KR102159343B1 - 가자육 추출물 포함하는 안구 건조증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

가자육 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 안구 건조증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물 및 개체의 안구 건조증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

가자육 추출물 포함하는 안구 건조증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물 및 그 용도{A pharmaceutical composition for preventing or treating dry eye syndrome comprising an extract of Terminalia chebula or a fraction thereof and use thereof}

가자육 추출물 포함하는 안구 건조증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물 및 개체의 안구 건조증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

안구건조증(Dry eye syndrome, DES)은 건성 각막 결막염(keratoconjunctivitis sicca)으로 알려진 눈의 질환으로서, 다양한 원인에 의하여 눈과 눈물막에 결함이 나타나는 것으로, 일반적인 증상으로는 과민상태(irritation), 이물감(foreign body sensation), 광과민성(light sensitivity), 가려움증(itching) 등이 있다. 안구건조증은 눈의 면역 염증 장애를 나타내지만 이러한 발병기전은 아직 완전히 규명되지 않았으나, 염증세포의 침윤, 면역활성화 분자 및 접착분자발현 증가, Th1 및 Th17 반응, 염증 관련 사이토카인의 비정상적인 변화 등 염증이 중요한 역할을 한다는 연구결과가 보고되고 있다.

일반적으로 안구 건조증 치료를 위해서 인공눈물 (artificial tears)을 사용한다. 그러나 인공 눈물은 가벼운 증상을 조절할 수 있지만, 그 효과가 일시적이라는 단점이 있다. 코르티코스테로이드 (corticosteroid)와 사이크로스포린 (cyclosporine) 등과 같은 항염증제도 안구건조증 치료제로 사용되고 있지만, 장기적인 사용 시 녹내장 (glaucoma) 및 백내장 (cataract)과 같은 부작용 발생의 위험이 있고 안구에 적열이나 자극을 준다고 알려져 있다. 따라서, 안구 건조증에 대한 장기적인 치료법이나 알려진 기능성 식품이 적은 실정이다.

한편, 가자육(Terminalia fruit)은 사군자과(Combfreetaceae)에 속하는 가자나무(Terminalia chebula Retz.)의 성숙한 열매를 말린 것이다. 한국특허공개 10-2004-0035364는 가자 추출물을 포함하는 미백 조성물을 개시한다.

본 발명자들은 천연물에서 안구건조증 예방 및 치료용 조성물을 검색하던 중, 가자육 추출물 또는 이의 분획물이 눈물 분비량의 증가 및 각막형태 변화와 염증 발현의 억제를 통해 안구건조증을 치료 및 완화할 수 있는 가능성을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 가자육 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 안구 건조증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기한 약학적 조성물을 안구 건조증을 치료하기에 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 안구 건조증을 치료하는 방법을 제공한다.

일 양상은 가자육 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 안구 건조증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 "안구 건조증(dry eye syndrome)"은 눈물이 부족하거나, 눈물이 지나치게 증발 또는 눈물 구성성분의 균형이 맞지 않아 안구표면이 손상되는 안구질환을 포괄한다.

안구 건조증의 예방 및 치료 활성을 갖는 상기 가자육 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 열매의 몸통, 열매의 껍질뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터 추출 가능하며 가자육의 열매에서 추출하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 사용된 용어 "가자육"이란, 가자 나무의 열매로서 이는 인도, 미얀마, 말레이시아, 중국 사천성 등에 자생하는 열대성 큰키나무로 과즙에서는 미로발란(myrovalan)이란 노란 색소를 추출하기도 하며 가구용 목재로도 쓰인다. 바깥 면은 황갈색 내지 갈색으로 광택이 있고 5~6개의 세로 주름과 그 사이에 불규칙한 주름이 있으며 단단하다. 한국과 일본에서는 가자나무(Terminalia chebula Retzius)의 성숙한 열매에서 씨를 제거하고 말린 과육을 민간에서 약재로 이용된다. 이 약재는 수렴(收斂) 작용, 적리균과 포도상 구균에 대하여 항균 작용과 더불어 설사와 기침을 멎게 하는 민간요법으로 사용되어 왔다. 또한 이 약재는 설사, 이질, 기침 등에 쓰며 장출혈(enterorrhagia), 탈항, 부정자궁출혈, 목이 쉰 데, 대하증, 유정, 빈뇨 등 여러 질병을 치료하기 위하여 우리나라를 비롯하여 동양권의 전통의학에서 이용되어 왔다.

