KR101981935B1 - 클라미도모나스 변이주 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개선된 지아잔틴 색소 생산능을 갖는 새로운 조류에 관한 것으로, 본 발명의 변이주를 이용하면 잔토필 색소 중에서도 지아잔틴만을 손 쉽게 생산할 수 있고, 특히, 잔토필 색소 중에서 루테인과 지아잔틴 색소를 분리하는 단계를 요구하지 않으므로, 산업 수준에서 효율적으로 색소를 생산할 수 있어, 이를 포함하는 식품, 건강기능식품 및 의약품의 원료로 적용이 가능하다. 특히, 지아잔틴은 산화적 스트레스에 의해 생성되는 항산화 색소로서 자연계에서 적은 함량으로 존재하기 때문에 그동안 중요도에 비해 활용이 어려웠던 만큼 본 발명의 변이주는 미세조류를 이용한 지아잔틴을 생산하는 산업적인 측면에서 큰 경제 효과를 갖는다.

Description

클라미도모나스 변이주 및 이의 제조방법{CHLAMYDOMONAS MUTANTS AND PREPARING METHOD THEREOF}

본 발명은 지아잔틴 생산능을 갖는 조류, 상기 조류의 생산 방법, 그리고 상기 조류의 용도에 관한 것이다.

황반변성이란 눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직인 황반에 변성이 일어나 시력장애를 일으키는 질환으로, 시세포의 대부분이 황반에 모여있고 물체의 상이 맺히는 곳도 황반의 중심이므로 황반은 시력에 대단히 중요한 역할을 담당하고 있다. 황반변성을 일으키는 가장 많은 원인은 연령증가(연령관련 황반변성)를 들 수 있고, 가족력, 인종, 흡연과 관련이 있다고 알려져 있다.

황반변성은 크게 비삼출성(건성)과 삼출성(습성)으로 구분하게 되는데, 80-90% 정도가 비삼출성 황반변성에 해당한다. 비삼출성 황반변성은 서서히 진행되고 증상이 급격히 나빠지는 상황은 거의 일어나지 않으나 특별한 치료제가 없어, 건강식품 등을 통해서 증상을 완화하고 더 이상 나빠지지 않게 하는데 큰 도움을 받을 수 있다. 삼출성 황반변성은 상당히 위급하게 진행되므로, 시력보존을 위한 적극적인 치료가 필요하다. 변성이 일어난 부위의 경계를 명확히 알 수 있는 경우 열레이저광응고술, 광역학 치료, 항체주사, 유리체절제술 등을 시행할 수 있으나, 현재 황반변성을 완벽히 치료할 수 있는 방법 또는 치료제는 존재하지 않는다.

열레이저응고술의 경우 장기적인 시력저하 예방에는 효과가 있으나, 레이저치료 후 즉시 망막을 손상시켜 시력이 감소되는 문제점이 있고, 이러한 문제점을 보완하기 위해 약물과 레이저를 함께 사용하는 광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)가 개발되어 신생혈관성 병변을 안정화시키는데 도움이 되기는 하나, 치료의 적응에 제한이 있고, 치료약이 비싸 재치료를 필요로하는 경우가 많은 단점이 여전히 존재한다. 최근 신생혈관 생성 촉진 인자인 혈관내피세포 성장인자(VEGF)를 억제하여 신생혈관의 생성 및 삼출물의 누출을 차단하는 혈관내피세포 성장인자 억제 항체들이 임상시험에서 삼출성 황반변성 환자에서 시력의 유지 및 개선에 좋은 결과를 보였으나, 비용이 매우 비싸고, 반복 주사가 필요하며, 감염, 안압 상승 등의 부작용이 발생할 가능성이 높고, 결절맥락막 혈관병증의 30% 정도는 효과가 없다는 문제가 여전히 존재한다.

이러한 황반변성은 황반색소의 꾸준한 섭취 등을 통해서 예방 또는 그 진행을 늦출 수 있는데, 황반색소는 망막의 중앙부분에서 기인한 노인성 시력 감퇴를 줄여주고, 밝은 광선에 의한 망막조직의 손상을 막아주는 역할을 한다. 대표적인 예로 카로티노이드의 산소화에 의해 생산되는 카로티노이드계의 옥시카로티노이드 색소로 잔토필(크산토필, xanthophyll)로, 잔토필류에 속하는 색소로는 루테인(lutein) 또는 지아잔틴(zeaxanthin) 등이 있다.

동물은 잔토필을 생성할 수 없고, 음식의 섭취를 통해서만 얻을 수 있는데, 종래에는 마리골드와 같은 고등 식물로부터 추출하였으나, 그 효율이 낮고, 특히 고등식물의 경우 생산을 위한 토지 면적에 비해서 생산량이 많지 않아 생산 단가가 높은 문제가 있다. 또한, 루테인은 마리골드를 포함한 대다수의 녹색 잎채소에 풍부하지만 지아잔틴은 산화적 스트레스에 의해 생성되는 색소이므로 이들의 함량은 루테인과 비교시 훨씬 적어서 지아잔틴의 원료로 녹색 식물을 사용하기가 어렵다. 녹색 식물 시스템을 대체하기 위해 박테리아 시스템이 고안되었으나, 박테리아에서 얻어지는 색소는 궁극적으로 식품첨가물로 이용되기에는 부적합하고, 박테리아의 배양액 이나 바이오리액터 역시 유지비가 매우 비싸다는 문제가 있다.

이에 대한 해결책으로 미세조류가 이산화탄소를 바이오 연료, 산화 방지제, 지방산 및 카로티노이드와 같은 고 부가가치 제품으로 전환시키는 광합성 세포 공장으로 주목 받고 있는다. 미세조류는 다른 원천보다 더 많은 카로티노이드 함량을 가지며, 성장률 및 생산성이 높고, 경작지의 제한이 없고, 수확 주기가 짧아 카르티노이드 색소를 생산하는데 매우 적합한 장점이 있으나, 색소 간의 분리에 어려움이 있어, 특정 색소를 선택적으로 생산하기 위한 연구가 아직 필요한 상황이다.

특히, 이러한 장점에도 불구하고, 개량되지 않은 야생형 미세조류는 녹색식물과 같이 일반적으로 루테인이 풍부하지만 지아잔틴의 함량은 낮고, 배양 조건 만으로 지아잔틴을 선택적으로 생산할 수 없어, 야생형 미세조류는 여전히 지아잔틴 색소 생산에는 적합하지 않다. 따라서, 미세조류를 이용한 지아잔틴의 산업적 생산을 위한 새로운 측면에서의 접근이 필요하다.

국내 특허 출원 제2014-7007656호

본 발명의 목적은 지아잔틴의 효과적인 생산을 위한 방법 및 이를 통한 지아잔틴을 제공하기 위한 것으로, 구체적으로 효율적이고 개선된 지아잔틴 생산을 위해 우수한 지아잔틴 생성능을 갖는 미세조류 및 이의 용도를 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 유전적 재조합 방법이 아닌 다른 변이를 이용하여 야생형 또는 종래 존재하던 미세조류로부터 생물학적 특성이 개선된 변이주를 개발하고, 이를 이용한 최적의 지아잔틴 생산 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 특히, 본 발명의 변이주는 잔토필 색소 중에서 현저히 개선된 지아잔틴 생성능을 가지면서, 루테인은 생성하지 않아 조류의 배양 후 색소를 추출 및 분리하는 과정에서 지아잔틴만을 손쉽게 얻을 수 있다는 장점이 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이; 및 서열번호 2로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 LCYE 유전자 서열에서 599번째 염기와 600번째 염기 사이에 서열번호 9로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열이 삽입된 LCYE 유전자 변이를 포함하는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 변이주를 제공한다.

상기 변이주는 지아잔틴(zeaxanthin) 생성능을 가지면서, 루테인(lutein)을 생산하지 않는 것 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 변이주의 배양물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 색소 조성물을 제공한다. 상기 색소는 지아잔틴(zeaxanthin)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 눈의 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 또는 식품첨가제용 조성물 을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 사료 또는 사료첨가제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 주사제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 변이주를 배양하는 것을 포함하는 색소 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이주를 배양하는 것;을 포함하는 식품 또는 사료의 원료 생산방법을 제공한다.

