KR101896243B1 - Rgen rnp를 이용하여 개발된 클라미도모나스 변이주 및 이를 이용한 색소 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 색소 향상된 색소 생산능을 갖는 새로운 조류에 관한 것으로, 본 발명의 변이주를 이용하면 적은 에너지를 소모하여, 카로티노이드계 색소, 구체적으로 잔토필을 생산하는 것이 가능하므로 산업 수준에서 효율적으로 색소를 생산할 수 있다. 또한, 색소가 포함되는 식품, 건강기능식품 및 의약품의 원료로 적용이 가능하다. 특히, 상기 변이주가 제작되는 과정은 DNA 조각이 표적 염기서열 또는 표적외 염기서열 내에 삽입될 가능성이 없기 때문에 GMO로 규제되지 않을 것으로 예상되므로 미세조류를 이용하여 루테인과 지아잔틴을 생산하는 산업적인 측면에서 큰 경제 효과를 낼 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 색소 생산능을 갖는 조류, 상기 조류를 포함하는 색소 조성물 그리고 상기 색소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
황반변성이란 눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직인 황반에 변성이 일어나 시력장애를 일으키는 질환으로, 시세포의 대부분이 황반에 모여있고 물체의 상이 맺히는 곳도 황반의 중심이므로 황반은 시력에 대단히 중요한 역할을 담당하고 있다. 황반변성을 일으키는 가장 많은 원인은 연령증가(연령관련 황반변성)를 들 수 있고, 가족력, 인종, 흡연과 관련이 있다고 알려져 있다. 황반부는 중심 시력을 담당하는 곳이므로, 이 이곳에 변성이 생기면 시력감소, 중심암점, 사물이 찌그러져 보이는 증상인 변시증 등이 나타난다. 황반변성은 크게 비삼출성(건성)과 삼출성(습성)으로 구분하게 되는데 비삼출성인 경우 망막 및 맥락막 위축이 나타나는 후기를 제외하고는 대부분 시력에 큰 영향을 주지 않고, 망막 하에 드루젠이라는 노란 침착물이 보이는 단계이나, 망막 하 출혈이나 망막 하액, 색소상피박리 등이 나타나는 삼출성의 경우에는 이러한 병변의 위치가 황반 아래 또는 황반에 바로 연하여 있는 경우에는 초기부터 시력저하가 나타난다. 삼출성 황반변성의 경우 전체 황반변성의 10~20% 정도를 차지하지만, 만일 삼출성 황반변성을 치료하지 않고 그대로 방치해두면, 시력이 빠르게 저하되어 많은 환자들이 진단 후 2년 내에 실명에 이르게 된다. 황반변성을 예방하기 위해서는 정기적인 안저 검사를 통해 황반부의 이상을 초기에 발견과 비만, 흡연, 고혈압 등의 조절 가능한 인자를 줄이도록 애쓰는 것이 중요하다. 흡연은 맥락막 순환에 손상을 주어 혈중 항산화 인자를 떨어뜨리고, 맥락막 혈관수축을 야기하여 저산화 손상을 야기하므로, 황반변성의 위험성이 있는 환자는 반드시 금연이 필요하다. 또한, 황반색소(lutein, zeaxanthin)는 노화에 의한 손상을 감소시켜 망막을 건강하게 유지하는 역할을 하므로, 야채와 과일을 통해 충분히 섭취하거나, 상용화된 비타민제를 복용함으로써 황반변성의 예방에 도움을 줄 수 있다.
황반색소는 망막의 중앙부분에서 기인한 노인성 시력감퇴를 줄여주고, 밝은 광선에 의한 망막조직의 손상을 막아주는 역할을 하는 것으로 대표적인 예로 카로티노이드의 산소화에 의해 생산되는 카로티노이드계의 옥시카로티노이드 색소로 잔토필(크산토필, xanthophyll)가 있다. 잔토필류에 속하는 색소로는 루테인(lutein) 또는 지아잔틴(zeaxanthin) 등이 있다. 루테인은 몸속에서 자연적으로 생성되는 산소 자유라디칼(free radical)에 의해서 손상되는 눈의 내부를 보호하는 항산화제로서 활동하며, 암종양을 공급하는 혈관의 성장을 줄여 암세포를 죽이고, 유방, 결장, 폐, 난소암, 피부암 예방에 약간의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
동물은 잔토필을 생성할 수 없고, 음식의 섭취를 통해서만 얻을 수 있는데, 이러한 잔토필은 식물의 잎사귀, 꽃, 과실 등의 녹색부에 엽록소, 카로틴과 같이 존재한다. 최근 잔토필류를 포함하는 눈 건강을 위한 건강기능식품 등이 각광받고 있다.
