JP2607259B2

JP2607259B2 - 新規物質ｋｓ―５０４類

Info

Publication number: JP2607259B2
Application number: JP8008688A
Authority: JP
Inventors: 聡中西; 耕二山田; 勝彦安藤; 勲川本; 亨安澤; 浩佐野; 令明平山; 廣加瀬; 譲治後藤; 悦代清水
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1987-04-15
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1997-05-07
Anticipated expiration: 2012-05-07
Also published as: JPS6434936A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はモリシア（Mollisia）属に属する微生物が生
産する新規物質KS−504類に関する。

従来の技術微生物が生産する血管拡張作用を有する生理活性物質
としては、ストレプトミセス・オーレオファシエンス
（Streptomyces aureofaciens）が生産するWS−1228Aお
よびWS−1228B〔ジャーナル・オブ・アンチビオティク
ス（J.Antibiotics）35,151−156および157−163（198
2）〕、ミクロモノスポラ属に属する微生物が生産する
Ｋ−259−２（特開昭61−63289）、ストレプトミセス属
に属する微生物が生産するKS−619−１（特開昭61−969
87）などが知られている。

また、微生物が生産するヒスタミン遊離抑制作用を有
する化合物としては、ノカルディオプシス（Nocardiops
is）属に属する微生物が生産するＫ−252a〔ジャパニー
ズ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（Jpn.J.Phar
macol.）43,202（1987）〕およびKT5556（特開昭61−17
6531）が知られている。

しかしながら、これらの物質と本発明の物質は構造が
異なり、またモリシア属に属する微生物が生産する血管
拡張作用、ヒタスミン遊離抑制作用を有する化合物に関
する報告はない。

発明が解決しようとする課題血管拡張作用、ヒスタミン遊離抑制作用などを有する
優れた生理活性物質は、常に求められている。

課題を解決するための手段本発明者は、医薬品またはその中間体となりうる有用
な新規生理活性物質を提供するという目的のもとに、天
然界より入手した数多くの微生物の生産物について研究
を行った。その結果、新たに分離した微生物の培養物中
に血管拡張作用を示す生理活性物質およびヒスタミン遊
離抑制作用を示す生理活性物質が種々生産される事実を
見い出した。該培養物から該物質を単離、精製し、その
理化学的性質を調べたところ新規物質であることが判明
した。以下、該物質をKS−504類と称する。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明は、下記の構造式（Ｉ）で表される新規物質KS
−504類を提供する。

式中、R₁、R₂が一体となってを示し、かつR₃は−OH、R₄は−CHCl₂を示すか、もしく
はR₃、R₄は２位炭素原子と一体となってを示し、またはR₁、R₃が結合して１〜２位間が二重結合
を示し、かつR₂は−CCl₃、R₄は−CHOを示す。

上記の構造式（Ｉ）で表されるKS−504類には、下記
に示すような理化学的性質を有するKS−504a、KS−504
b、KS−504dおよびKS−504eが含まれる。

KS−504aおよびKS−504bの理化学的性質は以下に示す
通りである。

KS−504a 性状：無色プリズム状結晶融点:102.0〜102.5℃ 比旋光度：▲〔α〕²⁴ _D▼＝−113゜（c0.36,メタノー
ル）分子式:C₇H₃O₂Cl₇ 溶解性：可溶：メタノール、ｎ−ブタノール、クロロホルム、ア
セトン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド、ベンゼン、酢酸、ヘキサンピリジン、モノエタノールアミンなどの塩基性物質、ア
ルカリ性水にも溶けるが直ちに分解する。

不溶：水、酸性水呈色反応：ヨウ素、硫酸の各反応に陽性、アニスアルデ
ヒド、アニリンフタル酸、ニンヒドリン、ライドンスミ
ス、塩化第二鉄の各反応に陰性紫外部吸収スペクトル：λ_max＝243nm（ε＝9100、メタ
ノール溶液）赤外部吸収スペクトル（KBr法）： 3490,3100,2960,1585,1400,1366,1304,1288,1175,1155,
1135,1080,1039,999,945,930,895,807,759,710,695,63
7,613,586cm^-1 元素分析：計算値Ｃ 22.89,H 0.82 実測値Ｃ 22.71,H 0.73 NMRスペクトル：¹ H−NMR:（400MHz,CDCl₃,δ） 6.55（1H,s）,4.94（1H,br s）,3.45（1H,br s）¹³ C−NMR:（25MHz,CDCl₃＋CD₃OD,δ） 136.9,130.8,87.7（２）,85.0,69.3,66.7 KS−504b 性状：無色針状結晶融点:93.0〜93.5℃ 比旋光度：▲〔α〕²⁴ _D▼＝−35゜（c0.32,CHCl₃）分子式:C₇H₃O₂Cl₇ 溶解性：可溶：メタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチ
ル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドピリジン、モノエタノールアミンなどの塩基性物質、ア
ルカリ性水にも溶けるが、直ちに分解する。

