KR20150071264A - 글루타치온을 고발현하는 신규 균주 및 글루타치온 대량 생산 방법 - Google Patents

글루타치온을 고발현하는 신규 균주 및 글루타치온 대량 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루타치온을 고발현하는 하는 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01) 균주(KCTC 18262P)를 제공한다. 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주를 이용하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 우수한 항산화 효과를 나타내어 사료 첨가제, 건강 식품 첨가제 등 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

글루타치온을 고발현하는 신규 균주 및 글루타치온 대량 생산 방법{Novel Yeast Overproducing Glutathione and Method for Glutathione Overproduction by Using it}
본 발명은 글루타치온을 고발현하는 신규 균주 및 글루타치온 대량 생산 방법에 관한 것이다.
축산용 사료에는 미생물 감염에 의한 질병 예방을 통한 가축 생산성 향상을 위하여 1950년대 후반부터 항생제를 사용하였으며, 이는 육류에 항생제 잔류 등 항생제 남용에 의해 전 세계적으로 항생제 내성 문제가 사회적 이슈로 부각되면서 인체에 치명적인 슈퍼박테리아 출현 등의 인류 보건에 심각한 영향 문제가 발생되고 있다. 이에 따라, 축산용 항생제 남용이 슈퍼박테리아 출현의 주된 원인 중의 하나로 인식되고 있다는 오명을 감수해 오고 있어, 국민 건강 복지를 위하여 사료에 항생제의 사용이 대폭 규제가 되고 있는 실정이다. 그렇지만, 아직도 축산 농가에서는 사료에 항생제를 사용하지 않으면 질병 및 그 후유증(예: 발육저하 등)으로 인한 생산성이 낮아짐으로써 축산물 생산비 증가 및 경제성 악화로 축산물 가격 인상으로 축산업 위축될 우려가 상존하고 있다. 따라서 가축 성장촉진을 위한 항생제 대체제의 개발이 필요한 실정이다.
산소는 생명체를 유지하는데 없어선 안 될 가장 중요한 분자로서 폐에서 흡입한 산소는 혈액을 따라 각 조직의 세포로 공급되는데 이는 생명 현상을 유지하는데 필수적인 에너지를 만들기 위해서다. 세포 내에서 에너지를 만드는 중추적인 역할을 하는 곳이 미토콘드리아로 이곳에서 포도당 및 각종 영양분이 분해되는 동안 생성된 전자가 전자전달계를 통하여 산소에 전달되는 동안 에너지를 생산한다. 그러나, 이 과정에서 산소는 여러 가지 물리적, 화학적 및 환경적 요인에 의해 활성산소로 전환될 수 있다.
활성산소는 몸 안의 세균, 바이러스, 곰팡이와 같은 병원체를 없애는 생체 방어기능을 가질 수도 있지만, 활성산소는 쌍을 이루지 못한 전자를 가지고 있으면서 높은 에너지 상태이므로 반응성이 매우 강한 물질이다. 따라서 활성산소는 여러 가지 요인으로 체내에 활성산소가 과잉 생산되면서 오히려 세포를 공격하는 해로운 성분으로 인식되고 있다. 예를 들면, 지질과 반응하여 과산화 지질을 형성한 다음, 혈관 벽에 달라붙어 혈액 흐름을 방해하는 동맥경화의 주범이 되기도 하고 단백질, 핵산 등의 중요한 세포 물질을 공격하여 기능을 잃거나 이상하게 되어 세포에 손상을 주어 당뇨, 고혈압 등 성인병을 유발시킬 뿐만 아니라 노화 촉진 및 치매, 암 등의 심각한 질병을 일으키는 원인 중의 하나로 인식이 되고 있다.
사람을 포함한 동물들은 이러한 활성산소에 의한 독성을 방지하기 위하여 다양한 항산화 체계(예: 글루타치온 퍼록시다아제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 등)를 가지고 있다. 그러나 생체 내에 존재하는 항산화 체계에 의해 광범위하게 발생하는 활성산소에 의한 산화적 손상으로부터 세포를 완벽하게 보호하지 못하기 때문에, 이를 도울 수 있는 항산화 기능성 물질(예: 비타민 C 등)을 외부로부터 공급한다. 따라서 활성산소를 제거하거나 생성을 줄여 줄 수 있는 천연물 유래항산화제는 사람뿐만 아니라 가축 사육에 있어서 산화적 손상으로부터 보호해 줄 수 있을 것으로 판단된다. 특히, 천연물 유래의 항산화제는 가축의 면역 작용을 향상시켜 축산 동물 사육에서 항생제 대체 사육을 가능하게 할 수 있을 것으로 판단된다. 가축은 사육 환경, 가축 간 서열 정리 등의 생물적 환경에 의한 스트레스로 생산성과 번식률이 저하되며, 수송과 스트레스에 의해 면역능력이 저하되어 감염성 질병이나 설사 유발 등으로 생산성이 저하되는 것으로 보고되어 있다. 사료 또한 저장 및 유통되는 동안에 산화적 손상을 받을 수 있어, 영양학적으로 품질이 저하될 가능성이 존재한다. 특히, 이러한 산화적 손상에 민감한 영양소들로는 지방, 비타민 등으로 젖소의 경우, 우리나라와 같이 여름철 고온, 다습한 환경 조건하에서 받게 되는 고온 스트레스에 매우 취약해 사료 섭취량이 20-30% 정도 감소하고 이로 인하여 산유량이 약 20% 줄어들며, 스트레스에 의한 면역기능 저하로 유질이 떨어지며, 분만 전후 분만 스트레스에 의해 대사성 질병이 약 10% 정도 발생하여 농가에 경제적 손실이 막대한 것으로 알려져 있다.
