JPS5822461B2 - ２−クロトニルオキシメチル−（４ｒ，５ｒ，６ｒ）−４，５，６−トリハイドロキシサイクロヘキス−２−エノン、その製造法並びにそれを含有する制癌剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は次式〔Ｉ〕で示される２−クロトニルオキシエ
チル−（４Ｒ・５Ｒ・６Ｒ）−４・５・６−）’）ハイ
ドロキシサイクロへキス−２−エノン及びその製造法並
びにその制癌剤としての用途に関するものである。

従来から、メチルグリオキザールは代謝中間産物として
生体内に広く分布し、細胞分裂の調節作用を有すること
が知られている。

ＣＬ、 Ｇ、 ＥｇｙＷ 、Ａ、 ５ｚｅｎｔ−Ｇ％ｒ
ｇｙｉ ； Ｐ ｒｏｃ 。

Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、５５． ３８８〜３９３
（１９６６）、同誌：晃玉、２０３〜２０７、（１９６
６））又メチルグリオキザールのようなα−ケトアルデ
ヒド類及びグリオキサラーゼ阻害剤は制癌作用を示すこ
とも知られているＣＲｌＶｉｎｃｅ 、 Ｗ、 Ｂ、Ｗ
ａｄｄ ： Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 。

Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍ、 ３５．５９３〜５９８、（１，
９６９） 。

Ｒ，Ｖｉｎｃｅ 、 Ｓ、 Ｄａｌｕｇｅ ： Ｊ、
Ｍｅｄ、 Ｃｈｅｍ、 １４．３５〜３７ （１９７
１）、Ｍ、Ａ、 Ａｐｐｌｅ、 Ｄ、Ｍ。

Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ： Ｌｉｆｅ ５ｃｉｅｎｃｅ
６．２１．５７〜２１、６０ （１，９６７） ） 一方メチルグリオキザールは還元型グルタチオンの存在
下でグリオキサラーゼ■及びグリオキサラーゼ■（以下
グリオキサラーゼ系という。

）によって乳酸に代謝されることが一般的に知られてい
る。

そこでグリオキサラーゼ系の酵素活性を阻害し、生体内
のメチルグリオキザール量を蓄積させ、細胞分裂の激し
い癌細胞の分裂を抑制すればメチルグリオキザールの制
癌効果を発揮させることが期待される。

本発明者らはメチルグリオキザールを酵素的に変換して
乳酸に代謝するグリオキサラーゼ系の阻害剤を系統的に
探索し、放線菌の培養液及び菌体部の中にその阻害物質
の存在を見出し、精製単離し、その化学的な物性を明ら
かにすると共に、この化合物がＣＩ）の構造式を与える
新規化合物であることを発見した。

さらに本物質が強い制癌作用及びスルフヒドリル化合物
との強い反応性を有することを発見した。

本物質は本物質生産菌の培養物から無色針状結晶として
単離され、その融点は１８１°Ｃ１旋光度は、〔α）’
、；−１０９°（Ｃ＝１．５メタノール）の物質である
。

又マススペクトルで親ピークを示さず、その元素分析値
はＣ： ５４．４２、Ｈ：５８５．０：３８．９７であ
り他の元素は含まれていない。

本物質のＤＭＳＣ）−ｄ６中での１００ ＭＨｚ の核
磁気共鳴スペクトルのプロトン数が１４個であることが
らＣ１□Ｈ１４０６（分子量２４２．２２）の分子式が
与えられ、その理論値はＣ：５４．５４、Ｈ：５．８３
．０：３９．６３である。

定性反応は塩化第二鉄反応陽性（紫色）、Ｔ、 Ｔ、Ｃ
，反応陽性（桃紅色）、２・４−ジニトロフェニルヒド
ラジン反応陽性（黄色）であるが、ニンヒドリン、トレ
ンス、フェーリング反応等は陰性である。

紫外部吸収スペクトラムではエタノール中で２］ｕｎｍ
（ε 二 １９４００） 、 ３］２ｎ ｍ（ε ：５
２） 、水溶液中では２１３ｎｍ（ε： ２１８００）
、３１−ｏｎｍ（ε：５６）に吸収極太を示す（第１図
参照）。

さらに臭化カリ錠として測定した赤外部吸収スペクＩ・
ラムにおける主な吸収波長を示すと次のどと（である。

３４００．３２００．２９３０．２８００、］−７１０
，１，６９０゜１６５０．１４４５．１３８５．１３１
０．１２４５．１１９５．１１５０．１１３０．１１０
０．１０５５．１０４０．１０００．９６５．９０５．
８６０．８４０．７５０，７２０．６９０（ｃｒｆＬ
’）（第２図参照）。

溶解性は水、メタノール、エタノール、ジメチルスルホ
キサイド等に溶解し、ブタノール、酢酸エチル、酢酸ブ
チル等に僅かに溶解し、クロロホルム、アセトン、ｎ−
ヘキサン、ベンゼン、エチルエーテル、石油エーテル等
には溶解しない。

さらにシリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーでは
、クロロホルム：メタノール−１０：１でＲｆ値は０．
７５を示し、フ゛タノール：エタノールニ７Ｊ（〜４
： １ ： １ではＲｆ値は０．７３を示す。