본 발명의 가자육 추출물은 추출용매로 추출한 용매 추출물, 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획한 분획물 또는 상기 분획물에 크로마토그래피를 통하여 수득한 정제물일 수 있다.

상기 추출용매는 천연물 추출에 사용될 수 있는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 상기 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합물, 예를 들면 물 또는 에탄올일 수 있다.

본 발명의 가자육 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 가자육 추출물의 제조는 불순물을 제거한 가자육 열매의 건조물을 분쇄한 분쇄물에 추출용매를 가하고 추출하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 용매를 이용한 추출법은 냉침추출법, 온침추출법, 환류추출법 또는 초음파 분쇄 추출법일 수 있고, 바람직하게는 냉침 추출법일 수 있다. 상기 추출물은 가자육을 용매 중에서 인큐베이션하여 용매 중에서 활성 성분을 추출하는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 4℃ 내지 환류 온도, 4℃ 내지 100℃, 4℃ 내지 80℃, 4℃ 내지 60℃, 4℃ 내지 50℃, 4℃ 내지 40℃, 4℃ 내지 35℃, 4℃ 내지 30℃, 4℃ 내지 25℃, 또는 실온에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 활성 성분이 용매 중에 추출되는데 충분한 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 시간은 1 시간 내지 2주일, 1 시간 내지 1주일, 1 시간 내지 5일, 1 시간 내지 3일, 12 시간 내지 5일, 12 시간 내지 3일, 12 시간 내지 2일, 24 시간 내지 5일, 또는 24 시간 내지 3일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

또한, 상기 추출물의 분획물의 제조는 상기 추출법으로 제조한 추출물에 분획용매를 가한 후에 분획용매의 극성에 따라 분획물을 수득하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 분획물을 수득하는 방법은 층분리에 의한 분리법 또는 분회법으로 수행할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 추출물에 분획용매를 가한 후에, 예를 들어 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물의 분획용매를 상기 기재와 동일한 순서로 가한 후에 층분리된 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물을 수득하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 층분리에 의한 분획법은 상기 용매의 비극성의 정도에 따라 그 순차적으로 추출물에 가하고, 각 적용시마다 층분리에 의해 얻어지는 분획물을 수득하는 방법일 수 있고, 일 예로 에탄올 수용액 추출물에 헥산을 첨가하여 층분리가 된 헥산층을 분획하여 얻은 헥산 분획물; 상기 헥산 분획물을 분리하고 남은 물층에 클로로포름을 첨가하여 층분리가 된 클로로포름층을 분획하여 얻은 클로로포름 분획물; 상기 클로로포름 분획물을 분리하고 남은 물층에 에틸아세테이트를 첨가하여 층분리가 된 에틸아세테이트층을 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물; 상기 에틸아세테이트 분획물을 분리하고 남은 물층에 부탄올을 첨가하여 층분리가 된 부탄올 분획물 및 상기 부탄올 분획물을 분리하고 남은 층인 물 분획물 순서로 수득하는 방법일 수 있다.

본 발명은 실시예 1의 제조방법으로 추출한 가자육 에탄올 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 헥산, 크로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 가자육 추출물의 상기와 같은 분획물을 얻었으며, 헥산 분획물을 C18 역상크로마토그래피를 통해 Hexane 10%, 및 Hexane Washing 분획물을 얻었다.