돼지의 경우, 사육 밀집 스트레스 및 도살을 위한 이동으로 받는 수송 스트레스가 원인인 물퇘지 고기 발생으로 농가 소득에 손실을 주고 있다. 가금의 경우, 병아리 입추, 집단 및 케이지 사육에 의해 발생할 수 있는 환경 스트레스에 의한 생산성 저하를 가져올 수 있다. 이와 같이 가축 사육 시 발생하는 다양한 스트레스는 가축의 생산성에 많은 영향을 미치고 있는데 이를 최소화하기 위해 일부분 사육시설 개량에 의해 개선될 수 있지만 많은 비용이 소요되는 단점이 있다. 따라서, 가축 사육 시 발생할 수 있는 여러 가지 스트레스를 예방 할 수 있는 물질의 개발, 특히 항생제 대체할 성장촉진 물질 개발이 요구되며, 스트레스를 저감할 수 있는 물질을 개발하여 가축사양에 이용함으로서 다양한 스트레스 요인에 의한 가축 생산성 저하에 효율적으로 대처할 수 있는데 항산화제가 대체 물질 중의 하나로 인식되고 있다.
항산화제는 활성산소의 작용을 중화시키고 산소를 사용하는 생명체에서 산소로부터 생기는 활성산소에 의한 손상들을 차단 또는 억제하고 지연시키는 물질로 질병의 예방에 중한 역할을 하는 물질이다. 많은 기존의 항산화제는 활성산소를 해독하는 과정 중 산화되며 궁극적으로 이들을 재생하는 최종의 항산화제는 글루타치온으로 마스터 항산화제 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.
글루타치온(glutathione, GSH)은 글루탐산(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine) 세 가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드(L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine)이며, 티올기(-SH)를 가지고 있는 세포 내 수용성 항산화제 역할을 할 뿐만 아니라 여러 가지 항산화 효소들(예; 글루타치온 퍼록시다아제 등)의 보조인자 역할을 하는 중요한 물질이다(Kidd, P.M., Alt. Met. Rev. 1997, 2, 155-176). 글루타치온은 대부분의 생물에 존재하며, 사람의 경우 조직에 따라 차이가 있지만 세포 내에서 0.1-10 mM의 농도로 존재하며, 간에서 가장 많은 농도로 존재하며(10 mM 까지), 그 외, 비장, 신장 등에서도 많은 농도로 존재한다. 글루타치온의 항산화 활성은 이 물질이 가지고 있는 티올기의 강력한 전자 제공 능력 때문이며, 환원형(GSH) 및 산화형(GS-SG)으로 존재할 수 있으며, 환원형의 시스테인의 티올기가 전자를 제공하여 자신은 다른 환원형 글루타치온과 반응하여 산화형인 이황화 글루타치온(GS-SG)을 형성하면서 항산화 기능을 나타낸다(GSH + GSH GS-SG). 세포내에서 산화형 글루타치온은 GSH 환원효소에 의해 다시 환원형으로 재생되어 항산화 활성을 얻게 된다. 건강한 세포 및 조직에서는 총 글루타치온 풀(pool) 가운데 항산화 활성을 갖는 환원형 글루타치온이 약 90% 이상을 차지하고 산화형 글루타치온이 10% 미만으로 존재하는데 산화형 글루타치온과 환원형 글루타치온의 비가 증가하면 산화적 스트레스 상태가 높음을 의미한다.
자외선 및 방사선 조사와 같은 물리적 산화적 스트레스와 바이러스 감염, 환경 독성 물질 노출, 염증, 화상 등에 의해 글루타치온의 양은 급격하게 감소하게 된다(Cai 등. Progr. Retinal Eye Res. 2000, 19, 205-221; Look 등, Eur. J. Clin. Nutr. 1997, 51, 266-272). 글루타치온은 여러 효소들의 보조인자 역할을 하여 활성산소에 의한 독성을 제거한다. 예를 들면, 퍼록시다아제의 보조인자 역할을 하여 활성산소의 공격에 의해 생성된 생체분자의 과산화물을 해독하여 주고, 수소전달효소(transhydrogenase)의 보조인자 역할을 하여 활성산소와 반응하여 DNA, 단백질 및 다른 생체분자의 산화 상태를 감소시키며, 글루타치온 S-전이 효소의 보조인자 역할을 하여 세포 내에 존재하는 물질(예: 에스트로겐 등) 및 다양한 생체 이물질(xenobiotics) 등에 글루타치온을 결합시키는 반응을 진행하여 독성을 감소시키는 역할을 한다(Monks 등, Adv. Pharmacol. 1994, 27, 183-205; Mulder 등, Chem-Biol. Interact. 1997, 105, 17-34).
글루타치온은 생체 내에서 중요한 항산화 기능을 하는 물질로 보고되어 있어 산업적, 의약적으로 응용하려는 시도가 활발하게 진행되고 있다. 글루타치온은 동물, 식물을 포함하는 거의 모든 생물에서 존재하지만, 세포내에서 그 함량이 매우 낮아(0.1-10 mM) 산업적으로 응용하기에는 생산성 향상 등의 많은 문제점을 가지고 있다. Baker 효모 추출물에서 처음 발견된 이래로, 글루타치온을 생산하기 위한 방법으로 화학적 합성과 미생물을 이용한 발효 합성 등이 이용되고 있지만 주로 효모 등의 미생물로부터 생산되고 있다.