不溶：水、酸性水呈色反応：ヨウ素、硫酸の各反応に陽性、アニスアルデ
ヒド、アニリンフタル酸、ニンヒドリン、ライドンスミ
ス、塩化第二鉄の各反応に陰性紫外部吸収スペクトル：λ_max＝241nm（ε＝10000、メ
タノール）赤外部吸収スペクトル：（CHCl₃） 3550,3260,3030,2960,2320,1615,1605,1395,1372,1287,
1275,1200,1178,1156,1112,1080,994,955,938,900,830,
815,715,662,630,610,498,455cm^-1 NMRスペクトル：¹ H−NMR:（400MHz,CDCl₃,δ） 5.70（1H,s）,4.79（1H,br s）,3.46（1H,br s）¹³ C−NMR:（100MHz,CDCl₃,δ） 136.1（ｓ）,127.6（ｓ）,86.4（d,J＝156Hz）,86.4
（ｓ）,84.6（d,J＝3.1Hz）,73.0（d,J＝227Hz）,70.6
（ｓ）マススペクトル： CI−MS（ポジティブ）m/z 364（M⁺） CI−MS（ネガティブ）m/z 399（Ｍ＋Cl）⁻ 上記の理化学的性質より、KS−504aおよびKS−504b
は、下記の構造式（II）で表される。

KS−504bは、KS−504aと平面構造が同一であるが、旋
光度、各種スペクトルデータが異なることから立体構造
が異なる立体異性体である。以下、KS−504aおよびKS−
504bをまとめてKS−504Aと称すこともある。

KS−504dおよびKS−504eの理化学的性質は以下の通り
である。

KS−504d 性状：無色粉末融点:78.0〜79.0℃ 比旋光度：▲〔α〕²⁴ _D▼＝＋4.8゜（c0.32,CHCl₃）分子式:C₇H₄O₂Cl₈ 溶解性：可溶：アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル、ベンゼ
ン、メタノール、クロロホルム、ヘキサン、水、酸性水ピリジン、モノエタノールアミンなどの塩基性物質、ア
ルカリ性水にも溶けるが、直ちに分解する。

呈色反応：ヨウ素、硫酸の各反応に陽性、アニスアルデ
ヒド、ニンヒドリン、アニリンフタル酸、ランドンスミ
ス、塩化第二鉄の各反応に陰性紫外部吸収スペクトル：λ_max＝237nm（ε＝2700、メタ
ノール）赤外部吸収スペクトル：（CHCl₃） 3540,3300,3050,1592,1395,1315,1278,1150,1108,1060,
960,927,888,815,682,648,605,530cm^-1 NMRスペクトル：¹ H−NMR:（100MHz,CDCl₃,δ） 6.80（1H,s）,4.91（1H,br d,J＝12.0Hz）,3.87（1H,br
s）,3.50（1H,br d,J＝12.0Hz），¹³ C−NMR:（100MHz,CDCl₃,δ） 137.9（ｓ）,134.7（ｓ）,93.2（ｓ）,86.3（dd,J＝156
Hz,3.1Hz）,85.5（d,J＝10Hz）,85.2（ｓ）,73.1（d,J
＝181Hz）マススペクトル： CI−MS（ポジティブ）m/z 383（Ｍ−H₂O＋Ｈ）^＋、365（Ｍ−HCl＋Ｈ）^＋ CI−MS（ネガティブ）m/z 434（Ｍ−Ｈ＋Cl）⁻、399（Ｍ−Ｈ）⁻ KS−504e 性状：無色プリズム状結晶融点:89.0〜89.5℃ 比施光度：▲〔α〕²¹ _D▼＝＋9.0゜（c0.34,CHCl₃）分子式:C₇H₃O₂Cl₇ 溶解性：可溶：メタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチ
ル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドアルカリ性水、ピリジンにも溶けるが直ちに分解する。