상기 분획물의 정제를 위한 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC) 등의 다양한 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "예방"이란, 본 발명에 따른 가자육의 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 투여로 안구 건조증의 증상을 억제 또는 지연시켜 정상 대조군과 가까워지는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란, 본 발명에 따른 가자육의 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 투여로 상기 안구 건조증의 증상이 정상 대조군과 같거나 비슷하게 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 상기 조성물은 눈물의 분비량을 증가시키거나 각막의 두께 변화와 염증발현을 억제시키는 것일 수 있다. 상기 각막의 형태 변화는 눈물의 과다 건조로 인해 정상 대조군에 비해 각막의 표면의 두께가 얇아지고 염증반응에 따른 염증 세포 수의 증가로 인한 염증 발현을 나타내는데 본 발명의 조성물은 이를 개선시키는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 조성물은 눈물샘의 형태 변화와 염증발현을 억제시키는 것일 수 있다. 상기 각막의 형태 변화는 눈물의 과다 건조로 인해 정상 대조군에 비하여 선상 세포 (acinar cell)의 크기가 줄어들어 세포 간의 간격이 벌여져 틈이 생길 수 있으며 염증반응에 따른 염증 세포 수의 증가로 인한 염증 발현을 나타내는데 본 발명의 조성물은 이를 개선시키는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에서 가자육의 crude, hexane, ethylacetate, chloroform, butanol, 및 water를 용매로 하여 얻어진 분획물을 투여하여, 투여 14일 후 대부분의 분획물 투여군에서 안구 건조증 유발군과 비교하여 손상 부위가 줄어듦과 동시에 유의적으로 눈물 분비량이 증가함을 확인하였다. 이는 안구 건조증이 유발되지 않은 정상 대조군의 결과와 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 다른 일 실시예에서 가자육의 crude, hexane, ethylacetate, chloroform, butanol, 및 water를 용매로 하여 얻어진을 투여하여, 안구 건조증 질환 군에서 나타나는 각막의 두께의 변화와 염증 발현을 유의적으로 억제함을 확인하였다. 이는 안구 건조증이 유발되지 않은 정상 대조군의 결과와 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 다른 일 실시예에서 가자육의 crude, hexane, ethylacetate, chloroform, butanol, 및 water를 용매로 하여 얻어진 분획물을 투여하여, 안구 건조증 질환 군에서 나타나는 눈물샘의 형태 변화와 염증 발현을 유의적으로 억제함을 확인하였다. 이는 안구 건조증이 유발되지 않은 정상 대조군의 결과와 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 실시예에서 가자육의 에탄올 추출물을 hexane를 용매로 하여 얻어진 분획물의 fraction (Hexane, Hexane 10%, 및 Hexane washing)을 투여하여, 투여 14일 후 대부분의 분획물 투여군에서 안구 건조증 유발군과 비교하여 손상 부위가 줄어듦과 동시에 유의적으로 눈물 분비량이 증가함을 확인하였다. 이는 안구 건조증이 유발되지 않은 정상 대조군의 결과와 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 실시예에서 가자육의 Hexane를 용매로 하여 얻어진 분획물의 fraction(Hexane, Hexane 10%, 및 Hexane washing)을 투여하여, 안구 건조증 질환 군에서 나타나는 각막의 두께의 변화를 억제함을 확인하였다. 이는 안구 건조증이 유발되지 않은 정상 대조군의 결과와 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 실시예에서 가자육의 Hexane를 용매로 하여 얻어진 분획물의 fraction(Hexane, Hexane10%, Hexane washing)을 투여하여, 안구 건조증 질환 군에서 나타나는 눈물샘의 형태 변화를 억제함을 확인하였다. 이는 안구 건조증이 유발되지 않은 정상 대조군의 결과와 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 상기 결과를 통해서 가자육 추출물 또는 분획물이 안구 건조증에 대해 치료효과를 가짐을 알 수 있었다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약학 조성물"이란, 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각의 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 점안제, 크림제, 연고제, 겔제 또는 로션제로 제형화 할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 경구 투여하기 적합한 형태, 예를 들어, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중증도, 연령, 체중, 건강 성별, 약물에 대한 민감도 투여시간 경로 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소들을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다.