미생물을 이용한 생산 균주로 S. cerevisiae와 Candida utilis 등이 잘 알려져 있으며(Li 등, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 66, 233-242), 또한 Lactococcus lactis ssp.와 같은 유산균(Fernandes 등, J. Dairy Sci., 1993, 76, 1233-1242) 등으로부터 글루타치온이 생성되는 것으로 알려져 있다. 이 들 중, S. cerevisiae 및 C. utilis 등과 같은 효모로부터 발효법으로 글루타치온을 대량 생산하는 방법이 가장 많이 연구 및 이용되고 있다. 우리나라에서도 이미 1970년대 효모에서 글루타치온 생산 연구가 많이 진행되어 왔다(Cha 등, J. Microbiol. 2004, 42, 51-55; Cha 등, J. Microbiol. Life Sci. 2008, 18, 620-624). 효모를 이용한 글루타치온의 생산에는 탄소원으로서 포도당, 설탕, 당밀 및 에탄올 등을, 질소원으로 효모추출물, 펩톤 등의 유기질소원과 황산암모늄, 요소와 같은 무기질소원 뿐만 아니라 글루타치온 합성 전구체들(글루탐산, 시스테인, 글라이신)을 배지에 첨가하여 글루타치온을 생산하는 방법이 많이 활용되고 있다. 이러한 발효공학적 방법을 통하여 사용한 균주에 따라 차이가 있지만 배지 1 L 당 최대 약 500 mg의 글루타치온 생산이 보고되어 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 글루타치온을 고발현하는 산업 및 의약적으로 높은 유용성을 갖는 신규한 균주를 동정하고 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 글루타치온을 고발현하는 사카로마이세스 세레비지애 균주를 분리 동정하였고, 이 균주의 최적 배양 조건 및 글루타치온 대량 생산용 최적배양 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 글루타치온을 고발현하는 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주를 이용하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 글루타치온(glutathione)을 고발현하는 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01) 균주(KCTC 18262P)를 제공한다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01) 균주(KCTC 18262P)는 생막걸리에서 글루타치온을 고발현하는 균주를 분리하여 얻은 것이다.
본 발명의 균주는 형태학적, 생화학적 및 유전학적 특성을 조사하여 최종 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01) 균주로 동정하고, 2013년 11월 25일자로 한국생명공학연구원내 유전자은행에 기탁번호 KCTC 18262P로 기탁되어 있다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주의 특징은 글루타치온을 고발현 시킨다는데 있다.
글루타치온(L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH)은 세포내 존재하는 생리활성물질로서 글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine) 의 세 가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드로 동물, 식물 및 미생물의 세포내에서 0.1-10 mM의 농도로 존재하며, 세포의 총 비단백질성 활성성분의 90% 이상을 차지하고 있다. 이들의 다양한 기능은 농업 분야뿐만 아니라 효소학, 수송, 약물학, 치료, 독물학, 내분비학 및 미생물학을 포함하는 많은 의학분야에서 중요한 부분을 차지하고 있다.
생체 내에서 글루타치온은 백혈구 생성을 통한 면역 활성 증가를 야기함으로써 중요한 항바이러스제의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, GST(glutathione S-transferase)의 기질로 작용하여 생체에 해로운 비생체물질(xenobiotics)과 같은 독성물질과 결합되어 해독 작용에 중요한 역할을 한다. 이러한 작용들 중 세포내에서 중요한 항산화 기능을 하는 성분으로서 환원형 글루타치온(reduced glutathione)이 널리 알려져 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 글루타치온의 대량 생산 방법을 제공한다:
(a) 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01) 균주(KCTC 18262P)를 탄소원, 질소원 및 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물로부터 글루타치온을 회수하는 단계.
본 발명의 글루타치온 대량 생산 방법에서 이용되는 탄소원은 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 상기 탄소원은 총 배지에 대하여 0.1-10%(w/v)이고, 보다 바람직하게는 0.2-5%(w/v)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 탄소원은 포도당, 과당, 설탕 및 맥아당으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 이용되는 탄소원은 포도당 및 설탕이다.
본 발명에 따르면, 글루타치온 대량 생산 방법에서 이용되는 탄소원은 추가적으로 구연산 나트륨, 숙신산 나트륨 및 글리세린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 저분자 탄소원을 포함한다. 상기 저분자 탄소원은 총 배지에 대하여 0.02-5%(w/v)이며, 보다 바람직하게는 0.1-2%(w/v)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 이용되는 저분자 탄소원은 구연산 나트륨, 글리세린 또는 이의 조합이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 이용되는 저분자 탄소원은 구연산 나트륨이다.
본 발명의 글루타치온 대량 생산 방법에서 이용되는 질소원은 다양한 유기 질소원이 이용될 수 있으며, 상기 질소원은 총 배지에 대하여 0.1-5%(w/v)이며, 보다 바람직하게는 0.2-2.5%(w/v)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 이용되는 질소원은 트립톤(tryptone), 펩톤(peptone), 트립틱 소이 브로스(Tryptic soy broth), 소이펩톤(soypeptone) 및 효모 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 이용되는 질소원은 펩톤, 트립틱 소이 브로스, 소이펩톤 또는 이의 조합이다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 이용되는 질소원은 소이펩톤이다.
본 발명의 글루타치온 대량 생산 방법에서 이용되는 아미노산은 아르기닌, 아스파탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 메티오닌 및 발린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이며, 상기 아미노산은 총 배지에 대하여 0.01-2%(w/v)이며, 보다 바람직하게는 0.01-1%(w/v)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 이용되는 아미노산은 아르기닌, 라이신, 발린 또는 이의 조합이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 이용되는 아미노산은 라이신이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 글루타치온 대량 생산 방법에 이용되는 아미노산은 추가적으로 글루타치온 합성 전구체로서 시스테인, 글루탐산, 글라이신 또는 이의 조합을 포함하며, 상기 글루타치온 합성 전구체는 총 배지에 대하여 0.005-1%(w/v)이고, 보다 바람직하게는 0.01-0.5%(w/v)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 글루타치온 합성 전구체로서 이용되는 아미노산은 시스테인 및 글라이신의 조합이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 글루타치온 대량 생산 방법에 이용되는 배양 배지는 필수적으로 일인산 칼륨, 이인산 나트륨, MgSO4, FeSO4, ZnSO4 및 MnSO4를 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 균주 배양은 25-40℃ 배양 온도, 0.1-5.0 vvm 통기조건, 200-700 rpm 교반 조건에서 12-48시간 동안 실시한다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양 온도는 바람직하게는 25-40℃이고, 보다 바람직하게는 28-37℃이며, 보다 더 바람직하게는 32-35℃이다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양 중 공급되는 공기양은 0.1-5.0 vvm이고, 보다 바람직하게는 0.2-3.0 vvm이며, 보다 더 바람직하게는 0.5-1.5 vvm이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물 균주를 배양하고 배양액으로부터 글루타치온을 회수한다. 글루타치온은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 회수할 수 있다.