不溶：水、酸性水呈色反応：ヨウ素、硫酸の各反応に陽性、アニスアルデ
ヒド、アニリンフタル酸、ニンヒドリン、ライドンスミ
ス、塩化第二鉄の各反応に陰性紫外部吸収スペクトル：λ_max＝221nm（ε＝5200、メタ
ノール）赤外部吸収スペクトル：（CHCl₃） 3450,1748,1723,1695,1620,1393,1288,1260,1200,1160,
875,765,609cm^-1 NMRスペクトル：¹ H−NMR:（400MHz,CDCl₃,δ） 10.46（1H,s）,4.97（1H,br s）,3.57（1H,br s）¹³ C−NMR:（100MHz,CDCl₃,δ） 184.3（ｄ）,148.0（ｓ）,139.0（ｓ）,89.0（ｄ）,88.
9（ｓ）,86.4（ｓ）,83.9（ｓ）マススペクトル： CI−MS（ポジティブ）m/z365（Ｍ＋Ｈ）^＋ CI−MS（ネガティブ）m/z399（Ｍ＋Cl）⁻ 上記の理化学的性質より、KS−504dおよびKS−504e
は、それぞれ下記の構造式（III）および（IV）で表さ
れる。

KS−504d KS−504e 次に、各種展開剤によるKS−504a,KS−504b,KS−504d
およびKS−504eの薄層クロマトグラフィーのRf値を第１
表に示す。検出は253.7nmの紫外線照射により行った。

KS−504AおよびKS−504dは、下記実験例１で示すとお
り血管拡張作用を有するので、血圧降下剤、虚血性心疾
患治療剤、末梢、脳循環改善剤などとしての用途が期待
される。

さらに、KS−504eは、下記実験例２で示すとおりヒス
タミン遊離抑制作用を有するので、抗アレルギー剤、抗
炎症剤などとしての用途が期待される。

KS−504aのマウスにおける最少致死濃度は、経口投与
で300mg/kgである。

次に、KS−504類の製造法について説明する。

KS−504類は、モリシア（Mollisia）属に属し、KS−5
04類生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中に
KS−504類を生成蓄積させ、該培養物から生成したKS−5
04類を採取することにより製造される。

KS−504類生産性微生物としては、モリシア（Mollisi
a）属に属し、KS−504類生産能を有するものであれば、
いずれの微生物でもよい。具体的な例として、モリシア
・ベントーサ（Mollisia ventosa）KAC−1148株（以下K
AC−1148と称する）があげられる。KAC−1148は、本発
明者により、北海道において採集された落枝上に形成さ
れた子実体の子のう胞子から単胞子分離培養されたもの
で、その菌学的性質は次の通りである。

麦芽エキス寒天培地を用いて、20℃で培養した場合、
集落の直径は４週間で３〜3.5cmに達する。集落は、淡
褐色あるいは淡灰褐色を呈する。菌糸は隔壁を有し、培
地中および培地上に伸長し、よく分岐する。テレオモル
フおよびアナモルフとも培地上においては観察できな
い。

本菌株は、５〜25℃の温度範囲で生育することがで
き、至適生育温度は15〜20℃である。生育し得るpHは、
２〜11であり至適生育pHは、５〜７である。

本菌株の分離源である子実体は、皿状の子のう盤で、
その直径は１〜2mmである。子のう盤は、灰黄色あるい
はクリーム色を呈し、その周囲は灰褐色を呈する。子の
う盤外被は円形歯組織より成り、その細胞膜は暗色に着
色する。また、その内部は纒絡菌組織より成る。子のう
盤内側においては裸出した子実層から成り、子のうが裸
出して配列し、子のうの間には無色の側糸を有する。子
のうは、円筒状棍棒形で頂部は沃度反応陽性、長さ80〜
90μｍで８個の子のう胞子を含む。成熟した子のう胞子
は長楕円形あるいは円筒形であり、無色、平滑で、わず
かに湾曲するものもある。４室で長さ16.5〜22μｍ、幅
２〜2.5μｍである。

以上の諸性質よりKAC−1148は、モリシア・ベントー
サ（Mollisia ventosa）と同定された。

本発明者は、本菌株をモリシア・ベントーサKAC−114
8と命名し、微工研条寄第1333号（寄託日：昭和62年４
月３日）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
した。