본 발명을 통해 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이에서 외부 DNA의 도입이 없는 ZEP 유전자와 LCYE 유전자를 동시에 녹아웃 시킬 수 있는 변이 위치를 밝히고, 이에 따라 동시 녹아웃을 포함하는 새로운 변이주를 개발하였다. 상기 부위의 변이를 포함하는 변이주의 세포 특성을 확인한 결과 산업적으로 유용한 색소인 지아잔틴 생산량의 현저한 증가와 동시에 루테인을 생산하지 않는 특성을 보유하고 있어, 지아잔틴과 루테인을 분리/정제하는 단계를 거치지 않고도, 상업적 규모에서 효율적으로 지아잔틴을 생산할 수 있음을 확인하여, 미세조류를 이용한 지아잔틴의 산업적인 생산 측면에서 큰 경제효과를 낼 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 ZEP 및 LCYE 유전자 교정된 클라미도모나스 변이주의 제작 방법에 대한 전반적인 기술을 나타낸다.
도 2a, 2b 및 2c는 각각 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1의 ZEP 유전자 정보(2a), 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ2의 ZEP 유전자 정보(2b) 및 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ3의 ZEP 유전자 정보(2c)를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 DNA-free RGEN RNPs에 의해 유도된 ZEP 유전자의 돌연변이를 나타낸 것이다[3a: 각 sgRNA에 대한 RGEN-트랜스펙션된 세포 및 야생형의 돌연변이 (삽입 및 결실; indel) 빈도가 표적화된 심층 서열화(Targeted deep sequencing)에 의해 측정되었다. Indel 빈도는 약 0.46%까지 측정되었다. 3b: a의 표적화된 심층 서열화(Targeted deep sequencing) 분석 결과에서 관찰된 가장 효율이 높은 세 번째 sgRNA로부터 얻어진 대표적인 돌연변이체 DNA 서열(RGEN3), 즉 TCCGGCGAACGCACCTGGATGGG. 표적화된 심층 서열화(Targeted deep sequencing) 분석 결과에 의해 타겟 서열에서 확인된 다양한 indel 패턴, PAM 서열의 3nt 상류에서 나타났다. 20-bp 표적 서열은 밑줄로 표시되고 PAM 서열은 굵게 표시하였다.]
도 4는 DNA-free RGEN RNPs에 의해 발생된 세 개의 ZEP 돌연변이체에서 실제적인 ZEP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화를 생어 분석법(Sanger sequencing)을 통해 확인한 결과를 나타낸다[a: 야생형(wildtype), b: ZEP mutant 1(ΔZ1), c: ZEP mutant 2(ΔZ2) d. ZEP mutant 3 (ΔZ3)].
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 사용된 Cas9 단백질 서열을 나타낸다.
도 6a, 6b 및 6c는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형 조류, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 형태적인 특성을 나타내는 사진이다[6a: ZEP 유전자 녹아웃을 연구하기 위한 수백 개의 콜로니들에 대한 클로로필(Chl) 형광의 측정, 6b: 한천이 들어간 고체 TAP 배지에서 콜로니(Colony) 상태로 배양된 사진, 6c: HS 배지에서 액체 배양한 후 동일한 농도(OD 750 = 1)로 맞췄을 때의 상태를 보여주는 사진].
도 7은 야생형 클라미도모나스의 LCYE(Lycopene epsilon cyclase) 유전자의 서열정보를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 각각 클라미도모나스 레인하드티아이 dZL1 변이주와 dZL2 변이주의 LCYE 유전자에 대한 정보를 나타낸다. 붉은색으로 밑줄 표시된 서열은 각각 변이주에 삽입된 서열을 의미한다.
도 9는 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15, ZEP 1 변이주, dZA1 변이주, dZA2 변이주 각각의 고체 TAP 배지에서 세포 사진을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 색소 분석결과를 나타내는 것으로, 10a는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형 조류, ZEP Mutant 1, 변이주 dZL1 및 변이주 dZL2의 색소의 프로파일을 비교한 것이고, 10b는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 색소 프로파일을 비교한 HPLC 분석 그래프: 엽록소 a(chlorophyll a; Chl a) 당 루테인과 지아잔틴의 함량 분석 그래프이다: neo - 네오잔틴(neoxanthin), vio - 비올라잔틴(violaxanthin), An - 안테라잔틴(antheraxanthin), lut - 루테인(lutein), zea - 지아잔틴(zeaxanthin), chl a - 엽록소 a(chlorophyll a), chl b: 엽록소 b(chlorophyll b).
도 10c는 본 발명의 일 실시예에 따라 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형 조류, ZEP Mutant 1, 변이주 dZL1 및 변이주 dZL2의 지아잔틴 및 루테인 생산 특성 및 생산량을 확인한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 독립영양 배양 용기를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합영양 배양 용기를 나타낸 것이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

본 발명은 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 변이주에 관한 것이다.

본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이는 단세포 녹조류(Chlorophyta)로서 민물, 해양 등의 다양한 환경에 분포하는 진핵생물이며, 6~8시간의 분열시간(doubling time)을 가진다. 또한, 가장 널리 보급되어 있는 미세조류 모델 시스템들 중 하나로, 바이오리액터에서 생산이 가능하다.

본 발명의 변이주는 일반적인 돌연변이 처리가 아닌 RGNE RNPs, 크리스퍼 유전자 가위 기술을 이용하여 ZEP(Zeaxanthin epoxidase) 유전자와 LCYE(Lycopene epsilon cyclase) 유전자를 녹아웃시켜 제작될 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 변이주는 ZEP(Zeaxanthin epoxidase) 유전자와 LCYE(Lycopene epsilon cyclase) 유전자의 특정 위치에서 변이를 포함하는 것 일 수 있다. 크리스퍼 유전자 가위 기술을 이용하는 경우 원하는 유전자의 위치에 특이적으로 유전자 녹아웃이 가능하므로, 본 발명의 변이주는 정에하여 ZEP(Zeaxanthin epoxidase) 유전자와 LCYE(Lycopene epsilon cyclase) 유전자의 변이를 위치를 통해서 특정될 수 있고, 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 미세조류로부터 변이주의 생산이 가능하다.

본 발명에서 "변이"란 원래의 염기서열에 염기의 삽입, 결실, 또는 치환 등에 의하여 염기서열이 달라지는 것을 나타내는 것으로, 구체적으로"삽입 변이"란 일부의 염기가 원래의 염기서열 사이로 삽입되어 발생되는 변이를 의미하는 것으로, 상기 삽입되는 염기의 개수는 변이에 따라 상이할 수 있고, 이에 따라 제한되지 않는다.

본 발명의 변이주는 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 일부 염기가 삽입된 삽입 변이를 포함할 수 있고, 이를 통해서 ZEP 유전자를 녹아웃 시킬 수 있다.

본 발명은 일 실시예에서, 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) cw15의 ZEP 유전자 서열(서열번호 1)에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이를 포함할 수 있고, 상기 각 변이주에서 ZEP 유전자가 효과적으로 넉아웃 된 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 변이주는 ZEP 유전자 서열(서열번호 1)에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 변이주는 서열번호 2로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 LCYE 유전자 서열에서 599번째 염기와 600번째 염기 사이에 일부 염기가 삽입된 변이를 포함할 수 있고, 이를 통해서 LCYE 유전자를 녹아웃 시킬 수 있다.

본 발명은 일 실시예에서, 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) cw15의 LCYE 유전자 서열(서열번호 2)에서 599번째 염기와 600번째 염기 사이에 94개 또는 1870개의 염기가 각각 삽입된 변이주를 제조하였고, 상기 각 변이주에서 LCYE 유전자가 효과적으로 넉아웃 된 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예서 서열번호 2의 LCYE 유전자 서열에서 4개의 타겟 부위를 선정하여, sgRNA를 설계하고 이를 이용해서, Cas9을 통한 유전자 교정을 시도한 결과, 다른 타겟부위를 이용한 경우 LCYE 유전자의 녹아웃이 효과적으로 발생하지 않았으나, 186번째 염기부터 209번째의 연속하는 염기를 타겟으로하여 599번째 염기와 600번째 염기 사이에 변이를 발생시킨 경우에만 LCYE 유전자가 효과적으로 녹아웃되었음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 2의 LCYE 유전자 서열에서 599번째 염기와 600번째 염기 사이에 삽입 변이가 발생하는 경우 LCYE 유전자가 녹아웃 된 변이주를 얻을 수 있다는 점에서 매우 큰 기술적 특징이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른, 변이주는 LCYE 유전자 서열(서열번호 2)에서 599번째 염기와 600번째 염기 사이에 서열번호 9로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열이 삽입된 LCYE 유전자 변이를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이주는 LCYE 유전자 서열(서열번호 2)에서 599번째 염기와 600번째 염기 사이에 열번호 9로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열이 삽입된 LCYE 유전자 변이를 포함할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 변이주는 ZEP 및 LCYE 유전자 변이를 동시헤 포함하는 것 일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이; 및 서열번호 2로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 LCYE 유전자 서열에서 599번째 염기와 600번째 염기 사이에 서열번호 9로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열이 삽입된 LCYE 유전자 변이를 포함하는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 일 수 있다.

