KR20060060039A - 카로티노이드 화합물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 실질적으로 동일한 카로티노이드 생산 미생물에 돌연변이를 유발시키고, 총 카로티노이드 생산량 중 제아크산틴, β-카로틴 또는 라이코펜의 비율이 높은 변이주를 선별함으로써 제아크산틴, β-카로틴 또는 라이코펜 생산 미생물을 수득하며, 전기 변이 미생물을 배양하여 수득한 배양물로부터 제아크산틴, β-카로틴 또는 이들을 함유하는 카로티노이드 혼합물을 수득하는 것을 포함하는 제아크산틴, β-카로틴 또는 라이코펜의 제조방법에 관한 것이다.
카로티노이드, 제아크산틴, β-카로틴, 라이코펜, 미생물학적 제조방법
Description
본 발명은 사료용, 식품용, 화장품용, 의약품용 등의 천연황색색소, 천연적색색소 및 항산화 작용물질로서 유용한 제아크산틴(zeaxanthin), β-카로틴(β-carotene), 라이코펜(lycopene) 및 이들을 함유하는 카로티노이드 혼합물의 미생물학적 제조방법에 관한 것이다.
제아크산틴은 옥수수 등 여러 가지의 식물에 포함되어 천연황색색소로 사료에 첨가되고, 닭 등의 가금류의 난황, 고기 및 표피의 색조를 개선시키는 용도 및 식품의 착색료로서의 용도가 공지되어 있다. 또한, 강력한 항산화 작용을 가지고 있으며(참조: Fisheries Science, 62(1), p134-p137, 1996), 항종양 효과도 보고되어 있다(참조: Biol. Pharm. Bull., 18(2), p227-p233, 1995). 제아크산틴은 루테인(lutein)과 함께 망막 및 수정체에 존재하여 눈의 건강유지에 관여하고 있음이 공지되어 있다(참조: FOOD Style 21, 3(3), p50-p53, 1999). 이들의 생리적 효과로부터 제아크산틴은 건강식품소재, 화장품소재 및 의약품소재로서 유용하다. β- 크립토크산틴(β-cryptoxanthin)은 감귤류에 포함되고, 항종양 효과를 가지고 있으며(참조: Biol. Pharm. Bull., 18(2), p227-p233, 1995), 식품소재 및 사료배합제로서의 용도로 사용된다. β-카로틴은 프로비타민 A 작용 및 항산화 작용을 가지며, 사료첨가물, 식품첨가물 및 천연착색료 등으로 광범위하게 사용되고 있다.
제아크산틴의 제조방법으로는 옥소이소포론(oxoisophorone)의 부제환원(asymmetric reduction)으로 수득된 광학활성의 히드록시케톤(hydroxyketone)을 원료로 이용하는 화학합성법(참조: Pure Appl. Chem., 63(1), p45, 1991), 옥수수의 종자에서 추출하는 방법(생체색소, 1974, 아사쿠라쇼텐)이 공지되어 있다. 또한, 매리골드(marigold)에서 추출하는 방법도 공지되어 있지만(참조: 특개평 8-092205호 공보), 매리골드 유래 카로티노이드의 주성분은 루테인이며, 제아크산틴의 함량은 낮다. 또한, 미생물이 생산되는 예로는 스피루리나 조류(Spirulina algae)(참조: 특개평 10-155430호 공보), 난노클로리스(Nannochloris)속 미세조류(참조: 특개평 7-59558호 공보), 플렉시박터(Flexibacter)속 세균(참조: 특개평 5-328978호 공보), 알테로모나스(Alteromonas)속 세균(참조: 특개평 5-49497호 공보), 플라보박테리움(Flavobacterium)속 세균(참조: Carotenoids, in Microbial Technology, 2nd edn, Vol. 1, p529-p544, New York Academic Press), 세균 아그로박테리움 오우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)(참조: FEMS Microbiology Letters, 128, p139-p144, 1995), 및 새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서) 등이 공지되어 있다.
β-카로틴은 당근 등의 녹황색 야채에 포함되는 천연의 황색 카로티노이드이며, 버터 또는 마가린과 같은 식품의 착색료로서 광범위하게 사용되고 있다. 또한, 프로비타민 A 활성을 가지고 있으며, 인간에게 있어 중요한 영양소이다. 항산화 작용을 가지고 있으며(참조: Fisheries Science, 62(1), p134-p137, 1996), 항종양ㆍ항암작용이 보고되어 있다(참조: Biol. Pharm. Bull., 18(2), p227-p233, 1995). 이들의 생리적 효과로부터 β-카로틴은 착색료뿐만 아니라, 사료용, 식품용, 화장품용 및 의약품용의 기능성 소재로서 유용하다.
β-카로틴의 제조방법으로는 β-이오논(β-ionone)으로부터의 화학합성(참조: Pure Appl. Chem., 63(1), p45, 1979), 당근, 고구마, 호박 등의 녹황색 야채로부터의 추출(텐넨챠큐쇼쿠료 핸드북, 코우린, 1979, 텐넨챠큐쇼쿠료 헨슈이인카이편)이 알려져 있다. 또한, β-카로틴을 생산하는 미생물의 예로는 두나리엘라 조류(Dunaliella algae)(참조: J. Phycol, 23, p176, 1987), 계상균 브랙슬리아 트리스포라(Blakeslea trispora)(참조: Appl. Environ. Microbiol. 36, p639-p642, 1979), 효모 파피아 로도자이머(Phaffia rhodozyma)(참조: 특개평 5-168465호 공보), 로도토룰라(Rhodotorula)속 효모(참조: 특개평 6-22748호 공보), 세균 아그로박테리움 오우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)(참조: FEMS Microbiology Letters, 128, p139-p144, 1995), 새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서) 등이 공지되어 있다.
라이코펜은 토마토에 포함되는 천연의 적색 카로티노이드이며, 식품의 착색 료로서 유용하다. 또한, 강력한 항산화 작용을 가지고 있고(참조: Arch. Biochem. Biophys., 271, p532, 1989), 동맥경화에 관계되는 저밀도 리포단백질의 산화를 저해시키고 있음이 공지되어 있으며(참조: Nutr. Metab. Cordiovasc., Dis 7, p433, 1997), 암세포의 증식을 억제시키는 것이 보고되어 있다(참조: J. Natl. Cancer Inst. 91, p313, 1999). 이들의 생리적 효과로부터 라이코펜은 사료용, 식품용, 화장품용 및 의약품용의 소재로서 유용하다.
라이코펜의 제조방법으로는 리나룰(linalool) 또는 게라니올(geraniol)을 원료로 화학합성하는 방법(참조: 특개 2001-39943호 공보), 토마토에서 분리정제하는 방법(참조: 특개 2002-193850호 공보)이 공지되어 있다. 또한, 라이코펜을 생산하는 미생물의 예로는 두나리엘라 조류(참조: 특개 2001-161391호 공보), 클로렐라 조류(참조; 특개 2000-152778호 공보), 로도박터(Rhodobacter)속 세균(참조: 특개평 8-239658호 공보)이 공지되어 있다. 게다가, 새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서)는 카로티노이드 화합물을 고농도로 생산하는 것이 공지되어 있지만, 라이코펜의 생산량은 극히 적다.
그러나, 상술한 제아크산틴, β-카로틴 및 라이코펜의 화학합성방법은 유기용제를 사용하기 때문에, 안전성 및 최근 천연물을 지향하는 측면에서 문제가 있다. 또한, 종래의 미생물에 의한 배양에서는 생산성이 낮기 때문에 실용적이지 않고, 식물(예를 들어, 옥수수, 당근, 토마토 등)로부터의 추출에서는 목적으로 하는 카로티노이드 화합물의 함량이 낮기 때문에, 비용이 많이 들고, 날씨에 좌우되기 때문에 안정공급이 어렵다는 결점을 가지고 있다. 카로티노이드 화합물 생산균으로 알려진 E-396주는 각종 실험에 의하여 이미 그 안전성이 확인되어 아스타크산틴을 함유하는 카로티노이드 화합물을 공업적 규모에서 고농도로 생산하는 방법이 확립되어 있지만, 생산되는 총 카로티노이드 중의 제아크산틴, β-카로틴 및 라이코펜의 비율은 낮다.