微生物の培養に際しては、菌類の培養に用いられる通
常の培養方法が適用される。用いられる培地は菌の資化
しうる炭素源，窒素源，無機物などを程よく含有する培
地であれば天然培地，合成培地のいずれでも用いうる。

炭素源としてはグルコース，フラクトース，シュクロ
ース，ラクトース，スタビロース，澱粉，デキストリ
ン，マンノース，マルトース，糖蜜，マッシュポテトの
素などの炭水化物，クエン酸，リンゴ酸，酢酸，フマー
ル酸などの有機酸，メタノール，エタノールなどのアル
コール，メタン，エタン，プロパン,n−パラフィンなど
の炭化水素，グルタミン酸などのアミノ酸あるいはグリ
セロール，綿実油などが用いられる。

窒素源としては塩化アンモニウム，硫酸アンモニウ
ム，硝酸アンモニウム，リン酸アンモニウムなどのアン
モニウム塩，アスパラギン酸，グルタミン，シスチン，
アラニンなどのアミノ酸，尿素，麦芽エキス，ペプト
ン，肉エキス，酵母エキス，乾燥酵母，コーン・スチー
プ・リカー，大豆粉，綿実粕，大豆カゼイン，カザミノ
酸，ファーマメディア，ソルブル，ベジタブル，プロテ
イン，野菜・果実のジュースなどが用いられる。

無機物としてはリン酸二水素カリウム，リン酸水素二
ナトリウム，リン酸マグネシウム，硫酸マグネシウム，
硫酸第一鉄，硫酸マンガン，硫酸コバルト，硫酸亜鉛，
パントテン酸カルシウム，モリブデン酸アンモニウム，
硫酸アルミニウムカリウム，炭酸バリウム，炭酸カルシ
ウム，塩化コバルト，塩化マグネシウム，塩化カリウ
ム，塩化ナトリウムなどが用いられる。特に、塩素を含
む化合物はKS−504類の生産に必須である。

その他必要に応じて培地にビタミンなど菌体の増殖あ
るいはKS−504類の生産を促進する物質を加えることが
できる。

用いられる微生物が特定の物質を要求する場合は生育
に必要な物を加えることが必要である。

培養は振盪培養法、通気攪拌培養法などにより、15〜
25℃の温度で中性付近のpHで行う。３〜10日の培養によ
ってKS−504類の蓄積が最大に達し、培養は完了する。

培養物中に生成蓄積したKS−504類をそれぞれ単離採
取するに際しては、通常の生理活性物質を培養物から採
取する方法が適用される。

即ち、アセトン、メタノールなどの溶剤による菌体成
分の抽出、過，遠心分離などによる菌体除去、適当な
溶媒系による分配、吸着樹脂，シリカゲル，修飾シリカ
ゲル，アルミナ，セルロース，珪藻土，珪酸マグネシウ
ム，ゲル過剤などを用いるカラムクロマトグラフィー
もしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱
着処理などによってKS−504a、KS−504b、KS−504dおよ
びKS−504eをそれぞれを単離することができる。

培養物からKS−504aを単離する１例は次の通りであ
る。

培養物にメタノールなどの溶剤を添加し、充分攪拌し
た後、過または遠心分離することにより菌体を除去す
る。得られた液または上清液を吸着樹脂、たとえばダ
イヤイオンHP−20（三菱化成工業社製）で処理して樹脂
に活性物質を吸着させる。次いでメタノールなどの適当
な溶剤を用いて溶離し、溶離液を減圧下で濃縮し水溶液
とする。この水溶液に、水と混和しない適当な溶剤たと
えば酢酸エチル,n−ブタノールなどを添加して活性物質
を抽出する。抽出液を減圧下で濃縮した後、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーを繰りかえし行うことにより
KS−504aの粗粉末を得る。この粗粉末をヘキサンなどの
適当な溶剤に溶かし、結晶化を行うことによりKS−504a
の結晶を得ることができる。なお、上記精製工程中のKS
−504aの検出は、蛍光剤入りのシリカゲルプレートを用
いて薄層クロマトグラフィーを行った後、254nmの紫外
線を照射することにより行う。

KS−504aを単離したのと同様にして、KS−504b、KS−
504dおよびKS−504eをそれぞれ単離することができる。

また、KS−504aを酸（たとえば塩酸）の存在下、加熱
還流することによってもKS−504eを得ることができる。
反応溶媒としては、脱水した酢酸エチル、クロロホル
ム、ジクロロメタンなどを用いることができる。反応
は、通常室温から75℃の間で行われ、数時間から１日で
終了する。