보다 구체적인 예로, 본 발명의 변이주는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8로 표시되는 ZEP 유전자 변이; 및 서열번호 8; 또는 서열번호 10으로 표시되는 LCYE 유전자 변이를 포함하는 것 일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 서열번호 8의 ZEP 유전자 변이; 및 서열번호 10으로 표시되는 LCYE 유전자 변이를 포함하는 ZEP/LCYE 이중 유전자 녹아웃 변이주를 dZL1(double ZEP/LCYE mutant 1)으로 명명하였고, 서열번호 8의 ZEP 유전자 변이; 및 서열번호 12로 표시되는 LCYE 유전자 변이를 포함하는 이중 유전자 녹아웃 변이주를 dZL2(double ZEP/LCYE mutant 2)로 명명하였다.

본 발명자는 또한, 상기 선발된 변이주 중 클라미도모나스 레인하드티아이 double ZEP/LCYE mutant 1(dZL1) 변이주를 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2018년 8월 21일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 13626BP를 부여받았다.

상기 두 변이주 모두 ZEP/LCYE 이중 유전자 녹아웃이 효과적으로 이루어져 루테인은 생산하지 않으면서, 현저히 향상된 지아잔틴 생상능을 가짐을 확인하였다. 특히, 본 발명의 변이주는 종래 지아잔틴 생산능이 없는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형과 비교해서 지아잔틴 생산능이 현저하게 향상되었고, 특히, 루테인을 생산하지 않아, 지아잔틴 만을 선택적으로 생산할 수 있는 특성을 가져, 지아잔틴 생산에 효과적으로 사용할 수 있는 장점을 갖는다.

본 발명의 변이주는 약광(dim light)에서 생존 가능하고, 구체적으로 10 내지 2,000 μmol photons/m²s 범위의 광도 조건 하에서 배양될 수 있다. 상기 변이주가 약광 조건 이하인 완전한 어둠에서는 광합성을 할 수 없고, 너무 높은 광 조건에서는 광 스트레스에 의해 세포가 데미지를 입을 수 있다. 상기 조건에서 본 발명의 변이주를 배양하는 경우, 변이주 내 지아잔틴 함량이 높으면서도, 우수한 생장률을 갖는 장점이 있다.

본 발명의 변이주는 통상의 클라미도모나스 레인하드티아이 조류를 배양할 수 있는 생장환경(광도 조건, 온도 조건, 배지 등) 내에서 적절한 성장을 할 수 있다. 또한, 낮은 광도에서도 우수한 지아잔틴의 축적능을 갖는 바, 이러한 우수한 지아잔틴 생산능에 의하여 지아잔틴 색소 생산 미생물로 산업적으로 효과적으로 사용될 수 있고, 고광도 하에서도 군집 내의 밀도가 다른 조류와 비교해서 상대적으로 낮아, 단일 세포 내 광합성에 의한 색소 생산 효율이 우수한 효과를 갖는다. 구체적으로 클라미도모나스 레인하드티아이 야생형은 지아잔틴을 거의 생산하지 못하였으나, 본 발명의 변이주는 야생형 보다 지아잔틴 함유량이 약 30 배 이상 더 높고, 루테인을 생산하지 않아, 지아잔틴의 생산에 매우 적합하다.

본 발명의 변이주는 일반적인 클라미도모나스 레인하드티아이의 배양 조건에 따라 배양할 수 있고, 구체적으로 약한 광도 조건에서 조류를 배양할 수 있는 배양 배지를 사용할 수 있다. 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연 배지, 합성 배지 또는 선택 배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다. 예를 들면, 광합성 배지인 HS 배지 또는 TAP 배지로 배양할 수 있으며, 탄소원을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 실시예 내 표 1 또는 표 2의 배양액 조성환경에서, 본 발명의 변이주가 우수한 지아잔틴 생산능을 가짐을 확인하였다.

상기 배양배지의 pH는 클라미도모나스 레인하드티아이가 생존 및 성장 가능한 범위라면 특별히 제한되지 않고, 일 예로 pH 6 이상, 구체적으로 pH 6 내지 pH 9에서 생존가능하며, pH 7.0 이상 내지 pH 8.0 미만에서 최적의 성장률을 가질 수 있다.

본 발명의 변이주는 크리스퍼 유전자 가위 기술을 이용하여 ZEP 유전자 및 LCYE 유전자 내 타겟 서열에 직접 RGEN RNPs로 도입함으로써 제작할 수 있다.

본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 세포 내에 지아잔틴 색소를 고함량으로 축적할 수 있어, 본 발명의 변이주 또는 이의 배양물로부터 얻은 지아잔틴을 식품, 사료, 의약품 등의 원료로 효과적으로 사용될 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 배양물에 관한 것이다.

본 발명에서 "배양물"이란 특정 미생물이 배양된 배지, 즉 배양 후 배지를 의미하는 것으로, 상기 배양물은 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 포함하거나 또는 이를 배양한 후 변이주를 제거한 잔여물을 모두 포함한다. 상기 배양물은 배양 후 배양배지를 농축, 건조 등의 가공을 한 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물을 모두 포함하는 의미이다. 상기 배양물은 그의 부산물을 포함할 수 있고, 그 제형이 한정되지 아니하며, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다.

상기 배지는 특성 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 배지의 pH는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주가 생장 가능한 범위일 수 있고, 일 예로 pH 6 이상, 바람직하게는 pH 6 내지 pH 9 일 수 있다.

또한, 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 조류의 배양물, 상기 변이주 또는 배양물의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 변이주는 지아잔틴을 포함하는 잔토필계 색소를 생성하여 체내 축적하는 특성을 가지는 바, 이러한 측면에서 상기 조성물은 색소 조성물일 수 있고, 또는 지아잔틴 색소 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 클라미도모나스 레인하드티아이 야생형 조류, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 각 세포당 총 색소 내 지아잔틴의 함량을 측정한 결과, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 경우 야생형 또는 ZEP 유전자 변이만을 포함하는 변이주와 비교해서도 색소 중 지아잔틴의 함량이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다(도 10의 b).

상기 색소 조성물은 식품 또는 사료의 원료로 사용될 수 있고, 경구 투여 또는 경구 외 투여 제제로 사용될 수 있고, 구체적으로 경구, 안구 또는 주사제 투여를 위한 제제로 사용될 수 있다. 따라서, 상기 조성물 또는 추출물을 포함하는 색소 조성물 또는 잔토필 색소 조성물은 식품, 의약품 또는 사료 등에 포함되는 경구로 공급될 수 있다는 점에서 경구 투여 또는 주사제용 조성물일 수 있다.

경구 투여용 조성물의 경우, 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화된 경구용 제제에 포함될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제물을 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다.

상기 조성물은 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 변이주는 지아잔틴 생산능이 높고, 루테인을 생산하지 않고 지아잔틴 만을 선택적으로 생산할 수 있어 지아잔틴이 유효성분으로 포함되는 식품, 건강기능식품, 사료 또는 의약품 등의 원료로서 이용될 수 있다.

이러한 측면에서 본 발명은 본 발명의 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 눈의 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

또한, 상기 조성물은 식품 또는 사료에 특별한 목적 용도를 달성하기 위하여 첨가될 수 있으므로, 이러한 측면에서 식품 조성물, 식품첨가제용 조성물, 사료 조성물 또는 사료첨가제용 조성물일 수 있다. 상기 조성물이 사료 또는 식품에 사용되는 경우, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주에 의해 생산되고 세포에 축적된 지아잔틴에 의하여 체내 건강을 유지 또는 강화할 수 있다. 구체적으로, 상기 지아잔틴은 황반 색소로서 황반의 변성 등을 예방 또는 개선할 수 있어, 황반 변성과 관련된 눈 질환의 예방 또는 개선에 효과적이다. 더욱 구체적으로 상기 지아잔틴은 눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선 효과가 있으므로, 상기 사료 또는 식품 조성물은 상기 증상의 예방 또는 개선, 또는 상기 효과를 위한 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에서 "첨가제용"은 식품 또는 사료에 주원료가 외에 첨가되는 구성이라면 모두 포함되며, 구체적인 예로 식품 또는 사료에서 기능성을 갖는 유효 활성물질 또는 가공식품에서 착색, 보존 등을 위해 첨가되는 식품 의약품 안전처에서 정의하고 있는 식품첨가물일 수 있다. 상기 식품은 건강 기능성 식품일 수 있다. 보다 구체적으로, 눈 건강을 위한 건강 기능성 식품일 수 있다.