따라서, 제아크산틴, β-카로틴 및 라이코펜의 안정적인 가격으로, 안정공급 가능한 안전성이 높은 제조방법이 요구되고 있다.
발명의 개시
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 아스타크산틴 등의 카로티노이드 화합물을 생산하는 미생물을 변이처리하여, 생산되는 총 카로티노이드 양에 차지하는 제아크산틴, β-카로틴 또는 라이코펜의 생산비율이 높은 미생물이 용이하게 수득되는 것을 알아내었고, 본 발명을 완성시키게 되었다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 제공한다.
(1) 16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 실질적으로 동일한 아스타크산틴 생산 미생물에 돌연변이를 유발시키는 단계; 생산되는 제아크산틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주를 선별함으로써 제아크산틴 생산 미생물을 수득하는 단계; 전기 제아크산틴 생산 미생물을 배양하는 단계; 및, 전기 수득한 미생물의 배양물로부터 제아크산틴 또는 제아크산틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물을 수득하는 단계를 포함하는, 제아크산틴 또는 제아크산틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물의 제조방법.
(2) 전기 (1)에 있어서 생산되는 제아크산틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주의 선별이 고체 배지상에서 황색 내지 주황색을 나타내는 콜로니를 선택하여 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
(3) 전기 (1) 또는 (2)에 있어서 전기 제아크산틴 생산 미생물에 의하여 생산되는 제아크산틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 20질량% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
(4) 전기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서 전기 제아크산틴 생산 미생물에 의하여 생산되는 에키네논, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 각각의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 10질량% 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
(5) 전기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서 제아크산틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물이 β-크립토크산틴 및/또는 β-카로틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(6) 전기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서 아스타크산틴 생산 미생물이 E-396주(FERM BP-4283)와 그의 변이주 및 A-581-1주(FERM BP-4671)와 그의 변이주로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
(7) 16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 실질적으로 동일한 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴으로부터 선택되는 적어도 하나의 카로티노이드 화합물을 생산하는 카로티노이드 생산 미생물을 변이를 위한 친주로 사용하여 전기 미생물에 돌연변이를 유발시키는 단계; 생산되는 β-카로틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주를 선별함으로써 β-카로틴 생산 미생물을 수득하는 단계; 전기 β-카로틴 생산 미생물을 배양하는 단계; 및, 전기 수득한 미생물의 배양물로부터 β-카로틴 또는 β-카로틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물을 수득하는 단계를 포함하는, β-카로틴 또는 β-카로틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물의 제조방법.
(8) 전기 (7)에 있어서 생산되는 칸타크산틴 및 에키네논의 합계량의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 50질량% 이상인 카로티노이드 생산 미생물을 변이의 친주로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
(9) 전기 (7) 또는 (8)에 있어서 생산되는 제아크산틴 및 β-크립토크산틴의 합계량의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 50질량% 이상인 카로티노이드 생산 미생물을 변이의 친주로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
(10) 전기 (7) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서 생산되는 β-카로틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주의 선별이 고체 배지상에서 황색 내지 주황색을 나타내는 콜로니를 선택하여 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
(11) 전기 (7) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서 β-카로틴 생산 미생물에 의하여 생산되는 β-카로틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 50질량% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
(12) 전기 (7) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서 β-카로틴 생산 미생물에 의하여 생산되는 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 각각의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 20질량% 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
(13) 전기 (7) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서 카로티노이드 생산 미생물이 E-396주(FERM BP-4283)와 그의 변이주 및 A-581-1주(FERM BP-4671)와 그의 변이주로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
(14) 16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 실질적으로 동일한 β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴으로부터 선택되는 적어도 하나의 카로티노이드 화합물을 생산하는 카로티노이드 생산 미생물을 변이를 위한 친주로 사용하여 전기 미생물에 돌연변이를 유발시키는 단계; 생산되는 라이코펜의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주를 선별함으로써 라이코펜 생산 미생물을 수득하는 단계; 전기 라이코펜 생산 미생물을 배양하는 단계; 및, 전기 수득한 미생물의 배양물로부터 라이코펜 또는 라이코펜을 함유하는 카로티노이드 혼합물을 수득하는 단계를 포함하는, 라이코펜 또는 라이코펜을 함유하는 카로티노이드 혼합물의 제조방법.
(15) 전기 (14)에 있어서 생산되는 라이코펜의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주의 선별이 고체 배지상에서 분홍색 내지 적자색을 나타내는 콜로니를 선택하여 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
(16) 전기 (14) 또는 (15)에 있어서 전기 라이코펜 생산 미생물에 의하여 생산되는 라이코펜의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 40질량% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
(17) 전기 (14) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서 전기 라이코펜 생산 미생물에 의하여 생산되는 β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 각각의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 20질량% 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
(18) 전기 (14) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서 카로티노이드 생산 미생물이 E-396주(FERM BP-4283)와 그의 변이주 및 A-581-1주(FERM BP-4671)와 그의 변이주로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
이하에서는 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 방법에서는 변이의 친주로 아스타크산틴 또는 카로티노이드를 생산하는 미생물이 이용되지만, 이와 같은 미생물로는 그의 16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 실질적으로 동일한 아스타크산틴 또는 카로티노이드 생산세균을 예로 들 수 있다. 본 명세서에서 "실질적으로 동일한(substantially homologous)"이라 함은 DNA의 염기서열 결정시 에러빈도 등을 고려하여 98% 이상의 상동성인 것을 의미한다.
상기 서열과 실질적으로 동일한 서열을 가지는 아스타크산틴 또는 카로티노이드 생산 미생물로는, 구체적으로는, E-396주(FERM BP-4283)와 A-581-1주(FERM BP-4671) 및 E-396주 또는 A-581-1주를 변이개량하는 것으로, 수득된 각종 변이주 및 상기 2종의 근연종(closely related strain)을 예로 들 수 있다. 서열번호 1의 DNA 염기서열은 E-396주의 리보좀 RNA에 상응하고, 서열번호 2의 DNA 염기서열은 A-581-1주의 리보좀 RNA에 상응한다. E-396주와 A-581-1주의 16S 리보좀 RNA의 염기서열의 상동성은 99.4%이고, 서로 극히 가깝게 연관된 균주인 것을 알 수 있었다. 따라서, 이들의 균주는 카로티노이드를 생산하는 세균으로서 하나의 그룹을 형성하고 있다. 본 발명의 방법에서 이용되는 변이의 친주는 E-396주와 A-581-1주, E-396주 또는 A-581-1주의 변이주 및 이들의 균주의 근연종으로, 16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 98% 이상의 상동성을 가지는 아스타크산틴 또는 카로티노이드 생산 세균으로 정의된다.
본 발명에 사용되는 아스타크산틴 또는 카로티노이드 생산 미생물로 예를 들 수 있는 E-396주에 대하여 설명한다. 이 주는 본 발명자들이 새롭게 분리한 것으로, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1츄오 다이 6)에 1993년 4월 27일에 FERM BP-4283으로 기탁되었다. 보다 구체적인 다른 미생물로는 A-581-1주를 예로 들 수 있다. 이 주는 발명자들이 새롭게 분리한 것으로, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1츄오 다이 6)에 1994년 5월 20일에 FERM BP-4671로 기탁되었다.
아스타크산틴
생산 미생물의 돌연변이처리 및
제아크산틴
생산 변이주의 선별
본 발명에서 아스타크산틴 생산 미생물을 변이처리하는 방법은 돌연변이를 유발시키는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG), 에틸메탄술포네이트(methanesulfonate, EMS) 등의 변이제에 의한 화학적 방법, 자외선 조사, X선 조사 등의 물리학적 방법, 유전자 재조합, 트랜스포슨(transposon) 등에 의한 생물학적 수단 등을 이용할 수 있다. 상기 변이처리는 1회만 처리하여도 무방하다. 또한, 상기 돌연변이처리에 의하여 아스타크산틴 생산 미생물의 변이체를 수득하며, 이를 다시 돌연변이처리하는 방법으로 2회 이상의 변이처리를 하여도 무방하다.