상기 조성물은 가자육 추출물 또는 그의 분획물을 단일 유효성분으로서 포함하는 것일 수 있다. 즉, 가자육 추출물 또는 그의 분획물 외의 다른 단일 유효성분을 포함하지 않는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기한 약학적 조성물을 안구 건조증을 예방 또는 치료하기에 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 안구 건조증을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물을 사람, 개, 고양이, 소, 염소, 또는 돼지일 수 있다.

상기 투여는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 예를 들어 점안 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피 패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있고, 구체적으로 점안 투여의 경로 등을 통해 목적하는 바에 따라 투여될 수 있다.

일 양상에 따른 약학적 조성물은 안구건조증의 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 즉, 상기 조성물은 안구건조증에 의한 눈물 분비량의 감소 및 각막 두께의 변화와 염증반응, 눈물샘의 형태 변화와 염증반응을 유의하게 억제할 수 있다.

다른 양상에 따른 안구 건조증을 치료하는 방법에 의하면, 안구 건조증을 효율적으로 치료할 수 있다.

도 1은 가자육 에탄올 추출물에 대해 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 계통 분획하는 단계와 헥산 분획물을 C18 역상 크로마토그래피를 통한 분리를 나타내는 개략도이다.
도 2는 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 각막 손상 부위 감소를 나타내는 사진이다.
도 3은 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 눈물 분비량 변화를 나타내는 그래프이다(*: p<0.05 vs. Con; #: p<0.05 vs. DE).
도 4는 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 각막 두께 변화를 나타내는 사진이다.
도 5는 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 눈물샘 형태 변화를 나타내는 사진이다.
도 6은 가자육 Hexane 분획물 투여에 따른 마우스의 각막 손상 부위 감소를 나타내는 사진이다.
도 7은 가자육 Hexane 분획물 따른 마우스의 눈물 분비량 변화를 나타내는 그래프이다(*: p<0.05 vs. Con; #: p<0.05 vs. DE).
도 8은 가자육 Hexane 분획물 투여에 따른 마우스의 각막 두께 변화를 나타내는 사진이다.
도 9는 가자육 Hexane 분획물 투여에 따른 마우스의 눈물샘 형태 변화를 나타내는 사진이다.
도 10a, 10b, 10c, 및 10d는 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 각막에서 염증 사이토카인의 발현을 나타낸 그 래프이다(*: p<0.05 vs. Con; #: p<0.05 vs. DE).
도 11a, 11b, 11c, 및 11d는 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 눈물샘에서 염증 사이토카인의 발현을 나타낸 그 래프이다(*: p<0.05 vs. Con; #: p<0.05 vs. DE).

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 가자육 추출물 및 분획물 제조

본 실시예에서는 가자육(Terminalia chebula) 600 g을 에탄올로 추출한 후 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 부탄올로 순차적으로 용매 분획하여 용매 분획물을 각각 870 mg, 1.57 g, 9 g, 및 20 g을 수득하고 수용액층 82 g을 얻었다. 이중 헥산 분획을 C18 역상 실리카겔을 고정상으로 메탄올을 이동상으로 한 크로마토그래피(column chromatography)를 실시하여 2 개의 분획물로 나누었다.

1. 에탄올 추출물의 제조

가자의 성숙한 열매에서 씨를 제거하고 과육을 말린 가자육 600 g을 100 % 에탄올 2L에 담구어 24 시간 실온에서 정치하는 것을 2회 반복하였다. 용액을 거름종이로 여과하여 얻어진 여과액(filtrate)을 35 ℃에서 감압 증류하여 조 주출물 121 g을 얻었다(이하 "에탄올 추출물"이라 한다.).

도 1은 가자육 추출물 및 그 분획물의 제조 과정을 그린 도면이다.