상기 식품용 또는 식품첨가제용 조서울이나 사료용 또는 사료첨가제용 조성물은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물의 활성을 해치지 않는 범위에서 다른 유효성분을 더 포함할 수 있다. 또한, 담체 등의 부가 성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 건조 균체, 상기 변이주의 배양물 및 이의 추출물을 포함하고, 추가적으로 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 포함하여 제조할 수 있다. 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 변이주, 상기 변이주의 건조 균체, 상기 조류의 배양물 및 이의 추출물을 포함하여, 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있다. 사일레지는 청예사료와 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 건조 균체, 상기 변이주의 배양물 및/또는 이의 추출물을 혼합하여 제조될 수 있으나, 본 발명의 조성물의 사용이 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 식품 또는 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제 (powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 조성물의 pH는 조성물이 사용되는 약제, 식품 등의 제조조건 등에 따라서 용이하게 변경 가능하다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 배양물, 상기 변이주 또는 배양물의 건조물 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 상기 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 그 자체 또는 건조된 형태로 조성물에 포함될 수 있고, 상기 조류의 배양물은 농축 또는 건조된 형태로 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 상기 건조물은 상기 조류 또는 그 배양물의 건조된 형태를 의미하는 것으로, 동결건조 등에 의해 제조된 분말 형태일 수 있다.

또한, 상기 추출물은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 이의 배양액 또는 이의 건조물로부터 추출하여 얻어진 것을 의미하는 것으로, 용매 등을 이용한 추출물, 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 파쇄하여 얻어진 것을 포함한다. 구체적으로 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 세포 내에 축적된 색소를 물리적 또는 화학적 방법으로 추출 및 분리한 것일 수 있다.

상기 추출과정은 통상의 방법에 의하여 수행될 수 있고, 일 예로 추출용매를 가하고 균질화한 후, 균체를 파쇄하여 목적 색소를 추출할 수 있다. 추출 후에는 원심분리하여 조류의 파쇄물을 제거하고, 추출용매는 감압증류 등의 방법으로 제거할 수 있다. 또한 통상의 정제공정을 더 포함할 수 있다. 상기 색소의 경우 물에 녹지않는 성질을 가지므로, 본 발명의 조류로부터 더욱 용이하게 추출될 수 있다.

본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 낮은 광도에서 잔토필, 특히 지아잔틴의 우수한 생산능을 가지므로, 상기 변이주 및 이의 부산물을 포함하는 조성물은 신체 활성 향상, 체기능성 유지 및 저하 예방 효과를 가진다. 구체적으로, 상기 잔토필 색소는 황반변성 억제 효과, 항산화, 항암 효과 등이 있는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 조성물은 신체건강 유지용, 구체적으로 상기 잔토필 색소가 관여하는 신체 기능의 유지, 저하 예방 또는 향상을 용도로 식품, 건강 기능식품, 의약품 또는 사료 등에 포함되는 원료로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 이용한 색소 생산방법을 제공하는 것이다. 상기 색소 생산방법은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 배양하는 것을 포함하는 식품 또는 사료의 원료 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 색소는 지아잔틴 일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 변이주를 이용하는 경우 루테인을 생산하지 않으면서, 고함량의 지아잔틴을 생산할 수 있어, 지아잔틴의 선택적 생산에 효과적으로 활용할 수 있다는 점에서 매우 큰 장점이 있다.

본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 이용하는 경우 배양되는 상기 조류 내의 지아잔틴 축적량을 높일 수 있고, 루테인을 생산하지 않아, 지아잔틴만 분리/정제하기 위한 단계를 거치지 않아도 되므로, 산업적으로 사용되는 지아잔틴을 원료로 공급하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

또한, 상기 생산방법은 상기 배양 단계 이후에, 배양물로부터 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 분리하는 것;을 더 포함할 수 있다. 상기 분리된 조류는 건조를 포함한 가공 단계를 더 거칠 수 있다.

또한, 상기 생산방법은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물로부터 색소를 추출하는 것;을 더 포함할 수 있다.

상기 배양은 pH 6.0 내지 8.0 조건의 배지에서 수행될 수 있다. 또한, 약광 조건, 구체적으로 10 내지 2,000 μmol photons/m²s 범위의 광도 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 경우 낮은 광도에서도 색소 생산능이 우수하여, 체내 지아잔틴 함량을 높일 수 있는 바, 고광도의 에너지를 투여하지 않고도 우수한 지아잔틴 축적을 달성할 수 있어, 산업적으로 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 이러한 추출은 미생물로부터 색소를 추출하는 방법에 대한 통상적인 방법으로 수행할 수 있고, 일 예로 효소법, 초음파 추출법, 기계 추출법 등이 있으며 이에 한정되지 않는다.

상기 생산방법은 배양 단계 외에, 배양 후 조류의 함량을 높이는 농축 단계, 농축 단계를 거친 조류의 수분을 더욱 감소시킴으로써 건조시키는 건조 단계를 더 포함할 수 있다. 그러나 농축단계 또는 건조 단계가 반드시 필요한 것이 아니며, 일반적으로 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 농축 및 건조 방법, 기계를 사용하여 수행할 수 있다.

상기 생산방법은 상기 추출 단계 이후 정제단계를 더 포함하여 수행할 수 있고, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 정제방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 농축 또는 건조 단계를 거쳐 제조된 잔토필은 식품, 건강기능성 식품, 화장품 또는 약제 등의 원료로 사용될 수 있다.

상기 잔토필 생산방법은 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위 내에서 다른 방법을 채용하여 수행될 수 있다.

상기 변이주 및 조성물에 대한 내용은 본 발명의 생산방법에도 준용될 수 있다.

이하에서, 실시예에 따라 본 발명을 더욱 상세힌 설명하는바, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1. 균주의 배양

본 발명의 일 실시예에서 클로미도모나스 조류의 배양은 특별히 언급하지 않는 한, 다음의 배지 및 배양조건에 따라서 수행되었다.

1-1) 독립영양 배양

광합성만을 이용하여 외부의 탄소원 공급이 없는 상태로 배양하는 독립영양 배양(Autotrophic culture)을 하는 경우 최소 배지인 HS 배지에서 5% CO₂를 공급하여 배양하였다. 하기 표 1과 같은 조성을 가진 배지를 만든 뒤 오토클레이브에서 고압살균하고, 활발한 성장기(growth stage)에 있는 세포를 이용하여 배양액에 10⁶cell/mL의 농도가 되도록 만들어 성장을 시작하였다. 배양용기는 도 11과 같이 유리로 된 컬럼(column)을 사용하여 아래에서 공기(Bubble)를 공급하고 양 옆에서 200uE의 광도로 형광등을 이용해 빛을 주었다.

2) 혼합영양 배양

광합성과 탄소원을 같이 공급하여 배양하는 혼합영양 배양(Mixotrophic culture)의 경우는 TAP 배지에서 아세트산(acetic acid)을 첨가하여 배양하였다. 하기 표 2와 같은 조성을 가진 배지를 만든 뒤 오토클레이브로 고압/살균하고, 활발한 성장기(growth stage)에 있는 세포를 이용하여 배양액에 10⁶cell/mL의 농도가 되도록 만들어 성장을 시작하였다. 배양용기는 도 12와 같이 유리로 된 플라스크 또는 병(bottle)을 사용하여 큰 부피(volume)로 배양하였으며 자성 막대(magnetic bar)를 이용하여 저어주었다. 70uE의 광도로 형광등을 이용해 빛을 함께 주었다.

실시예 2. 크리스퍼 유전자 가위 기술( CRISPR - Cas9 RNP )을 이용한 ZEP 유전자 녹아웃 클라미도모나스 변이주 제작

클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자(phytozome: Cre02.g082550 또는 NCBI: AY211267.1)[https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!gene?search=1&detail=1&method=4614&searchText=transcriptid:30785220; 2번 염색체 중 1244277-1250969의 위치에 존재]를 표적하기 위해 sgRNA는 Cas-Designer (www.rgenome.net)을 이용하여 미세상동성-유도된(microhomology-driven) 구조 이동 돌연변이(frame shift mutation)를 유도하는 다섯 개의 sgRNA을 디자인하였으며, 이를 In vitro 전사(transcription) 방법을 통해 합성하였다. Cas-디자이너(www.rgenome.net/cas-designer/)를 사용하여 ZEP 유전자를 표적하기 위해 제작된 다섯 개의 sgRNA의 타켓 서열은 다음 표 3과 같다.

전체 게놈에서 3 뉴클레오타이드(nt)만큼 어떠한 다른 표적 부위들과 상이하고 66보다 더 높은 프레임-외 스코어를 가진 ZEP 유전자의 코딩 서열 영역의 절반 내에서 5개의 sgRNA를 신중하게 디자인하였다. 'CDS(코딩 서열) 위치'는 RNA 전사물에서 절단 지점의 상대적인 위치를 의미한다. Direction의 +는 타겟 서열과 동일한 방향, 즉 같은 시퀀스가 RGEN의 시퀀스이며, -는 타겟 서열과 역 방향, 즉 표적 서열(target sequence)과 결합되어 있는 서열인 서로 상보적인(reverse complement)한 관계의 서열을 의미한다. '프레임-외 스코어(Out-of-frame Score)'는 깨진 이중-가닥 DNA가 미세 상동성-매개된 단부 연결(MMEJ) 경로에 의해 수선될 때 발생하는 프레임쉬프트-유도 결실의 가능성을 가리킨다. '표적-오프 부위의 #'은 전체 게놈을 통틀어 미스매치된 서열의 수를 의미한다. 타겟서열에 나머지 sgRNA 서열 (Gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc) 연결하면 전체 sgRNA를 나타낸다.