다음으로, 상기와 같이 수득되는 아스타크산틴 생산 미생물의 돌연변이체에서 생산되는 제아크산틴의 총 카로티노이드 양에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주를 선별함으로써 제아크산틴 생산 미생물을 수득한다. 상기 목적을 위하여, 변이처리후에 고체 배지상에 콜로니를 형성시키고, 임의로 콜로니를 수득하여도 무방하지만, 제아크산틴 생산 미생물의 콜로니는 황색 내지 주황색을 나타내는 경우가 많기 때문에, 친주의 적색 내지 밝은 주황색의 콜로니에 비교해서 황색 내지 주황색을 나타내는 콜로니를 선택하여, 효율적으로 제아크산틴 생산 미생물(변이주)을 선별하는 것이 바람직하다. 이 공정을 포함하여, 총 카로티노이드 양에 대한 제아크산틴의 생산비율이 높은 변이주를 수득할 수 있는 확률은 상당히 향상된다.
상술한 바와 같이 선택된 각 변이주 콜로니를 통상적인 방법으로 배양하고, 배양종료후에 각 변이주의 배양액에 포함되는 카로티노이드 화합물을 분석하여, 제아크산틴의 생산비율이 높은 변이주를 선별한다.
변이주의 배양은, 예를 들어, 생산균의 생육에 필요하고, 카로티노이드 화합물을 생성하는 성분을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다. 배양방법은 실험관, 플라스크 등의 진탕배양(shake culture), 통기교반배양(aeration agitation culture) 등 어떠한 방법에서도 무방하다. 카로티노이드 화합물의 분석방법은 카로티노이드 화합물을 분리검출할 수 있는 방법 등 어떠한 방법에서도 무방하지만, 예를 들어, 고속액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 페이퍼 크로마토그래피 등을 이용할 수 있다.
본 발명에서 제아크산틴 생산 미생물의 수득은 총 카로티노이드 양에 대한 제아크산틴의 생산비율이 높은 변이주를 선별하여 행해지지만, 본 명세서에서 "총 카로티노이드 양(the whole amount of carotenoids)"이라 함은 아스타크산틴, 칸타크산틴, 아도니크산틴, β-카로틴, 에키네논, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈 등의 카로티노이드 화합물의 총량을 의미한다.
E-396주와 같은 아스타크산틴 생산 미생물은 아스타크산틴, 칸타크산틴, 아도니크산틴, β-카로틴, 에키네논, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈 등 여러 종류의 카로티노이드 화합물을 동시에 생성시킨다. 이 때문에, 총 카로티노이드 양에 대한 제아크산틴의 생산비율은 낮고, 통상은 0 내지 10질량% 정도이다. 본 발명에서는 아스타크산틴 생산 미생물에 돌연변이를 유발시키고, 생산되는 총 카로티노이드 양에 대한 제아크산틴의 비율이 특히 높은 변이주를 선별한다. 그 선별 기준으로는 최소한 제아크산틴의 생산비율이 변이전 친주의 제아크산틴의 생산비율보다 높은 것이 요구되고, 생산되는 총 카로티노이드 양에 대하여 제아크산틴의 생산비율이 바람직하게는 20질량% 이상, 보다 바람직하게는 40질량% 이상, 보다 더 바람직하게는 60질량% 이상인 변이주를 선별한다.
아스타크산틴의 생합성은 β-카로틴을 상류로 하여 케톤화(ketonization) 효소 및 수산화 효소에 의하여 각각 양 말단의 6원환이 수식되어 행해진다고 추정되고 있다(참조: 도 1). 이 케톤화 효소가 완전히 결손되면, β-카로틴, β-크립토크산틴 및 제아크산틴만이 생산되며, 케톤화 효소를 필요로 하는 에키네논, 칸타크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴은 생산되지 않음을 알 수 있다. 또한, 이 케톤화 효소가 불완전하게 결손되면, 에키네논, 칸타크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 총 카로티노이드 양에 대한 비율이 낮아짐을 알 수 있다. 따라서, 변이주에서 제아크산틴 생산 미생물을 선별하기 위한 또 하나의 유효한 수단으로는 에키네논, 칸타크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 총 카로티노이드 양에 대한 각각의 비율이 낮은 것을 기준으로 선별하는 방법을 이용할 수 있다. 상술한 화합물 각각의 총 카로티노이드에 대한 비율이 모두 10질량% 미만, 보다 바람직하게는 5질량% 미만, 보다 더 바람직하게는 1질량% 미만인 것을 기준으로 선별할 수 있다.
카로티노이드 생산 미생물의 돌연변이처리 및 β-카로틴 생산 변이주의 선별
본 발명에 사용되는 변이를 위한 친주는 16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 98% 이상의 상동성을 가지며, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴으로부터 선택되는 적어도 하나의 카로티노이드 화합물을 생산하는 카로티노이드 생산 미생물로 정의되지만, 바람직하게는 생산되는 칸타크산틴 및 에키네논의 합계량의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 50질량% 이상인 카로티노이드 생산 미생물, 또는 생산되는 제아크산틴 및 β-크립토크산틴의 합계량의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 50질량% 이상인 카로티노이드 생산 미생물이 이용된다. 보다 바람직하게는 생산되는 칸타크산틴 및 에키네논의 합계량의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 70질량% 이상인 카로티노이드 생산 미생물, 또는 생산되는 제아크산틴 및 β-크립토크산틴의 합계량의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 70질량% 이상인 카로티노이드 생산 미생물이 이용된다. 본 명세서에서 "총 카로티노이드 양(the whole amount of carotenoids)"이라 함은 β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴, 아스타크산틴 등의 카로티노이드 화합물의 총량을 의미한다.
카로티노이드의 생합성에서는 라이코펜의 양 말단이 환화(ring formation)되어 β-카로틴을 생성하고, β-카로틴이 케톤화 효소 및 수산화 효소에 의하여 각각 양 말단의 6원환이 수식되어 칸타크산틴, 제아크산틴, 아스타크산틴 등이 생성된다고 추정되고 있다(참조: 도 1).
본 발명자들은 아스타크산틴을 높은 비율로 생산하는 미생물을 변이의 친주에 이용하는데 비교하고, 칸타크산틴 및 에키네논을 높은 비율로 생산하는 미생물, 또는 제아크산틴 및 β-크립토크산틴을 높은 비율로 생산하는 미생물을 변이의 친주로 이용하여 β-카로틴 생산 미생물의 수득 확률이 상당히 향상됨을 알 수 있었다. 상기 현상은 이하와 같이 설명할 수 있다. 즉, 아스타크산틴을 높은 비율로 생산하는 카로티노이드 생산 미생물은 β-카로틴을 수산화하는 효소와 케톤화하는 효소 모두를 겸비하기 때문에, β-카로틴을 축적시키기 위해서는 두 효소를 동시에 결손시킬 필요가 있지만, 칸타크산틴 및 에키네논의 합계량의 비율이 높은 미생물은 수산화 효소가 결손되어 있는 미생물이기 때문에, 케톤화 효소만을 변이로 결손시키면 무방하고, 제아크산틴 및 β-크립토크산틴의 합계량의 비율이 높은 미생물은 케톤화 효소가 결손되어 있는 미생물이기 때문에, 수산화 효소만을 결손시키면 무방하다. 칸타크산틴과 에키네논과의 합계량의 비율이 높은 미생물, 및 제아크산틴과 β-크립토크산틴과의 합계량의 비율이 높은 미생물은 원래 야생주로 그의 성질을 가지고 있어도 무방하지만, 아스타크산틴 생산 미생물 등으로부터 돌연변이에 의하여 수득된 것이어도 무방하다.
본 발명에서 카로티노이드 생산 미생물을 변이처리하는 방법은 돌연변이를 유발시키는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), 에틸메탄술포네이트(EMS) 등의 변이제에 의한 화학적 방법, 자외선 조사, X선 조사 등의 물리학적 방법, 유전자 재조합, 트랜스포슨 등에 의한 생물학적 수단 등을 이용할 수 있다. 상기 변이처리는 1회만 처리하여도 무방하다. 또한, 상기 돌연변이처리에 의하여 카로티노이드 생산 미생물의 변이체를 수득하며, 이를 다시 돌연변이처리하는 방법으로 2회 이상의 변이처리를 하여도 무방하다.