アビセルを用いた薄層クロマトグラフィーでは、ブタノ
ール：酢酸：水−４：］：］でＲｆ値は０．７４を示す
。

ＤＭＳＯ−ｄ６中の１００ ＭＨ２の核磁気共鳴スペク
トラムは、内部規準としてテトラメチルシランを用いて
測定すると次のごとくである。

１．８７ （３Ｈ）、４．１９ （Ｈ＋Ｈ）、４．５７
（、Ｈ）、４．７０（２Ｈ）、５．０３（Ｈ）、５．１
５（Ｈ）、５．３５（Ｈ）、５．９０（Ｈ）、６．６１
（Ｈ）、６．９３ （Ｈ） ｐｐｍ。

上記理化学的性状に基づいて、さらに詳細な化学的研究
から本物質の化学構造式は前記〔■〕で示される２−ク
ロトニルオキシメチル＝（４Ｒ・５Ｒ・６Ｒ）−４・５
・６−トリバイドロキシサイクロヘキスー２−エノンと
本発明者らによって決定された。

次に本物質を生産する菌株ストシブｌ−ミセス・グリオ
キサラーゼＭＤ ２８７−ＣＦ ４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ Ｇｒｉｓｅｏｓｐｏｒｅｕｓ ＭＤ ２８７
−ＣＦ４）（以下ｒＭＤ ２８７−ＣＦ ４株」という
。

）について記述する。

ＭＤ ２８７−ＣＦ ４株は本発明者らにより昭和４６
年１１月、微生物化学研究所において東京部内の土壌よ
り分離された放線菌であり、昭和５１年２月２４日付で
工業技術院微生物工業研究所に微工研菌寄第３４４９号
として受託されたものである。

ＭＤ ２８７−ＣＦ ４株は下記のような性状を有する
。

１、形態 ＭＤ２８７−ＣＦ４株は顕微鏡下で分枝した基中菌糸よ
り気菌糸を伸長し、螺旋形成は認められない。

成熟した胞子鎖は１０個以上の胞子の連鎖を認め、胞子
の大きさは０．８Ｘ１．２ミクロン位で、胞子の表面は
平滑である。

２、各種培地における生育状態 色の記載は、日本色彩研究所「色の標準」による。

０内に示す標準はコンテイナー・コーポレーション・オ
ブ・アメリカ（ＣｏｎｔａｉｎｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ）のカラー°″−モニイ
・マニュアル（Ｃｏ１ｏｒ ｈａｒｍｏｎｙ Ｍａｎｕ
ａｌ）によるものである。

（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 無色〜うす黄（ｐａｌｅ ｙｅｌｌｏｗ） Ｃ２ｃａ。

Ｌｔ Ｉｖｏｒｙ、Ｅｇｇ ５ｈｅｌｌ ）の発育上に
白（Ｗｈｉｔｅ ） 〔ａ、Ｗ石ｔｅ ）の気菌糸をご
（わずかに着生し、溶解性色素は認められない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培養
） うす黄（ｐａｌｅ ｙｅｌｌｏｗ） Ｃ２ｅａ 、 Ｌ
ｔＷｈｅａｔ 、 Ｌ ｔ Ｍａｉｚｅ ）の発育上に
明るい茶入（ｌｉｇｈｔ ｂｒｏｗｎｉｓｈ ｇｒａｙ
） Ｃ３ｃｂ、 ５ａｎｄ）の気菌糸を着生し、溶解性
色素は認められない。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５．２７℃培養） 黄茶（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ、 ｂｒｏｗｎ ） Ｃ３１
ｃ 。

Ａｍｂｅｒ 、 Ｂｕｔｔｅｒｓｃｏｔｃｈ ）の発育
上に白（（Ｗｈｉｔｅ） （ａ、ｗｈｉｔｅ ）の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。

（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ −培地４．
２７℃培養） 黄茶（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ ｂｒｏｗｎ ） Ｃ３１ｃ
。

Ａｍｂｅｒ 、 Ｂｕｔｔｅｒｓｃｏｔｃｈ ）の発育
上に白（Ｗｈｉｔｅ） Ｃａ、Ｗｈｉｔｅ ） 〜明る
い茶入（ｌｉｇｈｔ ｂｒｏｗｎｉｓｈ ｇｒａｙ ）
（３ｃｂ、 ５ａｎｄ：〜明るい灰（ｌｉｇｈｔ ｇ
ｒａｙ） （Ｃ，Ｌｔ、Ｇｒａｙ）の気菌糸を着生し、
溶解性色素は認められない。

（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ ＝培地７．２７℃培
養） 無色（ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ） 〜茶入（ｂｒｏｗｎｉ
ｓｈｇｒａｙ） Ｃ３１ｉ 、 Ｂｅａｖｅｒ ）の発
育上に明るい灰（ｌｉｇｈｔ ｇｒａｙ） ＣＣ，Ｌｔ
Ｇｒａｙ）の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶入（ｂ
ｒｏｗｎｉｓｈｇｒａいを呈する。

（６）栄養寒天培地（２７℃培養） 無色（ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ）に発育し、気菌糸の着生
は認められない。

溶解性色素は暗い黄（ｄａｒｋ ｙｅｌｌｏｗ）を呈す
る。

（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２．２７
℃培養） 黄茶（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ ｂｒｏｗｎ ） Ｃ３ｎｉ
。

Ｃ１ｏｖｅ Ｂｒｏｗｎ ）の発育上に明るい茶入（ｌ
ｉｇｈｔ ｂｒｏｗｎｉｓｈ ｇｒａｙ） 〔３ｃｂｌ
Ｓａｎｄ）〜明るい灰（ｌｉｇｈｔ ｇｒａｙ） ＣＣ
，Ｌｔ Ｇｒａｙ ：）の気菌糸を着生し、溶解性色素
は黄茶 （ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ ｂｒｏｗｎ ）を呈する。

