KR20210069544A - 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법 및 기능성 오일을 포함하는 유화액 - Google Patents

Abstract

본 발명은 플라미도모나스 레인하드티아이와 같은 미세조류로부터 루테인 및 제아잔틴 함량이 증대된 기능성 오일을 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출된 오일을 포함하는 유화액에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법은 루테인 및 제아잔틴의 함유량이 높은 기능성 오일을 추출할 수 있는 특징이 있으며, 기존의 추출방법보다 시간을 단축할 수 있고, 추출 장치의 용량에 따른 대량 추출이 가능하므로 추출 비용의 감소를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 기능성 오일 및 이를 함유하는 유화액은 저장안정성이 우수하고, 루테인 및 제아잔틴의 함유량이 높으므로 황반변성을 개선할 수 있는 기능성 식품으로 활용될 수 있다.

Description

미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법 및 기능성 오일을 포함하는 유화액{Method for Extracting Functional Oil from Microalgae and Emulsion Comprising Functional Oil}

본 발명은 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법 및 기능성 오일을 포함하는 유화액에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 플라미도모나스 레인하드티아이와 같은 미세조류로부터 루테인 및 제아잔틴 함량이 증대된 기능성 오일을 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출된 오일을 포함하는 유화액에 관한 것이다.

미세조류는 담수 또는 해양계에서 발견되는 현미경으로 봐야 볼 수 있는 수준의 작은 조류로서, 개별적으로 존재하거나 사슬 또는 군락의 형태로 존재하는 단세포 종이며, 종에 따라 그 크기는 수 ㎛에서 수백 ㎛까지 다양하다. 고등 식물과는 달리 미세조류에는 뿌리, 줄기 또는 잎이 없으며, 광합성을 하는 독립영양생물이다.

미세조류는 내부에 오일을 포함하고 있어 최근에는 이를 바이오디젤로 활용하려는 연구가 진행되고 있으나, 아직 미세조류가 갖는 기능성 오일의 활용에 대한 연구는 미진한 상태이다.

미세조류의 하나인 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)는 약 24%의 오일을 가지고 있고, 오일의 17%는 오메가 3 및 오메가 6와 같은 불포화지방산으로 구성되어 있다. 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0121052호에서는 클라미도모나스 변이주를 사료로 사용하여 황반변성에 효과적인 루테인과 제아잔틴을 생산할 수 있는 방법에 대해서 기재하고 있다.

황반변성이란 눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직인 황반에 변성이 일어나 시력장애를 일으키는 질환으로, 시세포의 대부분이 황반에 모여있고 물체의 상이 맺히는 곳도 황반의 중심이므로 황반은 시력에 대단히 중요한 역할을 담당하고 있다.

황반색소는 망막의 중앙부분에서 기인한 노인성 시력감퇴를 줄여주고, 밝은 광선에 의한 망막조직의 손상을 막아주는 역할을 하는 것으로 대표적인 예로 카로티노이드의 산소화에 의해 생산되는 카로티노이드계의 옥시카로티노이드 색소로 잔토필(xanthophyll)가 있다. 잔토필류에 속하는 색소로는 루테인(lutein) 및 제아잔틴(zeaxanthin) 등이 있다. 루테인은 몸속에서 자연적으로 생성되는 산소 자유라디칼(free radical)에 의해서 손상되는 눈의 내부를 보호하는 항산화제로서 활동하며, 암종양을 공급하는 혈관의 성장을 줄여 암세포를 죽이고, 유방, 결장, 폐, 난소암, 피부암 예방에 약간의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

동물은 잔토필을 생성할 수 없고, 음식의 섭취를 통해서만 얻을 수 있는데, 이러한 잔토필은 식물의 잎사귀, 꽃, 과실 등의 녹색부에 엽록소, 카로틴과 같이 존재한다. 루테인/제아잔틴의 하루권장 섭취량은 10mg/day로 일반적인 식사섭취로 이를 충족시키기는 힘들어, 최근 잔토필류를 포함하는 눈 건강을 위한 건강기능식품 등이 각광받고 있다.

루테인 및 제아잔틴은 통상 마리골드 꽃으로부터 추출하는데, 마리골드는 재배면적에 비해 생산량이 적고, 재배기간이 길며, 재배에 이용되는 자원이 많아 단가가 높은 문제가 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 미세조류로부터 루테인 또는 제아잔틴을 생산하기 위한 연구가 지속되고 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-2019448호에서는 클로렐라속 HS3으로부터 루테인을 생산하는 방법을 기재하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-2020144호에서는 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주를 이용하여 고농도의 루테인을 생산하는 방법을 기재하고 있다.

그러나, 지금까지 미세조류로부터 잔토필류 색소를 수득하는 연구에서는 제아잔틴의 함량이 너무 낮아 루테인과 제아잔틴을 모두 일정량 이상 얻기는 어려운 문제가 있었다.

본 발명의 목적은 미세조류로부터 루테인 및 제아잔틴이 다량 함유된 기능성 오일을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 추출된 기능성 오일을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 기능성 오일 및 식물성 오일을 포함하는 기능성 오일 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 기능성 오일을 포함하는 유화액을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유화액을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법을 제공한다:

(a) 미세조류를 유기용매에 80 내지 120mL/g의 비율로 첨가하는 단계;

(b) 상기 용액을 20 내지 60kHz로 초음파 처리하는 단계; 및

(c) 상기 용액을 원심분리 후 상층액으로부터 기능성 오일을 분리하는 단계.

본 발명의 방법은 상기 (a) 단계 이전에 미세조류를 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 헥산, 이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 초음파 처리는 33 내지 40℃에서 140 내지 160분간 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 상기 (c) 단계는 상층액에 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화나트륨 및 황산마그네슘으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 극성용매를 첨가하여 상분리를 유도하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 미세조류는 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이, 및

서열번호 2로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 AGP 유전자 서열에서 116번째 염기와 117번째 염기 사이에 아데닌(A)삽입되거나; 115번째 염기 결실 및 116번째 염기가 티민(T)으로 치환된 AGP 유전자 변이를 포함하는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 변이주인 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8로 표시되는 ZEP 변이 유전자; 및 서열번호 9; 또는 서열번호 10으로 표시되는 AGP 변이 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 추출되고, 루테인 및 제아잔틴이 함유된 기능성 오일을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 기능성 오일; 및 옥수수 오일, 콩 오일, 참기름 및 해바라기 오일로부터 선택된 1종 이상의 식물성 오일을 포함하는, 기능성 오일 조성물을 제공한다.

본 발명을 또한, 상기 기능성 오일 조성물; 유화제; 및 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨, 시트르산 나트륨 및 포름산 나트륨으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 완충용액을 포함하는, 유화액을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 완충용액의 pH는 3 내지 5인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기 유화액을 포함하는, 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법은 루테인 및 제아잔틴의 함유량이 높은 기능성 오일을 추출할 수 있는 특징이 있다. 또한, 기존의 추출방법보다 시간을 단축할 수 있고, 추출 장치의 용량에 따른 대량 추출이 가능하므로 추출 비용의 감소를 기대할 수 있다.

본 발명의 기능성 오일 및 이를 함유하는 유화액은 저장안정성이 우수하고, 루테인 및 제아잔틴의 함유량이 높으므로 황반변성을 개선할 수 있는 기능성 식품으로 활용될 수 있다.