다음으로, 상기와 같이 수득되는 카로티노이드 생산 미생물의 돌연변이체에서 생산되는 총 카로티노이드 양에 대한 β-카로틴의 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주를 선별함으로써 β-카로틴 생산 미생물을 수득한다. 상기 목적을 위하여, 변이처리후에 고체 배지상에 콜로니를 형성시키고, 임의로 콜로니를 수득하여도 무방하지만, β-카로틴 생산 미생물의 콜로니는 황색 내지 주황색을 나타내는 경우가 많기 때문에, 이와 같은 색을 나타내는 콜로니를 선택하여, 효율적으로 β-카로틴 생산 미생물(변이주)을 선별할 수 있다. 이 공정을 포함하여, 생산되는 총 카로티노이드 양에 대한 β-카로틴의 비율이 높은 변이주를 수득할 수 있는 확률은 상당히 향상된다.
상술한 바와 같이, 선택된 각 변이주 콜로니를 통상적인 방법으로 배양하고, 배양종료후에 각 변이주의 배양액에 포함되는 카로티노이드 화합물을 분석하고, β-카로틴의 생산비율이 높은 변이주를 선별할 수 있다.
변이주의 배양은, 예를 들어, 생산균의 생육에 필요하고, 카로티노이드 화합물을 생성하는 성분을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다. 배양방법은 실험관, 플라스크 등의 진탕배양, 통기교반배양 등 어떠한 방법에서도 무방하다. 카로티노이드 화합물의 분석방법은 카로티노이드 화합물을 분리검출할 수 있는 방법 등 어떠한 방법에서도 무방하지만, 예를 들어, 고속액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 페이퍼 크로마토그래피 등을 이용할 수 있다.
본 발명에서 β-카로틴 생산 미생물의 수득은 총 카로티노이드 양에 대한 β-카로틴의 비율이 높은 변이주를 선별하여 행해진다. E-396주와 같은 카로티노이드 생산 미생물은 아스타크산틴, 칸타크산틴, 아도니크산틴, β-카로틴, 에키네논, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈 등 여러 종류의 카로티노이드 화합물을 동시에 생성하기 때문에, 총 카로티노이드 양에 대한 β-카로틴의 비율은 낮고, 통상은 0 내지 20질량% 정도이다.
본 발명에서는 카로티노이드 생산 미생물에 돌연변이를 유발시키고, 생산되는 총 카로티노이드 양에 대한 β-카로틴의 비율이 특히 높은 변이주를 선별한다. 그 선별 기준으로는 최소한 변이주의 β-카로틴의 생산비율이 변이전 친주의 β-카로틴의 생산비율보다 높은 것이 요구되고, 생산되는 총 카로티노이드 양에 대하여 β-카로틴의 비율이 바람직하게는 50질량% 이상, 보다 바람직하게는 70질량% 이상, 보다 더 바람직하게는 90질량% 이상인 변이주를 선별한다.
카로티노이드의 생합성은 상술한 것과 같이 β-카로틴이 케톤화 효소 및 수산화 효소에 의하여 각각 양 말단의 6원환이 수식되어, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아스타크산틴 등이 생성되어 행해진다고 추정되고 있다(참조: 도 1). 이 케톤화 효소 및 수산화 효소의 양방이 완전히 결손되면, β-카로틴까지의 화합물만이 생산되며, β-카로틴 이후의 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴은 생산되지 않음을 알 수 있다. 또한, 이 케톤화 효소 및 수산화 효소가 불완전하게 결손되면, β-카로틴의 생산비율이 높아지고, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 낮아짐을 알 수 있다. 따라서, 변이주에서 β-카로틴 생산 미생물을 선별하기 위한 또 하나의 유효한 수단으로는 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 총 카로티노이드 양에 대한 각각의 비율이 낮은 것을 기준으로 선별하는 방법을 이용할 수 있다. 상술한 화합물 각각의 총 카로티노이드에 대한 비율이 모두 20질량% 미만, 보다 바람직하게는 10질량% 미만, 보다 더 바람직하게는 5질량% 미만인 것을 기준으로 선별할 수 있다.
카로티노이드 생산 미생물의 돌연변이처리 및
라이코펜
생산 변이주의 선별
본 발명에 사용되는 변이의 친주는 16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 98% 이상의 상동성을 가지며, β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴으로부터 선택되는 적어도 하나의 카로티노이드 화합물을 생산하는 카로티노이드 생산 미생물로 정의된다. 상기 카로티노이드의 적어도 하나를 생산하는 야생주를 변이의 친주에 이용할 수 있지만, 인공적인 돌연변이처리에 의하여, 예를 들어, 아스타크산틴 생산성이 향상된 변이주 또는 칸타크산틴 생산성이 향상된 변이주, 제아크산틴 생산성이 향상된 변이주, β-카로틴의 생산성이 향상된 변이주 등을 친주로 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에서 카로티노이드 생산 미생물을 변이처리하는 방법은 돌연변이를 유발시키는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), 에틸메탄술포네이트(EMS) 등의 변이제에 의한 화학적 방법, 자외선 조사, X선 조사 등의 물리학적 방법, 유전자 재조합, 트랜스포슨 등에 의한 생물학적 수단 등을 이용할 수 있다. 상기 변이처리는 1회만 처리하여도 무방하다. 또한, 상기 돌연변이처리에 의하여 카로티노이드 생산 미생물의 변이체를 수득하며, 이를 다시 돌연변이처리하는 방법으로 2회 이상의 변이처리를 하여도 무방하다.
다음으로, 상기와 같이 수득되는 카로티노이드 생산 미생물의 돌연변이체에서 총 카로티노이드 생산량에 대한 생산되는 라이코펜의 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주를 선별함으로써 라이코펜 생산 미생물을 수득한다. 상기 목적을 위하여, 변이처리후에 고체 배지상에 콜로니를 형성시키고, 임의로 콜로니를 수득하여도 무방하지만, 라이코펜 생산 미생물의 콜로니는 분홍색 내지 적자색을 나타내는 경우가 많기 때문에, 친주의 적색 내지 밝은 주황색의 콜로니에 비교해서 분홍색 내지 적자색을 나타내는 콜로니를 선택하여, 효율적으로 라이코펜 생산 미생물(변이주)을 선별할 수 있다. 이 공정을 포함하여, 라이코펜의 총 카로티노이드 양에 대한 비율이 높은 변이주를 수득할 수 있는 확률은 상당히 향상된다.
상술한 바와 같이 선택된 각 변이주 콜로니를 통상적인 방법으로 배양하고, 배양종료후에 각 변이주의 배양액에 포함되는 카로티노이드 화합물을 분석하여, 라이코펜의 생산비율이 높은 변이주를 선별할 수 있다.
변이주의 배양은, 예를 들어, 생산균의 생육에 필요하고, 카로티노이드 화합물을 생성하는 성분을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다. 배양방법은 실험관, 플라스크 등의 진탕배양, 통기교반배양 등 어떠한 방법에서도 무방하다. 카로티노이드 화합물의 분석방법은 카로티노이드 화합물을 분리검출할 수 있는 방법 등 어떠한 방법에서도 무방하지만, 예를 들어, 고속액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 페이퍼 크로마토그래피 등을 이용할 수 있다.
본 발명에서 라이코펜 생산 미생물의 수득은 라이코펜의 총 카로티노이드 양에 대한 비율이 높은 변이주를 선별하여 행해지지만, 본 명세서에서 "총 카로티노이드 양(the whole amount of carotenoids)"이라 함은 라이코펜, β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴, 아스타크산틴 등의 카로티노이드 화합물의 총량을 의미한다.
E-396주와 같은 카로티노이드 생산 미생물은 아스타크산틴, 칸타크산틴, 아도니크산틴, β-카로틴, 에키네논, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈 등 여러 종류의 카로티노이드 화합물을 동시에 생성시키기 때문에, 총 카로티노이드 양에 대한 라이코펜의 비율은 낮고, 통상은 0 내지 5질량% 정도이다.