（８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ −培地３．２７
℃培養） 無色（ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ） 〜明るい赤味黄（ｌｉ
ｇｈｔ ｒｅｄｄｉｓｈ −ｙｅｌｌｏｗ ） Ｃ３ｐ
ａ。

Ｂｒｉｔｅｍａｒｉｇｏｌｄ、 Ｂｒｉｔｅｙｅｌｌｏ
ｗ、 Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ）の発育上に明るい茶入（
ｌｉｇｈｔｂｒｏｗｎｉｓｈ ｇｒａｙ） Ｃ３ｃｄ
１Ｓａｎｄ）の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められ
な℃・。

（９）ペプトン・イースト・鉄寒天培地（■ＳＰ−培地
６．２７°Ｃ培養） 無色（ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ）に発育し、気菌糸の着生
は認められない。

溶解性色素はわずかに暗い黄茶（ｄａｒｋ ｙｅｌｌｏ
ｗｉｓｈ ｂｒｏｗｎ）を呈する。

（１０）リンゴ酸・石灰寒天培地（２７℃培養）無色（
ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ） 〜うす黄（ｐａｌｅｙｅｌｌ
ｏｗ ） Ｃ２ｃａ、 Ｌｔ Ｉｖｏｒｙ、 Ｅｇｇｓ
ｈｅｌｌ ）の発育上に白（Ｗｈｉｔｅ ） （ａ 、
Ｗｈｉｔｅ ）の気菌糸をごくわずかに着生し、溶解性
色素は認められない。

（ＩＩ）クルコース・ペプトン・ゼラチン穿刺培地（２
７°Ｃ培養） 発育は無色で気菌糸の着生は認められない。

溶解性色素は茶黒（ｂｒｏｗｎｉｓｈ ｂｌａｃｋ ）
をＶする ０２）脱脂牛乳（３７°Ｃ培養） 発育は入山（ｇｒａｙｉ ｓｈ ｗｈｉｔｅ ）、気菌
糸は着生せず、溶解性色素は灰味黄茶（ｇｒａｙｉｓｈ
ｙｅｌ ＩＯＷ ｂｒｏｗｎ ）を呈する・３、生理的
性質 け）生育温度範囲 マルトース・イーストエキストラクト寒天（マルトース
１０．１’、イーストエキストラクト４．０７、寒天１
７．０′？、脱イオン水１０００ｒｎｌＪ、 ＰＨ７，
０）を用いた、４°Ｃ１８℃、１５℃、２２℃、２７℃
、３２°０１４５℃の各湿度で試験の結果、４°Ｃ１４
５°Ｃを除いてそのいずれの温度でも生育したが最適湿
度は２２°Ｃ〜３２°Ｃであった。

（２）ゼラチンの液化（グリコース・ペプトン・ゼラチ
ン、２７°Ｃ培養） 培養開始５日目頃より液化が始まり、２１日で完了した
。

その液化能は中程度である。（３）スターチの加水分解
（スターチ・無機塩寒天培地 ＩＳＰ −培地４．２７
°Ｃ培養）液化開始５日目頃より氷解性が認められ、そ
の作用は強い。

（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 培養開始４日目に凝固は完了し、後ペプトン化が始まり
その作用は強い。

（５）・ メラニン様色素の生成（トリゾトン・イース
トブロス、ｌ５Ｐ−培地■、ペプトン・イースト・鉄寒
天ＩＳＰ −培地６、チロシン寒天ＩＳＰ −培地７、
いずれも２７℃培養）いずれの培地においてもメラニン
様色素の生成が認められろ。

（６）炭素源の利用性（ゾリドハム・ゴトリーブ寒天２
７℃培養） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、シュークロース、イノシトール、Ｌ
−ラムノース、ラフィノース、Ｄ−マンニトールのいず
れの炭素源もよく利用ｌ〜生育する。

（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸・石灰寒天２７℃
培養） リンゴ酸石灰の溶解が認められ、その作用は強い。

（８）硝酸塩の還元反応（１，０％硝酸塩ンーダ含有ペ
プトン水、２７℃培養） 陽性である。

以上の性状を要約すると、ＭＤ ２８７−ＣＦ ４株は
ストレプトミセス属に属し、分枝した基中菌糸より気菌
糸を伸長１〜、螺旋形成は認められず胞子の表面は平滑
である。

種々の培地でうす黄〜黄茶の発育上に白〜明るい茶入〜
明るい灰の気菌糸を着生ｊ〜、メラニン様色素以外の溶
解性色素はほとんど認められない。

メラニン様色素は、トリゾトン・イースト・ブロス・チ
ロシン寒天培地、ペプトン・イースト・鉄寒天培地のい
ずれにおいても陽性である。

蛋白の分解力は中程度で、スターチの氷解性は強い。

これらの性状により既知菌種を検索すると。

ＭＤ２８７−ＣＦ４株に最も近縁の種としてストレプト
ミセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｒｉｓｅｏｓｐｏｒｅ
ｕｓ．Ｎｉ ｉｄａ．Ｔ．、ａｎｄＭ． Ｏｇａｓａｗ
ａｒａ． ］ ９ ６ ０，Ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌ
ｓｔｕｄｙｏｎ ａ ｎｅｗ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ Ｐ ｒｏｄｕｃｉｎｇＦａｉｔｏｍｙｃｉｎ．
Ｓｃｉ 、 Ｒｅｐ．Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａ Ｋａｉ
ｓｈａＬｔｄ，、３、２３〜２９）があげられろ。