도 1은 ZEP 및 AGP 유전자 교정된 클라미도모나스 변이주의 제작 방법에 대한 전반적인 기술을 설명하는 도이다.
도 2a, 2b 및 2c는 각각 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1의 ZEP 유전자 정보(2a), 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ2의 ZEP 유전자 정보(2b) 및 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ3의 ZEP 유전자 정보(2c)를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 DNA-free RGEN RNP에 의해 유도된 ZEP 유전자의 돌연변이를 나타낸 것이다[3a: 각 sgRNA에 대한 RGEN-트랜스펙션된 세포 및 야생형의 돌연변이(삽입 및 결실; indel) 빈도가 표적화된 심층 서열화(Targeted deep sequencing)에 의해 측정되었다. Indel 빈도는 약 0.46%까지 측정되었다. 3b: a의 표적화된 심층서열화(Targeted deep sequencing) 분석 결과에서 관찰된 가장 효율이 높은 세 번째 sgRNA로부터 얻어진 대표적인 돌연변이체 DNA 서열(RGEN3) 표적화된 심층 서열화(Targeted deep sequencing) 분석으로 타겟 서열에서 확인된 다양한 indel 패턴을 확인한 결과이다, PAM 서열의 3nt 상류에서 나타났다.
도 4는 DNA-free RGEN RNPs에 의해 발생된 세 개의 ZEP 돌연변이체에서 실제적인 ZEP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화를 생어 분석법(Sanger sequencing)을 통해 확인한 결과를 나타낸다[a: 야생형(wildtype), b: ZEP mutant 1(ΔZ1), c: ZEP mutant 2(ΔZ2) d. ZEP mutant 3 (ΔZ3)].
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 사용된 Cas9 단백질 서열을 나타낸다.
도 6a, 6b 및 6c는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형 미세조류, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 형태적인 특성을 나타내는 사진이다[6a: ZEP 유전자 녹아웃을 연구하기 위한 수백 개의 콜로니들에 대한 클로로필(Chl) 형광의 측정, 6b: 한천이 들어간 고체 TAP 배지에서 콜로니(Colony) 상태로 배양된 사진, 6c: HS 배지에서 액체 배양한 후 동일한 농도(OD₇₅₀=1)로 맞췄을 때의 상태를 보여주는 사진].
도 7은 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15의 AGP(ADP glucose pyrophosphorylase) 유전자의 서열정보를 나타낸다.
도 8a는 클라미도모나스 레인하드티아이의 AGP(ADP glucose pyrophosphorylase) 유전자를 표적하기 위한 네 개의 sgRNA의 위치 및 특징을 보여주는 표이고, 도 8b는 DNA-free RGEN RNP에 의해 발생된 두 개의 AGP 변이주에서 실제적인 AGP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화 확인한 결과이다.
도 9a 및 9b는 각각 클라미도모나스 레인하드티아이 dZA1 변이주와 dZA2 변이주의 AGP 유전자에 대한 서열정보를 나타낸다. 붉은색으로 표시된 서열은 각각 변이주에 삽입(insertion), 결실(deletion) 또는 치환(substitution)된 서열을 의미한다.
도 10은 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15, dZA1 변이주, dZA2 변이주의 형태적인 특성을 확인한 결과이다: a. 액체배지(TAP)에서 배양 후 동일한 농도로 맞췄을 때의 색 표현형 비교; b. 3일간 질소 고갈 후 동일 농도에서 루골용액에 반응시켰을 때 전분(Starch)에 의한 변색반응.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15, dZA1 변이주, dZA2 변이주의 생장 특성을 확인한 결과이다: 시간에 따른 성장곡선(부피 당 세포 수, cells/ml)을 나타내는 그래프.
도 12a, 12b, 12c 및 12d는 본 발명의 일 실시예에 따라 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 dZA1, dZA2의 색소를 분석한 결과를 나타낸다: 12a. 각 균주의 색소의 프로파일을 나타내는 HPLC 분석 그래프(neo: 네오잔틴(neoxanthin), vio: 비올라잔틴(violaxanthin), an: 안테라잔틴(antheraxanthin), lut: 루테인(lutein), zea: 제아잔틴(zeaxanthin), chl a: 엽록소 a(chlorophyll a), chl b: 엽록소 b(chlorophyll b); 12b. 각 균주의 색소(루테인 및 제아잔틴) 함량을 확인한 그래프; 12c. 시간에 따른 루테인의 함량(부피당 무게, mg/L) 분석 그래프; 12d. 시간에 따른 제아잔틴의 함량(부피당 무게, mg/L)을 확인한 그래프.
도 13a 및 13b는 본 발명의 일 실시예에 따라 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15, dZA1 변이주 및 변이주 dZA2의 지질 생산 특성을 비교한 그래프이다: 13a. Nile red solution을 이용한 TAG 지질 함량 분석 결과; 13b. 유기 용매추출법을 통한 전체 지질 함량 분석(g/L).
도 14a는 본 발명의 기능성 오일을 옥수수유와 혼합하여 15일간 저장한 경우의 루테인 잔존량과 온도의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 14b는 본 발명의 기능성 오일을 옥수수유와 혼합하여 15일간 저장한 경우의 루테인 잔존량과 산소의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 14c는 본 발명의 기능성 오일을 옥수수유와 혼합하여 15일간 저장한 경우의 루테인 잔존량과 빛의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 14d는 본 발명의 기능성 오일을 옥수수유와 혼합하여 15일간 저장한 경우의 루테인 잔존량과 산소 및 빛의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시형태에 따른 기능성 오일을 포함하는 유화액을 나타낸다.
도 16a는 본 발명의 기능성 오일을 함유하는 유화액의 온도에 따른 저장안정성을 루테인 함량에 대하여 분석한 그래프이다.
도 16b는 본 발명의 기능성 오일을 함유하는 유화액의 온도에 따른 저장안정성을 제아잔틴 함량에 대하여 분석한 그래프이다.
도 16c는 본 발명의 기능성 오일을 함유하는 유화액의 빛의 유무에 따른 저장안정성을 루테인 함량에 대하여 분석한 그래프이다.
도 16d는 본 발명의 기능성 오일을 함유하는 유화액의 빛의 유무에 따른 저장안정성을 제아잔틴 함량에 대하여 분석한 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 미세조류로부터 루테인 및 제아잔틴을 포함하는 기능성 오일을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 초음파 추출 공정을 이용하여 미세조류로부터 루테인 및 제아잔틴의 함량이 증대된 기능성 오일을 추출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 미세조류를 유기용매에 첨가하는 단계; 상기 용액을 초음파 처리하는 단계; 및 기능성 오일을 분리하는 단계에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 미세조류로는 루테인 및 제아잔틴을 함유하고 있는 미세조류를 사용하는 것이 바람직하며, 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 및 듀날리엘라 테르티오렉타(Dunaliella tertiolecta)가 바람직하고, 클라미도모나스 레인하드티아이가 가장 바람직하다.

특히, 후술하는 바와 같이, 유전자 변이를 통하여 루테인 및 제아잔틴 함량을 향상시킨 미세조류를 사용하는 것이 바람직하다.

기능성 오일을 추출하기 위하여 미세조류를 먼저 공지의 방법을 이용하여 건조시킬 수 있다. 상기 건조는 열풍 건조 또는 동결 건조를 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

건조가 완료된 미세조류는 초음파 추출을 위하여 유기용매에 첨가하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 헥산, 이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 용매를 1종 이상 사용할 수 있으며, 2종 이상의 용매를 혼합하여 사용하는 것도 가능하다. 본 발명의 초음파 추출에 사용하기 위하여, 헥산 및 이소프로판올의 혼합 용매가 더욱 바람직하며, 상기 헥산 및 이소프로판올을 1:1 내지 2:1의 부피비로 혼합한 용매를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 유기용매는 미세조류 1g에 대하여 80 내지 120mL를 사용하는 것이 바람직하며, 90 내지 110mL를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 유기용매의 비율을 너무 높게 하거나 오히려 너무 낮게 설정하는 경우 루테인과 제아잔틴의 수율이 낮아지게 된다는 것을 발견하였으며, 상기 범위 내에서 가장 높은 수율의 루테인 및 제아잔틴을 수득할 수 있다는 것을 확인하였다.

미세조류를 유기용매에 첨가한 다음에는 갈색병에 넣은 다음 초음파 발생장치를 이용하여 초음파 처리할 수 있다. 유기용매에 미세조류를 침지시킨 후 초음파를 가하게 되면 세포막 내 유체의 속도 변화로 인하여 공동 현상(cavitation)이 생겨 짧은 시간 내에 세포막의 파괴를 유도하고 지용성 물질과 오일의 용출을 유도할 수 있다.

본 발명에서, 초음파 처리는 저주파를 이용하는 것이 바람직하며 20 내지 60kHz의 초음파가 더욱 바람직하다.

상기 초음파 처리는 단순히 길게 한다고 해서 루테인 및 제아잔틴의 함량이 높게 추출되는 것은 아니며, 적정한 시간 내에 처리를 진행하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 바람직한 초음파 처리 시간은 120 내지 180분이며, 140 내지 160분이 가장 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 초음파 처리 시간을 상기 범위보다 더 길게하거나 더 짧게 하면 루테인 및 제아잔틴의 함량이 더 떨어지게 된다는 것을 실험을 통하여 확인하였다.

본 발명에서는 상기 초음파 처리에 있어서 처리 온도가 루테인 및 제아잔틴의 수율에 큰 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 상기 초음파 처리는 30 내지 50℃에서 수행할 수 있으며, 33 내지 40℃이 더욱 바람직하고, 약 35℃가 가장 바람직하다.

초음파 처리를 완료하면, 처리액을 원심분리기를 이용하여 분리할 수 있다.원심분리는 3,000 내지 4,000g의 중력가속도로 25℃에서 10분 정도 수행할 수 있다.

원심분리 후 상층액을 분리하고, 상기 상층액에 극성용매를 투입하여 상층액을 오일 및 기능성 물질을 포함하는 유기용매층과 불순물층으로 상분리를 유도한다. 상기 극성용매는 예를 들어, 헥산 및 아이소프로판올의 혼합액에서 아이소프로판올에 용해되어 극성을 강하게 하고 밀도를 높여 결과적으로 기능성 오일이 용해된 유기용매인 헥산이 분리되도록 할 수 있다. 상기 극성용매는 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화나트륨, 황산마그네슘 등의 용매를 1종 이상 이용하는 것이 바람직하며, 염화칼륨이 가장 바람직하다.

상기 극성용매는 상층액과 1:2 내지 2:1의 비율로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하며, 용액으로부터 기능성 오일이 용해된 유기용매층이 분리되면 용매를 증류시켜 기능성 오일 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 미세조류 1g에 대하여 0.5mg 이상의 루테인 및 0.3mg 이상의 제아잔틴을 함유하는 오일을 추출할 수 있으며, 0.6mg 이상의 지질을 함유하는 오일을 추출할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 유전자 변형 클라미도모나스 레인하드티아이를 이용하여 기능성 오일을 추출한 결과 0.65mg/g의 루테인, 0.36mg/g의 제아잔틴 및 71.89mg/g의 지질을 함유하는 오일을 수득할 수 있다는 것을 확인하였다.