본 발명에서는 카로티노이드 생산 미생물에 돌연변이를 유발시키고, 생산되는 라이코펜의 총 카로티노이드 양에 대한 비율이 특히 높은 변이주를 선별한다. 그 선별 기준으로는 최소한 라이코펜의 생산비율이 변이전 친주의 라이코펜 생산비율보다 높은 것이 요구되지만, 생산되는 총 카로티노이드 양에 대하여 라이코펜의 생산비율이 바람직하게는 40질량% 이상, 보다 바람직하게는 65질량% 이상, 보다 더 바람직하게는 90질량% 이상인 변이주를 선별한다.
카로티노이드의 생합성은 라이코펜의 양 말단이 환화되어 β-카로틴을 생성하고, β-카로틴이 케톤화 효소 및 수산화 효소에 의하여 각각 양 말단의 6원환이 수식되어 칸타크산틴, 제아크산틴, 아스타크산틴 등이 생성된다고 추정되고 있다(참조: 도 1). 이 환화효소가 완전히 결손되면, 라이코펜만이 생산되고, 라이코펜 이후의 β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴은 생산되지 않음을 알 수 있다. 또한, 이 환화효소가 불완전하게 결손되면, 라이코펜의 생산비율이 높아지고, β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 낮아짐을 알 수 있다. 따라서, 변이주에서 라이코펜 생산 미생물을 선별하기 위한 또 하나의 유효한 수단으로는 β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 총 카로티노이드 양에 대한 각각의 비율이 낮은 것을 기준으로 선별하는 방법을 이용할 수 있다. 상술한 화합물 각각의 총 카로티노이드에 대한 비율이 모두 20질량% 미만, 보다 바람직하게는 10질량% 미만, 보다 더 바람직하게는 5질량% 미만인 것을 기준으로 선별할 수 있다.
선별된 변이주의 배양과 카로티노이드 화합물의 수득
상술한 바와 같이 선별된 제아크산틴 생산 변이주, β-카로틴 생산 변이주 또는 라이코펜 생산 변이주를 이하와 같이 배양하고, 목적으로 하는 카로티노이드 화합물을 수득한다.
본 발명에서 제아크산틴, β-카로틴, 라이코펜 또는 이들을 함유하는 카로티노이드 혼합물을 수득하기 위하여 상술한 각 변이 미생물을 배양한다. 변이 미생물을 배양하는 방법은 목적으로 하는 카로티노이드 화합물을 생성하는 조건이라면, 어떠한 방법에서도 무방하지만, 예를 들어, 이하와 같은 방법을 이용할 수 있다. 즉, 배지로서는 생산균이 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기염 및 필요시 특수한 요구물질(예를 들어, 비타민, 아미노산, 핵산 등)을 포함하는 것을 사용한다. 탄소원으로는 글루코스(glucose), 슈크로스(sucrose), 프룩토스(fructose), 트레할로스(trehalose), 만노스(mannose), 만니톨(mannitol), 말토스(maltose) 등의 당류, 초산, 푸마르산, 시트르산, 프로피온산, 말산, 말론산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 이소부탄올 등의 알코올류 등을 예로 들 수 있다. 첨가비율은 탄소원의 종류에 따라 다르지만, 통상 배지 1L당 1 내지 100g, 바람직하게는 2 내지 50g이다. 질소원으로는 질산칼륨, 질산암모니움, 염화암모니움, 황산암모니움, 인산암모니움, 암모니아, 요소, 글루타민산소다 등의 1종 또는 2종 이상이 이용된다. 첨가비율은 질소원의 종류에 따라 다르지만, 통상 배지 1L에 대하여 0.1 내지 20g, 바람직하게는 1 내지 10g이다. 무기염으로는 인산이(二)수소칼륨, 인산수소이(二)칼륨, 인산수소이(二)나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 황산철, 염화철, 황산망간, 염화망간, 황산아연, 염화아연, 황산구리, 염화칼슘, 탄산칼슘, 탄산나트륨 등의 1종 또는 2종 이상이 이용된다. 첨가비율은 무기염의 종류에 따라 다르지만, 통상 배지 1L에 대하여 0.1mg 내지 10g이다. 특수한 요구물질로는 비타민류, 핵산류, 효모엑기스, 펩톤, 고기엑기스, 맥아엑기스, 콘스팁리쿼(corn steep liquor), 건조효모, 대두박, 대두유, 올리브유, 옥수수유, 아마인유 등의 1종 또는 2종 이상이 이용된다. 첨가비율은 특수한 요구물질의 종류에 따라 다르지만, 통상 배지 1L에 대하여 0.01mg 내지 100g이다. 배지의 pH는 2 내지 12, 바람직하게는 6 내지 9로 조정한다. 배양조건은 10 내지 70℃, 바람직하게는 20 내지 35℃의 온도이며, 통상 1일 내지 20일간, 바람직하게는 2 내지 9일간 진탕배양 또는 통기교반배양을 행한다.
다음으로, 상기의 방법에 의해 수득된 배양액으로부터 수분을 제거한다. 제아크산틴, β-카로틴, 라이코펜 또는 이들을 함유하는 카로티노이드 혼합물을 수득하기 위하여, 배양액으로부터 어느 정도의 수분제거가 필요하는지는 배양액의 색소함유량 등의 상태에 따라 다르지만, 일반적으로 우선 여과를 행하고, 수분제거가 필요하면, 침전물을 건조시킨다. 여과방법은 통상의 여과법, 원심분리법 등에 따라 행해질 수 있다. 게다가, 수분을 제거할 필요가 있는 경우에는 침전물을 건조시키는 방법을 취하는 것이 가능하다. 건조방법으로는 통상의 분무건조, 드럼건조, 동결건조 등을 예로 들 수 있다.
필요시 추출에 의해 목적으로 하는 카로티노이드 화합물의 함량을 높게 할 수도 있다. 추출원료로는 배양액을 이용하여도, 여과후의 침전물 또는 그것을 건조시킨 것을 이용하여도 무방하다. 추출방법으로는 용매추출이나 초임계 이산화탄소추출(supercritical carbon dioxide extraction)을 예로 들 수 있다. 용매추출에 이용하는 유기용매는 특별히 한정되지 않고, 수용성 유기용매 또는 불수용성 유기용매 어느 것을 사용하여도 무방하다. 수용성 유기용매의 예로는 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 피리딘, 디옥산, 시클로헥산, 시클로헥산올, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 에틸메틸케톤, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드를 들 수 있다. 추출용매는 2종 이상을 혼합하여 사용하여도 무방하고, 또는 물을 혼합하여 사용하여도 무방하다. 수득된 추출액은 감압농축 등에 의하여 용매를 제거하고 제품으로 할 수 있다. 필요에 따라 탈취처리를 하거나 식물유에 현탁시켜도 무방하다.
또한, 목적으로 하는 카로티노이드 화합물의 함량을 높게 할 필요가 있는 경우에는 2종 이상의 용매 재조합에 의한 액액추출(liquid-liquid extraction), 컬럼 크로마토그래피 등 통상의 정제수단에 의하여 정제하고, 카로티노이드 화합물을 포함하는 추출액 또는 용출액 등을 농축 또는 냉각시키거나, 빈 용매(poor solvent)를 첨가하여 카로티노이드 화합물을 석출시켜도 무방하다.
상기의 방법으로 수득된 제아크산틴, β-카로틴 또는 라이코펜을 포함하는 배양침전물, 침전건조물, 추출물, 추출정제물 등은 사료배합제, 식품소재, 화장품소재 및 의약품소재 등에 이용할 수 있다.
본 명세서는 본원 우선권의 기초인 특허 2003-325104호, 특허 2003-325130호 및 특허 2003-325144호의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.
도 1은 카로티노이드 화합물의 생합성 경로를 나타낸 그림이다.