지아잔틴과 루테인의 원료로는 기존의 마리골드 꽃이 대표적이며, 다른 고등식물에서 추출하는 것도 연구되어 있다. 그뿐만 아니라, 박테리아에서 색소 합성 기작을 유전적으로 변이시켜 지아잔틴과 루테인을 생산하기도 한다. 미세조류로부터 이들 색소를 얻는 연구도 진행된 바 있다. 이러한 종래의 원료물질 중 마리골드 꽃은 생산을 위해 화초를 육종하기까지 시간이 오래 걸리는 단점이 있고, 생산을 위한 토지 면적에 비해서 생산량이 많지 않아 생산 단가가 높은 문제가 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 고등식물 시스템을 대체하기 위한 박테리아 시스템을 이용해 색소 합성 기작을 삽입한 지아잔틴과 루테인 생산 조류 개발이 이루어졌지만, 박테리아에서 얻어지는 색소는 궁극적으로 식품첨가물로 이용되기에는 부적합하다는 문제점이 있다. 또한, 유전자 삽입 기술 등을 이용한 유전자 재조합 식품(GMO; genetically modified organism)은 국내에서 선호되고 있지 않기 때문에 소비자들의 인식이 중요한 식품첨가물 시장에는 치명적 단점으로 작용하며, 고등식물 시스템과 마찬가지로 박테리아 배양액이나 바이오 리액터 등을 유지하는 비용이 많이 요구될 수 있는 문제가 있다.
미세조류로부터 이들 색소를 얻는 방법의 경우, 종래의 미세조류는 개량이 되지 않은 야생형으로 루테인의 함량은 일정량 있지만 지아잔틴의 함량이 광량에 따라 매우 낮기 때문에 최적의 생산 조류로 이용하기에는 한계가 있었다.
본 발명의 목적은 종래 식품의 원료로 사용되는 잔토필을 대체할 수 있는 원료 또는 종래의 원료 생산방법을 대체할 수 있는 방법을 제공하는 것으로, 구체적으로 잔토필 생산능, 특히 루테인 및 지아잔틴 생산능이 우수한 미생물, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 잔토필(xanthophyll)의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 식품 산업에서 문제가 될 가능성이 있는 유전적 재조합 방법이 아닌 다른 변이를 이용하여 야생형 또는 종래 존재하던 미세조류의 부족한 생산성을 해결할 수 있는 조류를 개발하기 위해 노력한 결과, 종래의 클라미도모나스 레인하드티아이 조류보다 황반색소 생산량이 높은 변이주를 개발, 이를 이용한 최적의 색소 생산 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이러한 측면에서 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 WT의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 삽입한 ZEP 유전자 변이를 가지며, 잔토필 생산능을 갖는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 WT의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 삽입한 ZEP 유전자 변이를 가지며, 잔토필 생산능을 갖는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 WT의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 염기 A를 삽입한 ZEP 유전자 변이를 가지며, 잔토필 생산능을 갖는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 제공한다.
상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 3종은 각각 잔토필 생산능을 가질 수 있다.
상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 3종은 각각 루테인(lutein)과 지아잔틴(zeaxanthin); 그리고 엽록소 b(chlorophyll b), 엽록소 a(chlorophyll a) 및 베타-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 색소의 생산능을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 배양물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 색소 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경구 투여용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 사료 또는 사료첨가제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 또는 식품첨가제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주를 이용한 색소 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 또는 사료 원료 생산방법을 제공한다.
본 발명을 통해 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이에서 외부 DNA의 도입이 없는 크리스퍼 유전자 가위 기술(RGEN RNPs)을 이용하여 ZEP 유전자를 녹아웃 시켜 돌연변이체 3종을 제작하였고 기존 야생형과 본 발명의 변이주 3종의 세포적 특성 비교하였을 때 산업적으로 유용한 색소인 지아잔틴의 양이 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 상기 변이주가 제작되는 과정은 DNA 조각이 표적 염기서열 또는 표적외 염기서열 내에 삽입될 가능성이 없기 때문에 GMO로 규제되지 않을 것으로 예상되므로 미세조류를 이용하여 루테인과 지아잔틴을 생산하는 산업적인 측면에서 큰 경제 효과를 낼 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에서 적용된 기술과 방법에 대한 전반적인 요약을 나타낸 것이다.