글루타치온은 세포 내 물질이므로 배양물 또는 균주로부터 글루타치온을 분리하기 전에 균주를 용균시키는 것이 좋다. 균주의 용균은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법 예를 들어, 용균용 완충용액, 소니케이터, 열 처리 및 후렌치 프레서 등에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주 또는 이의 배양물로부터 글루타치온을 분리하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함한 전통적인 방법에 의하여 분리할 수 있다. 더 나아가, 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, SDS-PAGE를 포함하여 일반에 공지된 다양한 방법을 통해서 분리 가능하다.
본 발명의 방법은 글루타치온을 고발현하는 신규한 균주를 이용하며, 상술한 바람직한 배양 조건 및 배지 조성을 따르는 경우에는 글루타치온을 저가로 대량 생산할 수 있다.
본 발명에 의해 생산된 글루타치온 및 글루타치온을 함유한 효모는 기능성 식품, 건강보조제, 보조영양제, 의약품을 비롯해 생체 건강을 위한 기능성 제제 등에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01) 균주(KCTC 18262P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 강력한 항산화 효과를 나타냄으로써 산화적 스트레스를 감소시켜 가축의 성장을 촉진시킨다.
본 발명의 사료 첨가제를 사료에 배합하여 첨가하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 사료 첨가제가 이용되는 사료에는 일반 볏짚, 야초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 글루타치온을 고발현하는 하는 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01) 균주(KCTC 18262P)를 제공한다.
(b) 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주를 이용하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
(c) 본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 우수한 항산화 효과를 나타내어 사료 첨가제, 건강 식품 첨가제 등 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 글루타치온 최적 생산용 배지를 이용하여 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주를 5 L 발효기로 액침 배양하였을 때, 배양시간에 따른 글루타치온 생산 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 글루타치온 최적 생산용 배지를 이용하여 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주를 50 L 발효기로 액침 배양하였을 때, 배양시간에 따른 글루타치온 생산 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주를 첨가한 사료에 의한 닭 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시 예 1: 글루타치온 정량
96웰 플레이트에 50 ㎕의 시료 용액 또는 글루타치온 표준 용액을 넣고 100 ㎕의 반응용액(5.75 ㎖의 반응 완충용액(100 mM 인산타트륨 완충용액,pH 7.5/1 mM EDTA), 0.1 ㎖의 GSH 환원효소(200 U/ml), 5 ㎖의 1 mM DTNB((5,5-dithio-bis 2-nitrobenzoic acid) 및 5 ㎖의 1 mM NADPH 혼합액, 사용하기 직전에 혼합하여 사용)을 가한 후 간단하게 혼합하여 준 후, 상온에서 20분간 방치한 후 반응액의 흡광도는 410 nm(Spectramax PLUS 384, Molecular Device사. 미국)에서 측정하였다. 이 때, 0-1 ㎍의 글루타치온을 이용하여 표준곡선을 구하였고 시료의 흡광도를 글루타치온 표준 곡선에 대입하여 시료의 글루타치온 양을 계산하였다.
실시예 2: 생막걸리로부터 글루타치온을 생산하는 균주의 분리
본 발명자들은 국내 생막걸리(전남 영암군 삼호읍 생막걸리)로부터 글루타치온을 생산하는 균주를 다음과 같이 분리하였다. 먼저 채취한 생막걸리 시료 1 ㎖을 10 ㎖의 멸균 증류수와 잘 혼합한 후, 상기 시료를 멸균 증류수로 103, 104 및 105 배 희석하고 각 희석 시료 0.1 ㎖을 취하여 YM 아가 평판 배지에 균일하게 자라도록 도말하고 35℃에서 하루 동안 배양하여 군락(colony)을 형성하였다.
군락의 크기가 2 ㎜이상 되는 군락을 선택한 후, 선택된 균주들을 3 ㎖의 YM 액체 배지를 포함하는 캡튜브에 접종하고 35℃에서 200 rpm으로 24시간 동안 진탕 배양한 후, 원심분리(12,000 rpm, 5분)하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포에 1 ㎖의 식염수를 가하여 현탁한 후 원심분리하여 세포를 잘 세척하였다. 다시, 회수한 세포에 1 ㎖의 1% SDS 용액을 가하여 잘 현탁한 후 각각 10개의 유리구슬(직경 2-3 mm)을 넣어주고 미니비드비터(Biospec Products사, 미국)로 분당 2,000 ocillations의 속도로 1시간 동안 처리하여 세포를 파쇄하였다.
파쇄한 세포를 원심분리(13,000 rpm, 10분)하여 상층액을 회수하고 상기 실시예 1 의 방법으로 글루타치온 양을 측정하였다. 그 결과, 글루타치온 함량이 가장 뛰어난 균주를 선별하였고, 선별한 균주를 동정하였다. 상기 균주의 18S 리보소말 RNA의 염기서열을 분석한 결과, 서열목록 제1서열에 기재된 염기서열의 18S 리보소말 RNA를 갖는 것으로 밝혀졌고, 상기 염기서열을 분석한 결과 본 발명의 균주는 사카로마이세스 속 균주임을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 상기에서 선별한 균주를 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01)로 명명하고, 이를 2013년 11월 25일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 18262P).
실시예 3: 유기 질소원이 글루타치온 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온 생산에 미치는 유기 질소원의 영향을 조사하였다. 상기의 균주를 YM 배지에 접종하여 35℃에서 24시간동안 진탕 배양한 배양액을 시드 배양액으로 사용하였다. 사용한 기본 배양배지 조성은 표 1에 나타내었다.