そこでストレプトミセス・グリゼオスボレウスの原記載
およびＩＳＰ タイプ・カルチャー株５５６２とＩＶ［
Ｄ ２ ８ ７−ＣＦ ４株を同時比較培養シタトコ口
、以下の点において差異がみられた。

（１）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５）における気菌糸の色 ＭＤ２８７−ＣＦ４株は白の気菌糸を着生するが、スト
レプトミセス・グリゼオスボレウス株は白および明るい
灰の気菌糸を着生する。

（２）イースＩ・・麦芽寒天培地（ＩＳＰ −培地２）
におけろ気菌糸の色 ＭＤ２８７−ＣＦ４株は明るい茶入〜明るい灰の気菌糸
を着生するが、ストレプトミセス・グリゼオスポレウス
は白〜入山の気菌糸を着生する。

（３）オートミ・−ル寒天培地（ ＩＳＰ−培地３）に
おける生育及び気菌糸の色 ＭＴ） ２ ８ ７−ＣＦ ４株は無色〜明るい赤味黄
の発育上に明るい茶入の気菌糸を着生するが、スＩ・レ
プトミセス・り゛リゼオスボレウス株は無色〜うす黄の
発育上に明るい灰の気菌糸を着生すイ〕。

上記に示したように幾分の差異はみられるが、その他の
生育、気菌糸の色、形態、生理的性質はほとんど−へ致
ずイ）。

、し７かしＭＤ２８７−ＣＦ４株はタイトマンンを生産
しな℃・ことからストレプトミセス・グリゼオスボレウ
スの変異株と考える。

放線菌は−・般に人工的に、又は自然界で変異をおこ（
〜やすり・が、本発明にいう菌種は２−り「１トニルオ
ギンメチル−（、Ｂｔ・５Ｒ・６Ｒ）−４−５・６−ｈ
す・・イドロギ・ンザイクロヘキス−２丁ノンを生産し
、」く菌種及びその変異菌と明確に区別されない菌はす
べてこれを包含する。

本発明により、本物質を製造すく）にはそれを生産する
菌株を通常の微生物の培養法として公知の方法で培養１
〜て培養物中に生産させればよい。

例えばＭＤ ２８７−ＣＦ ４株は、グリセリン・アス
パラギン寒天、酵母・麦芽寒天培地等の公知の培地に継
代培養され、本物質の生産のためには、これらの寒天培
地上の発育菌糸を直接培地に接種して培養できる。

又液体培地に生育せしめた菌体を種母と（−て、生産培
地に接種して培養し、これを生産せしめろこともできる
。

ＭＤ ２８７−ＣＦ ４株を培養して、本物質を生産せ
しめる培養温度は２２°〜３２°Ｃが好まし℃・が、特
に効率よく生産せしめるためには２７°〜３０°Ｃが適
切である。

、又、本物質を生産せしめるためにはカビ、不完全菌、
放線菌、細菌などの微〕生物の培養に公知の栄養源はす
べて利用できる。

伝えばクルコース、マルトース、ラクト−ス、ザツカロ
ース、グリセリン、テギストリンＪ、糖蜜などが炭素源
として利用できる。

すなわら大豆粉１．５％、食塩０３％、Ｋ２ＨＰＯ４０
，１％、Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ２００，１％、Ｃｕ ＳＯ４
・５ Ｈ２００、０００７％、ＦｅＳＯ４・７ Ｈ，Ｏ
Ｏ，０００１％、ＭｎＣ１，・４ Ｈ２Ｏ０，０００８
％、ＺｎＳＯ４” ７ Ｈ２Ｏ０，０００２％を含む培
地を基礎培地と１〜で卜記の炭素源を第１人の濃度にな
るように添加した培地１２５ｍ１を５００ｍ１容の坂ロ
フラスコに分注して、１２０°Ｃで２０分間、加圧殺菌
し、これにグリセリン・アスパラギン寒天斜面培地に２
７°Ｃで１５ Ｅ１間培養１〜た菌糸を一白金耳宛接種
して２７℃で振盪培養し、培養４日口のグリオキザラー
ゼの阻害率及び培養ｐ液を後述のようにアン″−ライト
■ＸＡＤ−２に吸着、水洗後、５０％含水アセトンで溶
出１〜、溶出液をシリカゲルの薄層りＬ１マドグラフィ
ー（溶媒はブタノール：エタノール：水−４：１：１）
にかげて得られる本物質のＲｆ値０．７３の２・３・５
−１−リフェニルテトラゾリウノ、クロライド反応（以
下Ｆ Ｔ、 Ｔ、 Ｃ１反応−１という。

）陽性のスポットの強弱（非常に多い：１１１−１多い
：升、普通に認められるニド、弱いが認められる：±、
認められないニー）を測定した。

これを示せば第１表のようであった。

上表のように何れの炭素源も本物質の生産に利用できる
が、特にグルコース、澱粉が好適な炭素源であった。

本物質の生産には、カビ、不完全菌、放線菌、細菌など
の微生物の発育のために用いられる窒素源はすべて利用
できる。

例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、大
豆粕、コーンステイープリカー、綿実粉、カザミノ酸な
どが利用できる。

