가열하여 산 가수분해 반응을 수행하였다. 산 가수분해물에 수산화나트륨을 가하여 pH 6.0~6.5로 중화하였다.
중화된 산 가수분해물에 중량 기준으로 1.2배의 수포화 부탄올을 혼합한 후 흔들어 혼합하고 충분하게 분리될 때까지 정치하여 수포화 부탄올 층 분획물을 수득하였다.
상기 수포화 부탄올 층 분획물에 중량 기준으로 1.2배의 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄을 각각 혼합하고 정치시킨 후 층 분리가 이루어진 다음 에틸아세테이트 층, 헥산 층, 디클로로메탄 층을 각각 분리하여 제거하였다. 상기 에틸아세테이트 층, 헥산 층, 디클로로메탄 층이 각각 제거된 각각의 분획물을 실온에서 감압농축하여 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (c) 내지 (e)를 각각 수득하였다.
제조예 4. 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (f) 내지 (h)의 제조
상기 제조예 3에서, 산 가수분해 반응시 1%(v/v) 아세트산 용액 대신에 시트르산 분말(덕산, 1287)을 1%(w/v) 농도로 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법에 의해 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (f) 내지 (h)를 수득하였다.
실시예 1. 산 가수분해 반응시 전환 진세노사이드의 확인
산 가수분해 반응에 따른 진세노사이드 전환을 확인하기 위해, 상기 제조예 1-2의 진세노사이드 Rh1 강화 단계에서, 정제수, 아세트산, 시트르산으로 각각 산 가수분해를 수행한 이후에 각 진세노사이드 종류에 따른 함량(㎍/㎖) 및 그 변화를 고성능 액체 크로마토그래프법에 의해 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타낸다.
실시예 2. 부탄올 층 분획물에서 진세노사이드 Rh1의 강화 효과의 확인
고성능 액체 크로마토그래프법에 의해, 상기 제조예 1-1의 증삼농축액 대비 제조예 1-2의 수포화 부탄올 층 분획물에 함유된 진세노사이드 Rh1 함량을 비교하였다. 각각의 진세노사이드의 증가율(%)은 다음 식에 의해 계산되었다.
증가율(%)= 수포화 부탄올 층 분획물 내 진세노사이드 함량/증삼농축액 내 진세노사이드 함량 * 100
| Rb1 | Rb2 | Rc | Rd | Rg3s | Rg3r | Re | Rf | Rg1 | Rg2s | Rh1 | |
| 제조예 1-1의 증삼농축액 (mg/g) | 19.33 | 7.55 | 9.66 | 2.36 | 1.13 | 2.12 | 7.19 | 1.31 | 3.37 | 1.30 | 0.33 |
| 제조예 1-2의 수포화 부탄올 층 분획물 (mg/g) | 122.92 | 54.30 | 69.19 | 19.31 | 17.47 | 9.78 | 38.75 | 10.47 | 19.05 | 13.04 | 19.15 |
| 증가율 (%) | 636 | 719 | 716 | 818 | 1547 | 461 | 539 | 799 | 565 | 1003 | 5803 |
상기 표 1의 결과로부터, 증삼농축액의 산 가수분해물 반응 후 부탄올 분획을 수행하여 수득된 부탄올 층 분획물에서 진세노사이드 Rh1이 강화된 것을 확인할 수 있다. 부탄올 분획 전의 증삼농축액에 함유된 진세노사이드 Rh1 함량과 비교해보면, 대략 58배만큼 진세노사이드 Rh1 함량이 증가되었고, 이와 같은 진세노사이드 Rh1의 증가는 다른 진세노사이드에 비해 특히 높은 증가율을 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 3. 산 가수분해 시간에 따른 진세노사이드 종류 및 함량의 변화
상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (a) 제조시에, 산 가수분해 시간 조건을 0시간, 3시간, 6시간, 18시간 및 24시간으로 달리하면서 분획물을 수득하였고, 이로써 수득된 최종 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (a) 내에서 주요 진세노사이드 Rg1, Re, Rh1, Rg2s 함량의 변화를 확인하였다. 그 결과를 아래 표 2에 나타낸다.