도 2는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형의 ZEP(Zeaxanthin epoxidase) 유전자에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 3은 클라미도모나스 레인하드티아이 ZEP 유전자를 표적하기 위해 디자인된 다섯 개의 타겟 서열을 정리한 것이다[Cas-디자이너(www.rgenome.net/cas-designer/)를 사용하여, 전체 게놈에서 3 뉴클레오타이드(nt)만큼 어떠한 다른 표적 부위들과 상이하고 66보다 더 높은 프레임-외 스코어를 가진 ZEP 유전자의 코딩 서열 영역의 절반 내에서 5개의 sgRNA를 신중하게 디자인하였다. 'CDS (코딩 서열) 위치'는 RNA 전사물에서 절단 지점의 상대적인 위치를 의미한다. Direction의 +는 타겟 서열과 동일한 방향, 즉 같은 시퀀스가 RGEN의 시퀀스이며, -는 타겟 서열과 역 방향, 즉 target sequence와 결합되어 있는 서열인 서로 reverse complement한 관계의 시퀀스를 의미한다. '프레임-외 스코어'는 깨진 이중-가닥 DNA가 미세 상동성-매개된 단부 연결 (MMEJ) 경로에 의해 수선될 때 발생하는 프레임쉬프트-유도 결실의 가능성을 가리킨다. '표적-오프 부위의 #'은 전체 게놈을 통틀어 미스매치된 서열의 수를 의미한다. 타겟서열에 나머지 sgRNA 서열 (Gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc) 연결하면 전체 sgRNA임].
도 4는 DNA-free RGEN RNPs에 의해 유도된 ZEP 유전자의 돌연변이를 나타낸 것이다[a: 각 sgRNA에 대한 RGEN-트랜스펙션된 세포 및 야생형의 돌연변이 (삽입 및 결실; indel) 빈도가 표적화된 심층 서열화(Targeted deep sequencing)에 의해 측정되었다. Indel 빈도는 약 0.46%까지 측정되었다. b: a의 Targeted deep sequencing 분석 결과에서 관찰된 가장 효율이 높은 세 번째 sgRNA로부터 얻어진 대표적인 돌연변이체 DNA 서열(RGEN3), 즉 TCCGGCGAACGCACCTGGATGGG. Targeted deep sequencing 분석 결과에 의해 타겟 서열에서 확인된 다양한 indel 패턴, PAM 서열의 3nt 상류에서 나타났다. 20-bp 표적 서열은 밑줄로 표시되고 PAM 서열은 굵게 표시하였다.]
도 5는 실시예 1에서 사용된 Cas9 단백질 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형 조류, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 형태적인 특성을 나타내는 사진이다[a: ZEP 유전자 녹아웃을 연구하기 위한 수백 개의 콜로니들에 대한 클로로필(Chl) 형광의 측정, b: 한천이 들어간 고체 TAP 배지에서 Colony 상태로 배양된 사진, c: HS 배지에서 액체 배양한 후 동일한 농도(OD 750 = 1)로 맞췄을 때의 상태를 보여주는 사진].
도 7은 DNA-free RGEN RNPs에 의해 발생된 세 개의 ZEP 돌연변이체에서 실제적인 ZEP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화를 확인한 것이다[a: wildtype, b: ZEP mutant 1(ΔZ1), c: ZEP mutant 2(ΔZ2) d. ZEP mutant 3 (ΔZ3)].
도 8a는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1의 ZEP 유전자에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 8b는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ2의 ZEP 유전자에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 8c는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ3의 ZEP 유전자에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 9는 독립영양 배양 용기를 나타낸 것이다.
도 10은 혼합영양 배양 용기를 나타낸 것이다.
도 11은 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 △Z1, △Z2, △Z3의 색소 프로파일을 나타내는 HPLC 분석 그래프이다[neo+lor: 네오잔틴(neoxanthin) + 로로잔틴(loroxanthin), vio: 비올라잔틴(violaxanthin), an: 안테라잔틴(antheraxanthin), lut: 루테인(lutein), zea: 지아잔틴(zeaxanthin), chl a: 엽록소 a(chlorophyll a), chl b: 엽록소 b(chlorophyll b), α-car: 알파-카로틴(α-carotene), β-car: 베타-카로틴(β-carotene)].