2. 분획물의 제조

(1) 헥산 층 분획 추출물

1절에서 얻은 가자육 조추출물 121 g 중 121 g을 물 800 mL에 녹이고 이를 헥산 800 mL와 혼합한 후 24 시간 실온에서 정치한 후 헥산 층을 분리하였다. 이 과정을 3회 수행하여 얻어진 헥산 층을 감압 증류하여 870 mg의 헥산 층 추출물을 얻었다 (이하 '헥산 추출물'이라 한다.).

(2) 클로로포름 층 분획 추출물

(1)에서 헥산 추출물을 얻은 후 남은 물 층을 클로로포름 800 mL와 혼합한 후 24 시간 실온에서 정치한 후 클로로포름 층을 분리하였다. 이 과정을 3회 수행하여 얻어진 클로로포름 층을 감압 증류하여 1.57 g의 chloroform 층 추출물을 얻었다 (이하 '클로로포름 추출물'이라 한다.).

(3) 에틸아세테이트 층 분획 추출물

(2)에서 클로로포름 추출물을 얻은 후 남은 물 층을 에틸아세테이트 800 mL와 혼합한 후 24 시간 실온에서 정치한 후 에틸아세테이트 층을 분리하였다. 이 과정을 3회 수행하여 얻어진 에틸아세테이트 층을 감압 증류하여 9 g의 에틸아세테이트 층 추출물을 얻었다 (이하 '에틸아세테이트 추출물'이라 한다.).

(4) 부탄올 분획 추출물

(3)에서 에틸아세테이트 추출물을 얻은 후 남은 물 층을 부탄올 800 mL와 혼합한 후 24 시간 실온에서 정치한 후 부탄올 층을 분리하였다. 이 과정을 2회 수행하여 얻어진 부탄올 층을 감압 증류하여 20 g의 부탄올 층 추출물을 얻었다 (이하 '부탄올 추출물'이라 한다.).

(5) 물 층 분획 추출물

(4)에서 부탄올 층을 분획 후 남은 물 층을 감압 증류하여 82 g의 물 층 추출물을 얻었다 (이하 '물 추출물'이라 한다.).

(6) C18 역상 실리카겔 헥산 분획물 분리

1절에서 얻은 가자육 조 추출물의 헥산 분획물 870 mg 중 800 mg을 C18 역상 실리카겔을 고정상으로 메탄올을 이동상으로 한 크로마토그래피(column chromatography)를 실시하여 2 개의 분획물로 나누었다.

유리컬럼(직경 9.3 cm × 길이 8.0 cm)에 C18 수지를 충진시키고 메탄올을 용매로 하여 2개의 분획물로 분리하였다. 이하 2 개 분획물을 각각 'Hexane 10%', 및 'Hexane Washing'이라 한다. 'Hexane 10%'는 메탄올 10 %, 및 물 90 % 혼합용매를 C18 수지로 충진된 유리컬럼에 흘려주어 얻어진 분획물을 감압 증류하여 87 mg의 분획물을 얻었으며, 'Hexane Washing'는 100% 아세톤을 용리액으로 사용하여 얻은 분획물을 감압 증류하여 얻어진 건조 추출물 120 mg을 나타낸다.

실시예 2: 실험동물을 이용한 효능 평가

1. 안구 건조증 동물 모델 제작

6 주령 수컷 Balb/c 마우스(강원생명과학, 한국)를 구입하고, 일주일 순화 후, 안구 건조증 유발을 위해 24시간 제습기를 사용하여 건조조건 35%의 습도를 유지하며 14일간 지속적으로 조건을 유지하였다.

2. 동물 실험 디자인

건조기로 인해 유발된 안구 건조증에 대한 가자육 분획물의 효과를 확인하기 위하여, 상기 1절의 실험동물을 이용하였다. 무작위로 배정된 군당 5 마리의 개체를 각 실험군별로 다음과 같이 구성하였다: 아무 처리를 하지 않은 정상 대조군 (Con), 1절의 방법으로 건조기로 인한 안구 건조증을 유발시킨 질환군 (DE), 가자육의 에탄올 추출물인 Crude 군, 상기 에탄올 추출물의 각 분획물인 Hexane 군, ethylacetate 군, chloroform 군, butanol 군, 및 water 군 즉, 정상대조군 1개 군, 질환군 1개 군, 및 분획물 투여군 6개 군으로 구성하였다.