| 0시간 | 3시간 | 6시간 | 18시간 | 21시간 | 24시간 | |
| Rg1 | 494.8 | 433.9 | 254.4 | 52.3 | 54.1 | 60.3 |
| Re | 1152.9 | 918.9 | 710.8 | 225.5 | 171.3 | 108.5 |
| Rh1 | 141.9 | 185.6 | 245.6 | 300.5 | 328.9 | 275.8 |
| Rg2s | 480.8 | 597.6 | 635.4 | 737.4 | 711.3 | 753.4 |
| (Rg1+Re)/Rh1 | 11.61 | 7.29 | 3.93 | 0.92 | 0.68 | 0.611 |
상기 표 2의 결과로부터, 산 가수분해 반응은 대략 18시간 내지 24시간 범위에서 수행되는 경우에, 진세노사이드 Rh1 강화 효과가 우수한 것을 확인할 수 있고, 특히 21시간으로 수행한 경우에, 가장 우수한 진세노사이드 Rh1 강화 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 4. 산 종류에 따른 진세노사이드 Rh1 강화 효과의 차이
본 발명에서 산 가수분해 반응시 처리하는 산 종류에 따른 진세노사이드 Rh1의 강화 효과의 차이를 확인하기 위해, 상기 제조예 1에서 1%(v/v) 아세트산 대신에 1%(v/v) 홍삼초(출원번호 10-2017-0061190에 개시된 "홍삼초의 제조방법"에 따라 제조하였으며, 구체적으로는 홍삼 미분을 누룩균으로 당 가수분해 후 정제수를 투입하고, 초산균으로 2차 발효한 후 제균하여 사용함), 1%(v/v) 염산(ACROS ORGANICS, 124200010)을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법에 의해 인삼 추출물의 분획물 (a) 및 (b)를 제조하였다. 산 가수분해 시간은 18시간 및 21시간으로 달리하였다.
상기 제조예 1의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (a), 제조예 2의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (b), 인삼 추출물의 분획물 (a) 및 (b)에 함유된 진세노사이드 Rh1의 함량을 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타낸다.
도 2의 결과로부터, 유기산인 아세트산 또는 시트르산을 이용하여 각각 수득된 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (a) 또는 (b)의 경우, 진세노사이드 Rh1이 매우 강화된 것을 확인할 수 있다.
반면, 홍삼초를 이용하여 수득된 인삼 추출물의 분획물 (a)의 경우 가수분해가 효과적으로 이루어지지 않아 적정 수준의 Rh1이 생성되지 않았고, 염산을 이용하여 수득된 인삼 추출물의 분획물 (b)의 경우 가수분해가 과도하게 진행되어 Rh1이 적은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 수불용성 물질 제거에 따른 진세노사이드 Rh1의 강화 효과
본 발명에서 부탄올 층 분획물에 대해 비양자성 용매를 이용하여 분획 및 제거한 후 진세노사이드 Rh1이 강화되는 효과가 있는지 확인하기 위해, 상기 제조예 1의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (a), 제조예 2의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (b), 제조예 3의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (c) 내지 (e), 및 제조예 4의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (f) 내지 (h)에 함유된 진세노사이드 Rh1의 함량을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3으로부터, 아세트산 또는 시트르산 가수분해물을 각각 부탄올 분획하여 수득된 부탄올 층 분획물에 대해, 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 분획을 통해 불수용성 물질을 제거함으로써 수득된 각각의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (c) 내지 (e), 또는 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (f) 내지 (h)의 경우 대조군(증삼농축액) 대비 진세노사이드 Rh1 함량이 증가된 것을 확인할 수 있다. 특히, 헥산, 디클로로메탄 분획을 통해 불수용성 물질을 제거한 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 (d), (e), (g), (h)의 경우 Rh1 함량이 크게 증가되었고, 이는 진세노사이드 강화 분획물 (a) 또는 (b)에 비해서도 더욱 증가된 것이다.
뿐만 아니라, 이와 같은 추가적인 분획 공정을 통해 수불용성 물질 함유 분획물을 제거함으로써 용이하게 수불용성 물질을 제거할 수 있으므로, 부탄올 층 분획물의 농축 단계 이후에 수불용성 물질을 제거하기 위해 가열 및 침전물 제거 등의 추가적인 공정을 수행하지 않아도 되는 점에서 공정의 효율성이 증대된다.
실험예 1. 진세노사이드 Rh1 강화 분획물에 의한 염증 인자의 발현 감소 효과
미세먼지에 의해 유도되는 피부세포의 손상 인자의 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물에 의해 억제되는지 확인하기 위해 미세먼지와 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 처리 전후에 염증성 사이토카인 TNF-α의 발현 정도를 관찰하였다.