生成物の単離、精製には、抽出、結晶化、クロマトグ
ラフィーなどを組み合わせることにより行うことができ
る。

KS−504AまたはKS−504dを含有する血管拡張剤、およ
びKS−504eを含有する抗アレルギー剤は、たとえば錠
剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、坐剤な
どの通常適用される剤形に調製して経口的に、あるいは
筋肉内注射、静脈内注射、動脈内注射、点滴、坐剤によ
る直腸内投与のような非経口的投与で投与することがで
きる。それらの経口的または非経口的に投与する剤形の
製剤化には、通常知られた方法が適用され、たとえば、
各種の賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、懸濁化剤、等
張化剤、乳化剤などを含有していてもよい。

使用する製剤用担体としては、例えば、水、注射用蒸
留水、生理食塩水、グルコース、フラクトース、白糖、
マンニット、ラクトース、でん粉、コーン・スターチ、
セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸、
タルク、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸
水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、尿素、シ
リコーン樹脂、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン
脂肪酸エステルなどがあげられる。

製剤は、KS−504A、KS−504dまたはKS−504eをそれぞ
れ0.01〜85％（重量比）含有する。

以下に実施例を示す。

実施例１種菌としてモリシア・ベントーサ（Mollisia ventos
a）KAC−1148（FERM BP−1333）を用いる。種培地とし
て、グルコース1.0g/dl、ペプトン（極東製薬工業社
製）0.5g/dl、乾燥酵母エビオス（朝日麦酒社製）0.5g/
dl、Ｖ−８野菜ジュース（キャンベル社製）0.2dl/dl、
炭酸カルシウム0.3g/dlの組成を有する培地（pH6.0）を
用いる。該菌を上記組成の種培地40mlに植菌し、25℃で
菌が充分生育するまで振盪培養した。この種培養液40ml
を360mlの上記組成の種培地に植菌し、25℃で２日間振
盪培養した。このようにして得られた種培養液1.8を1
8の下記生産培地を含む30ジャーファーメンターに
植菌した。

生産培地：シュクロース5.0g/dl,大豆粉2.0g/dl,コーン
・スチープ・リカー1.0g/dl、塩化マグネシウム・６水
塩0.8g/dl,リン酸マグネシウム・８水塩0.05g/dl、pH6.
5 培養は25℃で７日間通気攪拌下に行った。培養終了
後、培養物に等容量のメタノールを添加し、充分攪拌
し、ついで菌体を吸引過により除去した。得られる
液40を、500mlのダイヤイオンHP−20（三菱化成工業
社製）を充填したカラムに通塔し、KS−504a、KS−504
b、KS−504d、KS−504eを吸着させた後、2.5の50％
（v/v）メタノールで洗浄し、1.5のメタノールで溶出
した。メタノール溶出画分を減圧下で濃縮した後、水を
加えて300mlとし、酢酸エチル300mlで３回抽出した。酢
酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃
縮すると約10gの褐色油状物が得られた。この油状物を
クロロホルムを用いて充填した１のワコーゲルＣ−20
0（和光純薬社製）カラムを用いて、６のクロロホル
ムで展開した。KS−504a、KS−504bおよびKS−504eは、
前半の３に、KS−504dは、後半の３に溶出された。

KS−504a、KS−504b、KS−504eを含む画分を減圧下で
濃縮後、少量のヘキサン−クロロホルム（1:1v/v）の混
合溶媒に溶解した。この溶液を同じ組成の混合溶媒を用
いて充填した500mlのワコーゲルＣ−300（和光純薬社
製）カラムの上端に供給し、同じ組成の混合溶媒2.5
を用いて展開した。展開液を250mlずつ分取すると画分
番号７にKS−504a、画分番号８と９にKS−504b、画分番
号10にKS−504eが主に検出された。

画分７を減圧下で濃縮すると無色油状物（451mg）が
得られた。この油状物を少量のヘキサン−クロロホルム
（1:1v/v）の混合溶媒に溶解した後、同じ組成の混合溶
媒を用いて平衡化したローバーカラム（メルク社製Si6
0、サイズＢ）の一端に供給し、同じ組成の混合溶媒500
mlを用いて展開した。KS−504aを含む画分を集めて減圧
濃縮した後、少量のヘキサンを加えて、４℃に放置する
ことにより結晶化を行った。結晶を別して乾燥させる
ことによりKS−504aの無色プリズム状結晶80mgを得た。