Cas9 단백질 경우 E. coli를 이용하여 재조합 Cas9 단백질(recombinant Cas9 protein)을 발현시켜 정제를 거쳐 준비하였다. 실험에 사용된 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 mt (CC-4349)은 Chlamydomonas Resource Center(www.chlamycollection.org)를 통해 확보하였다[http://www.chlamycollection.org/product/cc-4349-cw15-mt-goodenough-330a/].

클라미도모나스 세포는 표 2의 TAP 배지를 이용해 25℃에서 50ml 플라스크에 담아 70uE의 광도로 형광등을 이용해 빛을 제공하고, 90 rpm으로 흔들어 주면서(shaking) 배양하였다. 세포의 농도는 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 측정하며 OD₇₅₀에서 0.3 ~ 0.5 정도의 활발히 배양 중인 시기의 세포를 사용하였다.

RNPs 복합체를 만들기 위해 200㎍의 Cas9 단백질(도 5, 서열번호 15)은 140㎍의 sgRNA(서열번호 16)와 뉴클레아제-프리(nuclease-free) 물에서 섞고, 10분간 상온에서 인큐베이션 하였다. 결합된 RNPs 복합체는 50ⅹ10⁴개의 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 mt(CC-4349) 세포와 함께 4mm 전기천공(Electroporation) 큐벳(cuvette)에서 Biorad Gene Pulser Xcell™ 전기천공 시스템(Electroporation System)을 이용하여(Voltage 600V, Capacity 50uF), 전기충격을 통해 형질 전환시킨 뒤, 12시간 동안 암조건에서 인큐베이션 한 후에 gDNA를 추출하여, 표적 심층 시퀀싱(targeted deep sequencing)으로 분석하였으며, 일부는 2000개의 세포로 희석(dilution)하여 TAP 한천 평판(agar plate)에 도말하여 단일 콜로니(single colony)를 얻었다.

도 3a 및 3b는 표적 심층 시퀀싱에 의해 RGEN-RNPs에 의해 유도된 ZEP 유전자의 돌연변이를 확인한 결과이다. 가장 형질전환 효율이 높은 세 번째 sgRNA(0.456%)에 의해 유도된 단일 콜로니(single colony)를 분리하여 표적 유전자(target gene)의 돌연변이를 확인하였다. 도 3b는 표적 심층 시퀀싱의 결과로, RNP를 이용한 형질전환 실험 후 전체 세포를 모으고 gDNA를 뽑아서 분석했을 때 전체 세포를 대상으로 표적 부위의 DNA 가닥에서 일어나는 모든 변이를 분석하여 그 패턴과 빈도(frequency)를 알 수 있다. 다만, 도 3b는 표적 심층 시퀀싱을 통해 표적 부위에서 실제로 확인된 변이의 패턴들을 나타내는데, 42bp 이상의 삽입(insertion)과 같은 큰 사이즈 변화는 표적 심층 시퀀싱의 원리로는 찾아내기 어려우므로, 실제로 얻어진 단일 콜로니(single colony)의 변이와 차이가 있을 수 있다.

이렇게 ZEP 유전자 특이적 녹아웃 돌연변이체를 DNA 없는 RGEN RNP를 사용하여 생성한 후에, 페트리 디쉬에서 모든 세포에 대해 Chl 형광을 측정하였고 여러 개의 추정되는 ZEP 녹아웃 세포주를 선별하였다.

도 6a에서 적색 원형은 약광(50 μmol photons/m²s) 조건 하에서 TAP 아가 배지 상에서 성장한 추정되는 ZEP 녹아웃 돌연변이체를 가리킨다. NPQ/4 영상은 Imaging PAM(Walz)으로 측정되었다. 야생형(WT) 및 ΔZEP 돌연변이주의 단일 세포 콜로니들이 약광(50 μmol photons/m²s) 조건 하에서 최소 한천 배지 상에서 성장하였다(도 6a 및 6b). 이렇게 확인된 콜로니 중 황반색소 함량이 증가된 변이주 3개(△Z1, △Z2, △Z3)를 선별하였으며, RGEN RNPs에 의해 발생된 세 개의 ZEP 돌연변이체에서 실제적인 ZEP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화를 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)을 통해 확인하였다(도 2a, 2b 및 도 2c).

도 6b에 나타낸 바와 같이, 동일한 조건의 광도 하에서 TAP 한천 평판에서 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15, 그리고 변이주 △Z1, △Z2, △Z3의 콜로니가 서로 유사한 형태와 크기로 자란 것을 확인할 수 있었다. 또한, HS 배지에서 광합성을 통해 액체 배양된 세포들 경우, 같은 세포수의 농도에서 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 조류는 녹색을 띄는 것에 비해 변이주 △Z1, △Z2, △Z3은 풀색 톤의 유사한 녹색을 띠는 것을 확인할 수 있다(도 6c).

선발된 변이주 중 변이주 Z1는 클라미도모나스 레인하드티아이 ZEP 변이 1 (△Z1)(Chlamydomonas reinhardtii ZEP mutant 1(△Z1))로 명명하였으며, 상기 변이주는 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2017년 3월 22일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 13230BP를 부여 받았다.

이후, 이중 유전자 교정을 위해 변이주 Z1을 이용하였다.

실시예 3. 클라미도모나스에서 크리스퍼 유전자 가위 기술(CRISPR-Cas9 RNP)을 이용한 LCYE(Lycopene epsilon cyclase) 유전자 녹아웃 클라미도모나스 변이주 제조

LCYE 유전자를 표적하기 위해 sgRNA는 Cas-Designer(www.rgenome.net)를 이용하여 미세상동성-유도된(microhomology-driven) 구조 이동 돌연변이(frame shift mutation)를 유도하는 네 개의 sgRNA를 제작하였다. LCYE 유전자를 표적하기 위해 제작된 네 개의 sgRNA는 다음 표 4와 같다(각 항목의 의미는 표 3 참조; 표 4에서 타겟 위치는 CDS 서열 기준으로 염기위치를 기재함).

RNPs 복합체를 만들기 위해 200㎍의 Cas9 단백질(서열번호 15)과 140㎍의 sgRNA(서열번호 17)를 뉴클레아제-없는(nuclease-free) 물에서 섞고, 10분간 상온에서 인큐베이션하였다. 결합된 RNPs 복합체는 히그로마이신(hygromycin) 저항성 유전자 카세트 1㎍과 50ⅹ10⁴개의 클라미도모나스(Chlamydomonas) 세포와 함께 4mm 전기천공 큐벳(cuvette)에서 Biorad Gene Pulser Xcell™ 전기천공 시스템(Electroporation System)을 이용하여(Voltage 600V, Capacity 50uF) 형질전환 시킨 뒤, 12시간 동안 암조건 인큐베이션 한 후에 전부를 히그로마이신(hygromycin)이 첨가된 TAP 한천 평판(agar plate)에 도말하여, 단일 콜로니(single colony)를 얻었다.

도 7은 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 조류의 LCYE의 유전자 정보 및 타겟 서열을 나타내는 것으로, 상기 유전자 교정을 통해서 선별된 dZL1과 dZL2 변이주가 각각 도 8a 및 8b의 유전 정보를 가짐을 생어 서열분석법(Sanger sequencing)을 통해 확인하였다.

선발된 변이주 중 변이주 dZL1은 클라미도모나스 레인하드티아이 double ZEP/LCYE mutant 1(dZL1)으로 명명하였으며, 상기 변이주는 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2018년 8월 21일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 13626BP를 부여 받았다.

실시예 4. ZEP/LCYE 이중 유전자 녹아웃의 변이주의 세포적 특성 및 색소 함량 분석

상기에서 단일 콜로니로 분리된 ZEP 1 변이주와 두 개의 ZEP / LCYE 이중 녹아웃의 변이주의 세포적 특성을 확인하기 위해, 각 변이주를 계속 배양하고, 각 콜로니에 대한 HPLC를 이용해 색소 분석을 수행하였다.