상기 기능성 오일은 식물성 오일과 혼합하여 기능성 식품으로 활용할 수 있다.

상기 식물성 오일로는 옥수수 오일, 콩 오일, 참기름, 해바라기 오일 등을 사용할 수 있으며, 옥수수 오일이 저장 안정성의 측면에서 가장 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기 기능성 오일을 포함하는 유화액에 관한 것이다.

상기 유화액은 본 발명의 기능성 오일을 포함하는 유상부 10 내지 40중량% 및 수상부 60 내지 90중량%를 혼합하여 균질기로 균질화시켜 제조할 수 있다. 기능성 오일을 유화액의 형태로 저장하여 보관하는 경우 저장 안정성을 크게 향상시킬 수 있으며 기능성 식품, 화장료 조성물, 약학 조성물 등에 적용이 용이하여 활용성을 증진시킬 수 있다.

상기 유상부는 본 발명의 기능성 오일을 포함하고, 또한 상기 기능성 오일이 식물성 오일에 혼합된 형태가 가장 바람직하다. 상기 식물성 오일은 옥수수 오일, 콩 오일, 참기름, 해바라기 오일 등을 사용할 수 있으며, 옥수수 오일이 저장 안정성의 측면에서 가장 바람직하다.

상기 수상 용액은 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨, 시트르산 나트륨, 포름산 나트륨 등의 완충용액 및 유화제를 포함할 수 있으며, 아세트산 나트륨 완충용액이 바람직하다. 상기 완충용액은 pH가 3 내지 5인 것이 바람직하며, pH 4가 가장 바람직하다.

본 발명에서 기능성 오일을 추출하기 위해 가장 바람직한 미세조류는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)이다. 클라미도모나스 레인하드티아이는 단세포 녹조류(Chlorophyta)로서 민물, 해양 등의 다양한 환경에 분포하는 진핵생물이며, 6~8시간의 분열시간(doubling time)을 가진다. 또한, 가장 널리 보급되어 있는 미세조류 모델 시스템들 중 하나로, 바이오리액터에서 생산이 가능하다.

본 발명에서는 상기 클라미도모나스 레인하드티아이의 변이주를 사용하여 루테인 및 제아잔틴의 함유량이 우수한 기능성 오일을 추출하고자 하였다. 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 일반적인 돌연변이 처리가 아닌 RGNE RNPs, 크리스퍼 유전자 가위 기술을 이용하여 ZEP(Zeaxanthin epoxidase) 유전자와 AGP(ADP glucose pyrophosphorylase) 유전자를 이중으로 녹아웃시켜 제작될 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 변이주는 ZEP(Zeaxanthin epoxidase) 유전자와 AGP(ADP glucose pyrophosphorylase) 유전자의 특정 위치에서 변이를 포함하는 것일 수 있다. 크리스퍼 유전자 가위 기술을 이용하는 경우 원하는 유전자의 위치에 특이적으로 유전자 녹아웃이 가능하므로, 본 발명의 변이주는 ZEP(Zeaxanthin epoxidase) 유전자와 AGP(ADP glucose pyrophosphorylase) 유전자의 변이 위치를 통해서 특정될 수 있고, 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 미세조류로부터 변이주의 생산이 가능하다.

본 발명에서 "변이"란 원래의 염기서열에 염기의 삽입, 결실, 또는 치환 등에 의하여 염기서열이 달라지는 것을 나타내는 것으로, 구체적으로 "삽입 변이"란 일부의 염기가 원래의 염기서열 사이로 삽입되어 발생되는 변이를 의미하는 것으로, 상기 삽입되는 염기의 개수는 변이에 따라 상이할 수 있고, 이에 따라 제한되지 않는다. "결실 변이"란 원래의 염기서열에서 염기가 없어지는 변이를 의미하며, "치환 변이"란 원래의 염기서열에서 수의 변화 없이 원래의 염기가 다른 하나의 염기로 바뀌는 것을 의미한다.

본 발명의 변이주는 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 일부 염기가 삽입된 삽입 변이를 포함할 수 있고, 이를 통해서 ZEP 유전자를 녹아웃 시킬 수 있다.

본 발명은 일 실시예에서, 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) cw15의 ZEP 유전자 서열(서열번호 1)에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이를 포함할 수 있고, 상기 각 변이주에서 ZEP 유전자가 효과적으로 넉아웃된 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 변이주는 ZEP 유전자 서열(서열번호 1)에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 변이주는 서열번호 2로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 AGP 유전자 서열에서 116번째 염기와 117번째 염기 사이에 일부 염기가 삽입, 결실 및/또는 치환된 변이를 포함할 수 있고, 이를 통해서 AGP 유전자를 녹아웃 시킬 수 있다.

본 발명은 일 실시예에서, 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) cw15의 AGP 유전자 서열(서열번호 2)에서 116번째 염기와 117번째 염기 사이에 아데닌(A)이 삽입되거나; 115번째 염기의 결실 및 116번째 염기가 티민(T)으로 치환된 AGP 유전자 변이를 포함하는 변이주를 제조하였고, 상기 각 변이주에서 AGP 유전자가 효과적으로 녹아웃된 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서 서열번호 2의 AGP 유전자 서열에서 4개의 타겟 부위를 선정하여, sgRNA를 설계하고 이를 이용해서, Cas9을 통한 유전자 교정을 시도한 결과, 다른 타겟 부위를 이용한 경우 AGP 유전자의 녹아웃이 발생하지 않았으나, 서열번호 2의 서열에서 100번째 염기부터 연속하는 20 내지 30개의 염기를 타겟으로 하는 경우, 바람직하게는 115번째 염기 내지 117번째 염기 사이에 변이를 발생시킨 경우에만 AGP 유전자가 효과적으로 녹아웃 되었다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 2의 AGP 유전자 서열에서 115번째 염기 내지 117번째 염기 사이에 변이가 발생하는 경우 AGP 유전자 녹아웃 변이주를 얻을 수 있다는 점에 매우 큰 기술적 특징이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른, 변이주는 AGP 유전자 서열(서열번호 2)에서 116번째 염기와 117번째 염기 사이에 아데닌(A)삽입되거나; 서열번호 2의 AGP 유전자 서열에서 115번째 염기가 결실되고 116번째 염기가 티민(T)으로 치환된 유전자 변이를 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 본 발명의 변이주는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 변이된 AGP 유전자를 포함할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 변이주는 ZEP 및 AGP 유전자 변이를 동시에 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이; 및 서열번호 2로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 AGP 유전자 서열에서 116번째 염기와 117번째 염기 사이에 아데닌(A)삽입되거나; 115번째 염기가 결실되고 116번째 염기가 티민(T)으로 치환된 AGP 유전자 변이를 포함하는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주일 수 있다.

보다 구체적인 예로, 본 발명의 변이주는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8로 표시되는 변이된 ZEP 유전자; 및 서열번호 9 또는 서열번호 10으로 표시되는 변이된 AGP 유전자를 포함하는 것 일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 서열번호 8의 ZEP 유전자 변이; 및 서열번호 9로 표시되는 AGP 유전자 변이를 포함하는 ZEP/AGP 이중 유전자 녹아웃 변이주를 dZA1(double ZEP/AGP mutant 1)으로 명명하였고, 서열번호 8의 ZEP 유전자 변이; 및 서열번호 10으로 표시되는 AGP 유전자 변이를 포함하는 이중 유전자 녹아웃 변이주를 dZA2(double ZEP/AGP mutant 2)로 명명하였다.

본 발명자는 또한, 상기 선발된 변이주 중 클라미도모나스 레인하드티아이 double ZEP/AGP mutant 1(dZA1) 변이주를 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2018년 10월 15일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 13659BP를 부여받았다.

상기 두 변이주 모두 ZEP/AGP 이중 유전자 녹아웃이 효과적으로 이루어져 루테인 및 제아잔틴 생산과 동시에 향상된 지질 생상능을 가짐을 확인하였다. 특히, 본 발명의 변이주로부터 추출된 기능성 오일은 루테인 및 제아잔틴과 같은 항산화능을 갖는 잔토필계 색소의 함량이 야생형 균주 유래의 오일보다 높아, 기능성이 높고, 보관 안전성이 향상된 오일을 제공할 수 있다는 점에서 산업적으로 활용도가 더욱 높다. 또한, 본 발명의 이중 녹아웃을 포함하는 변이주는 야생형 균주와 비교해서 생장 속도가 빨라, 산업적인 규모로 미세조류 유래 물질을 생산 또는 제공하는데 매우 효과적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 변이주는 약광(dim light)에서 생존 가능하고, 구체적으로 10 내지 2,000μmol photons/m²s 범위의 광도 조건 하에서 배양될 수 있다. 상기 변이주가 약광 조건 이하인 완전한 어둠에서는 광합성을 할 수 없고, 너무 높은 광 조건에서는 광 스트레스에 의해 세포가 데미지를 입을 수 있다. 상기 조건에서 본 발명의 변이주를 배양하는 경우, 변이주 내 제아잔틴 함량이 높으면서도, 우수한 생장률을 갖는 장점이 있다.