효모 BB-01에서 글루타치온 생산을 위한 기본 배양배지 조성
성분 조성
일인산 칼륨 0.2%
이인산 나트륨 0.2%
효모 추출물 0.5%
포도당 1.0%
MgSO4 0.01%
FeSO4 0.01%
ZnSO4 0.001%
MnSO4 0.001%
상기의 기본 배양배지에 옥수수 침지물(Corn steep liquor), 대두박, 펩톤 등의 유기 질소원을 0.5% 농도로 포함된 배지를 제조하여 사용하였으며, 500 ㎖의 배플 플라스크(baffled flask)에 100 ㎖ 배지를 포함하도록 하여 배양하였다. 상기의 배양배지에, 24 시간 동안 배양한 시드 배양액을 최종 농도가 1% 되게 접종한 후, 35℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
상기 균주를 원심분리(12,000 rpm, 5분)하여 세포를 회수하고 상기의 실시예 2와 동일한 방법으로 글루타치온 양을 측정하였다. 그 결과, 유기 질소원이 첨가된 경우 트립톤, 펩톤, 트립틱 소이브로스 및 소이펩톤 첨가에 의하여 글루타치온 생산이 증가하였지만 옥수수 침지물, 대두박, 카제인 및 젤라틴을 첨가하였을 때 글루타치온의 생산이 감소하였다. 특히, 소이펩톤을 첨가하였을 때 글루타치온의 생산이 약 65% 증가하였으며 트립톤, 펩톤 및 트립틱 소이브로스를 첨가하였을 때 각각 27, 51 및 43% 정도 증가함을 알 수 있었다. 특히, 소이펩톤(0.5%)을 첨가하였을 때 배지 1 L 당 약 81 mg의 글루타치온이 생산되었다(표 2).
상기 결과로부터 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온의 최적 생산에는 트립톤, 펩톤, 트립틱 소이브로스, 소이펩톤 또는 효모추출물 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 특히 소이펩톤 또는 효모추출물을 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 그 사용 범위는 0.2-5% 에서 사용하는 것이 바람직하다.
유기 질소원이 효모 BB-01에서 글루타치온 생산에 미치는 영향
유기 질소원(0.5%) GSH(mg/L 배지) 증가량(%)
대조군 49.0 100.0
트립톤(tryptone) 62.3 127.1
펩톤(peptone) 74.5 151.9
옥수수 침지물(Corn steep liquid) 36.9 75.2
트립틱 소이 브로스(Tryptic soy broth) 70.0 142.8
대두박(Soybean meal) 26.9 54.9
카제인(Casein) 31.3 63.9
젤라틴(Gelatin) 24.7 50.4
소이펩톤(Soypeptone) 81.1 165.4
실시예 4: 탄소원이 글루타치온 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온 생산에 미치는 탄소원의 영향을 조사하였다. 소이펩톤(0.5%) 을 포함하는 표 1의 기본 배지(포도당을 제외)에 포도당, 과당 및 말토스 등과 같은 탄소원을 1% 되게 첨가한 배지를 사용하였으며, 500 ㎖의 배플 플라스크에 100 ㎖ 배지를 포함하도록 하여 배양하였다. 상기의 배양배지에, 시드 배양액을 최종 농도가 1% 되게 접종한 후, 35℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
상기 균주를 원심분리(12,000 rpm, 5분)하여 세포를 회수하고 상기의 실시예 2와 동일한 방법으로 글루타치온 양을 측정하였다. 그 결과, 탄소원이 첨가된 경우 과당, 포도당, 맥아당 및 설탕을 1% 이상의 농도로 첨가하였을 때 글루타치온 생산이 증가하였지만 당밀, 칼락토스, 유당 및 전분을 첨가하였을 때 글루타치온 생산이 감소하였다. 특히, 포도당(2%), 설탕(1.5%) 및 맥아당(2%)을 첨가하였을 때 글루타치온의 생산양이 각각 30, 22 및 34% 증가함을 알 수 있었으며 설탕을 1.5%로 첨가하였을 때 배지 1 L 당 약 134 mg의 글루타치온이 생산되었다(표 3). 상기 결과로부터 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온의 최적 생산에는 포도당, 설탕 또는 맥아당 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 그 사용 범위는 0.2-10% 범위에서 사용하는 것이 바람직하며, 0.2-5% 범위에서 사용하는 것이 더 바람직하다.
탄소원이 효모 BB-01에서 글루타치온 생산에 미치는 영향
탄소원 GSH(mg/L 배지) 증가량(%)
포도당 0.5% 6.4 89.3
1.0% 85.5 100.0
1.5% 102.5 119.8
2.0% 110.7 129.5
2.5% 102.2 119.5
맥아당 0.5% 78.5 91.7
1.0% 96.7 113.1
1.5% 101.2 118.4
2.0% 104.1 121.7
2.5% 99.5 116.3
설탕 0.5% 85.9 100.4
1.0% 96.1 112.4
1.5% 114.7 134.1
2.0% 106.8 124.8
2.5% 102.8 120.2
과당 1.0% 88.5 103.5
갈락토오스 1.0% 59.7 69.7
유당 1.0% 66.3 77.5
감자 전분 1.0% 56.2 65.7
밀가루 1.0% 67.3 78.7
당밀 1.0% 46.2 54.0
실시예 5: 저분자량의 탄소원이 글루타치온 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온 생산에 글리세린, 구연산나트륨 및 초산나트륨과 같은 저분자량을 갖는 탄소원의 영향을 조사하였다. 소이펩톤(0.5%), 포도당(2%) 및 설탕(1.5%)을 포함하는 표 1의 기본 배지에 글리세린 및 구연산 나트륨 등과 같은 저분자량의 탄소원을 0.5% 되도록 첨가한 배지를 사용하였으며, 500 ㎖의 배플 플라스크에 100 ㎖ 배지를 포함하도록 하여 배양하였다. 상기의 배양배지에 시드 배양액을 최종 농도가 1% 되도록 접종한 후, 35℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
상기 균주를 원심분리(12,000 rpm, 5분)하여 세포를 회수하고 상기의 실시예 2와 동일한 방법으로 글루타치온 양을 측정하였다. 그 결과, 저분자량을 갖는 탄소원이 첨가된 경우 구연산나트륨, 숙신산나트륨, 초산나트륨 및 글리세린을 0.5%로 첨가하였을 때 글루타치온 생산이 증가하였지만 젖산나트륨 및 프로피온산나트륨을 첨가하였을 때 글루타치온 생산이 감소하였다. 특히, 구연산나트륨(0.5%) 및 글리세린(0.5%)을 첨가하였을 때 글루타치온의 생산양이 각각 약 35 및 26% 증가함을 알 수 있었으며 구연산나트륨을 0.5%로 첨가하였을 때 배지 1 L 당 약 190 mg의 글루타치온이 생산되었다(표 4). 상기 결과로부터 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온의 최적 생산에는 구연산나트륨, 숙신산나트륨 또는 글리세린 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 그 사용 범위는 0.1-10% 범위에서 사용하는 것이 바람직하며, 0.2-5% 범위에서 사용하는 것이 더 바람직하다.