설명을 실시하기
위한
최량의
형태
실시예
이하에서는 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1
E-396주(FERM BP-4283)를 농도 200mg/L의 NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘)에서 온도 28℃, 30분간 정치하여 변이처리하였다. 하기 표 1의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 황색 내지 주황색을 나타내는 변이주 콜로니 200주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균(one platinum loop)을 접종하고, 28℃에서 4일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 생산량에 대한 제아크산틴의 비율이 60질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 2에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 E-396주 배양액의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 조성 | 첨가량(g/L) |
| 효모엑기스 | 20 |
| 펩톤 | 5 |
| 슈크로스 | 50 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| Na2HPO4ㆍ12H2O | 3.8 |
| MgSO4ㆍ7H2O | 0.5 |
| FeSO4ㆍ7H2O | 0.01 |
| CaCl2ㆍ2H2O | 0.01 |
| Na2CO3 | 배지가 pH7이 되는 양 |
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 4.0 | 23.5 |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | 2.4 | 14.1 |
| 아스타크산틴 | - | |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | 10.6 | 62.4 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 1.6 | 6.6 |
| 에키네논 | 1.8 | 7.4 |
| 3-히드록시에키네논 | 0.4 | 1.6 |
| 칸타크산틴 | 1.6 | 6.6 |
| 아도니루빈 | 1.0 | 4.1 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 6.4 | 26.3 |
| 아스테로이데논 | 1.5 | 6.2 |
| 아도니크산틴 | 8.6 | 35.4 |
| 제아크산틴 | 1.4 | 5.8 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
2
E-396주(FERM BP-4283)를 농도 200mg/L의 NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘)에서 온도 28℃, 30분간 정치하여 변이처리하였다. 표 1의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 변이주 콜로니를 임의로 1,500주 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 4일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 에키네논, 칸타크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 10질량% 미만인 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 4.4 | 31.9 |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | 0.2 | 1.4 |
| β-크립토크산틴 | 3.1 | 22.5 |
| 아스타크산틴 | 0.5 | 3.6 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | 1.1 | 8.0 |
| 제아크산틴 | 4.5 | 32.6 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
3
E-396주(FERM BP-4283)를 NTG에서 변이처리하고, 적색의 색조가 짙은 콜로니를 선별하여 아스타크산틴의 생산성이 향상된 변이주 Y-559주를 수득하였다. 이 Y-559주를 150mg/L의 NTG에서 변이처리하였다. 표 1의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 황색 내지 주황색을 나타내는 변이주 콜로니를 350주 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 5일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 에키네논, 칸타크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 1% 미만인 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 5에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 Y-559주 배양액의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 6에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 34.0 | 59.1 |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | 3.4 | 5.9 |
| 아스타크산틴 | - | |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | 0.4 | 0.7 |
| 제아크산틴 | 19.7 | 34.3 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 26.2 | 13.6 |
| 에키네논 | 7.9 | 4.1 |
| 3-히드록시에키네논 | 0.9 | 0.5 |
| 칸타크산틴 | 12.0 | 6.3 |
| 아도니루빈 | 20.3 | 10.6 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 67.7 | 35.3 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | 56.4 | 29.4 |
| 제아크산틴 | 0.6 | 0.3 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
4
A-581-1주(FERM BP-4671)에 UV 램프로 자외선을 조사하여 변이처리하였다. 표 1의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 황색 내지 주황색을 나타내는 변이주 콜로니를 280주 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 4일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 양에 대한 제아크산틴의 비율이 20질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 7에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 A-581-1주 배양액의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 8에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 3.9 | 48.1 |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | 2.2 | 27.2 |
| 아스타크산틴 | - | |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | 2.0 | 24.7 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 0.6 | 7.8 |
| 에키네논 | 0.6 | 7.8 |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 0.7 | 9.1 |
| 아도니루빈 | 0.4 | 5.2 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 1.8 | 23.4 |
| 아스테로이데논 | 0.4 | 5.2 |
| 아도니크산틴 | 2.7 | 35.1 |
| 제아크산틴 | 0.5 | 6.5 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
5
E-396주(FERM BP-4283)를 농도 100mg/L의 NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘)에서 온도 28℃, 30분간 정치하여 변이처리하였다. 하기 표 9의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 황색 내지 주황색을 나타내는 변이주 콜로니 4,000주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 4일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 생산량에 대한 β-카로틴의 비율이 50질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 10에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 E-396주 배양액의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 11에 나타내었다.
| 성분 | 첨가량(g/L) |
| 효모엑기스 | 20 |
| 펩톤 | 5 |
| 슈크로스 | 50 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| Na2HPO4ㆍ12H2O | 3.8 |
| MgSO4ㆍ7H2O | 0.5 |
| FeSO4ㆍ7H2O | 0.01 |
| CaCl2ㆍ2H2O | 0.01 |
| Na2CO3 | 배지가 pH7이 되는 양 |
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 11.9 | 85.0 |
| 에키네논 | 0.2 | 1.4 |
| 3-히드록시에키네논 | ||
| 칸타크산틴 | 0.3 | 2.1 |
| 아도니루빈 | 0.4 | 2.9 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 0.7 | 5.0 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | 0.5 | 3.6 |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 1.6 | 6.6 |
| 에키네논 | 1.8 | 7.4 |
| 3-히드록시에키네논 | 0.4 | 1.6 |
| 칸타크산틴 | 1.6 | 6.6 |
| 아도니루빈 | 1.0 | 4.1 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 6.4 | 26.3 |
| 아스테로이데논 | 1.5 | 6.2 |
| 아도니크산틴 | 8.6 | 35.4 |
| 제아크산틴 | 1.4 | 5.8 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
6
E-396주(FERM BP-4283)를 NTG에서 변이처리하고, 주황색의 콜로니를 선별하여 칸타크산틴의 생산성이 향상된 변이주 CA-22주를 수득하였다. 이 CA-22주를 200mg/L의 NTG에서 변이처리하였다. 표 9의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 황색 내지 주황색을 나타내는 변이주 콜로니 80주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 5일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 생산량에 대한 β-카로틴의 비율이 50질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 12에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 CA-22주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 13에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 17.4 | 96.1 |
| 에키네논 | 0.4 | 2.2 |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 0.3 | 1.7 |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | - | |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 1.2 | 5.7 |
| 에키네논 | 2.5 | 11.9 |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 16.1 | 76.7 |
| 아도니루빈 | 0.9 | 4.3 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 0.3 | 1.4 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
7
E-396주(FERM BP-4283)를 NTG에서 변이처리하고, 황색의 콜로니를 선별하여 제아크산틴의 생산성이 향상된 변이주 ZE-7주를 수득하였다. 이 ZE-7주를 150mg/L의 NTG에서 변이처리하였다. 표 9의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 황색 내지 주황색을 나타내는 변이주 콜로니 60주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 5일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 생산량에 대한 β-카로틴의 비율이 50질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 14에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 ZE-7주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 15에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 16.0 | 100 |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | - | |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 4.0 | 23.5 |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | 2.4 | 14.1 |
| 아스타크산틴 | - | |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | 10.6 | 62.4 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
8
A-581-1주(FERM BP-4671)에 UV 램프로 자외선을 조사하여 변이처리하였다. 표 9의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 황색을 나타내는 변이 콜로니 3,000주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 4일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 각각의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 20질량% 미만을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 16에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 A-581-1주 배양액의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 17에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 2.9 | 64.4 |
| 에키네논 | 0.5 | 11.1 |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 0.2 | 4.4 |
| 아도니루빈 | 0.2 | 4.4 |
| β-크롭토크산틴 | 0.3 | 6.7 |
| 아스타크산틴 | 0.2 | 4.4 |
| 아스테로이데논 | ||
| 아도니크산틴 | 0.2 | 4.4 |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| β-카로틴 | 0.6 | 7.8 |
| 에키네논 | 0.6 | 7.8 |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 0.7 | 9.1 |
| 아도니루빈 | 0.4 | 5.2 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 1.8 | 23.4 |
| 아스테로이데논 | 0.4 | 5.2 |
| 아도니크산틴 | 2.7 | 35.1 |
| 제아크산틴 | 0.5 | 6.5 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
9
E-396주(FERM BP-4283)를 농도 100mg/L의 NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘)에서 온도 28℃, 30분간 정치하여 변이처리하였다. 하기 표 18의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 분홍색 내지 적자색을 나타내는 변이주 콜로니 60주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 4일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 생산량에 대한 라이코펜의 비율이 40질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 19에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 E-396주 배양액의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 20에 나타내었다.