본 발명의 변이주는 통상의 클라미도모나스 레인하드티아이 조류를 배양할 수 있는 생장환경(광도 조건, 온도 조건, 배지 등) 내에서 적절한 성장을 할 수 있다. 또한, 낮은 광도에서도 우수한 지질 생산능을 가지며, 세포 생장속도도 빨라 식물성 오일 생산 미생물로 산업적으로 효과적으로 사용될 수 있고, 고광도 하에서도 군집 내의 밀도가 다른 조류와 비교해서 상대적으로 낮아, 단일 세포 내 광합성에 의한 색소 생산 효율이 우수한 효과를 갖는다. 구체적으로 클라미도모나스 레인하드티아이 야생형은 제아잔틴을 거의 생산하지 못하였으나, 본 발명의 변이주는 야생형과 달리 제아잔틴을 생산할 수 있고, 10 내지 20% 이상의 지질 생산능 및 20% 이상의 빠른 생장속도를 가지므로, 본 발명의 기능성 오일 생산 균주로서 매우 적합하다.

본 발명의 변이주는 일반적인 클라미도모나스 레인하드티아이의 배양 조건에 따라 배양할 수 있고, 구체적으로 약한 광도 조건에서 조류를 배양할 수 있는 배양 배지를 사용할 수 있다. 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연 배지, 합성 배지 또는 선택 배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다. 예를 들면, 광합성 배지인 HS 배지 또는 TAP 배지로 배양할 수 있으며, 탄소원을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 실시예 내 표 1 또는 표 2의 배양액 조성환경에서, 본 발명의 변이주가 항산화 색소 함량이 증진된 기능성 오일의 우수한 생산능을 가짐을 확인하였다.

상기 배양배지의 pH는 클라미도모나스 레인하드티아이가 생존 및 성장 가능한 범위라면 특별히 제한되지 않고, 일 예로 pH 6 이상, 구체적으로 pH 6 내지 pH 9에서 생존가능하며, pH 7.0 이상 내지 pH 8.0 미만에서 최적의 성장률을 가질 수 있다.

본 발명의 변이주는 크리스퍼 유전자 가위 기술을 이용하여 ZEP 유전자 및 AGP 유전자 내 타겟 서열에 직접 RGEN RNP로 도입함으로써 제작할 수 있다.

본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 세포 내에 제아잔틴 잔토필계 색소 및 지질을 고함량으로 축적할 수 있어, 본 발명의 변이주로부터 추출된 기능성 오일 또는 이를 포함하는 유화액을 식품, 사료, 의약품 등의 원료로 효과적으로 사용할 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 유래의 기능성 오일을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 화장료 조성물, 식품 조성물, 식품 첨가제용 조성물, 사료 조성물, 사료 첨가제용 조성물, 의약 조성물, 식품 원료 조성물, 사료의 원료 조성물 또는 의약 원료 조성물일 수 있다.

상기 배지는 특성 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 액체 또는 고형의 물질로, 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합될 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지 또는 합성배지를 모두 포함한다. 또한, 상기 배지는 완전배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 배지의 pH는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주가 생장 가능한 범위일 수 있고, 일 예로 pH 6 이상, 바람직하게는 pH 6 내지 pH 9 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 클라미도모나스 레인하드티아이 야생형 조류, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 각 세포당 총 색소 내 제아잔틴의 함량을 측정한 결과, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 경우 야생형과 비교해서 색소 중 제아잔틴의 함량이 현저하게 높고, 지질 생산능도 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 12b, 도 13a 및 도 13b).

상기 조성물은 식품 또는 사료의 원료로 사용될 수 있고, 경구 투여 또는 경구 외 투여 제제로 사용될 수 있다. 일 예로, 경구 또는 주사제 투여를 위한 제제로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 상기 조성물 또는 추출물을 포함하는 조성물은 식품, 의약품 또는 사료 등에 포함되는 경구로 공급될 수 있다는 점에서 경구 투여용 조성물일 수 있다.

경구 투여용 조성물의 경우, 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화된 경구용 제제에 포함될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제물을 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다.

상기 조성물은 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 변이주는 항산화 색소 함량이 증진된 기능성 오일 생산능을 가지므로 산폐가 잘 되지 않고, 기능성으로 항산화 활성 등이 종래의 미세조류 유래의 식물성 오일보다 우수한 오일을 제공할 수 있어, 식품, 건강기능식품, 사료 또는 의약품 등의 원료로서 효과적으로 이용될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 식품 또는 사료에 특별한 목적 용도를 달성하기 위하여 첨가될 수 있으므로, 이러한 측면에서 식품 조성물, 식품첨가제용 조성물, 사료 조성물 또는 사료첨가제용 조성물일 수 있다. 상기 조성물이 사료 또는 식품에 사용되는 경우, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주에 의해 생산되고 세포에 축적된 제아잔틴을 비롯한 색소 및 지질에 의하여 체내 건강을 유지 또는 강화할 수 있다.

본 발명에서 "첨가제용"은 식품 또는 사료에 주원료가 외에 첨가되는 구성이라면 모두 포함되며, 구체적인 예로 식품 또는 사료에서 기능성을 갖는 유효 활성물질 또는 가공식품에서 착색, 보존 등을 위해 첨가되는 식품 의약품 안전처에서 정의하고 있는 식품첨가물일 수 있다. 상기 식품은 건강 기능성 식품일 수 있다. 보다 구체적으로, 눈 건강을 위한 건강 기능성 식품일 수 있다.

본 발명에서 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 유래 기능성 오일 또는 이의 유화액을 포함하고, 추가적으로 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 포함하여 제조할 수 있다.

상기 조성물은 식품 또는 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제 (powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 조성물의 pH는 조성물이 사용되는 약제, 식품 등의 제조조건 등에 따라서 용이하게 변경 가능하다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 유래 기능성 오일 또는 이의 유화액을 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 상기 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 낮은 광도에서 잔토필, 특히 제아잔틴의 우수한 생산능을 가지므로, 상기 변이주 및 이의 부산물을 포함하는 조성물은 신체 활성 향상, 체기능성 유지 및 저하 예방 효과를 가진다. 구체적으로, 상기 잔토필 색소는 황반변성 억제 효과, 항산화, 항암 효과 등이 있는 것으로 알려져 있고, 미세조류 유래 식물성 오일은 불포화 지방산의 효과적인 공급처이므로, 본 발명의 조성물은 신체건강 유지용, 구체적으로 상기 잔토필 색소 및 불포화 지방산이 관여하는 신체 기능의 유지, 저하 예방 또는 향상을 용도로 식품, 건강 기능식품, 의약품 또는 사료 등에 포함되는 원료로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 기능성 오일의 제조방법은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 생산방법은 상기 배양 단계 이후에, 배양물로부터 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 분리하는 것;을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 변이주를 이용한 기능성 오일의 생산방법은 세포의 생장속도가 빨라 목적 물질의 빠른 회수가 가능하고, 고함량의 제아잔틴 생산능 및 지질 생산능을 가지므로 보관 기간이 길고, 항산화 활성이 우수한 식물성 오일 제공하는데 효과적으로 활용할 수 있다는 점에서 매우 큰 장점이 있다.

상기 배양은 pH 6.0 내지 8.0 조건의 배지에서 수행될 수 있다. 또한, 약광 조건, 구체적으로 10 내지 2,000μmol photons/m²s 범위의 광도 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 경우 낮은 광도에서도 색소 생산능이 우수하여, 체내 제아잔틴 함량을 높일 수 있는 바, 고광도의 에너지를 투여하지 않고도 우수한 제아잔틴 축적을 달성할 수 있어, 산업적으로 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 생산방법은 배양 단계 외에, 배양 후 조류의 함량을 높이는 농축 단계, 농축 단계를 거친 조류의 수분을 더욱 감소시킴으로써 건조시키는 건조단계를 더 포함할 수 있다. 그러나 농축단계 또는 건조 단계가 반드시 필요한 것이 아니며, 일반적으로 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 농축 및 건조방법, 기계를 사용하여 수행할 수 있다.

상기 생산방법은 배양물로부터 분리된 물질을 정제하는 단계를 더 포함하여 수행할 수 있고, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 정제방법에 의하여 수행될 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 균주의 배양

본 발명의 일 실시예에서 클로미도모나스 조류의 배양은 특별히 언급하지 않는 한, 다음의 배지 및 배양조건에 따라서 수행되었다.

1-1. 독립영양 배양

광합성만을 이용하여 외부의 탄소원 공급이 없는 상태로 배양하는 독립영양 배양(Autotrophic culture)을 하는 경우 최소 배지인 HS 배지에서 5% CO₂를 공급하여 배양하였다. 하기 표 1과 같은 조성을 가진 배지를 만든 뒤 오토클레이브에서 고압살균하고, 활발한 성장기(growth stage)에 있는 세포를 이용하여 배양액에 10⁶cell/mL의 농도가 되도록 만들어 성장을 시작하였다. 배양용기는 도 11과 같이 유리로 된 컬럼(column)을 사용하여 아래에서 공기(Bubble)를 공급하고 양 옆에서 200uE의 광도로 형광등을 이용해 빛을 주었다.