도 12는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형, 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 시간에 따른 성장곡선(부피당 세포 수, cells/ml)을 나타내는 그래프이다.
도 13은 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형(WT)과 ZEP 녹아웃 돌연변이체 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 시간에 따른 루테인과 지아잔틴 색소 생산량을 비교한 그래프이다[a: 시간에 따른 루테인의 생산량(mg/L), b: 시간에 따른 지아잔틴의 생산량(mg/L), c: 시간에 따른 루테인과 지아잔틴의 생산량의 합(mg/L)].
도 14는 지아잔틴과 루테인의 함량이 높은 것으로 알려져 있는 고등식물들과 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형(WT), 클라미도모나스 레인하드티아이 ZEP 녹아웃 돌연변이체 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3와의 지아잔틴과 루테인의 함량 비교한 것이다.
도 2는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형의 ZEP(Zeaxanthin epoxidase) 유전자에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 3은 클라미도모나스 레인하드티아이 ZEP 유전자를 표적하기 위해 디자인된 다섯 개의 타겟 서열을 정리한 것이다[Cas-디자이너(www.rgenome.net/cas-designer/)를 사용하여, 전체 게놈에서 3 뉴클레오타이드(nt)만큼 어떠한 다른 표적 부위들과 상이하고 66보다 더 높은 프레임-외 스코어를 가진 ZEP 유전자의 코딩 서열 영역의 절반 내에서 5개의 sgRNA를 신중하게 디자인하였다. 'CDS (코딩 서열) 위치'는 RNA 전사물에서 절단 지점의 상대적인 위치를 의미한다. Direction의 +는 타겟 서열과 동일한 방향, 즉 같은 시퀀스가 RGEN의 시퀀스이며, -는 타겟 서열과 역 방향, 즉 target sequence와 결합되어 있는 서열인 서로 reverse complement한 관계의 시퀀스를 의미한다. '프레임-외 스코어'는 깨진 이중-가닥 DNA가 미세 상동성-매개된 단부 연결 (MMEJ) 경로에 의해 수선될 때 발생하는 프레임쉬프트-유도 결실의 가능성을 가리킨다. '표적-오프 부위의 #'은 전체 게놈을 통틀어 미스매치된 서열의 수를 의미한다. 타겟서열에 나머지 sgRNA 서열 (Gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc) 연결하면 전체 sgRNA임].
도 4는 DNA-free RGEN RNPs에 의해 유도된 ZEP 유전자의 돌연변이를 나타낸 것이다[a: 각 sgRNA에 대한 RGEN-트랜스펙션된 세포 및 야생형의 돌연변이 (삽입 및 결실; indel) 빈도가 표적화된 심층 서열화(Targeted deep sequencing)에 의해 측정되었다. Indel 빈도는 약 0.46%까지 측정되었다. b: a의 Targeted deep sequencing 분석 결과에서 관찰된 가장 효율이 높은 세 번째 sgRNA로부터 얻어진 대표적인 돌연변이체 DNA 서열(RGEN3), 즉 TCCGGCGAACGCACCTGGATGGG. Targeted deep sequencing 분석 결과에 의해 타겟 서열에서 확인된 다양한 indel 패턴, PAM 서열의 3nt 상류에서 나타났다. 20-bp 표적 서열은 밑줄로 표시되고 PAM 서열은 굵게 표시하였다.]
도 5는 실시예 1에서 사용된 Cas9 단백질 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형 조류, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 형태적인 특성을 나타내는 사진이다[a: ZEP 유전자 녹아웃을 연구하기 위한 수백 개의 콜로니들에 대한 클로로필(Chl) 형광의 측정, b: 한천이 들어간 고체 TAP 배지에서 Colony 상태로 배양된 사진, c: HS 배지에서 액체 배양한 후 동일한 농도(OD 750 = 1)로 맞췄을 때의 상태를 보여주는 사진].
도 7은 DNA-free RGEN RNPs에 의해 발생된 세 개의 ZEP 돌연변이체에서 실제적인 ZEP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화를 확인한 것이다[a: wildtype, b: ZEP mutant 1(ΔZ1), c: ZEP mutant 2(ΔZ2) d. ZEP mutant 3 (ΔZ3)].