| 성분 | 첨가량(g/L) |
| 효모엑기스 | 20 |
| 펩톤 | 5 |
| 슈크로스 | 50 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| Na2HPO4ㆍ12H2O | 3.8 |
| MgSO4ㆍ7H2O | 0.5 |
| FeSO4ㆍ7H2O | 0.01 |
| CaCl2ㆍ2H2O | 0.01 |
| Na2CO3 | 배지가 pH7이 되는 양 |
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | 15.5 | 96.3 |
| β-카로틴 | - | |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 0.3 | 1.9 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | 0.3 | 1.9 |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | - | |
| β-카로틴 | 1.6 | 6.6 |
| 에키네논 | 1.8 | 7.4 |
| 3-히드록시에키네논 | 0.4 | 1.6 |
| 칸타크산틴 | 1.6 | 6.6 |
| 아도니루빈 | 1.0 | 4.1 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 6.4 | 26.3 |
| 아스테로이데논 | 1.5 | 6.2 |
| 아도니크산틴 | 8.6 | 35.4 |
| 제아크산틴 | 1.4 | 5.8 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
10
E-396주(FERM BP-4283)를 농도 100mg/L의 NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘)에서 온도 28℃, 30분간 정치하여 변이처리하였다. 표 18의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 변이주 콜로니를 임의로 800주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 4일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 생산량에 대한 라이코펜의 비율이 40질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 21에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 E-396주 배양액의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 20에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | 10.1 | 74.3 |
| β-카로틴 | 0.2 | 1.5 |
| 에키네논 | 0.5 | 3.7 |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 0.3 | 2.2 |
| 아도니루빈 | 0.4 | 2.9 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 1.2 | 8.8 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | 0.9 | 6.6 |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
11
E-396주(FERM BP-4283)를 NTG에서 변이처리하고, 적색의 색조가 짙은 콜로니를 선별하여 아스타크산틴의 생산성이 향상된 변이주 Y-559주를 수득하였다. 이 Y-559주를 150mg/L의 NTG에서 변이처리하였다. 표 18의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 분홍색 내지 적자색을 나타내는 변이주 콜로니 80주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 5일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 생산량에 대한 라이코펜의 비율이 40질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 22에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 Y-559주 배양액의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 23에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | 163.9 | 99.6 |
| β-카로틴 | - | |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 0.7 | 0.4 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | - | |
| β-카로틴 | 26.2 | 13.6 |
| 에키네논 | 7.9 | 4.1 |
| 3-히드록시에키네논 | 0.9 | 0.5 |
| 칸타크산틴 | 12.0 | 6.3 |
| 아도니루빈 | 20.3 | 10.6 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 67.7 | 35.3 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | 56.4 | 29.4 |
| 제아크산틴 | 0.6 | 0.3 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
12
E-396주(FERM BP-4283)를 NTG에서 변이처리하고, 주황색의 콜로니를 선별하여 칸타크산틴의 생산성이 향상된 변이주 CA-22주를 수득하였다. 이 CA-22주를 200mg/L의 NTG에서 변이처리하였다. 표 18의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 분홍색 내지 적자색을 나타내는 변이주 콜로니 60주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 5일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 생산량에 대한 라이코펜의 비율이 40질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 24에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 CA-22주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 25에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | 19.3 | 98.0 |
| β-카로틴 | - | |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 0.4 | 2.0 |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | ||
| 아스타크산틴 | - | |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | - | |
| β-카로틴 | 1.2 | 5.7 |
| 에키네논 | 2.5 | 11.9 |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 16.1 | 76.7 |
| 아도니루빈 | 0.9 | 4.3 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 0.3 | 1.4 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
13
E-396주(FERM BP-4283)를 NTG에서 변이처리하고, 황색의 콜로니를 선별하여제아크산틴의 생산성이 향상된 변이주 ZE-7주를 수득하였다. 이 ZE-7주를 150mg/L의 NTG에서 변이처리하였다. 표 18의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 분홍색 내지 적자색을 나타내는 변이주 콜로니 80주를 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 5일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, 총 카로티노이드 생산량에 대한 라이코펜의 비율이 40질량% 이상을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 26에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 ZE-7주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 27에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | 17.1 | 96.1 |
| β-카로틴 | - | |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | 0.2 | 1.1 |
| 아스타크산틴 | - | |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | 0.5 | 2.8 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | - | |
| β-카로틴 | 4.0 | 23.5 |
| 에키네논 | - | |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | - | |
| 아도니루빈 | - | |
| β-크립토크산틴 | 2.4 | 14.1 |
| 아스타크산틴 | - | |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | - | |
| 제아크산틴 | 10.6 | 62.4 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
실시예
14
A-581-1주(FERM BP-4671)에 UV 램프로 자외선을 조사하여 변이처리하였다. 표 18의 조성으로 구성된 배지 6ml를 내경 18mm의 실험관에 넣고, 121℃, 15분간 증기살균처리하고, 실험관 배지를 제조하였다. 분홍색을 나타내는 변이 콜로니 100주 선별하고, 각각 실험관 배지에 1 백금이식균을 접종하고, 28℃에서 4일간, 330rpm의 왕복 진탕배양을 행하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 수득된 균체의 카로티노이드 화합물의 분석을 고속액체 크로마토그래피에 의하여 행하였는 바, β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 각각의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 20질량% 미만을 나타내는 균주를 1주 수득하였다. 이 균주의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 28에 나타내었다. 비교를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양한 A-581-1주 배양액의 카로티노이드 화합물의 분석결과를 하기 표 29에 나타내었다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | 3.3 | 54.1 |
| β-카로틴 | - | |
| 에키네논 | 0.4 | 6.6 |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 0.3 | 4.9 |
| 아도니루빈 | 0.3 | 4.9 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 1.1 | 18.0 |
| 아스테로이데논 | - | |
| 아도니크산틴 | 0.7 | 11.5 |
| 제아크산틴 | - |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
| 카로티노이드 화합물 | 배양액당 생성농도 (mg/L) | 생성비율 (질량%) |
| 라이코펜 | - | |
| β-카로틴 | 0.6 | 7.8 |
| 에키네논 | 0.6 | 7.8 |
| 3-히드록시에키네논 | - | |
| 칸타크산틴 | 0.7 | 9.1 |
| 아도니루빈 | 0.4 | 5.2 |
| β-크립토크산틴 | - | |
| 아스타크산틴 | 1.8 | 23.4 |
| 아스테로이데논 | 0.4 | 5.2 |
| 아도니크산틴 | 2.7 | 35.1 |
| 제아크산틴 | 0.5 | 6.5 |
* -은 검출한계(0.1mg/L) 미만인 것을 나타낸다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물을 그대로 참고하여, 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.