1-2. 혼합영양 배양

광합성과 탄소원을 같이 공급하여 배양하는 혼합영양 배양(Mixotrophic culture)의 경우는 TAP 배지에서 아세트산(acetic acid)을 첨가하여 배양하였다. 하기 표 2와 같은 조성을 가진 배지를 만든 뒤 오토클레이브로 고압/살균하고, 활발한 성장기(growth stage)에 있는 세포를 이용하여 배양액에 10⁶cell/mL의 농도가 되도록 만들어 성장을 시작하였다. 배양용기는 도 12와 같이 유리로 된 플라스크 또는 병(bottle)을 사용하여 큰 부피(volume)로 배양하였으며 자성 막대(magnetic bar)를 이용하여 저어주었다. 70uE의 광도로 형광등을 이용해 빛을 함께 주었다.

실시예 2. 크리스퍼 유전자 가위 기술(CRISPR-Cas9 RNP)을 이용한 ZEP 유전자 녹아웃 클라미도모나스 변이주 제작

클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자(phytozome: Cre02.g082550 또는 NCBI:AY211267.1)[https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!gene?search=1&detail=1&method=4614&searchText=transcriptid:30785220; 2번 염색체 중 1244277-1250969의 위치에 존재]를 표적하기 위해 sgRNA는 Cas-Designer (www.rgenome.net)을 이용하여 미세상동성-유도된(microhomology-driven) 구조 이동 돌연변이(frame shift mutation)를 유도하는 다섯 개의 sgRNA을 디자인하였으며, 이를 In vitro 전사(transcription) 방법을 통해 합성하였다. Cas-디자이너(www.rgenome.net/cas-designer/)를 사용하여 ZEP 유전자를 표적하기 위해 제작된 다섯 개의 sgRNA의 타켓 서열은 다음 표 3과 같다.

전체 게놈에서 3 뉴클레오타이드(nt)만큼 어떠한 다른 표적 부위들과 상이하고 66보다 더 높은 프레임-외 스코어를 가진 ZEP 유전자의 코딩 서열 영역의 절반 내에서 5개의 sgRNA를 신중하게 디자인하였다. 'CDS(코딩 서열) 위치'는 RNA 전사물에서 절단 지점의 상대적인 위치를 의미한다. Direction의 +는 타겟 서열과 동일한 방향, 즉 같은 시퀀스가 RGEN의 시퀀스이며, -는 타겟 서열과 역방향, 즉 표적 서열(target sequence)과 결합되어 있는 서열인 서로 상보적인(reverse complement)한 관계의 서열을 의미한다. '프레임-외 스코어(Out-of-frame Score)'는 깨진 이중-가닥 DNA가 미세 상동성-매개된 단부 연결(MMEJ) 경로에 의해 수선될 때 발생하는 프레임쉬프트-유도 결실의 가능성을 가리킨다. '표적-오프 부위의 #'은 전체 게놈을 통틀어 미스매치된 서열의 수를 의미한다. 타겟서열에 나머지 sgRNA 서열(Gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc) 연결하면 전체 sgRNA를 나타낸다.

Cas9 단백질 경우 E.coli를 이용하여 재조합 Cas9 단백질(recombinant Cas9 protein)을 발현시켜 정제를 거쳐 준비하였다. 실험에 사용된 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 mt (CC-4349)은 Chlamydomonas Resource Center(www.chlamycollection.org)로부터 확보하였다[http://www.chlamycollection.org/product/cc-4349-cw15-mt-goodenough-330a/].

클라미도모나스 세포는 표 2의 TAP 배지를 이용해 25℃에서 50ml 플라스크에 담아 70uE의 광도로 형광등을 이용해 빛을 제공하고, 90rpm으로 흔들어 주면서(shaking) 배양하였다. 세포의 농도는 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 측정하며 OD750에서 0.3 ~ 0.5 정도의 활발히 배양 중인 시기의 세포를 사용하였다.

RNP 복합체를 만들기 위해 100㎍의 Cas9 단백질(도 5, 서열번호 13)은 70㎍의 sgRNA(서열번호 14, 앞 쪽 20bp가 DNA의 표적서열과 결합하는 부분이고, 나머지 서열은 Cas9 단백질과 복합체를 만들기 위한 서열, 앞쪽 20bp는 표적서열에 따라 표 3의 표적서열에 따라 달라짐)와 뉴클레아제-프리(nuclease-free) 물에서 섞고, 10분간 상온에서 인큐베이션 하였다. 결합된 RNPs 복합체는 50ⅹ10⁴개의 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 mt(CC-4349) 세포와 함께 4mm 전기천공(Electroporation) 큐벳(cuvette)에서 Biorad Gene Pulser Xcell™ 전기천공 시스템(Electroporation System)을 이용하여(Voltage 600V, Capacity 50uF), 전기충격을 통해 형질 전환시킨 뒤, 12시간 동안 암조건에서 인큐베이션 한 후에 gDNA를 추출하여, 표적 심층 시퀀싱(targeted deep sequencing)으로 분석하였으며, 일부는 2000개의 세포로 희석(dilution)하여 TAP 한천 평판(agar plate)에 도말하여 단일 콜로니(single colony)를 얻었다.

도 3a 및 3b는 표적 심층 시퀀싱에 의해 RGEN-RNPs에 의해 유도된 ZEP 유전자의 돌연변이를 확인한 결과이다. 가장 형질전환 효율이 높은 세 번째 sgRNA(0.456%)에 의해 유도된 단일 콜로니(single colony)를 분리하여 표적 유전자(target gene)의 돌연변이를 확인하였다. 도 3b는 표적 심층 시퀀싱의 결과로, RNP를 이용한 형질전환 실험 후 전체 세포를 모으고 gDNA를 뽑아서 분석했을 때 전체 세포를 대상으로 표적 부위의 DNA 가닥에서 일어나는 모든 변이를 분석하여 그 패턴과 빈도(frequency)를 알 수 있다. 다만, 도 3b는 표적 심층 시퀀싱을 통해 표적부위에서 실제로 확인된 변이의 패턴들을 나타내는데, 42bp 이상의 삽입(insertion)과 같은 큰 사이즈 변화는 표적 심층 시퀀싱의 원리로는 찾아내기 어려우므로, 실제로 얻어진 단일 콜로니(single colony)의 변이와 차이가 있을 수 있다.

이렇게 ZEP 유전자 특이적 녹아웃 돌연변이체를 DNA 없는 RGEN RNP를 사용하여 생성한 후에, 페트리 디쉬에서 모든 세포에 대해 Chl 형광을 측정하였고 여러 개의 추정되는 ZEP 녹아웃 세포주를 선별하였다.

도 6a에서 적색 원형은 약광(50μmol photons/m²s) 조건 하에서 TAP 아가 배지 상에서 성장한 추정되는 ZEP 녹아웃 돌연변이체를 가리킨다. NPQ/4영상은 Imaging PAM(Walz)으로 측정되었다. 야생형(WT) 및 ΔZEP 돌연변이주의 단일 세포 콜로니들이 약광(50μmol photons/m²s) 조건 하에서 최소 한천 배지 상에서 성장하였다(도 6a 및 6b). 이렇게 확인된 콜로니 중 황반색소 함량이 증가된 변이주 3개(△Z1, △Z2, △Z3)를 선별하였으며, RGEN RNPs에 의해 발생된 세 개의 ZEP 돌연변이체에서 실제적인 ZEP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화를 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)을 통해 확인하였다(도 2a, 2b 및 도 2c).

도 6b에 나타낸 바와 같이, 동일한 조건의 광도 하에서 TAP 한천 평판에서 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15, 그리고 변이주 △Z1, △Z2, △Z3의 콜로니가 서로 유사한 형태와 크기로 자란 것을 확인할 수 있었다. 또한, HS 배지에서 광합성을 통해 액체 배양된 세포들 경우, 같은 세포수의 농도에서 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 조류는 녹색을 띄는 것에 비해 변이주 △Z1, △Z2, △Z3은 풀색 톤의 유사한 녹색을 띠는 것을 확인할 수 있다(도 6c).

선발된 변이주 중 변이주 Z1는 클라미도모나스 레인하드티아이 ZEP 변이 1 (△Z1)(Chlamydomonas reinhardtii ZEP mutant 1(△Z1))로 명명하였으며, 상기 변이주는 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2017년 3월 22일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 13230BP를 부여 받았다.

이후, 이중 유전자 교정을 위해 변이주 Z1을 이용하였다.