도 8a는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1의 ZEP 유전자에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 8b는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ2의 ZEP 유전자에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 8c는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ3의 ZEP 유전자에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 9는 독립영양 배양 용기를 나타낸 것이다.
도 10은 혼합영양 배양 용기를 나타낸 것이다.
도 11은 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 △Z1, △Z2, △Z3의 색소 프로파일을 나타내는 HPLC 분석 그래프이다[neo+lor: 네오잔틴(neoxanthin) + 로로잔틴(loroxanthin), vio: 비올라잔틴(violaxanthin), an: 안테라잔틴(antheraxanthin), lut: 루테인(lutein), zea: 지아잔틴(zeaxanthin), chl a: 엽록소 a(chlorophyll a), chl b: 엽록소 b(chlorophyll b), α-car: 알파-카로틴(α-carotene), β-car: 베타-카로틴(β-carotene)].
도 12는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형, 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 시간에 따른 성장곡선(부피당 세포 수, cells/ml)을 나타내는 그래프이다.
도 13은 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형(WT)과 ZEP 녹아웃 돌연변이체 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 시간에 따른 루테인과 지아잔틴 색소 생산량을 비교한 그래프이다[a: 시간에 따른 루테인의 생산량(mg/L), b: 시간에 따른 지아잔틴의 생산량(mg/L), c: 시간에 따른 루테인과 지아잔틴의 생산량의 합(mg/L)].
도 14는 지아잔틴과 루테인의 함량이 높은 것으로 알려져 있는 고등식물들과 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형(WT), 클라미도모나스 레인하드티아이 ZEP 녹아웃 돌연변이체 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3와의 지아잔틴과 루테인의 함량 비교한 것이다.
다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 변이주에 관한 것이다.
상기 클라미도모나스 레인하드티아이는 단세포 녹조류(Chlorophyta)로서 민물, 해양 등의 다양한 환경에 분포하는 진핵생물이며, 6 ~ 8시간의 doubling time을 가지고 있다. 또한, 가장 널리 보급되어 있는 미세조류 모델 시스템들 중 하나로, 바이오리액터에서 생산이 가능하다.
상기 변이주는 일반적인 돌연변이 처리가 아닌 RGNE RNPs를 이용하여 즉, 외부 DNA의 도입이 없는 크리스퍼 유전자 가위 기술을 이용하여 ZEP(Zeaxanthin epoxidase) 유전자를 녹아웃시켜 제작되었다.
상기 변이주는 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 WT의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 서열번호 2로 표시되는 염기서열(gaaattaata agactcatta tattccggcg aacgcacctg ga)을 삽입한 ZEP 유전자 변이를 가지는 변이주(이하, ΔZ1로 명명함)이다. 즉, 서열번호 3으로 표시되는 ZEP 유전자 변이를 가지는 변이주이다.
또한, 상기 변이주는 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 WT의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 서열번호 4로 표시되는 염기서열(tagctctaaa acatccaggt gcgttcgccg gactatagtg agta)을 삽입한 ZEP 유전자 변이를 가지는 변이주(이하, ΔZ2로 명명함)이다. 즉, 서열번호 5로 표시되는 ZEP 유전자 변이를 가지는 변이주이다.
또한, 상기 변이주는 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 WT의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 염기 A를 삽입한 ZEP 유전자 변이를 가지는 변이주(이하, ΔZ3으로 명명함)이다. 즉, 서열번호 6으로 표시되는 ZEP 유전자 변이를 가지는 변이주이다.
본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 3종은 각각 색소 생산능, 구체적으로 잔토필 생산능을 갖는다. 구체적으로, 루테인(lutein)과 지아잔틴(zeaxanthin) 생산능을 가질 수 있다. 더욱 구체적으로, 루테인(lutein)과 지아잔틴(zeaxanthin); 그리고 엽록소 b(chlorophyll b), 엽록소 a(chlorophyll a) 및 베타-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 색소의 생산능을 가질 수 있다.
상기 변이주는 세포당 지아잔틴의 생산능이 종래 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형과 비교해서 현저하게 높고, 루테인과 지아잔틴 함량이 높은 것으로 알려져 있는 고등식물들과 비교해도 12배 이상 많아[도 14 참조], 잔토필 생산을 위한 조류로 효과적으로 사용될 수 있는 장점이 있다.