すなわちグルコース１％、澱粉１％、食塩０．３％、Ｋ
２ＨＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１％、
ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ０，０００７％、ＦｅＳＯ４・７
Ｈ２００，０００１％、 ＭｎＣ１□・４Ｈ２００，０００８％、 ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，０００２％を含む培地を基礎
培地として第２表の濃度になるように窒素源を添加して
殺菌し、これに前記の寒天斜面培地に発育せしめた菌糸
を接種して４日間２７℃で振盪培養し、グリオキサラー
ゼの阻害率及びＴ、Ｔ、Ｃ０反応により、本物質の生産
性を試１験した。

その結果を表記すると第２表のようであった。

上表のごとく、大豆粉、酵母エキス等が、本物質の生産
に好適な窒素源であった。

本物質を生産せしめるために必要とするときは無機塩、
金属塩、重金属塩の微量を加える。

又培地殺菌中、培養中に消泡を必要とするときは、シリ
コン樹脂、大豆油、アデカノールなどの消泡剤を使用で
きる。

本物質はＭＤ ２８７−ＣＦ ４を好気的に培養して得
られるが、ペニシリン等の抗生物質の生産に用いられる
通気攪拌タンク培養法がそのまま本発明に用いられる。

又、本物質の培養液中での濃度は各々の培養での諸条件
によって異なることは専門家にとっては公知の事実であ
る。

従って菌株の改良、培養条件の選択によって本物質を合
理的に生産せしめることは専門家にとっては容易なこと
である。

この発明は、それ等の全ての修飾方法をも包含するもの
である。

次に定量法について記述する。

本物質はグリオキサラーゼ系の阻害活性によって定量で
きるが、グリオキサ−ゼ活性は、アレキサンダー等の報
告した方法によって測定されるＣ Ｎ０Ｍ。

Ａ １ｅｘａｎｄｅｒ 、 Ｊ 、 Ｌ、 Ｂｏｙｅｒ
： Ａｎａｌ 、 Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、、Ａ」、２９
〜３８、（１９７１））。

すなわちメチルグリオキサール１０ｍＭ、還元型グルタ
チオン２．５ｍＭを０．０８６Ｍの燐酸緩衝液（ＰＨ７
，４に溶解させ、その溶解液７０μｌに蒸留水又は試験
溶液３０μｌを加えて、３７℃で３分間、前培養後、酵
素溶液１０μｌを加えて、３７℃で１０分間、酵素反応
を行い、さらに０．８Ｍのセミカルバジド塩酸塩３．０
ｍｌを加えて、室温で２０分間以上反応させて、酵素反
応で残ったメチルグリオキサールをセミカルバゾンとし
た後、蒸留水で２０倍に希釈し、２８６Ｈｍの紫外部吸
収の吸光度を測定し、次の算定式から阻害率を求めた。

阻害禍＝（１３−Ｃ） （ＩＢ ＩＣ）／Ｂ−ｃｘ
＋ｏ。

Ｃ：酵素液を添加したものの吸光度 Ｂ：蒸留水を添加したものの吸光度 ■ｃ：試験溶液を加え、酵素液を添加したものの吸光度 ■Ｂ：試験溶液を加え、酵素液を添加しないものの吸光
度 次に本物質の抽出精製について記述する。

本物質は、水、メタノール、エタノール等に溶解し、ブ
タノールには僅かに溶解するが、それらの性状を利用し
て培養Ｐ液及び菌体部から抽出される。

すなわち培養液は通常のｒ過性でｒ液と菌体部に分離さ
れ、Ｐ液は活性炭吸着、水洗後、酸性の５０％含水アセ
トン（ＰＨ２，０〜３，０）で溶離されるが、アンバー
ライト”ＸＡＤ−２を用いて吸着させ、水洗後、中性の
５０％メタノール、５０％アセトン等の溶媒で溶離する
方法が収率がよい。

菌体部はメタノールで抽出後、メタノールを減圧で溜去
し、残った水溶液を上記の方法で処理する。

上記のようにして得た溶離液を減圧濃縮し、水溶液とし
た後、酸性でブタノールで抽出する。

さらにブタノール抽出液を減圧濃縮乾固すると褐色の粉
末が得られる。

この粉末をメタノールに溶解させ、不溶部を除き、さら
にメタノールの４倍量のクロロホルムを加えて不溶部を
除いた後、セファデックス■ＬＨ−２０を用い、メタノ
ールで展開するカラムクロマトグラフィーを行い、グ［
リオキサラーゼ１狙害活性を示す分画を集め、さらにシ
リカゲルカラムクロマトグラフィーで、クロロホルム：
メタノール−２０：１又は１０：１の溶媒系を用いて展
開し、グリオキサラーゼ阻害活性を示す分画のうち、シ
リカゲルの薄層クロマトグラフィーで、ブタノール：エ
タノール：水−４：１：１で展開してＲｆ値０．７３の
Ｔ、 Ｔ、 Ｃ，反応陽性のスポットを与える分画を集
めて濃縮乾固し黄白色の粉末を得る。

必要ならば少量の活性炭脱色法、セファデックス［Ｆ］
ＬＨ−２０クロマトグラフイー、シリカゲルの再クロマ
トグラフィーを行い、クロロホルム：メタノール−１０
：１から結晶化を行うことにより無色の針状結晶として
本物質が単離される。

次に本物質の生物学的性状について述べる。

・ 本物質はラットの肝臓から抽出した粗製のグリオキ
サラーゼに対して４３０ ｍｃｇ ／１１１１！（１，
８Ｘｌ、０”Ｍ）、酵母由来のグリオキサラーゼ■に対
して３３０ｍｅｇ／７７１１（１，４ｘ １０−３Ｍ
）で各各５０％の阻害率を示した。