구체적으로, HaCaT 세포를 3.5×105 세포/웰 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 이후, FBS 2%가 함유된 DMEM 배지에 1.25, 2.5, 5 ㎍/㎖의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물과, 미세먼지로서 ERM-CZ100(조인트 리서치 센터) 50 ㎍/㎖을 함께 희석하여 18시간 처리하였다. 상기 진세노사이드 Rh1 강화 분획물로는 제조예 1의 Rh1 강화 분획물에 정제수 및 1,2-헥산다이올을 첨가하여 진세노사이드 Rh1 함량이 0.20%가 되도록 제조된 것을 사용하였다. 이때, 양성 대조군은 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 대신 α-나프토플라본(α-Naphthoflavone, α-NF)을 미세먼지와 함께 희석하여 처리하였다. 이후 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. 그 다음, RNA 정량 후 preRNA, oligo dT, DEPC DW를 합한 뒤 65℃에서 5분간 반응시키고 얼음에 5분간 시료를 옮겨 놓은 뒤 42℃에서 1시간, 70℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. PCR 프리믹스 및 하기 표 3의 TNF-α에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 후, 2% 아가로오즈 겔에 러닝하여 TNF-α의 mRNA 발현 정도를 비교하였고, 그 결과를 도 4에 나타낸다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열 (5'->3') | 서열번호 |
| TNF-α | Forward | CACAGTGAAGTGCTGGCAAC | 1 |
| Reverse | ACATTGGGTCCCCCAGGATA | 2 |
도 4에 나타난 바와 같이, 각질형성세포 HaCaT에 50 ㎍/㎖의 미세먼지를 처리하였을 때 염증성 사이토카인인 TNF-α의 mRNA 발현이 증가되었고, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 2.5 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 처리시 미세먼지 단독 처리군 대비 각각 60.2%, 19.8% 정도 감소 효능이 나타났으며, 이는 양성 대조군인 α-NF에 의한 감소 효능(약 7.2%)보다 높은 수준이다. 특히, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 처리한 모든 군에서 양성 대조군 대비 우수한 TNF-α 발현 억제 효과가 나타났다.
이로부터, 미세먼지에 의해 피부 염증 반응이 증가하고, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물은 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 억제함으로써 미세먼지에 의한 피부 손상을 방지하는 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 2. 진세노사이드 Rh1 강화 분획물에 의한 CYP1A1의 발현 감소 효과
AhR은 세포 내 사이토졸에 존재하며 리간드와 결합시 활성화되어 핵 내로 이동하고 ARNT와 복합체를 형성한 후 이종 반응 요소(xenobiotic responsive element, XRE)에 결합하여 CYP1A1의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. AhR 리간드로 알려져 있는 미세먼지 내에 함유된 PAHs의 자극을 진세노사이드 Rh1 강화 분획물이 억제하는지 확인하기 위해 CYP1A1의 발현 정도를 관찰하였다.
구체적으로, HaCaT 세포를 3.5×105 세포/웰 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, FBS 2%가 함유된 DMEM 배지에 1.25, 2.5, 5 ㎍/㎖의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물과 ERM-CZ100(조인트 리서치 센터) 50 ㎍/㎖을 함께 희석하여 18시간 처리한 후, 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. 그 다음, RNA 정량 후 preRNA, oligo dT, DEPC DW를 합한 뒤 65℃에서 5분간 반응시키고 얼음에 5분간 시료를 옮겨 놓은 뒤 42℃에서 1시간, 70℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. PCR 프리믹스 및 하기 표 4의 CYP1A1에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. 그 후, 2% 아가로오즈 겔에 러닝하여 CYP1A1의 mRNA 발현 정도를 비교하였고, 그 결과를 도 5에 나타낸다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열 (5'->3') | 서열번호 |
| CYP1A1 | Forward | TCTTTCTCTTCCTGGCTATC | 3 |
| Reverse | CTGTCTCTTCCCTTCACTCT | 4 | |
| β-actin | Forward | GGCATCGTGATGGACTCCG | 5 |
| Reverse | GCTGGAAGGTGGACAGCGA | 6 |
도 5에 나타난 바와 같이, HaCaT 세포에 50 ㎍/㎖의 미세먼지를 처리하였을 때 증가된 CYP1A1 발현이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 감소되는 것을 확인하였다. 구체적으로, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 5 ㎍/㎖ 처리시 미세먼지 단독 처리군 대비 약 12.3% 감소 효능이 나타났다.
실험예 3. AhR 단백질 수준
AhR은 세포 내 사이토졸에 존재하며 리간드와 결합시 활성화되어 핵 내로 이동하고 ARNT와 복합체를 형성한 후 이종 반응 요소(XRE)에 결합하여 CYP1A1의 발현을 증가시키는 역할을 하며, 이후 이 활성화된 AhR은 세포 핵에서 제거되고 28S 프로테오좀에 의해 분해되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 미세먼지와 결합하여 반응 후 분해되는 AhR의 단백질 수준이 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 처리에 의해 회복되는지 확인하기 위해 AhR의 발현 수준을 관찰하였다.