画分８と９をあわせて減圧下で濃縮すると無色油状物
（804mg）が得られた。この油状物を少量のヘキサン−
クロロホルム（1:1v/v）の混合溶媒に溶解した後、同じ
組成の混合溶媒を用いて平衡化したローバーカラム（Si
60、サイズＣ）の一端に供給し、同じ組成の混合溶媒1.
5を用いて展開した。KS−504bを含む画分を集めて減
圧濃縮した後、少量のクロロホルムで溶解し、適当量の
ヘキサンを加えて、４℃に放置することにより結晶化を
行った。結晶を別して乾燥させることによりKS−504b
の無色針状結晶92mgを得た。

画分10を減圧下で濃縮すると淡黄色油状物（78mg）が
得られた。この油状物を少量のクロロホルム−ヘキサン
（3:7v/v）の混合溶媒に溶解した後、同じ組成の混合溶
媒を用いて平衡化したローバーカラム（Si60、サイズ
Ｂ）の一端に供給し、同じ組成の混合溶媒500mlを用い
て展開した。KS−504eを含む画分を集めて減圧濃縮した
後、少量のクロロホルムで溶解し、適当量のヘキサンを
加えて、４℃に放置することにより結晶化を行った。結
晶を別して乾燥させることによりKS−504eの無色プリ
ズム状結晶10mgを得た。

ワコーゲルＣ−200カラムクロマトグラフィーののち
に得られたKS−504dを含む画分を減圧濃縮した後、少量
のメタノールに溶解した。このメタノール溶液を、あら
かじめ70％メタノール水を用いて充填した100mlのYMC−
ODS（山村化学研究所製、60〜200メッシュ）カラムの上
端に供給し、300mlの70％メタノール水によって展開し
た。展開液をすべてあつめて減圧下で濃縮した後、少量
のクロロホルムに溶解した。この溶液をあらかじめクロ
ロホルムで充填した400mlのワコーゲルＣ−300カラムの
上端に供給し、クロロホルム２を用いて展開した。展
開液を10gずつ分取すると、画分番号129から177の間にK
S−504dが溶出された。この画分をあつめて濃縮乾固す
ることによりKS−504dの無色粉末を510mg得た。

上記精製工程中、KS−504a、KS−504b、KS−504dおよ
びKS−504eの検出は、蛍光剤を含むシリカゲルプレート
（シリカゲル60F₂₅₄、メルク社製）を用いて薄層クロマ
トグラフィーを行った後、254nmの紫外線を照射するこ
とによって行った。

実施例２ KS−504a（104mg）を1.7N塩化水素を含む酢酸エチル2
mlに溶解し、60℃で20時間反応させた。反応後、水を加
えて混和した後、酢酸エチル層を取り、クロロホルム−
ヘキサン（3:7v/v）を展開溶媒としてシリカゲルカラム
クロマトグラフィーを行い、さらに、少量のクロロホル
ムを含むヘキサンから結晶化することによりKS−504e
（48mg）を得た。

参考例１錠剤 10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、KS−504a
100g、ラクトース40g、コーン・スターチ18gおよびカ
ルボキシメチルセルロースカルシウム10gを加えて、混
練した。混合物を押し出し造粒機（1.0mmスクリーン）
を用いて造粒し、60℃で乾燥させた。得られた細粒をふ
るい（16メッシュ）にかけ、ステアリン酸マグネシウム
を加えて、通常の方法で、１錠（170mg）あたり100mgの
KS−504aを含む8mmの大きさの錠剤を調製した。

参考例２カプセル剤 10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、KS−504a
50g、ラクトース80gおよびでん粉38gを加えて、混練
した。混合物を実施例３と同様にして造粒し、ステアリ
ン酸マグネシウムを加えて、通常の方法に従い、１カプ
セル（170mg）あたり50mgのKS−504aを含むカプセル剤
を調製した。

参考例３ソフトカプセル剤 10gのKS−504aを100gの大豆油に溶かし、得られた溶
液を、通常の方法に従いカプセルに注入することによ
り、１カプセルあたり10mgのKS−504aを含むソフトカプ
セル剤を調製した。