培養ＨｅＬａ細胞に対）しては、本物質を３日間作用さ
せると１８ｍｃｇ／ｍｌ（７，２５Ｘ １０ ’Ｍ
）で５０％の生育阻害率を示しさらに３Ｈ−デオキシチ
ミジン及び１４Ｃ−アミノ酸混合物を用いて高分子合成
阻害率を調べると、１０ ｍｃｇ ／ｒｕｌ の濃度
でＤＮＡ合成を６８％、蛋白質の合成を５３％阻害した
。

又、本物質の酵素阻害様式は補酵素であるグルタチオン
と反応してグリオキサラーゼ系を阻害することが酵素学
的に証明され、さらに化学的には酵素反応の条件下で、
還元型グルタチオン、システィン、チオグリコール、ジ
チオスレイトール、チオフェノール、パラニトロチオフ
エノーノ瓢バラフ菊モチオノエノールなどのＳＨ化合物
と当量で速やかに反応して異質の化合物を造ることが確
認された。

抗菌活性はグラム陽性菌、グラム陰性菌、糸状菌を被検
菌として寒天希釈法で測定するとキサントモナス・オリ
ゼーに１００ ｍｃｇ ／ｍｌ 、エロモナス・パンク
タータに２００ ｍ ｃｇ ／ｍｌ！ で生育を阻止
した以外は２００ ｍｃｇ ／ｍｌ で生育阻１−Ｌ作
用を示さなかった。

次に本発明化合物の制癌作用を述べろ。

１ エールリッヒ腹水癌 ＩＣＲ／ＳＬＣ系マウス（雄性、７週齢、５ＰＦ）の腹
腔内にｌＸｌ０６個のエールリッヒ癌細胞を移植し、そ
の２４時間後から本物質を１０．３３．１゜１ ｍ９／
ｋｇ／ ｄａｙの用量で１日１回１０日間連続して腹腔
内に投与した。

１群のマウス数は５匹とした。

対照群は生理食塩液を同様に投り、した。

エールリッヒ腹水癌では１０．３．３．１１ｍｙ／ ｋ
ｙ／ ｄａｙ ｘ ｌｏ日日間腹腔内投与）でその延命
率は各々１９３．１４１．８５％であった。

２、エールリッヒ固型癌 ＩＣＲ／ＳＬＣ系マウス（雄性、７週齢、５ＰＦ）の鼠
頚部皮下に２Ｘ１０’個のエールリッヒ癌細胞を移植し
、その２４時間後から本物質を１０．５．２．５、ｉ、
２５．０．６３．０．３２％’／に！９／ｄａｙの用量
で１日１回連続１０日間腹腔内に投与した。

対照群は生理食塩液を同様に投与した。

１群のマウス数は処置群５匹、対照群１５匹とした。

腫瘍移植後、１５日目に腫瘍を摘出して重量を測定した
。

エールリッヒ固型癌では１０．５．２５．１．２５．０
．６３．０．３２ ｒｎ９／ｋｇ／ ｄａｙ Ｘ １．
０日間（腹腔内投与）で各々６１．８．４４．９．３７
．６．４１６．３９，９．１４，０％の阻害率を示した
。

３、マウス白血病Ｌ １．２１０ ＢＤＦ１／ＳＬＣ系マウス（雄性、７週齢、ＳＰＦ
）の腹腔内に１×１０５個のＬ１２１０細胞を移植し、
その２４時間後から本物質を１日１回７日間連続腹腔内
投与した。

対照群は生理食塩液を投与した。

１群は５匹のマウスにより構成した。

マウス白血病Ｌ１２１０では５０．３５．２５．１５．
１０ ”９／ ｋｇ／ ｄａｙ Ｘ ７日間（腹腔内投
与）で各々５２ （４１５毒死）、１７７ （１１５毒
死）、１４０１１２７．１２４の延命効果を示した。

人に対して投与する場合は本物質を無菌的に凍結乾燥し
た粉末を使用直前に例えば生理的食塩水、５％ブドウ糖
溶液等に溶解して使用する。

本物質はマウスに静脈注射した時ＬＤ、。

は９０〜／ｋｇであり、上述のようにマウス白血病Ｌ１
２１０（ｉ、ｐ、（腹腔内注射）、ｉ、ｐ、）、エーリ
ツヒ腹水癌（ｉ、ｐ、、ｉ、ｐ、）、エールリッヒ固型
癌Ｃ８，Ｃ，（皮下注射）、ｉ、ｐ、’）等の実験腫瘍
に３〜３５〜／ｋｇｌＯ日間連日投与によってすぐれた
抗腫瘍効果を示したが、この投与量の範囲で毒性を示さ
ないので、上述の成績を総合すると人の白血病又はその
他の固型癌にこれを用いる場合、一般に人第−相試験に
おける投与量設定に用いられる試験動物におけるＬＤ５
０値の１／６００（総合端末１９．２６７３〜２６７７
．１９７０）すなわち本物質の０．１５ｍ９／ｋｇを最
低投与量、上限は、実験動物では５０ｍ９／ｋｇ１０回
が中毒発現投与量である所から約１７１９／ｋｇと設定
して治療を行う。

投与方法は白血病に対しては静脈投与、その他の固型癌
では静脈又は皮下投与を行う。

以下に本発明の本物質の製造法の実施例を示す、が、本
発明により本物質が微生物で造られることが明らかにさ
れたので、この明細書に記載された方法を修飾した方法
が容易に設定される。