저 분자량 탄소원이 효모 BB-01 에서 글루타치온 생산에 미치는 영향
저 분자량 탄소원(0.5%) GSH(mg/L 배지) 증가량(%)
무첨가 140.6 100.0
구연산나트륨 189.6 134.8
숙신산나트륨 143.9 102.4
초산나트륨 142.4 101.3
젖산나트륨 133.0 94.6
프로피온산나트륨 95.0 67.6
글리세린 177.9 125.9
실시예 6: 아미노산이 글루타치온 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온을 생산할 때 아미노산의 영향을 조사하였다. 소이펩톤(0.5%), 포도당(2%), 설탕(1.5%) 및 구연산나트륨(0.5%)을 포함하는 표 1의 기본 배지에 여러 가지 아미노산을 0.01-0.5% 되도록 첨가한 배지를 사용하였으며, 500 ㎖의 배플 플라스크에 100 ㎖ 배지를 포함하도록 하여 배양하였다. 상기의 배양배지에, 24 시간 동안 배양한 시드 배양액을 최종 농도가 1% 되게 접종한 후, 35℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
상기 균주를 원심분리(12,000 rpm, 5분)하여 세포를 회수하고 상기의 실시예 2와 동일한 방법으로 글루타치온 양을 측정하였다. 그 결과, 아르기닌, 아스파탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 메티오닌 및 발린, 시스테인 및 글라이신 첨가에 의하여 글루타치온 생산이 증가하였으며 다른 아미노산의 첨가는 글루타치온 생산에 큰 영향을 주지 않았다. 특히, 아르기닌(0.1%), 라이신(0.1%), 발린(0.1%), 글라이신(0.5%) 및 시스테인(0.2%)을 첨가하였을 때 글루타치온 생산이 각각 15, 19, 13, 9 및 22% 증가함을 알 수 있었다. 특히, 시스테인을 0.01, 0.02, 0.05 및 0.2% 농도로 첨가하였을 때 글루타치온 생산이 각각 약 28, 42, 27 및 22% 증가하였지만 0.5%로 첨가하였을 때 글루타치온 생산이 오히려 감소함을 알 수 있었으며, 시스테인을 0.02%로 첨가하였을 때, 배지 1 L 당 약 240 mg의 글루타치온이 생산되었다(표 5). 상기 결과로부터 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온 최적 생산에는 아르기닌, 라이신, 발린, 글라이신 또는 시스테인 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 그 사용 범위는 0.01-1% 에서 사용하는 것이 바람직하다.
아미노산이 효모 BB-01에서 글루타치온 생산에 미치는 영향
아미노산 GSH(mg/L 배지) 증가량(%)
대조군 - 188.4 100.0
알라닌 0.1% 185.1 98.2
아르기닌 0.1% 216.0 114.7
아스파라긴 0.1% 189.5 100.6
아스파탐산 0.1% 191.7 101.8
글루타민 0.1% 195.0 103.5
히스티딘 0.1% 196.1 104.1
이소루이신 0.1% 189.5 100.6
루이신 0.1% 188.4 100.0
라이신 0.1% 223.8 118.8
메티오닌 0.1% 190.6 101.2
페닐알라닌 0.1% 176.7 93.8
프롤린 0.1% 186.3 98.9
세린 0.1% 181.7 96.5
트레오닌 0.1% 182.8 97.1
트립토판 0.1% 187.3 99.4
티로신 0.1% 186.2 98.8
발린 0.1% 212.7 112.9
시스테인 0.01% 241.5 128.2
0.02% 268.0 142.3
0.05% 240.3 127.6
0.2% 230.4 122.3
0.5% 176.2 93.5
글루탐산 0.01% 177.3 94.1
0.05% 184.5 97.9
0.2% 186.3 98.9
0.5% 179.3 95.2
글라이신 0.01% 186.2 98.8
0.05% 187.3 99.4
0.2% 199.4 105.9
0.5% 205.5 109.1
실시예 7: 글루타치온 합성 전구체가 글루타치온 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온 생산에 글루타치온 합성 전구체(글라이신, 글루탐산 및 시스테인)의 영향을 조사하였다. 소이펩톤(0.5%), 포도당(2%), 설탕(1.5%), 구연산나트륨(0.5%), 라이신(0.1%) 및 시스테인(0.2%)을 포함하는 표 1의 기본배지에 글라이신 및 글루탐산 을 0.01~0.5% 되게 첨가한 배지를 사용하였으며, 500 ㎖의 배플 플라스크에 100 ㎖ 배지를 포함하도록 하여 배양하였다. 배양배지에, 시드 배양액을 최종 농도가 1% 되게 접종한 후, 35℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
상기 균주를 원심분리(12,000 rpm, 5분)하여 세포를 회수하고 상기의 실시예 2와 동일한 방법으로 글루타치온 양을 측정하였다. 그 결과, 시스테인(0.02%)에 나머지 글루타치온 합성 전구체인 글라이신 및 글루탐산의 복합 첨가에 의해서 글루타치온 생산에 큰 영향을 주지 않았지만, 0.02% 시스테인 및 0.5% 글라이신 복합 첨가에 의하여 글루타치온의 생산이 약 9% 증가 하였으며, 이 배양 배지를 사용하여 배양하였을 때 배지 1 L 당 약 348 mg의 글루타치온이 생산되었다(표 6). 상기 결과로부터 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온의 최적 생산에 글루타치온 합성 전구체인 글라이신 또는 시스테인 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 그 사용 범위는 0.01-1% 에서 사용하는 것이 바람직하다.