또한, 가장 효과적인 개선능을 보인 Hexane 군을 분획(fraction)한 실험은 Hexane, Hexane 10%, 및 Hexane washing 군을 포함하여 5개의 군으로 구성하였다. 본 발명의 가자육 분획물을 포함하는 약물의 농도는 분획물 투여군의 농도는 40 mg/kg로 설정하였으며, 0.5 % DMSO가 포함된 멸균 생리식염수를 vehicle로 하여 상기 농도로 녹여 준비하였으며, 매일 오전, 오후 2회씩 존데(Sonde)를 통해 경구 투여하여 기능성 건강식품으로 활용 가능 여부를 조사하였으며, 정상 대조군과 질환군에도 vehicle만을 동량 경구 투여하였다.

3. 눈물 분비량 측정 및 각막의 손상 부위 감소량 측정

건조기로 인해 유발된 안구 건조증의 눈물 분비량과 각막의 손상 부위 감소량에 대한 가자육 분획물의 효과를 확인하였다. 약물 투여 14일 후 상기 2절의 동물 실험 디자인을 이용하여 쉬르머 시험 (shirmer test)법으로 눈물 양을 측정한 후 마우스의 눈에 형광 염색법 (Fluorescence staining)을 이용하여 손상부위 감소량을 확인하였다.

도 2는 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 각막 손상 부위 감소를 나타내는 사진이다. 도 2에서, 화살표는 플루오레신(fluoresin) 염색을 통한 각막의 손상 정도를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, crude, hexane, ethylacetate, chloroform, 및 butanol 군에서 DE 군에 비하여 각막 손상 부위가 감소하였다. 이는 도 2에서, 표시된 화살표 수의 감소로서 나타난다. 그 중 crude, 및 hexane 군에서 DE 군에 비하여 각막 손상 부위가 가장 적었다.

도 3은 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 눈물 분비량 변화를 나타내는 그래프이다(*: p<0.05 vs. Con; #: p<0.05 vs. DE).

도 3에 나타낸 바와 같이, 눈물 분비량은 crude, hexane, ethylacetate, chloroform, 및 butanol 군에서 DE 군에 비하여 증가하였다. 그 중 hexane 군에서 DE 군에 비하여 눈물이 가장 많았다.

도 4는 가자육 Hexane 분획물 투여에 따른 마우스의 각막 손상 부위 감소를 나타내는 사진이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 안구건조증에 의하여 발생한 염증이 각막의 두께를 감소시키는 정도를 관찰할 수 있었다.

도 5는 가자육 Hexane 분획물 따른 마우스의 눈물 분비량 변화를 나타내는 그래프이다(*: p<0.05 vs. Con; #: p<0.05 vs. DE).

4. 각막의 두께 및 눈물샘의 형태 변화 측정

건조기로 인해 유발된 안구 건조증의 각막의 두께 및 눈물샘의 형태 변화에 대한 가자육 분획물의 효과를 확인하였다. 구체적으로, 약물 투여 14일 후 상기 2절의 동물 실험 디자인을 이용하여 H&E staining을 통해 안구 및 눈물샘 조직을 염색하여 관찰하였다.

도 6은 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 각막 두께 변화를 나타내는 사진(좌측) 및 그로부터 측정된 각막 두께를 나타내는 그래프이다(우측). 도 6에 나타낸 바와 같이, Crude, Hexane, Ethylacetate, Chloroform, Butanol, 및 물 군에서 DE 군에 비하여 각막 두께가 증가하였다. 그 중 hexane 군에서 각막 두께가 가장 두꺼웠다. 따라서, 각 용매별 추출물의 투여군에서 각막의 두께가 정상 대조군과 같이 두꺼워지고 눈물샘의 형태에서 염증세포의 감소와 선상 세포의 수축이 개선됨을 확인하였다.