本発明者等が微生物が作る酵素阻害剤の系統的研究で示
したように酵素阻害剤の生産は特定の菌株に限らない。

かくして本発明で放線菌の一株による本物質の生産が明
らかにされたので、放線菌の他の菌種を用いて生産せし
めることは専門家にとって容易なことである。

本発明はそのすべての修飾方法をも包含し実施例はその
例示で、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例 Ｉ ＭＤ２８７−ＣＦ４株（微工研申請書受理番号第３４４
９号）をイースト・麦芽寒天斜面培地に１４日間、２７
℃で生育させ、その気菌糸から一白金耳量をとり、これ
を大豆粉１．５％、グルコース１％、澱粉１％、ＮａＣ
１０，３％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４−７Ｈ
２Ｏ０，１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，０００７％、
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２００，０００１％、ＭｎＣｌ２・４
Ｈ２００，０００８％、 ＺｎＳＯ４−７Ｈ２００，０００２％を含む培地を殺菌
前ＰＨ７，２に修正し、５００ｍ１容の坂ロフラスコに
１２５ｍ１宛分注し、１２０℃２０分間殺菌した培地に
接種し、２７°Ｃで毎分１３０往復の振盪機で４日間培
養した。

ＰＨは植菌前は７０、植菌２口開６．５．３口開６．８
．４日日７．２であった。

培養中の残糖はアンスロン試薬を用いて分析すると植菌
２口開で２．５５．３日間１．００．４日月０８６％で
あった。

この培養液５０００ｍｌを吸引ｐ過し、蒸留水で２倍に
希釈してグリオキサラーゼ反応を５０％阻害するｐ過液
４０００ｍ１を得た。

このｒ液をアンバーライト［Ｆ］ＸＡＤ−２（８００ｍ
ｌ）に吸着させ、５０００ＴｒＬｌの蒸留水で洗い、さ
らに５０％含水アセトンで溶出するとグリオキサラーゼ
阻害活性分画は１０１００Ｏにまとまって溶出された。

この活性分画を３００ｍ１まで減圧濃縮後、ＩＮ塩酸で
ＰＨ２，０に調節し、３００ｍ＃７）ブタノールで２回
抽出を行うと活性の８０％はブタノール層に移行した。

この抽出層を減圧濃縮乾固し、褐色粉末２．５１を得た
。

この粉末をメタノール１００ｍ１に溶解し不溶部を沢別
しクロロホルム４００ｍ１を加えて生ずる沈澱を除去し
た後、シリカゲル（マリンクロット社製ニジリシックア
シド−ＡＲ）１０．１を加えて減圧濃縮乾固する。

こノ乾固物を、クロロホルム：メタノール−１０：１の
溶媒系でシリカゲル（前記と同様のもの）■２５１をゲ
ル化させ３×８０ｃＩｒＬのカラムに充填したカラムに
上積させ、上記の溶媒系で展開し、２０グのフラクショ
ンに分画すると活性部は５０〜１２０の分画に一つのピ
ークとなって溶出された。

この各々の分画をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（
メルク社製、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４、厚
さ０．２５ｍｍ）で、ブタノール：エタノール：水＝４
：１：１の溶媒系を用いて展開し、Ｔ、 Ｔ、 Ｃ。

反応陽性のＲｆ：０．７３のスポットが確認される分画
５０〜８０を集めて濃縮乾固すると、褐色粉末５２０ｒ
Ｉｖ？を得る。

さらにこの粉末を１００ｍ１のメタノールに溶解し、５
２〜の活性炭（武田薬品社製、「白すギ」）を加えて室
温で３０分間攪拌後、ｒ別し、メタノール溶液をｌｏｍ
Ａ？まで濃縮後、セファデックス■ＬＨ−２０のメタノ
ールで展開する３００ｍ１のカラムクロマトグラフィー
を行い、上記の方法でＴ、 Ｔ、 Ｃ，反応陽性の分画
３０ｍ１を得た。

この分画を減圧濃縮乾固し、１５０７％の白色粉末を得
た。

この粉末を５７７１１のメタノールに溶解し、５Ｑｍｌ
のクロロホルムを加えて４℃の冷室で一夜放置すると、
無色針状結晶が析出する。

これを同様な方法で再結晶し、８２〜の本物質の純粋な
結晶を得た。

実施例 ２ ジャーファーメンタ−による培養とそれに伴う抽出精製
は次の方法で行なった。

すなわち実施例１と同様な方法で培地を調製し、それと
同様な方法１盪培養を行い、培養１日後の培養液を、実
施例１と同一組成の培地を３０．ｅ容のジャーファーメ
ンタ−に１２１仕込み、消泡剤としてシリコン樹脂１．
２ｍｌを添加して１２０℃、３０分間高熱蒸気で殺菌し
たものにジャーファーメンタ−１基につき３００罰宛接
種し、２８℃で４８時間、毎分１．２１の殺菌空気を通
気し、毎分３５０回転の攪拌機で攪拌しながら培養を続
けた。

この培養液３６７に６６０２のバイフロス−パーセル［
Ｆ］を加えてフィルタープレスでｒ過し３０１のＰ液を
得た。

このｒ液を３倍に希釈したものはグリオキサラーゼ活性
を５０％阻害した。

このＰ液を実施例１と同様な方法で抽出精製、再結晶し
て５８０〜の純粋な本物質の結晶を得た。

実施例 ３ タンク培養については以下の方法にしたがった。

すなわち第１次種母としては実施例１と同様な方法で１
日間振盪培養し、さらに第２次種母として５１容の三角
フラスコにｌｌ宛前記の培地を仕込み、殺菌後、各１本
につき１２５ｍ１の第１次種母を接種して、２４時間、
２７℃で毎分１３０回転のロータリー振盪機で振盪培養
した培養液を用いた。