분리된 단일 콜로니들을 TAP 배지에서 70 μmol photons/m²s 조건으로 3일 동안 배양하였고, 구체적인 배양 조건은 실시예 1의 배양 조건과 같이 수행하였다. 수확된 조류들을 80% 아세톤을 사용하여 색소를 추출하고 원심분리한 상층액을 다시 나일론 필터를 이용하여 여과한 후 HPLC에 주입하여 분석하였다.

구체적으로, 색소를 분리하기 위해 용매의 총 유속은 분당 1.2mL로 하였고, 제0분 내지 제15분까지 pH 8.0의 Tris는 14%, 아세토니트릴은 84%로부터 0%까지 각각 균일하게 감소시키고, 메탄올과 에틸아세테이트는 2%로 시작하여 제15분까지 각각 68%, 32%까지 증가시켰다. 이후 3분 동안(제15분 내지 18분) 이 용매 비율을 그대로 유지시킨 다음, 1분 동안(제18분 내지 제19분) 각 용매의 비율을 시작할 때의 비율로 되돌린 다음 나머지 6분간 그대로 유지하며 포스트-런(postrun)을 하였다. 펌프는 Shimadzu사의 LC-20A Prominence를, 컬럼은 Watera Spherisorb TMS5(DS1 4.6 x 250 mm, 5μm Cartridge Column, USA)를 사용하였고, 컬럼의 온도는 40 ℃로 유지하였다. 검출기는 포토다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector: SPD-M20A, Shimadzu)를 사용하여 데이터를 분석하였고, 지아잔틴을 비롯한 카로티노이드 색소들은 445nm에서, 엽록소 a는 670nm에서 검출된 결과를 DHL(Agern Alle, Horsholm, Denmark)에서 구입한 카로티노이드와 엽록소 a, b를 정량한 표준곡선을 스탠다드로 사용하여 농도를 구하였다.