글루타치온 합성 전구체가 효모 BB-01에서 글루타치온 생산에 미치는 영향
전구체 GSH(mg/L 배지) 증가량(%)
시스테인(0.02%) 317.8 100.0
시스테인(0.02%)/글라이신(0.2%) 335.3 105.5
시스테인(0.02%)/글루탐산(0.2% 313.9 98.8
시스테인(0.02%)글루탐산(0.2%)/글라이신(0.2%) 323.3 101.7
시스테인(0.02%)/글라이신(0.5%) 347.9 109.5
시스테인(0.02%)/글루탐산(0.5%) 321.5 101.2
시스테인(0.02%)/글루탐산(0.5%)/글라이신(0.5%) 323.1 101.7
상기 실시예 3에서 실시예 7까지 결과를 종합하였을 때 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온의 최적 생산에 필요한 배지 조성은 하기의 표 7에 표시하였다.
효모 BB-01 에서 글루타치온 생산을 위한 기본 배양 배지 조성
성분 조성 성분 조성
일인산 칼륨 0.2% MgSO4 0.01%
이인산 나트륨 0.2% FeSO4 0.01%
효모 추출물 0.5% ZnSO4 0.001%
소이펩톤 0.5% MnSO4 0.001%
포도당 2.0% 라이신 0.1%
설탕 1.5% 시스테인 0.02%
구연산나트륨 0.5% 글라이신 0.5%
실시예 8: 배양 온도가 글루타치온 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온 생산 시 배양 온도의 영향을 조사하였다. 구체적으로, 상기 표 7의 글루타치온 생산 최적 배양배지를 사용하였으며, 500 ㎖의 배플 플라스크에 100 ㎖ 배지를 포함하도록 하여 배양하였다. 상기의 배양배지에, 시드 배양액을 최종 농도가 1% 되게 접종한 후, 25~40℃ 범위에서 24시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
상기 균주를 원심분리(12,000 rpm, 5분)하여 세포를 회수하고 상기의 실시예 2와 동일한 방법으로 글루타치온 양을 측정하였다. 그 결과, 28, 30, 32, 35 및 37℃에서 최적 생산배지를 이용하여 배양하였을 때, 배지 1 L 당 각각 299, 341, 382, 373 및 303 mg의 글루타치온이 생산되어(표 8), 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온을 생산할 때 배양 온도는 28-37℃에서 배양하는 것이 바람직하다.
배양 온도가 글루타치온 생산에 미치는 영향
온도(℃) GSH(mg/L 배지)
25 248.6
28 299.0
30 341.0
32 381.9
35 373.6
37 363.1
70 233.9
실시예 9: 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온 생산1(5 L 발효기)
본 발명자들은 상기 표 7의 글루타치온 생산 최적 배양 배지의 조성으로 배지를 제조하였다. 발효기는 5 L 발효조(코바이오텍 사, 한국)를 사용하였으며, 배지는 3 L를 제조하여 사용하였으며, 시드 배양액을 최종 농도가 1% 되게 접종한 후, 48 시간 동안 배양하였다. 이 때, 공기의 공급 속도는 1 vvm, 교반 속도는 500 rpm, 배양온도는 32℃ 이었으며 거품 생성을 최소화하기 위하여 Antifoam-A(Sigma 사, 미국)를 사용하였다.
각 시간 대 별로 일정한 양의 배양액을 회수하고 상기의 배양액을 원심분리(12,000 rpm, 5분)하여 세포를 회수하고 실시예 2와 동일한 방법으로 글루타치온 양을 측정하였다. 그 결과, 상기와 같은 조건으로 배양한 사카로마이세스 세레비지애 BB-01는 36 시간 동안 배양할 때까지 글루타치온 생산이 증가하였으며, 그 후 글루타치온 생산은 감소하기 시작하였다. 20, 24, 28, 32 및 36 시간 배양하였을 때, 배지 1 L 당 각각 377, 434, 457, 501 및 566 mg의 글루타치온이 생산되었으며, 36 시간 이상 배양하였을 때, 글루타치온이 생산이 감소하여 40 및 48 시간 배양하였을 때, 배지 1 L 당 각각 427 및 326 mg의 글루타치온이 생산되었다(도 1), 상기의 결과로부터 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주에서 글루타치온의 최적 배양 시간은 24-36시간 동안 배양하는 것이 바람직하다.
실시예 10: 사카로마이세스 세레비지애 BB-01에서 글루타치온 생산2(50 L 발효기)
본 발명자들은 상기 표 7의 글루타치온 생산 최적 배양배지의 조성으로 배지를 제조하였다. 발효기는 50 L 발효조(코바이오텍 사, 한국)를 사용하였으며, 배지는 30 L를 제조하여 사용하였으며, 시드 배양액을 최종 농도가 1% 되게 접종한 후, 40시간 동안 배양하였다. 이 때, 공기의 공급 속도는 1 vvm, 교반 속도는 250 rpm, 배양온도는 32℃ 이었으며 거품 생성을 최소화하기 위하여 Antifoam-A(Sigma 사, 미국)를 사용하였다.
각 시간 대 별로 일정한 양의 배양액을 회수하고 상기의 배양액을 원심분리(12,000 rpm, 5분)하여 세포를 회수하고 실시예 2와 동일한 방법으로 글루타치온 양을 측정하였다. 그 결과, 상기와 같은 조건으로 배양한 사카로마이세스 세레비지애 BB-01은 36시간 배양할 때까지 글루타치온의 생산이 증가하였으며, 그 후 글루타치온 생산은 감소하기 시작하여, 5 L 발효기를 사용하였을 때와 유사한 글루타치온 생산 패턴을 나타내었다. 24, 28, 32 및 36 시간 배양하였을 때, 배지 1 L 당 각각 416, 453, 571 및 545 mg의 글루타치온이 생산되었으며, 36 시간 이상 배양하였을 때, 글루타치온이 생산이 감소하여 40 시간 배양하였을 때, 배지 1 L 당 각각 436 mg의 글루타치온이 생산되었다(도 2). 상기의 결과로부터 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주에서 글루타치온의 최적 배양 시간은 24~36시간 동안 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 생산한 글루타치온을 함유한 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 효모의 생균수를 측정하였다. 먼저 배양한 효모 배양액을 멸균 증류수로 105, 106 및 107 배 희석하고 각 희석 시료 0.1 ㎖을 취하여 YM 아가 평판 배지에 균일하게 자라도록 도말하고 35℃에서 24시간 동안 배양하여 군락을 형성하고, 생성된 군락의 수를 측정한 결과 배지 1 ㎖ 당 2 X 109 개 이상으로 측정되었다.