구체적으로, HaCaT 세포를 2.5×105 세포/웰 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 다음 FBS 2%가 함유된 DMEM 배지에 1.25, 2.5, 5 ㎍/㎖의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 6시간 전처리하였다. 그리고 배지를 제거한 후 FBS 2%가 함유된 DMEM 배지에 상기 각 농도의 진세노사이드 Rh1 강화 분확물과 ERM-CZ100(조인트 리서치 센터) 50 ㎍/㎖을 함께 희석하여 24시간 처리하였다. DPBS로 세척 후 방사성 면역침전 분석(RIPA) 완충액을 처리하여 세포를 모으고 원심분리하였다. 그 다음 웨스턴 블롯용 전기영동 겔을 200V 40분간 로딩하고 트랜스퍼를 통해 PVDF 멤브레인으로 옮긴 다음 AhR 항체를 노출시켜 단백질 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서와 같이, 미세먼지 단독 처리군의 경우에는, AhR 활성화 이후 단백질 분해에 의해 그 수준이 감소됨을 확인하였다. 또한, Rh1 강화 분획물을 함께 처리한 경우에는 AhR 단백질 분해가 억제된 것을 확인하였다. 구체적으로, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 5 ㎍/㎖ 처리시 미세먼지 단독 처리군 대비 약 230.4% 증가 효능이 나타났다.
따라서, 실험예 2 및 3의 결과로부터, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물은 미세먼지의 작용 기전을 직접적으로 억제함으로써 미세먼지에 의한 세포 손상을 방지하는 것을 알 수 있다.
실험예 4. 자가포식 활성 억제 효능
미세먼지는 피부 각질세포에서 AhR 활성화를 통해 P62, LC3-Ⅱ를 활성화하여 세포 내 자가포식 과정을 활성화하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서 Rh1 강화 분획물이 미세먼지로 인해 활성화되는 자가포식 작용을 억제시키는지 확인하기 위해 P62, LC3-Ⅱ의 발현 정도를 관찰하였다.
구체적으로, HaCaT 세포를 2.5×105 세포/웰 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 다음 FBS 2%가 함유된 DMEM 배지에 1.25, 2.5, 5 ㎍/㎖의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물을 6시간 전처리하였다. 그리고 배지를 제거한 후 FBS 2%가 함유된 DMEM 배지에 각 농도의 진세노사이드 Rh1 강화 분획물과 ERM-CZ100(조인트 리서치 센터) 50 ㎍/㎖을 함께 희석하여 24시간 처리하였다. DPBS로 세척 후 방사성 면역침전 분석(RIPA) 완충액을 처리하여 세포를 모으고 원심분리하였다. 그 다음 웨스턴 블롯용 전기영동 겔을 200V 40분간 로딩하고 트랜스퍼를 통해 PVDF 멤브레인으로 옮긴 다음 p62 및 LC3-Ⅱ 항체를 노출시켜 단백질 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7의 결과로부터, 미세먼지에 의해 피부 각질세포에서 자가포식 연관 단백질인 P62, LC3-Ⅱ의 수준이 증가된 것을 확인하였다. 또한, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물에 의해 이와 같은 자가포식 연관 단백질의 수준이 감소되는 것을 알 수 있다. 구체적으로, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물 5 ㎍/㎖ 처리시 미세먼지 단독 처리군 대비 각각 약 36.1%, 33.1% 감소 효능이 나타났으며, 이는 α-NF에 의한 감소 효능(각각 약 24.1%, 32.5%)보다도 높은 수준이다.
<110> KOREA GINSENG CORP.
<120> Method For Preparing Ginsenoside Rh1 Enhanced Fractions With Skin
Protective Effect From Particulate Matters
<130> 2021-DPA-4067
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha Forward primer
<400> 1
cacagtgaag tgctggcaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha Reverse primer
<400> 2
acattgggtc ccccaggata 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP1A1 Forward primer
<400> 3
tctttctctt cctggctatc 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP1A1 Reverse primer
<400> 4
ctgtctcttc ccttcactct 20
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta-actin Forward primer
<400> 5
ggcatcgtga tggactccg 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta-actin Reverse primer
<400> 6
gctggaaggt ggacagcga 19
Claims (8)
- 인삼 추출물에, 시트르산 또는 아세트산 중 적어도 하나의 유기산을 첨가하여 산 가수분해 반응 후 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올을 용매로 이용하여 분획하는 것, 및 상기 분획에 의해 수득된 알코올 층을 회수하여 농축하는 것을 포함하는, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 산 가수분해 반응은 18시간 내지 24시간 동안 수행되는, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 알코올계 용매는 부탄올을 포함하는, 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법. - 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 분획에 의해 수득된 알코올 층에 비양자성 유기용매를 가하여 분획을 수행하고 이로써 수득된 비양자성 유기용매 층을 제거하는 것을 추가로 포함하는 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 비양자성 유기용매는 헥산(n-헥산), 에테르, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 벤젠 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 진세노사이드 Rh1 강화 분획물의 제조 방법. - 삭제
- 삭제
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