실시예 3. 클라미도모나스에서 크리스퍼 유전자 가위 기술(CRISPRCas9 RNP)을 이용한 AGP ( ADP glucose pyrophosphorylase ) 유전자 녹아웃 클라미도모나스 변이주 제조

AGP 유전자를 표적하기 위해 sgRNA는 Cas-Designer(www.rgenome.net)를 이용하여 미세상동성-유도된(microhomology-driven) 구조 이동 돌연변이(frame shift mutation)를 유도하는 네 개의 sgRNA를 제작하였다. AGP 유전자를 표적하기 위해 제작된 네 개의 sgRNA는 다음 표 4와 같다(각 항목의 의미는 표 3 참고).

AGP4	RGEN Target (5' to 3')	Position	Cleavage Position (%)	Direction	GC Contents	Out of frame Score	Mismatches
sgRNA					(%, w/o PAM)		0	1	2
AGP4_sg1	TAGCATGGCCCTGAAGATGCGGG	100	4.6	+	55	48.9	1	0	0
AGP4_sg2	CAGACCTTCGTCTGCCCCCACGG	149	12.9	+	65	68.9	1	0	0
AGP4_sg3	GACTCATCTCGCAGGCTCAGTGG	229	20.1	+	60	70.1	1	0	0
AGP4_sg4	GTCGACCCCCGTTGAGACCAAGG	393	41.6	+	65	45.7	1	0	0

RNP 복합체를 만들기 위해 100㎍의 Cas9 단백질(도 5, 서열번호 13)과 70㎍의 sgRNA(예: 서열번호 15, 앞 쪽 20bp가 DNA의 표적서열과 결합하는 부분이고, 나머지 서열은 Cas9 단백질과 복합체를 만들기 위한 서열, 앞쪽 20bp는 표적서열에 따라 표 3의 표적서열에 따라 달라짐)를 뉴클레아제-없는(nuclease-free) 물에서 섞고, 10분간 상온에서 인큐베이션하였다. 결합된 RNP 복합체는 50ⅹ10⁴개의 클라미도모나스(Chlamydomonas) 세포와 함께 4mm 전기천공 큐벳(cuvette)에서 Biorad Gene Pulser Xcell™ 전기천공 시스템(Electroporation System)을 이용하여(Voltage 600V, Capacity 50uF) 형질전환 시킨 뒤, 12시간 동안 암조건 인큐베이션 한 후에 gDNA 추출하여 딥 시퀀싱(deep sequencing)하여 분석하였다. 일부는 2000개의 세포로 희석(dilution)하여 TAP 아가 플레이트에 도말하여 단일 콜로니(colony)를 얻었다.

도 7은 야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 조류의 AGP의 유전자 정보 및 타겟 서열을 나타낸다. 도 8b는 두 개의 변이주에서 실제적인 AGP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화를 확인한 결과이다. 또한, 도 9a 및 9b에서 생어 서열 분석법(Sanger sequencing)을 통해 확인한 상기 유전자 교정을 통해서 선별된 dZA1과 dZA2 변이주에서 AGP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화를 보여준다.

실시예 4. ZEP / AGP 이중 유전자 녹아웃의 변이주의 세포적 특성 분석

상기에서 단일 콜로니로 분리된 두 개의 ZEP/AGP 이중 녹아웃의 변이주(dZA1 및 dZA2)의 세포적 특성을 확인하였다.

도 10의 a는 동일한 농도에서 야생형 클라미도모나스 균주와 CRISPR-Cas9 RNP에 의해 발생한 본 발명의 ZEP/AGP 이중 녹아웃 변이주들의 색을 비교한 사진이다.

또한, 세포들의 질소고갈 환경에서 루골 용액을 이용한 전분(starch) 변색 반응을 비교하여, AGP 녹아웃이 잘 이루어졌는지 확인하였다. 질소가 충분한 배지와 질소 고갈 배지에서 각각 세포를 배양하여 건강한 상태의 세포를 획득하였다. OD750 = 1인 세포 배양액 1ml에 루골용액 1μl를 넣고, 30초 동안 세포를 균일하게 섞어준 후, 질소 조건에 따라 루골용액에 반응한 색깔을 비교하였다.

질소 고갈 조건에서 세포는 스트레스를 받아 세포 내에 전분과 지질을 축적하는데, 야생형 균주의 경우 질소 고갈 조건에서 세포 내 전분이 루골 용액으로 염색되어 보라색을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 그러나, ZEP/AGP 이중 녹아웃 변이주들은 AGP 유전자의 녹아웃으로 인해 전분 합성이 저해되어, 질소 고갈 환경에서도 루골에 의한 변색반응이 일어나지 않았다. 따라서, 도 10의 b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ZEP/AGP 이중 녹아웃 변이주에서 AGP 녹아웃이 잘 된 것을 확인할 수 있다.

클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형 조류와 ZEP/AGP 이중 녹아웃 변이주의 세포 성장률을 비교하기 위해 혼합영양배지인 TAP 배지에서 50μmol photons/m²s의 광도 조건에서 배양 실험을 하였다. 초기 접종 세포 수는 1x10⁶cells/ml로하고, 72시간 동안 12시간 간격으로 세포수를 측정하여 성장 곡선을 그렸다.

도 11에 나타낸 바와 같이, ZEP/AGP 이중 녹아웃 변이주들은 야생형과 비교해서 부피당 세포수가 빠르게 증가하는 것을 알 수 있다. 특히, dZA1 변이주는 야생형 조류와 비교해서 20%의 빠른 성장률을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

실시예 5. ZEP / AGP 이중 유전자 녹아웃의 변이주의 지질과 색소 함량 분석

본 발명의 변이주와 야생형 균주의 색소 함량의 차이를 비교하기 위해서 HPLC를 이용해 각 균주들의 세포 색소 프로파일을 분석하였다.

분리된 단일 콜로니들을 TAP 배지에서 70μmol photons/m²s 조건으로 3일 동안 배양하였고, 구체적인 배양 조건은 실시예 1의 배양 조건과 같이 수행하였다. 수확된 조류들을 90% 아세톤을 사용하여 색소를 추출하고 원심분리한 상층액을 다시 나일론 필터를 이용하여 여과한 후 HPLC에 주입하여 분석하였다. 구체적으로, 색소를 분리하기 위해 용매의 총 유속은 분당 1.2mL로 하였고, 제0분 내지 제15분까지 pH 8.0의 Tris는 14%, 아세토니트릴은 84%로부터 0%까지 각각 균일하게 감소시키고, 메탄올과 에틸아세테이트는 2%로 시작하여 제15분까지 각각 68%, 32%까지 증가시켰다. 이후 3분 동안(제15분 내지 18분) 이 용매 비율을 그대로 유지시킨 다음, 1분 동안(제18분 내지 제19분) 각 용매의 비율을 시작할 때의 비율로 되돌린 다음 나머지 6분간 그대로 유지하며 포스트-런(postrun)을 하였다. 펌프는 Shimadzu사의 LC-20A Prominence를, 컬럼은 Watera Spherisorb TMS5(DS1 4.6 x 250mm, 5μm Cartridge Column, USA)를 사용하였고, 컬럼의 온도는 40 ℃로 유지하였다. 검출기는 포토다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector: SPD-M20A, Shimadzu)를 사용하여 데이터를 분석하였고, 제아잔틴을 비롯한 카로티노이드 색소들은 445nm에서, 엽록소 a는 670nm에서 검출된 결과를 DHL(Agern Alle, Horsholm, Denmark)에서 구입한 카로티노이드와 엽록소 a, b를 정량한 표준곡선을 스탠다드로 사용하여 농도를 구하였다.

도 12a는 야생형(WT) 균주와 dZA1 및 dZA2 변이주(CRISPR-Cas9 RNP에 의해 발생한 ZEP/AGP 이중 녹아웃 변이주)의 색소 프로파일을 분석한 그래프이고, 도 12b는 한 세포당 루테인 및 제아잔틴의 함량을 비교한 그래프이다. 야생형 균주에서는 제아잔틴의 함량이 거의 존재하지 않으나, 본 발명에 따른 변

이주에서는 세포 내 제아잔틴의 함량이 매우 크게 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한, 시간의 따라 부피 당 루테인 및 제아잔틴의 함량을 확인하여 도 12c 및 12d에 각각 나타내었다. 야생형 균주의 경우, 역시 제아잔틴을 전혀 생성하지 못하였고, 각 변이주에서만 시간의 경과에 따라 제아잔틴 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이주가 야생형 균주와 색소 생산능에서 상이한 균학적 특성을 가짐을 알 수 있다.

또한, ZEP/AGP 이중 유전자 녹아웃의 변이주의 지질 생산능을 확인하기 위해서, 질소 고갈 환경에서 야생형과 본 발명의 각 변이주들의 지질 함량을 분석하였다. TAG(Triacylglycerol)을 측정할 수 있는 나일 레드 염색 용액을 이용해서 야생형 균주 및 dZA1 및 dZA2 변이주의 지질 함량을 각각 측정하였고(도 13a), 유기 용매 추출법을 이용해서 추출한 전체 세포 지질의 함량을 측정하였다(도 13b).

도 13a 및 13b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 dZA1 및 dZA2 변이주가 야생형과 비교해서 약 10 내지 20% 이상의 향상된 지질 생산능을 가짐을 알 수 있고, 도 12의 결과와 종합하면, 지질 내 포함된 루테인 및 제아잔틴과 같은 항산화 색소의 함량도 높아, 우수한 성질을 가짐을 알 수 있다.