参考例４錠剤 10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、KS−504b
100g、ラクトース40g、コーン・スターチ18gおよびカ
ルボキシメチルセルロースカルシウム10gを加えて、混
練した。混合物を押し出し造粒機（1.0mmスクリーン）
を用いて造粒し、60℃で乾燥させた。得られた細粒をふ
るい（16メッシュ）にかけ、ステアリン酸マグネシウム
を加えて、通常の方法で、１錠（170mg）あたり100mgの
KS−504bを含む8mmの大きさの錠剤を調製した。

参考例５カプセル剤 10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、KS−504b
50g、ラクトース80gおよびでん粉38gを加えて、混練
した。混合物を実施例６と同様にして造粒し、ステアリ
ン酸マグネシウムを加えて、通常の方法に従い、１カプ
セル（170mg）あたり50mgのKS−504bを含むカプセル剤
を調製した。

参考例６ソフトカプセル剤 10gのKS−504bを100gの大豆油に溶かし、得られた溶
液を、通常の方法に従いカプセルに注入することによ
り、１カプセルあたり10mgのKS−504bを含むソフトカプ
セル剤を調製した。

参考例７錠剤 10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、KS−504d
200g、ラクトース40g、コーン・スターチ18gおよびカ
ルボキシメチルセルロースカルシウム10gを加えて、混
練した。混合物を押し出し造粒機（1.0mmスクリーン）
を用いて造粒し、60℃で乾燥させた。得られた細粒をふ
るい（16メッシュ）にかけ、ステアリン酸マグネシウム
を加えて、通常の方法で、１錠（270mg）あたり200mgの
KS−504dを含む9mmの大きさの錠剤を調製した。

参考例８カプセル剤 10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、KS−504d
100g、ラクトース80gおよびでん粉38gを加えて、混練
した。混合物を実施例９と同様にして造粒し、ステアリ
ン酸マグネシウムを加えて、通常の方法に従い、１カプ
セル（220mg）あたり100mgのKS−504dを含むカプセル剤
を調製した。

参考例９ソフトカプセル剤 20gのKS−504dを100gの大豆油に溶かし、得られた溶
液を、通常の方法に従いカプセルに注入することによ
り、１カプセルあたり20mgのKS−504dを含むソフトカプ
セル剤を調製した。

参考例10 錠剤 10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、KS−504e
100g、ラクトース40g、コーン・スターチ18gおよびカ
ルボキシメチルセルロースカルシウム10gを加えて、混
練した。混合物を押し出し造粒機（1.0mmスクリーン）
を用いて造粒し、60℃で乾燥させた。得られた細粒をふ
るい（16メッシュ）にかけ、ステアリン酸マグネシウム
を加えて、通常の方法で、１錠（170mg）あたり100mgの
KS−504eを含む8mmの大きさの錠剤を調製した。

参考例11 カプセル剤 10％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、KS−504e
50g、ラクトース80gおよびでん粉38gを加えて、混練し
た。混合物を参考例10と同様にして造粒し、ステアリン
酸マグネシウムを加えて、通常の方法に従い、１カプセ
ル（170mg）あたり50mgのKS−504eを含むカプセル剤を
調製した。

参考例12 ソフトカプセル剤 10gのKS−504eを100gの大豆油に溶かし、得られた溶
液を、通常の方法に従いカプセルに注入することによ
り、１カプセルあたり10mgのKS−504eを含むソフトカプ
セル剤を調製した。

参考例13 軟膏 KS−504e 20gを、白色ワセリンとパラフィン液に加え
て混合し、100mg/gのKS−504eを含む軟膏を調製した。

次にKS−504AおよびKS−504dの血管拡張作用を、実験
例１で説明する。

実験例１ウサギ大動脈収縮におよぼす影響（１）方法白色雑系ウサギ（雄、２〜3kg）の腹部正中線を切開
し、大動脈を腹部から約２〜2.5cmの長さで切り出し、
幅３〜4mmのラセン状条片を作成した。両端を絹糸で結
紮し、下端は固定棒、上端は張力トランスデューサー
（日本光電社製TB−612T）につなぎ、初期張力1.5gで懸
垂した。標本をマグヌス管に入れた32℃のクレブス・ハ
ンゼライト（Krebs−Henseleit）液（NaCl6.92g/,KCl
0.35g/,MgSO₄・7H₂O0.29g/,CaCl₂・2H₂O0.37g/,K
H₂PO₄0.16g/,NaHCO₃2.1g/、グルコース1.0g/）中
に浸し、95％O₂,5％CO₂ガスを通じた。標本は１〜２時
間安定させた後実験に供した。血管収縮物質として、塩
化カリウムを終濃度20mMになるようにマグヌス管に添加
した。惹起された収縮反応は、張力トランスデューサー
を介して等尺性にポリグラフ（日本光電社製AM−6000）
に記録した。KS−504a、KS−504bおよびKS−504dをそれ
ぞれ10mg/mlとなるようにジメチルスルホキシドに溶解
し、クレブス・ハンゼライト液で適宜希釈したものを、
収縮薬適用の30分前にマグヌス管に添加した。