この第２次種母３１を、２００１容のタンクに１２０１
の培地（実施例１と同様の培地にシリコン樹脂０．１％
を添加した）を仕込み、実施例２と同様な方法で殺菌後
、接種し、２７℃で３６時間、毎分１２０１の殺菌空気
を通気し、毎分２５０回転の攪拌機で攪拌しながら培養
した。

この培養液を実施例２と同様な方法でｐ過すると、ｒ液
１００１が得られた。

これを３倍に希釈したものは５０％のグリオキサラーゼ
活性を示した。

このＰ液を実施例１と同様の方法で抽出精製、再結晶し
て２．４９３Ｐの本物質の結晶を得た。

実施例 ４ 実施例１と同様な方法で培養し、ｒ液４１と菌体部１ｋ
ｇを得た。

この菌体部を３１のメタノールで攪拌しながら抽出し、
残渣をｒ側抜、メタノールを溜去し、３００ｍ１まで濃
縮した。

さらにＩＮ塩酸でＰＨ２，０とした後、３００ｍ１のブ
タノールで３回抽出を（り返し、１１のブタノール抽出
液を得た。

これを実施例１と同様な方法でシリカゲルクロマトグラ
フィー、セファテックス■ＬＨ−２０クロマトグラフィ
ーにかけ、８．０〜の本物質の針状結晶を得た。

実施例 １ ２−クロトニルオキシメチル−（４，Ｒ・５Ｒ・６Ｒ）
−４・５・６−トリバイドロキシサイクロヘキス−２〜
エノン１００η及びマンニトール１１を蒸留水１００ｍ
１に溶解し除菌１過しだ後１ｍｌバイアルに充填し、凍
結乾燥して凍結乾燥製剤を得る。

実施例 ２ ・ ２−クロトニルオキシメチル−（４Ｒ・５Ｒ・６Ｒ
）−４・５・６−トリ・・イドロキシサイクロへキス−
２−エノン１０〜及ヒクルコース５′？を蒸留水１００
ｍ１に溶解し除菌ｒ過した後５ｍ、ｌのアンプルに充填
し、水溶液注射剤を得る。

実施例 ３ ２−クロトニルオキシメチル−（４Ｒ・５Ｒ・６Ｒ）−
４・５・６〜ｌ・リハイドロキシザイクロへキス−２−
エノン１００ｍＩ？及び塩化ナトリウム９００７１１９
を蒸留水１００ｍ１に溶解し静閑ｒ過しだ後１ ｍｌの
アンプルに充填し、水溶液注射剤を得る。

実施例 ４ ２−クロトニルオキシメチル−（４Ｒ・５Ｒ・６Ｒ）−
４・５・６〜トリハイドロキシサイクロヘキス−２〜エ
ノン（以下、主薬と略す）５グ及び結晶乳糖１３０′ｉ
Ｉ、微結晶セルロース２４グ、ステアリン酸マグネシウ
ム１グを混合し、直接打錠法により、主薬５ｍ９を含有
する１錠１６０〜の錠剤を得る。

実施例 ５ ２−クロトニルオキシメチル−（４Ｒ・５Ｒ・６Ｒ）−
４・５・６〜トリハイドロキシサイクロヘキス−２〜エ
ノン５グ及び乳糖９９５グを混合し、■ｖ中に主薬５ｍ
９を含有する散剤を得る。

実施例 ６ ２−クロトニルオキシメチル−（４Ｒ・５Ｒ・６Ｒ）−
、、、、−４・５・６−ドリノ・イドロキシザイクロへ
キス−２−エノン５？及びマンニｌ−−ル９９３１、ヒ
ドロキシプロピルセルロース２１に水ヲ加え、捏和した
後、押出造粒により１ｖ中に主薬５〜を含有する顆粒剤
を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本物質の１ｏｇ／ｍ、ｌの水溶液及び１ｍ？
／ｍ、ｌの水溶液中での紫外部吸収スペクトル曲線を示
す。 第２図は本物質を臭化カリ錠として測定した赤外部吸収
スペクトル曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １２−クロトニルオキシメチル−（４Ｒ・５．Ｒ・６Ｒ
   ）−４・５・６− トリハイドロキシサイクロヘキス−
   ２−エノン。 ２ ストレプトミセス属に属する２−クロトニルオキシ
   メチル−（４Ｒ・５Ｒ・６Ｒ）−４・５・６−トリハイ
   ドロキシサイクロヘキスー２−エノン生産菌を培地に培
   養し、２−クロトニルオキシメチル−（４Ｒ・５Ｒ・６
   Ｒ）−４・５・６−トリハイドロキシサイクロヘキスー
   ２−エノンを生成畜積せしめ、これを採取することを特
   徴とする２−クロトニルオキシメチル＝（４Ｒ・５Ｒ・
   ６Ｒ）＝４・５・６−） ’Ｊハイドロキシサイクロへ
   キス−２−エノンの製造法。 ３ ２−？ロトニルオキシメチルー（４Ｒ・５Ｒ・６Ｒ
   ）−４・ ５・ ６−１’Ｊノ・ロドロキシサイクロへ
   キス−２−エノンを含有する制癌剤。