실시예 6: 초음파 추출 방법을 이용한 기능성 오일 추출

본 발명의 변이주로부터 루테인 및 제아잔틴 함량이 증대된 기능성 오일을 추출하기 위하여 초음파 추출 방법을 이용하였다.

dZA1 변이주를 동결 건조한 다음, 갈색병에 정확하게 칭량한 0.5g C.reinhardtii 건조분과 헥산:아이소프로판올 3:2(v/v) 혼합용액을 변이주 1g에 대하여 60 내지 140mL의 비율로 혼합하였다.

갈색병을 초음파 발생장치(Powersonic 505, 화신공업사, 40kHz)에서 30 내지 50℃의 온도에서 90-210분간 처리하였다.

원심분리기(514R centrifuge, ㈜한일과학)를 이용하여 3500g의 중력가속도로 25℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 추출하였다. 얻어진 상층액을 분별깔대기에서 0.88%(w/v) 염화칼륨 용액과 50:50(v/v)의 비율로 혼합하고 헥산과 아이소프로판올, 염화칼륨용액이 분리되면 헥산 상을 수집하였다.

감압증류장치에서 50℃의 온도로 가열하여 헥산을 휘발시켜 기능성 오일 추출물을 얻었다.

얻어진 추출물은 Sulfo-phospho-vanillin법을 통해 지질양을 구하며, HPLC를 통해 루테인, 제아잔틴의 양을 구하였다. 그 결과를 아래의 표 5에 나타내었다.

구분	온도	시간	용매비율 (mL/g)	지질양 (mg)	루테인 (mg/g)	제아잔틴 (mg/g)
실험 1	30	150	100	48.92	0.39	0.23
실험 2	35	150	100	71.89	0.65	0.36
실험 3	40	150	100	74.73	0.61	0.35
실험 4	45	150	100	52.65	0.46	0.26
실험 5	50	150	100	46.12	0.39	0.22
실험 6	35	90	100	32.2	0.4	0.24
실험 7	35	210	100	50.99	0.38	0.22
실험 8	35	150	60	50.79	0.51	0.27
실험 9	35	150	80	76.06	0.45	0.27
실험 10	35	150	120	65.73	0.46	0.27
실험 11	35	150	140	50.97	0.28	0.16

상기 표에서 확인 가능한 바와 같이, 초음파 추출을 이용하여 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 경우 35℃ 내지 40℃에서 수행하는 것이 지질양과 루테인 및 제아잔틴 함량이 가장 높게 추출이 되는 것을 확인하였으며, 특히 35℃가 가장 높은 수율을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다.

추출 시간과 관련하여, 90분의 경우 추출 시간이 다소 부족하여 지질양과 루테인 및 제아잔틴 함량이 부족하게 추출이 되었으며, 150분의 경우 가장 높은 수율을 나타내었다. 210분간 추출한 경우 오히려 수율이 더 감소하는 경향을 나타내었다.

미세조류를 헥산 및 아이소프로판올 용액과 혼합한 비율에 따른 루테인 및 제아잔틴의 수율을 살펴보면 변이주 1g에 대하여 용매를 80mL 사용한 경우 가장 높은 지질양이 추출되었지만, 루테인 및 제아잔틴 함량은 100mL의 용매를 사용한 경우 가장 높은 것으로 확인되었다.

실시예 7: 기능성 오일의 저장안정성 시험

추출된 기능성 오일 2g을 옥수수유 100mL에 혼합하여 온도, 산소 및 빛 조건 하에서 저장 안정성에 대한 실험을 수행하였다.

먼저 온도에 대한 저장안정성을 확인하기 위하여 옥수수유 혼합물을 4℃, 25℃ 및 37℃에서 15일간 보관하여 루테인 잔존량을 측정하였다. 대조군으로는 옥수수유와 동일한 중쇄지방산인 테트라데케인(tetradecane)을 사용하였다. 결과를 도 14a에 나타내었다. 기능성 오일을 옥수수유에 보관한 경우 저온, 중온 및 고온 조건에서 모두 안정적인 결과를 나타내었으나 테트라데케인에 보관한 경우 고온에서 15일 후 50% 이하의 잔존량을 기록하였으며 중온의 경우에도 70% 수준의 루테인 잔존량을 나타내어 저장안정성이 부족한 것을 확인하였다.

산소의 영향을 확인하기 위하여 25℃에서 옥수수유 및 테트라데케인에 각각 산소를 제공하면서 15일간 보관하였다. 그 결과를 도 14b에 나타내었다. 산소를 제공한 경우 잔존량이 약간 떨어지는 경향을 나타내었으나 옥수수유 및 테트라데케인 모두 산소에 의한 영향은 작은 것을 확인하였다.

빛에 의한 영향을 확인하기 위하여, 산소와 동일한 조건으로 산소 대신 빛을 제공하여 실험을 수행하였다. 도 14c에서 옥수수유의 경우 빛을 제공하더라도 잔존량에서 크게 차이가 나지 않은 반면, 대조군의 경우 15일 후 10%대까지 잔존량이 하락하여 빛에 의하여 영향을 크게 받는다는 것을 확인하였다.

도 14d는 산소와 빛을 동시에 제공한 경우의 실험 결과를 나타낸다. 옥수수유에 보관한 경우 산소와 빛을 동시에 제공하더라도 약 25% 정도의 잔존량 하락을 나타내었으나, 대조군의 경우 약 60%의 잔존량 하락을 나타내었다.

실시예 8: 기능성 오일 함유 유화액 제조

상기 실시예 7의 옥수수유를 이용하여 유화액을 제조하였다.

400mL 증류수에 아세트산 나트륨 0.12g(분자량 136.09g/mol) 및 아세트산 0.37g(분자량 60.05g/mol)을 넣은 후 용해시켰다. 그 다음 0.1M NaOH 또는 HCl 용액으로 pH 4로 맞춘 후 500mL까지 증류수를 넣어 수상분을 제조하였다.

옥수수유 100mL 및 수상분 400mL을 혼합한 후 균질기로 6000rpm에서 2분간 균질화시켰다. 균질화 시킨 용액을 초음파 분산기를 이용하여 15분 처리하였다. 제조된 유화액을 도 15에 나타내었다.

제조된 유화액에 대한 저장 안정성 실험은 온도와 형광 조건을 각기 달리하여 실험을 수행하였다.

온도에 대한 저장 안정성을 확인하기 위하여 제조된 유화액을 질소로 치환한 후 빛을 차단한 조건에서 4℃, 25℃ 및 37℃에서 15일간 보관하며 루테인과 제아잔틴의 잔존량을 HPLC를 통해 측정하였다. 이때 루테인의 잔존량은 도 16a, 제아잔틴의 잔존량은 도 16b에 나타내었다.

도 16a 및 16b에서, 저장기간에 따라 루테인과 제아잔틴의 함량은 유의적으로 감소하였고, 온도가 높을수록 루테인, 제아잔틴의 분해가 촉진됨을 확인할 수 있었다.

이후 빛에 의한 영향을 확인하기 위하여, 25℃ 조건에서 형광 조건만 달리 하여 실험을 수행한 결과를 루테인 및 제아잔틴에 대하여 도 16c 및 16d에 각각 나타내었다.

도 16c 및 16d에서 유화액의 경우 루테인과 제아잔틴의 함유량은 빛의 영향이 미미하다는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC13659BP 20181015 한국생명공학연구원 KCTC13230BP 20170322