（２）実験成績第２表に示すようにKS−504a、KS−504bおよびKS−50
4dは濃度依存的にウサギ大動脈の収縮を抑制した。

次いで、KS−504eのヒスタミン遊離抑制作用を実験例
２により説明する。

実験例２ラット腹腔浸出細胞からのヒスタミン遊離に及ぼす影
響（１）方法体重150〜180gのラットを乾エーテル麻酔下に放血致
死させ、Sullivanらの方法〔ジャーナル・オブ・イムノ
ロジィ（J.Immunol.）114,1473,（1975）〕に準じて作
製した肥満細胞用培液（mast cell medium）（MCMと略
記、組成:150mM NaCl、3.7mM KCl、3mM Na₂HPO₄、3.5mM
KH₂PO₄、1mM CaCl₂、5.6mMグルコース、0.1％牛血清ア
ルブミン、10U/mlヘパリン）6ml/animalを腹腔内に注入
した。腹部を２分間マッサージした後、開腹し腹腔内浸
出液を採取した。６匹より集めた浸出液を４℃、100×
ｇで５分間遠心分離後、沈渣に適量の氷冷MCMを加えて
３回洗浄し、最終的には肥満細胞数が約３×10⁴cells/m
lとなるように細胞浮遊液（peritonealexudate cells,P
ECと略記）を調製した。

なお、肥満細胞の同定は0.05％トルイジンブルーで細
胞内顆粒を染色することにより行った。このようにして
得たPEC 1mlを37℃、10分間プレインキュベートした
後、種々の濃度の被検薬液0.1mlを加えて10分間インキ
ュベートし、フォスファチジル−Ｌ−セリン100μg/ml
及びコンカナバリンA1000μg/mlそれぞれ0.1mlを加えて
さらに15分間インキュベートした。氷冷した生理食塩水
3mlを加えて反応を停止後、４℃、1100×ｇで10分間遠
心分離して上清と沈渣を得た。上清および沈渣のヒスタ
ミン量は小松の方法〔アレルギー27,67（1978）〕に従
い蛍光法で測定した。ヒスタミン遊離率は細胞の総ヒス
タミン量に対する上清のヒスタミン量の百分率として表
した。また次式により被検薬液のヒスタミン遊離抑制率
を算出した。

（２）実験成績発明の効果本発明によれば、血管拡張作用を有する新規物質KS−
504A、KS−504dおよびヒスタミン遊離抑制作用を有する
新規物質KS−504eを得ることができる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 31/11 ＡＢＥＡ６１Ｋ 31/11 ＡＢＥＡＢＮＡＢＮＡＢＵＡＢＵＡＥＭＡＥＭ 31/335 ＡＢＲ 31/335 ＡＢＲＣ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｐ 7/02 7/24 7/24 17/02 17/02 (Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者平山令明神奈川県座間市立野台638―２ (72)発明者加瀬廣東京都小金井市前原町３―35―18 (72)発明者後藤譲治東京都町田市成瀬２―13―３ポプラヶ丘コープ３―404 (72)発明者清水悦代東京都町田市旭町２―３―15 審査官斎藤真由美

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の構造式（Ｉ）で表される新規物質KS
−504類。式中、R₁、R₂が一体となってを示し、かつR₃は−OH、R₄は−CHCl₂を示すか、もしく
はR₃、R₄は２位炭素原子と一体となってを示し、またはR₁、R₃が結合して１〜２位間が二重結合
を示し、かつR₂は−CCl₃、R₄は−CHOを示す。
【請求項２】下記の構造式（II）で表される請求項１記
載の新規物質KS−504A。
【請求項３】下記の構造式（III）で表される請求項１
記載の新規物質KS−504d。
【請求項４】下記の構造式（IV）で表される請求項１記
載の新規物質KS−504e。