도 9는 고체 TAP 배지에서 야생형 조류, Z1 변이주(ZEP Mutant 1), 그리고 dZL1 및 dZL2 변이주(CRISPR-Cas9 RNP에 의해 발생한 ZEP/LCYE 이중 녹아웃 변이주)를 비교한 사진이고, 도 10a 및 10b는 ZEP/LCYE 이중 유전자 녹아웃의 변이주(dZL1 및 dZL2)의 색소를 분석한 결과이다. 도 10a에서는 HPLC를 이용하여 세포의 색소 프로파일을 분석하였으며 도 10b에서는 엽록소 a(Chl a) 당 루테인과 지아잔틴의 양을 야생형과 비교하였다. 일반적인 성장조건에서 야생형에 거의 존재하지 않는 지아잔틴의 양이 모든 변이주에서 증가하였음을 확인하였고, 그 중 특히, ZEP/LCYE 이중 유전자 녹아웃의 변이주는 Z1 변이주와 달리 루테인 함량이 전혀 나타나지 않아, 하나의 변이만 포함하는 변이주와 매우 상이한 균학적 특성을 가짐을 알 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> CHLAMYDOMONAS MUTANTS AND REPARING METHOD THEREOF <130> P20180668OP/P18U10C1129 <160> 17 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 6693 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 1 gcgacgcacg gctgggccaa attcgccaac ggcaggagac caaatcgatc gaggcgatct 60 tgcgaagttc tcggacaaat cgatcgcacc catagtgatt taagcattac atttgcccaa 120 ggcgtgagaa gtgcgaggcc cgaacggcta tgacgccaat gcgcagctta cgacatttaa 180 agcaaattat tcatacatca tacagcacgc ttatgtgaag aaagccagga ttttaggctc 240 tcgccccgat caagacgatc tccccattgc gaagttctcg gtttctttcc ggttcgcctg 300 ctccgtatga tttacctttg cgctacaaca gcgacttaaa cgacctacgt cgccttactg 360 tgtgcgcgta cgtgtttgta gctgtgagat agttttgtcc gcagcgtacc cgcaaataga 420 atgctcgcga gcacttacac gccctgtggc gttcgccagg tggcaggccg cacggttgca 480 gtgcccagca gcttggtcgc gccagtggca gtcgctcggt cgctggggtt ggcgccctac 540 gtccctgtat gtgagccttc tgcggcgctt ccggcctgcc agcagcctag cgggcgtcgt 600 catgttcaga ctgctgccac tctccgtgcc gacaacccca gctcggtcgc gcagctggtg 660 catcagaatg gaaaggggat gaaggttatt atcgccggcg cgggcatcgg cggcctggtg 720 ctagccgttg cacttctgaa gcagggcttc caggttcagg tctttgagcg cgacctgacg 780 gccatccgcg gcgagggcaa gtaccgtgga cccatccagg tgcgttcgcc ggaacaccaa 840 cgcgcttgtt tttgctgtgc cgcgaccatg aactaggcct tatcttgagg tgttagcatg 900 tttagccagc gttggatctg tgtggcgagg ttggggtgag aacccttcct gtgtacctgc 960 tcgggcgtac cttgtgcccc accgctgact ggcttactta atgacaaaac gcaggttcaa 1020 agcaatgcgc tcgctgcgct ggaggctatc gatcccgagg tggccgcgga ggtgctgcgc 1080 gagggctgca tcactggcga ccgtatcaac gggctctgcg acggcctgac tggcgagtgg 1140 tgagtaggca atccagctgt gcatccagtc gcgcggttgc ggaggtcgtc tcgggaaacg 1200 cgacgtggcg tccactcgcc caaggagtgg tctcccgcag cgtggtctcc cgcagctcgg 1260 gtgcaacacc ctgccccctg ccgcgagcgc gctgcgcttg cttatgttgc gcagcggtgt 1320 gagttacaac agcttctgtt gaagagctgt catacgaagc acggcgcgct gtggcgctgc 1380 agccgtgctg tggaaactcc aacacctcca ccgccagcct gcgcacgcac acgcaataca 1440 ctcgcctcgt gtgccccctc ctcacacaac ggcatgtgac actcagtttt aactcttatt 1500 ttgacagctg agagctacac gcttgggtga atggggaggt ccttgatgtt tcgttgcact 1560 ccgtggctcc ggagtccgtg cggaccgtca cccacaaatg ggagcgcacg gctttcttgt 1620 gctgtctgcc ccgttagcca ctaactgcga atgaccttga cagtttactt tgctattttt 1680 ccttccaggt acgtcaagtt cgacacgttc cacccggcgg tcagcaaggg cctgccggtg 1740 acccgcgtca tcagccgcct cacgctgcag cagatcctgg ccaaagccgt ggagcggtga 1800 gccgtgcgcg cggtgtgatg gctttagcgt cagtgctagc atgggggttg gtgggtggta 1860 atcgcggcgc ccatggccgg gtagcagcgg ccgaaagctg gcgcagagcg cgcgttggac 1920 aagcggtcct gttgccggta tgggcacgag cagggcgctg gtgcgggcaa agggcagagt 1980 ggagttgcag agcagcgctg gcgtcggctg tgcgctctcc aaatggcctc gtggcattct 2040 gacgggacac atcctggaaa atagtagcgc acccaactgc tggtggctcc tcgtacaatc 2100 cccccaattt acaatcgctc gttctggctc gcagctacgg cggccccggc accatccaga 2160 acggctgcaa cgtgaccgag ttcacggagc gccgcaacga caccaccggc aacaacgagg 2220 tgagagcgtg ctaagaagag catgcacgtg gagcgtgtaa aattgtgtgg cctgaagcgg 2280 cagtgcctgc ggcatggact aggtggttgc agcatgctgc gcgcgtgggt tgccggtcag 2340 gaaaccgccg gaccgagccg cgcagattca gtcaggagcg gattaggaag tttgaaaaac 2400 agggttcgga gtgtgcaagc gggctcagga gctgtggtgc ctttctacac cggtcgccct 2460 accaggcacc cactgaaact gtaaaaccgt tgctgcgccg gcgatgccct ctacttcact 2520 aggtgactgt gcagctggag gacgggcgca cgtttgcggc cgacgtgctg gtgggcgccg 2580 acggcatctg gtccaagatc cgtaagcagc tcattggcga gaccaaggcc aactacagcg 2640 ggtacacctg ctacaccggt gagattattg accttcaagt tggaaggagg gagcgggggg 2700 agcggaatgg aaggaagcag cgtggacggg gcgcacggag gggaggggac tgcgggtcat 2760 agcgccgcct tgcggggcgt gaggagtgtt gggcggatat tcagttttct ttgcccaaga 2820 tcttcccaca atccgcgtgt gtctgacgcg ggatgtggcc cctgctgcca tggcttcgca 2880 ggcatctcgg actttacgcc ggcggacatt gacattgtgg gctaccgcgt gttcctgggc 2940 aacggccagt actttgtcag cagcgacgtg ggcaacggca agatgcagtg gtgagcggcg 3000 gcgggcgggc gagcgagggc tgcggggtct ggagggtgtg taccgggcgg aagggagggg 3060 aagggagggg aagggaaggc aggatgcagg cgagggcagg atgtgatggt gggaagaggg 3120 cgtggcgagc agcaactgga aaggtggtgg 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ctcagtatgc cgccgtcccg gccgcgccgc 4020 acaggccgcc catcttcacc tggagcaagg gccgcgtggc cctgctgggc gacagcgcgc 4080 acgccatgca gcccaacctg ggccagggcg gctgcatggc cattgaggac gcctacgagc 4140 tggccatcga cctcagccgc gccgtgtccg acaaggccgg aaacgcggcg gcggtggacg 4200 tggagggcgt gctgcgcagc taccaggaca gccgcatttt gcgcgtcagc gccattcacg 4260 gcatggcggg tgagagctgc aaccagcgta gtcgggctgg gctgctgtgg gcagggtcgg 4320 gttgggttgg gcgcacgtgg gcggcgagtg tatgtgcagt gtgacgtgca cactatcata 4380 atactttatg ctcaccgcac cgcgccgcgc cgcaccacgc gccacaggca tggctgcctt 4440 catggccagc acctacaagt gctacctggg cgagggctgg agcaagtggg ttgaggggct 4500 gcgcatcccg caccccggcc gcgtggtggg gcggctggtg atgctgctca ccatgcccag 4560 cgtgctggag tgggtgctgg gcggcaacac cgaccacgtg gcgccgcacc gcaccagcta 4620 ctgctcgctg ggcgacaagc ccaaggtgag cggctgccgg gctggggggg ggtggaggga 4680 gaggaggagg attgcgggga gacgagggag ggcaaggcag gcgctgcctt cgtggatgca 4740 ccgccccgtc gttagcagga cctcaggaac tcgtccccaa aaccacaaca gaacccccaa 4800 tatcgcctct tccttcactg cttgtcacgc ctggtccgcc gaccgcaggc tttccccgag 4860 agccgcttcc ccgagttcat gaacaacgac gcctccatca tccgctcctc ccacgccgac 4920 tggctgctgg tggcggagcg cgacgccgcc acggccgccg ccgccaacgt gaacgccgcc 4980 accggcagca gcgccgccgc ggccgccgcc gccgacgtga acagcagctg ccagtgcaag 5040 ggcatctaca tggcggactc ggcggccctg gtgggccgct gcggcgccac ctcgcgcccc 5100 gcgctggccg tggacgacgt gcacgtcgcc gagagtcacg cgcaggtctg gcgcggcctc 5160 gccggcctcc ccccctcctc gtcgtccgcc tccaccgccg ccgcctctgc gtccgccgcc 5220 tcctctgccg ccagcggcac cgccagcacc ctgggcagct cggagggcta ctggctccgc 5280 gacctgggca gcggccgcgg cacctgggtc aacggcaagc gcctgcccga cggcgccacg 5340 gtgcagctgt ggcccggcga cgcggtggag ttcggccggc accccagcca cgaggtgttc 5400 aaggtgaaga tgcagcacgt gacgctgcgc agcgacgagc tcagcggcca ggcctacacc 5460 acgctcatgg tgggcaagat ccggaacaac gactacgtca tgcccgagtc gcggccggac 5520 ggcggcagcc agcagccggg ccgcctggtg acggcttaag cggcgccgtg cgtaagggcc 5580 ggcttacggg ggcggcagtg tcgctgtgga gggatggtct ggggtgggag gaatgggagg 5640 agagcggcgg gagcccgagg agcggagcgc tggaggcttg cggagcggca gcttgggaag 5700 agctgcggag agaggaagga gcgcagggcg cttggagcac gcgccagatt acgatcacgg 5760 cagcgcgagg cgcgcgtctg acttcgaagt ggtaaggaag atttcatgta tgattgcgtc 5820 gagggacacc gcaagtttta cgcgcggcgg agggagcctt ggggcataca acagtacgag 5880 cgggcgttgg tgagaaggtg gtcactccgt atgagaagat ggttactccg taccttcgtg 5940 agaagctgct gcgcacaagt tacgaaccta tctgtgtgga gagcccggta gtatatcagg 6000 ggcgagggtc atgaacgcga gtggcgagtc tgtgagcgcc aatttgttat gcggcataat 6060 ttcgcatcgg ggtattacgt ctacaaaatg ttgagctggc ttagcgcagg aggcaacacc 6120 tcaggcagaa tgtacgaatg tgtgcagaag ggcagagtca aggcagaggc ggagaagttg 6180 tcagggctgt gtgtggtttg gtcagggcgt ggctagatgg atatgagacc cgccgccgtc 6240 tccagattgt ggcggaggtg gaactctcgg cccccgcgcc agtccccgcg gccagcgcat 6300 cccgccatgc gggttgttgg ctggtgcatc gcgcggggtg tgctatgagt gtggaaacac 6360 tatgtcgcgt gtcgtgctga ggtctgttga gaggtttcgt cgtttgtgca tgtcctgtcc 6420 cggttggagt ttgagcgagg tggttcaaag tttttggatc gcgtgggaga gactgaaacg 6480 gtttggtgag aatggttgag acagaggttg ggcttggaaa ctggaggaga ggagcagcgt 6540 aactcgagga cgatgcagta gatgcaccac aacagttgtg gtgggcgcct ggagtaacac 6600 gcgtgccacc aacacgcaat tacagagatc cgtcatacag gagggatcat atgcgattta 6660 attttggttt tgcatttgta agacgttttc aca 6693 <210> 2 <211> 6652 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 2 agagttgcac ataatccgct ggtgaaatct agcgtcggct ggggacgaag cgcccggtac 60 caaccacccc tgacatcgga gccagggttc ttacgcgcat cagccccttt agctcgcttg 120 taggcgcact tacgcaacaa actcaatcct aagcaagcat tcgtagagcg ttgttggcta 180 ttcctggcca ctcgctgcac tcccactgca agcagggttg gttgcgagca taggtccgcg 240 catctgacaa tttttagtat agtcgggtat tcacttgtac cactgagcat aattagcagc 300 ataacagggc tgttgtgagc caggcgaggt accttctgtt tggtaccgtc tcgtcttccc 360 tgtagacgct tccagtcagg cgccaaacca aacaaaaatg cttcaccaga ttagcgcaaa 420 gcgctgcgga gcgagcggcg tcgtgcgtgg cgctgcgggc ctgcaagcct ttagcacaaa 480 gctcgtcgct cccttgccag cgcggcgagt ggcttgccag gttgtatcta cggagactga 540 ggcacctacc atcgtgcttg accggcccgg gaggaccgtt cagccggagc tctccattcc 600 agcggccctg aatcaagaaa tccgcgaggg gcactatgag gccgcgctgg tgaaggagca 660 ggtaactact cgcttgcgtt caggcccaat tgaacgcgcc ccaaatcgaa ttcggttcgt 720 tgtatgtgct caggcgaaca aggcggacgc ctctcaagcg gcaattgcgt ccgtattgaa 780 gcccgctgac accacggtca cagccgatgt gacaattgtt ggtgcgggcc cggctggcct 840 cttcctggct gcggagttgg gcaagcgggg catgagcgtg aacgtcctcg gtgagcggcc 900 gtcgtgtcaa acggacagcc cccccccccc cgcatgccct tcttgccacg caactgccgc 960 acggtcgctg ccaggcgcga cgcctgcatc taatggctct gtctcttgtc tcgcttgtca 1020 agtatcctga agctctgctg taatgccggg gcgtgtcttg ttgacagcgg ttcaatccaa 1080 atgcgtgcaa tcgctagtgt ggcccgcgtc catccactcc acacgcaacc agccagcgtg 1140 tctccgaggg actggcagac gcctgctgca tgccattgct cttgcagcgc tctgctgttg 1200 cacacatcag ccctcgcccc tgcgtacccc cgcggtggga ggcacggcca taatcaaacc 1260 caccccttcc gtgtcccatg aagccacacc agcgactgtg cagagacaca cacacacaca 1320 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 1380 cacacacgcg acaatgcctt atgctggact tacacacgca taatcccgca tataggcctg 1440 gacgtgccca ttgtgaacaa ctacggcgtg tggacggacg agttcgaggc cctgggcctg 1500 acccatacac tggagtgctc ctggcctgat gccgtgtgct acttcggcga gggcaaccag 1560 gtgcggggtg gggcggggcg tggtggagcg gggaggcaga gggcagacag ggttgcgtgc 1620 atcttgctgt ggtacgtagg gacctcttgt acgctcttgc atgtagcgaa acggtgtggc 1680 agggggggct gcatgagtag cggcgcgagt gcacaagagt ccaacgagca gcagccctgg 1740 cgcccgtgcc agcgtcctgg cttcttacac gcgagtcttt tcttgttgtt tgtccaggtg 1800 agcgtgggcc gcggctacgg ccgtgtgagc cgccggctgc tgcgtgagca cctgctcaag 1860 atctgcgagg cggcgggcgt gcgcttcagc agcgccgagg tggcggacat caaggtgcgc 1920 gggcggggcg gggtggcggc gcagggtgtg gtggcgggtt gtggtctggt gtgcagttga 1980 ccgcaaaggg tctggctgac tggctggctg gtgcgagtac ggtgcttgag ctggatgagt 2040 cggccgactg gcaggagctt cactcactta ctgccatact gccaccccgc ccctgtccgc 2100 accatgcata ggttgtggag gagggcaagc tgactcagct caccaccaag gagggcgccg 2160 tgtacagcag caggtggggg aggggggggc ggcgggcagc agaagcggcc atgctaggca 2220 ctggctgtgg tgggggctgc gctgtagcaa cagcaatagc ggcatcagca gcagctgtgg 2280 gatacaaaaa gcgcacgtgc ctggctacgt ggcgctcgcg catgtcgtgc tctgacacct 2340 tgcgccctct tcacgcaacc ctcaggctga ccactctggc tgcgggtgcc gctgccggca 2400 agttcctgcg gtgagtgggt cgtccgcagc cctgggacag tgtctggtca cgtcacaaag 2460 atgtgaacgc cgtcttgctc tgccctgtgc cacctcccgg ctggagcctc ctccccactc 2520 ctcgcttctc acctcttctc cctctgccca cgcactccag ctatgaggag gacgcgccca 2580 ttgtcgccgc acaaaccgcg tacggcatcg aggcggaggt ggagggctat gacgccgcct 2640 acccgggcga cctcatgacc ttcatggatt tcaggtgcgg gcatgtgggc ttgtgtgtgg 2700 gtgcggatgg ttccaacacc aactaaacca agaccccagg ggggttgtag aggttagcag 2760 aatgcttgga gcatcaggcg agcgagcggc acgccaggga gcgaaagagc gagcaccaac 2820 agcgacgtga tgcacggtgc cggcgtactg gcggggaggg ggcgcgggca cgggggccga 2880 aacagccatc catgaatgcc ggggggcaaa tggtggcgtc gctgtggcct gacctggtcc 2940 cgctgtgttc ggccggctcc ccctcgcggc aggcgccacc acaccggcct gcacgacggc 3000 acggcgctca aattcgtgcc ggggcgccat cccaactcgg gcgacggcac gtggggcagc 3060 agcgaggagt gcccctcctt cctgtacgcc atgccgctgg gcggcaagcg cgtgttcctg 3120 gaggagacct gcctggtggc 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tttgtttcgt gtgtgtgcgt gtcatgtgat 6000 tgacctgttg cagtgcagat gcagttgttt gcttccagag ctgtgtcaac tagcctggct 6060 cgcgcgcccg ggcgtggcca ccagggggcg tgattgtgtg aaggggctgg aaggggagcc 6120 aggcagctct attggagact ccgcagcgcg ggtaggtgcg gcaggaaggg cacaacgctg 6180 aacattggcg gcaaagcgag cctggaagtg cgagcaatgt tgacgaggat taggagagcg 6240 agcgagttga ccaagaccag agaaggccag aagggagaag ttggttgcag catggcgtgt 6300 tgatgggatg ggtcgatggg gcggccccag gtagctcgtg ctgctgcttg gggcaatacg 6360 acccaagtgc tgaagtgcag cgaacaggaa gcggcagctt gtcagcgcgc acgctgcttt 6420 gcgctcgttg cgggaggacg ccgtgtgccc gcgcaagctg cgggcccttc tgcacttggt 6480 gcccgtaaca ttcatgttca accgccgctc tcctggctgt caccaccagg gatgtcccat 6540 ggcaccagga ctcaccaggg ctgttgcacg agcgccgggt gcgcgggcaa gcagggcacc 6600 tcaggttgga gggaatgaaa tatggtatgc gacagggacc acaagggtgt gggccattcc 6660 tggccggtcc atccgcaggg tgggccgcgt gcagagccac ctgtgattgg ttgtgctgcc 6720 agctccatgc gatagtaaga tcgggc 6746 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 13 cccatccagg tgcgttcgcc gga 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 14 gccggagctc tccattccag cgg 23 <210> 15 <211> 1406 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> cas9 protein <400> 15 Met Gly Ser Ser His His His His His His Val Tyr Pro Tyr Asp Val 1 5 10 15 Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile 20 25 30 Arg Ile Pro Gly Glu Lys Pro Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp 35 40 45 Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys 50 55 60 Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser 65 70 75 80 Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr 85 90 95 Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg 100 105 110 Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met 115 120 125 Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu 130 135 140 Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile 145 150 155 160 Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu 165 170 175 Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile 180 185 190 Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile 195 200 205 Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile 210 215 220 Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn 225 230 235 240 Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys 245 250 255 Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys 260 265 270 Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro 275 280 285 Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu 290 295 300 Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile 305 310 315 320 Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp 325 330 335 Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys 340 345 350 Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln 355 360 365 Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys 370 375 380 Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr 385 390 395 400 Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro 405 410 415 Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn 420 425 430 Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile 435 440 445 Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln 450 455 460 Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys 465 470 475 480 Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly 485 490 495 Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr 500 505 510 Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser 515 520 525 Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys 530 535 540 Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn 545 550 555 560 Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala 565 570 575 Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys 580 585 590 Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys 595 600 605 Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg 610 615 620 Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys 625 630 635 640 Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp 645 650 655 Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu 660 665 670 Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln 675 680 685 Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu 690 695 700 Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe 705 710 715 720 Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His 725 730 735 Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser 740 745 750 Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser 755 760 765 Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu 770 775 780 Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu 785 790 795 800 Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg 805 810 815 Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln 820 825 830 Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys 835 840 845 Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln 850 855 860 Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val 865 870 875 880 Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr 885 890 895 Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu 900 905 910 Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys 915 920 925 Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly 930 935 940 Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val 945 950 955 960 Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg 965 970 975 Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys 980 985 990 Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe 995 1000 1005 Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His 1010 1015 1020 Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys 1025 1030 1035 Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val 1040 1045 1050 Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly 1055 1060 1065 Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe 1070 1075 1080 Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg 1085 1090 1095 Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp 1100 1105 1110 Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro 1115 1120 1125 Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1130 1135 1140 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1145 1150 1155 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp 1160 1165 1170 Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly 1190 1195 1200 Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 1205 1210 1215 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile 1220 1225 1230 Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg 1235 1240 1245 Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu 1250 1255 1260 Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser 1265 1270 1275 His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys 1280 1285 1290 Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile 1295 1300 1305 Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala 1310 1315 1320 Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys 1325 1330 1335 Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu 1340 1345 1350 Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr 1355 1360 1365 Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala 1370 1375 1380 Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1385 1390 1395 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1400 1405 <210> 16 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> sgRNA of ZEP <400> 16 uccggcgaac gcaccuggau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96 <210> 17 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> sgRNA of LCYE <400> 17 ggagcucucc auuccagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96