SEQUENCE LISTING <110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> CHLAMYDOMONAS MUTANTS AND USE THEREOF <130> P18U22C1021 <160> 16 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 6693 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 1 gcgacgcacg gctgggccaa attcgccaac ggcaggagac caaatcgatc gaggcgatct 60 tgcgaagttc tcggacaaat cgatcgcacc catagtgatt taagcattac atttgcccaa 120 ggcgtgagaa gtgcgaggcc cgaacggcta tgacgccaat gcgcagctta cgacatttaa 180 agcaaattat tcatacatca tacagcacgc ttatgtgaag aaagccagga ttttaggctc 240 tcgccccgat caagacgatc tccccattgc gaagttctcg gtttctttcc ggttcgcctg 300 ctccgtatga tttacctttg cgctacaaca gcgacttaaa cgacctacgt cgccttactg 360 tgtgcgcgta cgtgtttgta gctgtgagat agttttgtcc gcagcgtacc cgcaaataga 420 atgctcgcga gcacttacac gccctgtggc gttcgccagg tggcaggccg cacggttgca 480 gtgcccagca gcttggtcgc gccagtggca gtcgctcggt cgctggggtt ggcgccctac 540 gtccctgtat gtgagccttc tgcggcgctt ccggcctgcc agcagcctag cgggcgtcgt 600 catgttcaga ctgctgccac tctccgtgcc gacaacccca 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cagcagtggt ggacagagct 2700 gttgaggcac ggcgcctgac tgcccggtgg tgacgatgtg cggatgctcg cgcccagcag 2760 aagggaccag gacccggctg gtggccgccg ccgccgccgc agcagcagtc gccacgtagc 2820 acgcagcggc tacagcagca accggcgccc acacccgcac cacaacccca gccaccgcac 2880 cagccaaaca cacgcaccct tccctctctc cccctctcct cacacggccc gcactgacct 2940 gtccctcccc gtctccctct gctccccctc cgccacctca gcgccgccgc caagccctac 3000 atcgcctcca tgggcatcta cgtcatgtcc gccaaggcgc tgcgcgagct gctgttgaac 3060 cgcatgccgg gcgccaacga cttcggaaac gaggtcatcc ccggcgccaa ggacgccggc 3120 ttcaaggtgc aggccttcgc ctttgacggc tactgggagg acatcggtac cgtggaggcc 3180 ttctacaacg ccaacctggc gctgaccgat cccgagaagg cgcagttctc gttctacgac 3240 aaggacgcgc cgatctacac catgtcgcgc ttcctgccgc cctccaaggt gatggactgc 3300 gacgtgaaca tgtccatcat cggcgacggc tgcgtgatca aggccggctc caagatccac 3360 aactccatca tcggcatccg ctcgctgatc ggctccgact gcatcatcga cagcgcgatg 3420 atgatgggct cggactacta cgagaccctg gaggagtgcg agtacgtgcc cggctgcctg 3480 cctatgggcg tgggcgatgg ctccatcatc cgtcgcgcca ttgtggacaa gaacgcgcgc 3540 attggtccca agtgccagat catcaacaag gacggcgtca aggaggccaa ccgcgaggac 3600 cagggcttcg tgatcaagga cggcattgtc gtcgtgatca aggactcgca catccccgcc 3660 ggcaccatca tctaaacgtg atggctcggg ccgggaagag gcggcgcggc gcagagccgg 3720 ccggcgcggc ggcagccggc ggcgcgcggc gtgtggcgga gacgttggtg atggagagca 3780 gacggaggtg gcgggacctc aggcacattt cggcagctgc cgcagcgagg agcagggaga 3840 gcgagcgtgt gtgggtgcac acgctagcgc gcactcacga cctgcagcag cagcagccgt 3900 ggcggagatg gcgggagctg ctcgggtact gttgaagcga ggcgggccct tggctgcgtt 3960 tttgggttgg aatgttgcgc agtgacggga ctctatagag taggggggat tgagtgtcct 4020 tggttcgggt gaacgccatg gaccggtgcg gcacggcgtg gcgtggcact gcgttgctgc 4080 ggaagcgcaa gctgcggcct tcccgcaacg gtgcagcagc cgcatcggac gcaacacccc 4140 aggagcggca gtagctgcca gtcgcgtgcg gctgttttga gggagagcgc tttttcggga 4200 gcgtgaacgg tcggaccaag caccggcggt ggcagcggca ggccttcggc cccccggccc 4260 ttaaagctgc cggcgccaag gcacgccgcg aggcgtgtgt gttcccgagg tgcagccggg 4320 cggtggcggc tgcagggtgg gtgcgagcca gctggcgtgc catccagcac ggcggcggtt 4380 gttgcggctc ggcggtgggg aaggtggagc actgagcggg cgtgggtcgg gacgcttcgc 4440 ggctcacgcg gcggttggcc gttgcggctg ccttccgtgg gatgccgtag gaggggcggg 4500 tccttactcg ctcgcgtccc acctgggggg ttgtagtttc ttaatttagc gtgtaccatg 4560 ctcaacattg tttgactccc ccagaccctg cgaacctgca tctgcggagg tagagagggc 4620 tcttgggtgt gtgcagattt ttggttgttt ggtttgggtg atggtgcaac agttttgcgc 4680 gtggcgagtg tgtgcgttct cagatgagga gaattgtttg tgctatgcag agttgaggcg 4740 agaggaagac ttttgggcac gactgcaccg tgcatccatg gagcacagct gcatagaagc 4800 acgtgggcaa cgcacggctt gcaccgtccg atgcatcgtc ccctccccca gagatttgga 4860 ccgagagaag aaatccagca catgtaaact cgtatgaggg ca 4902 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 11 cccatccagg tgcgttcgcc gga 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 12 tagcatggcc ctgaagatgc ggg 23 <210> 13 <211> 1406 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Cas 9 protein <400> 13 Met Gly Ser Ser His His His His His His Val Tyr Pro Tyr Asp Val 1 5 10 15 Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile 20 25 30 Arg Ile Pro Gly Glu Lys Pro Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp 35 40 45 Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys 50 55 60 Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser 65 70 75 80 Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr 85 90 95 Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg 100 105 110 Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met 115 120 125 Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu 130 135 140 Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile 145 150 155 160 Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu 165 170 175 Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile 180 185 190 Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile 195 200 205 Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile 210 215 220 Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn 225 230 235 240 Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys 245 250 255 Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys 260 265 270 Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro 275 280 285 Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu 290 295 300 Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile 305 310 315 320 Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp 325 330 335 Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys 340 345 350 Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln 355 360 365 Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys 370 375 380 Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr 385 390 395 400 Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro 405 410 415 Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn 420 425 430 Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile 435 440 445 Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln 450 455 460 Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys 465 470 475 480 Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly 485 490 495 Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr 500 505 510 Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser 515 520 525 Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys 530 535 540 Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn 545 550 555 560 Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala 565 570 575 Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys 580 585 590 Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys 595 600 605 Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg 610 615 620 Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys 625 630 635 640 Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp 645 650 655 Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu 660 665 670 Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln 675 680 685 Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu 690 695 700 Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe 705 710 715 720 Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His 725 730 735 Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser 740 745 750 Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser 755 760 765 Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu 770 775 780 Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu 785 790 795 800 Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg 805 810 815 Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln 820 825 830 Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys 835 840 845 Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln 850 855 860 Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val 865 870 875 880 Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr 885 890 895 Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu 900 905 910 Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys 915 920 925 Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly 930 935 940 Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val 945 950 955 960 Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg 965 970 975 Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys 980 985 990 Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe 995 1000 1005 Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His 1010 1015 1020 Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys 1025 1030 1035 Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val 1040 1045 1050 Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly 1055 1060 1065 Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe 1070 1075 1080 Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg 1085 1090 1095 Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp 1100 1105 1110 Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro 1115 1120 1125 Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1130 1135 1140 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1145 1150 1155 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp 1160 1165 1170 Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly 1190 1195 1200 Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 1205 1210 1215 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile 1220 1225 1230 Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg 1235 1240 1245 Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu 1250 1255 1260 Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser 1265 1270 1275 His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys 1280 1285 1290 Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile 1295 1300 1305 Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala 1310 1315 1320 Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys 1325 1330 1335 Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu 1340 1345 1350 Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr 1355 1360 1365 Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala 1370 1375 1380 Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1385 1390 1395 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1400 1405 <210> 14 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> sgRNA of ZEP <400> 14 uccggcgaac gcaccuggau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96 <210> 15 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> sgRNA 1 of AGP <400> 15 gcaucuucag ggccaugcua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96 <210> 16 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sgRNA for RGEN RNP <400> 16 gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60 ggcaccgagt cggtgc 76

Claims (12)

1. 다음의 단계를 포함하는 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법:
   (a) 미세조류를 유기용매에 80 내지 120mL/g의 비율로 첨가하는 단계;
   (b) 상기 용액을 20 내지 60kHz로 초음파 처리하는 단계; 및
   (c) 상기 용액을 원심분리 후 상층액으로부터 기능성 오일을 분리하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 (a) 단계 이전에 미세조류를 건조하는 단계를 더 포함하는, 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 유기용매가 헥산, 이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 초음파 처리를 33 내지 40℃에서 140 내지 160분간 수행하는 것을 특징으로 하는, 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 (c) 단계는 상층액에 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화나트륨 및 황산마그네슘으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 극성용매를 첨가하여 상분리를 유도하는 것을 특징으로 하는, 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 미세조류가 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 아데닌(A); 서열번호 3으로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 삽입된 ZEP 유전자 변이, 및
   서열번호 2로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 AGP 유전자 서열에서 116번째 염기와 117번째 염기 사이에 아데닌(A)삽입되거나; 115번째 염기 결실 및 116번째 염기가 티민(T)으로 치환된 AGP 유전자 변이를 포함하는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 변이주인 것을 특징으로 하는, 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주가 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8로 표시되는 ZEP 변이 유전자; 및 서열번호 9; 또는 서열번호 10으로 표시되는 AGP 변이 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세조류로부터 기능성 오일을 추출하는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 방법으로 추출되고, 루테인 및 제아잔틴이 함유된 기능성 오일.
9. 제 8 항에 따른 기능성 오일; 및
   옥수수 오일, 콩 오일, 참기름 및 해바라기 오일로부터 선택된 1종 이상의 식물성 오일을 포함하는, 기능성 오일 조성물.
10. 제 9 항에 따른 기능성 오일 조성물;
    유화제; 및
    아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨, 시트르산 나트륨 및 포름산 나트륨으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 완충용액을 포함하는, 유화액.
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 완충용액의 pH가 3 내지 5인 것을 특징으로 하는, 유화액.
12. 제 10 항에 따른 유화액을 포함하는, 식품 조성물.

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