본 발명의 방법은 색소나 항산화제 등에 유용한 제아크산틴, β-카로틴, 라이코펜 및 이들을 주성분으로 함유하는 카로티노이드 혼합물의 제조에 유용하다. 본 발명에 의하면, 안정적인 가격으로 안정공급 가능한 안전성이 높은 제아크산틴, β-카로틴 또는 라이코펜의 제조방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 제아크산틴, β-카로틴 또는 라이코펜 생산 변이주 중에는 주생성물로서 제아크산틴, β-카로틴 또는 라이코펜과 함께, 부생성물로서, 예를 들어, β-크립토크산틴 및/또는 β-카로틴 등의 다른 카로티노이드 화합물을 동시에 생산하는 경우도 있으며, 본 발명은 이들의 카로티노이드 혼합물을 효율적으로 제조하는 방법으로도 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Nippon Oil Corporation
<120> Method for producing carotenoid compound
<130> PH-2223PCT
<150> JP2003/325104
<151> 2003-09-17
<150> JP2003/325130
<151> 2003-09-17
<150> JP2003/325144
<151> 2003-09-17
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown Organism:E-396
<400> 1
agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60
gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120
aatagccccg ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg 180
agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240
atccatagct ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc 360
gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca gctgggaaga taatgacggt 420
accagcagaa gaagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct 480
agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggactggaaa gtcagaggtg 540
aaatcccagg gctcaacctt ggaactgcct ttgaaactat cagtctggag ttcgagagag 600
gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc 660
gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 720
attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc cagacgtcgg caagcatgct 780
tgtcggtgtc acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 840
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900
aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat ggcaggaccg ctggagagat tcagctttct 960
cgtaagagac ctgcacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020
ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac 1080
tctatggaaa ctgccgatga taagtcggag gaaggtgtgg atgacgtcaa gtcctcatgg 1140
gccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggtt aatccccaaa 1200
agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta 1260
atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320
accatgggag ttggttctac ccgacgacgn tgcgctaacc ttcggggggc aggcggccac 1380
ggtaggatca gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg 1440
gatcacctcc tt 1452
<210> 2
<211> 1426
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown Organism:A-581-1
<400> 2
tagagtttga tcctggctca gaacgaacgc tggcggcagg cttaacacat gcaagtcgag 60
cgagaccttc gggtctagcg gcggacgggt gagtaacgcg tgggaacgtg cccttctcta 120
cggaatagcc ccgggaaact gggagtaata ccgtatacgc cctttggggg aaagatttat 180
cggagaagga tcggcccgcg ttggattagg tagttggtga ggtaacggct caccaagccg 240
acgatccata gctggtttga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatctt agacaatggg ggcaaccctg atctagccat 360
gccgcgtgag tgatgaaggc cttagggttg taaagctctt tcagctggga agataatgac 420
ggtaccagca gaagaagccc cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg 480
gctagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgta ggcggactgg aaagtcagag 540
gtgaaatccc agggctcaac cttggaactg cctttgaaac tatcagtctg gagttcgaga 600
gaggtgagtg gaattccgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag gaacaccagt 660
ggcgaaggcg gctcactggc tcgatactga cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 720
aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgccagacgt cggcaagcat 780
gcttgtcggt gtcacaccta acggattaag cattccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840
taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900
agcaacgcgc agaaccttac caacccttga catggcagga ccgctggaga gattcagctt 960
tctcgtaaga gacctgcaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttcggttaag tccggcaacg agcgcaaccc acgtccctag ttgccagcat tcagttgggc 1080
actctatgga aactgccggt gataagccgg aggaaggtgt ggatgacgtc aagtcctcat 1140
ggcccttacg ggttgggcta cacacgtgct acaatggtgg tgacagtggg ttaatcccca 1200
aaagccatct cagttcggat tgtcctctgc aactcgaggg catgaagttg gaatcgctag 1260
taatcgcgga acagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1320
acaccatggg agttggttct acccgacgac gctgcgctaa cccttcgggg aggcaggcgg 1380
ccacggtagg atcagcgact ggggtgaagt cgtaacaagg tagcca 1426
Claims (18)
16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 실질적으로 동일한 아스타크산틴(astaxanthin) 생산 미생물에 돌연변이를 유발시키는 단계; 생산되는 제아크산틴(zeaxanthin)의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주를 선별함으로써 제아크산틴 생산 미생물을 수득하는 단계; 전기 제아크산틴 생산 미생물을 배양하는 단계; 및, 전기 수득한 미생물의 배양물로부터 제아크산틴 또는 제아크산틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물을 수득하는 단계를 포함하는, 제아크산틴 또는 제아크산틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물의 제조방법.
제 1항에 있어서,
생산되는 제아크산틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주의 선별이 고체 배지상에서 황색 내지 주 황색을 나타내는 콜로니를 선택하여 행해지는 것을 특징으로 하는
방법.
제 1항에 있어서,
전기 제아크산틴 생산 미생물에 의하여 생산되는 제아크산틴의 총 카 로티노이드 생산량에 대한 비율이 20질량% 이상인 것을 특징으로 하는
방법.
제 1항에 있어서,
전기 제아크산틴 생산 미생물에 의하여 생산되는 에키네논 (echinenone), 3-히드록시에키네논(3-hydroxyechinenone), 아스테로 이데논(asteroidenone), 칸타크산틴(canthaxanthin), 아도니루빈 (adonirubin), 아도니크산틴(adonixanthin) 및 아스타크산틴 (astaxanthin)의 각각의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 10질량% 미만인 것을 특징으로 하는
방법.
제 1항에 있어서,
제아크산틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물이 β-크립토크산틴(β- cryptoxanthin) 및/또는 β-카로틴(β-carotene)을 포함하는 것을 특 징으로 하는
방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
아스타크산틴 생산 미생물이 E-396주(FERM BP-4283)와 그의 변이주 및 A-581-1주(FERM BP-4671)와 그의 변이주로부터 선택되는 것을 특징으 로 하는
방법.
16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 실질적으로 동일한 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴으로부터 선택되는 적어도 하나의 카로티노이드 화합물을 생산하는 카로티노이드 생산 미생물을 변이를 위한 친주로 사용하여 전기 미생물에 돌연변이를 유발시키는 단계; 생산되는 β-카로틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주를 선별함으로써 β-카로틴 생산 미생물을 수득하는 단계; 전기 β-카로틴 생산 미생물을 배양하는 단계; 및, 전기 수득한 미생물의 배양물로부터 β-카로틴 또는 β-카로틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물을 수득하는 단계를 포함하는, β-카로틴 또는 β-카로틴을 함유하는 카로티노이드 혼합물의 제조방법.
제 7항에 있어서,
생산되는 칸타크산틴 및 에키네논의 합계량의 총 카로티노이드 생산량 에 대한 비율이 50질량% 이상인 카로티노이드 생산 미생물을 변이의 친주로 이용하는 것을 특징으로 하는
방법.
제 7항에 있어서,
생산되는 제아크산틴 및 β-크립토크산틴의 합계량의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 50질량% 이상인 카로티노이드 생산 미생물을 변 이의 친주로 이용하는 것을 특징으로 하는
방법.
제 7항에 있어서,
생산되는 β-카로틴의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주의 선별이 고체 배지상에서 황색 내지 주 황색을 나타내는 콜로니를 선택하여 행해지는 것을 특징으로 하는
방법.
제 7항에 있어서,
β-카로틴 생산 미생물에 의하여 생산되는 β-카로틴의 총 카로티노이 드 생산량에 대한 비율이 50질량% 이상인 것을 특징으로 하는
방법.
제 7항에 있어서,
β-카로틴 생산 미생물에 의하여 생산되는 에키네논, β-크립토크산 틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 각각의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 20질량% 미만인 것을 특징으로 하는
방법.
제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
카로티노이드 생산 미생물이 E-396주(FERM BP-4283)와 그의 변이주 및 A-581-1주(FERM BP-4671)와 그의 변이주로부터 선택되는 것을 특징으 로 하는
방법.
16S 리보좀 RNA에 상응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 실질적으로 동일한 β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴으로부터 선택되는 적어도 하나의 카로티노이드 화합물을 생산하는 카로티노이드 생산 미생물을 변이를 위한 친주로 사용하여 전기 미생물에 돌연변이를 유발시키는 단계; 생산되는 라이코펜(lycopene)의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주를 선별함으로써 라이코펜 생산 미생물을 수득하는 단계; 전기 라이코펜 생산 미생물을 배양하는 단계; 및, 전기 수득한 미생물의 배양물로부터 라이코펜 또는 라이코펜을 함유하는 카로티노이드 혼합물을 수득하는 단계를 포함하는, 라이코펜 또는 라이코펜을 함유하는 카로티노이드 혼합물의 제조방법.
제 14항에 있어서,
생산되는 라이코펜의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율(질량%)이 친주의 것보다 높은 변이주의 선별이 고체 배지상에서 분홍색 내지 적자색을 나타내는 콜로니를 선택하여 행해지는 것을 특징으로 하는
방법.
제 14항에 있어서,
전기 라이코펜 생산 미생물에 의하여 생산되는 라이코펜의 총 카로티 노이드 생산량에 대한 비율이 40질량% 이상인 것을 특징으로 하는
방법.
제 14항에 있어서,
전기 라이코펜 생산 미생물에 의하여 생산되는 β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산 틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 및 아스타크산틴의 각각의 총 카로티노이드 생산량에 대한 비율이 모두 20질량% 미만인 것을 특 징으로 하는
방법.
제 14항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
카로티노이드 생산 미생물이 E-396주(FERM BP-4283)와 그의 변이주 및 A-581-1주(FERM BP-4671)와 그의 변이주로부터 선택되는 것을 특징으 로 하는
방법.
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