Claims (16)

1. 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이; 및
   서열번호 2로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 LCYE 유전자 서열에서 599번째 염기와 600번째 염기 사이에 서열번호 9로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열이 삽입된 LCYE 유전자 변이를 포함하는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 변이주.
2. 제1항에 있어서,
   서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8로 표시되는 ZEP 변이 유전자; 및
   서열번호 10; 또는 서열번호 12으로 표시되는 LCYE 변이 유전자를 포함하는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 변이주는 지아잔틴(zeaxanthin) 생성능을 가지면서, 루테인(lutein)을 생산하지 않는 것을 특징으로하는, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
4. 제1항에 있어서,
   서열번호 4로 표시되는 ZEP 변이 유전자; 및
   서열번호 10으로 표시되는 LCYE 변이 유전자를 포함하는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주의 배양물,
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 색소 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 색소는 지아잔틴(zeaxanthin)를 포함하는 것 인, 색소 조성물.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 눈의 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선용 조성물.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품용 또는 식품첨가제용 조성물.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 사료용 또는 사료첨가제용 조성물.
11. 제 1 항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 주사제용 조성물.
12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주; 이의 배양물; 상기 변이주 또는 배양물의 건조물; 및 상기 변이주 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 눈의 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주를 배양하는 것을 포함하는 색소 생산방법.
14. 제13항에 있어서,
    상기 변이주, 상기 변이주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물로부터 색소를 분리하는 것;을 포함하는 색소 생산방법.
15. 제 1 항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주를 배양하는 것;을 포함하는 식품의 원료 생산방법.
16. 제 1 항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 변이주를 배양하는 것;을 포함하는 사료의 원료 생산방법.

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