도 7은 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 눈물샘 분비량을 나타내는 사진이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 안구건조증에 의해 감소된 눈물 분비량은 가자육 Hexane처리군에서 증가하는 것을 관찰하였다.

도 8은 가자육 Hexane 분획물 투여에 따른 마우스의 각막 두께 변화를 나타내는 사진이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 안구건조증으로 유발된 염증에 의해 감소된 각막의 두께가 Hexane 처리군에 의해 증가하는 것을 관찰하였다.

도 9는 가자육 Hexane 분획물 투여에 따른 마우스의 눈물샘 형태 변화를 나타내는 사진이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 눈물샘에 모여든 염증 세포의 수가 안구건조증 유도군에 비해 Hexane 분획물 투여군에서 감소하였다.

5. 각막과 눈물샘의 염증성 사이토카인 발현량 측정

건조기로 인해 유발된 안구 건조증의 각막과 눈물샘의 염증성 사이토카인 발현에 대한 가자육 분획물의 효과를 확인하였다. 구체적으로, 약물 투여 14일 후 상기 2절의 동물 실험 디자인을 이용하여 qPCR을 통해 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-1β, IFN-γ, TNF-α, 및 IL-6의 mRNA 수준의 발현량을 측정하였다. 이때 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 및 서열번호 11 및 12의 세트를 각각 사용하였다.

도 10a, 10b, 10c, 및 10d는 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 각막에서 염증 사이토카인의 발현을 나타낸 그래프이다(*: p<0.05 vs. Con; #: p<0.05 vs. DE). 도 10a, 10b, 10c, 및 10d에서, 측정된 염증 사이토카인은 각각 IL-1β, IFN-γ, TNF-α, 및 IL-6이다. 도 10a, 10b, 10c, 및 10d에 나타낸 바와 같이, DE 군에 비하여, Crude, Hexane, Ethylacetate, Chloroform, Butanol, 및 물 군에서 전체적으로 염증성 사이토카인의 mRNA 수준이 증가하였다.

도 11a, 11b, 11c, 및 11d는 가자육 분획물 투여에 따른 마우스의 눈물샘에서 염증성 사이토카인의 발현을 나타낸 그래프이다(*: p<0.05 vs. Con; #: p<0.05 vs. DE). 도 10 및 11에서 세로축의 단위는 대조군 대비 백분율이다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A pharmaceutical composition for preventing or treating dry eye syndrome comprising an extract of Terminalia chebula or a fraction thereof and use thereof <130> PN123243KR <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> priemr <400> 1 caggcaggca gtatcactca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aggccacagg tattttgtcg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atggatgcta ccaaactgga t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgaaggactc tggctttgtc t 21 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggaactcttt tcttaggcat tttga 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gatggtctcc acactctttt gga 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttgttaccaa ctgggacgac atgg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gatcttgatc ttcatggtgc tagg 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtcactggag ttgtacggca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agccctgtat tccgtctcct 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gccaaggtca tccatgacaa c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gtccaccacc ctgttgctgt a 21

Claims (9)

1. 가자육 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 안구 건조증을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알콜 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 과육으로부터 추출된 것이고, 경구 투여 제형인 것인 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 또는 헥산올인 것인 약학적 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 혼합물은 알콜을 0.1 내지 100 중량%으로 포함하는 것인 약학적 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 분획물은 가자육 추출물의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 또는 물 분획물인 것인 약학적 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 눈물 분비량을 증가시키거나 각막 형태 변화를 억제하는 것인 약학적 조성물.
7. 삭제
8. 청구항 1에 있어서, 가자육 추출물 또는 그의 분획물을 단일 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
9. 청구항 1, 3 내지 6, 및 8 중 어느 하나의 약학적 조성물을 안구 건조증을 예방 또는 치료하기에 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 안구 건조증을 치료하는 방법으로서, 상기 개체는 사람이 아닌 포유동물인 것인 방법.
   
   
   

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