실시예 11: 닭 사료 첨가제로서의 기능
본 발명자들은 상기 실시예 10에서 회수한 글루타치온을 함유한 사카로마이세스 세레비지애 BB-01을 이용하여 닭 성장에 미치는 효능을 측정하였다. 미강 150 ㎏, 말분 150 ㎏, 당밀 5 L, 상기 효모 배양액 30 L(약 15 g의 글루타치온 함유)를 잘 혼합하고 30℃에서 하루 동안 방치 후, 37℃에서 수분 함량이 10% 이하가 되도록 잘 건조하여 닭 사료를 제조하였다. 닭은 비교적 체중이 균일한 개체를 25,600 및 28,500 수를 사용하여 각각 대조군과 시험군으로 하였으며, 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하여 약 30일 간 사육하였다. 또한, 사료의 급여량 및 체중을 측정하여, 생존율, 일당 증체량, 수당 체중 및 사료 효율 등을 계산하였다.
사카로마이세스 세레비지애 BB-01가 생산한 글루타치온을 투여한 닭의 성장에 미치는 효능을 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(사료 1 ㎏ 당 약 50 ㎎의 글루타치온 함유하도록 설계)를 첨가한 사료를 30일 동안 섭취한 닭의 시험구의 육성율은 98.9%로 대조구(98.0%) 보다 높은 생존율을 나타내었고 일당 증체량은 48.6 g으로 대조구(46.9 g)보다 높은 일당 증체량을 나타남을 확인하였다. 또한, 닭은 사육 기간(30일)동안 평균 수당 체중은 1.66 ㎏으로 대조구(1.55 ㎏)보다 높은 체중을 나타내었으며, 사료 효율(1.53) 에서 대조군(1.64)에 비해 높은 성장 개선 효율을 나타남을 확인하였다(도 3). 상기의 결과로부터 글루타치온을 함유한 사카로마이세스 세레비지애 BB-01을 첨가하여 제조한 사료를 급여한 닭을 이용한 생물학적 효능 시험에서 글루타치온을 함유한 사카로마이세스 세레비지애 BB-01의 첨가가 생존율, 성장 촉진 및 사료 효율 개선에 효과가 있음을 알 수 있으며, 이는 효모가 생산하는 글루타치온의 강력한 항산화 기능을 하기 때문에 글루타치온이 급여된 가축의 경우 산화적 스트레스 감소를 통하여 성장 촉진에 좋은 효과가 있음을 생물학적 현장 시험을 통하여 입증한 것이다. 따라서, 사카로마이세스 세레비지애 BB-01 균주가 생산하는 글루타치온은 닭의 성장 촉진용 사료 첨가제로 유용함을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18262P 20131125
<110> Green EN Feed Co., Ltd. <120> Novel Yeast Overproducing Glutathione and Method for Glutathione Overproduction by Using it <130> PN130739 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 821 <212> RNA <213> S. cerevisiae BB-01 <400> 1 tgggcattgg atttatattt tgaaatggat tttttttgtt ttggcaagag catgagagct 60 tttactgggc aagaagacaa gagatggaga gtccagccgg gcctgcgctt aagtgcgcgg 120 tcttgctagg cttgtaagtt tctttcttgc tattccaaac ggtgagagat ttctgtgctt 180 ttgttatagg acaattaaaa ccgtttcaat acaacacact gtggagtttt catatctttg 240 caactttttc tttgggcatt cgagcaatcg gggcccagag gtaacaaaca caaacaattt 300 tatttattca ttaaattttt gtcaaaaaca agaattttcg taactggaaa ttttaaaata 360 ttaaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg 420 cgatacgtaa tgtgaattgc agaattccgt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg 480 ccccttggta ttccaggggg catgcctgtt tgagcgtcat ttccttctca aacattctgt 540 ttggtagtga gtgatactct ttggagttaa cttgaaattg ctggcctttt cattggatgt 600 ttttttttcc aaagagaggt ttctctgcgt gcttgaggta taatgcaagt acggtcgttt 660 taggttttac caactgcggc taatcttttt tatactgagc gtattggaac gttatcgata 720 agaagagagc gtctaggcga acaatgttct taaagtttga cctcaaatca ggtaggagta 780 cccgctgaac ttaagcatat caataaaccg gaggaaaagg a 821

Claims (10)

  1. 글루타치온(glutathione)을 고발현하는 하는 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01) 균주(KCTC 18262P).
  2. 다음의 단계를 포함하는 글루타치온의 대량 생산 방법:
    (a) 상기 제 1 항의 미생물 균주를 탄소원, 질소원 및 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 결과물로부터 글루타치온을 회수하는 단계.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 질소원은 트립톤(tryptone), 펩톤(peptone), 트립틱 소이 브로스(Tryptic soy broth), 소이펩톤(soypeptone) 및 효모 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 탄소원은 포도당, 과당, 설탕 및 맥아당으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 탄소원은 추가적으로 구연산 나트륨, 숙신산 나트륨 및 글리세린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 저분자 탄소원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 아미노산은 아르기닌, 아스파탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 메티오닌 및 발린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 아미노산은 글루타치온 합성 전구체로서 시스테인, 글루탐산, 글라이신 또는 이의 조합을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 2 항에 있어서, 상기 배양은 25-40℃ 배양온도, 0.1-5.0 vvm 통기조건 및 200-700 rpm 교반 조건으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 사카로마이세스 세레비지애 BB-01(S. cerevisiae BB-01) 균주(KCTC 18262P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 사료 첨가제는 가축의 성장을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 첨가제.
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