구체적인 일 실시예에서, 본 발명의 변이주가 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형과 비교해서, 시간에 따른 지아잔틴의 생산량이 크게 증가한 것으로 확인되었는 바(도 13의 b), 본 발명의 변이주는 잔토필, 특히 지아자틴의 생산능이 매우 우수한 균학적 성질을 가짐을 알 수 있고, 이를 활용하여 잔토필 색소의 생산원으로 효과적으로 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 변이주는 약광(dim light)에서 생존 가능하고, 구체적으로 10 내지 2,000 μmol photons/m2s 범위의 광도 조건 하에서 배양될 수 있다. 상기 변이주가 약광 조건 이하인 완전한 어둠에서는 광합성을 할 수 없고, 너무 높은 광 조건에서는 광 스트레스에 의해 세포가 데미지를 입을 수 있다. 상기 조건에서 본 발명의 변이주를 배양하는 경우, 변이주 내 잔토필 함량을 높이면서도, 우수한 생장률을 갖는 장점이 있다.
상기 변이주는 통상의 클라미도모나스 레인하드티아이 조류의 생장환경(광도 조건, 온도 조건, 배지 등) 내에서 적절한 성장을 할 수 있다. 또한, 낮은 광도에서도 우수한 지아잔틴의 축적능을 갖는 바(도 13), 이런 우수한 잔토필 생상능에 의하여 잔토필 색소 생산 미생물로 산업적으로 효과적으로 사용될 수 있고, 고광도 하에서도 군집 내의 밀도가 다른 조류와 비교해서 상대적으로 낮아, 단일 세포 내 광합성에 의한 색소 생산 효율이 우수한 효과를 갖는다. 구체적으로 클라미도모나스 레인하드티아이 야생형은 지아잔틴을 거의 생산하지 못하였으나, 본 발명의 변이주는 야생형 보다 지아잔틴 함유량이 약 50 배 이상 더 높다.
상기 변이주는 일반적인 클라미도모나스 레인하드티아이 조류를 배양할 수 있는 환경에서 배양할 수 있으며, 구체적으로 약한 광도 조건에서 조류를 배양할 수 있는 배양 배지를 사용할 수 있다. 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연 배지, 합성 배지 또는 선택 배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다. 예를 들면, 광합성 배지인 HS 배지 또는 TAP 배지로 배양할 수 있으며, 탄소원을 추가할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 실시예 내 표 1의 배양액 조성환경에서, 본 발명의 변이주가 우수한 지아잔틴 생산능을 가짐을 확인하였다.
상기 배양배지의 pH는 클라미도모나스 레인하드티아이가 생존 및 성장 가능한 범위라면 특별히 제한되지 않고, 일 예로 pH 6 이상, 구체적으로 pH 6 내지 pH 9에서 생존가능하며, pH 7.0 이상 내지 pH 8.0 미만에서 최적의 성장률을 가질 수 있다.
상기 변이주는 기존의 변이 유발 물질을 처리하거나 외래 유전자 삽입을 통한 유전자 재조합 변이체가 아닌 야생형 균주에 외래 DNA 도입 없이 크리스퍼 유전자 가위 기술을 이용하여 ZEP 유전자 내 타겟 서열에 직접 RGEN RNPs로 도입함으로써 제작할 수 있다.
본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 세포 내에 색소, 특히 잔토필계 색소를 고함량으로 축적할 수 있고, 그 중 지아잔틴의 함량을 더욱 높게 포함할 수 있어, 상기 조류를 배양하여 식품, 사료, 의약품 등의 원료로 효과적으로 사용될 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 배양물에 관한 것이다.
본 발명에서 "배양물"이란 특정 미생물이 배양된 배지, 즉 배양 후 배지를 의미하는 것으로, 상기 배양물은 상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 상기 배양물은 배양 후 배양배지를 농축, 건조 등의 가공을 한 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물을 모두 포함하는 의미이다. 상기 배양물은 그의 부산물을 포함할 수 있고, 그 제형이 한정되지 아니하며, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다.
상기 배지는 특성 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 배지의 pH는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주가 생장 가능한 범위일 수 있고, 일 예로 pH 6 이상, 바람직하게는 pH 6 내지 pH 9일 수 있다.
또한, 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 조류의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 변이주는 지아잔틴 및 루테인을 포함하는 잔토필계 색소를 생성하여 체내 축적하는 특성을 가지는 바, 이러한 측면에서 상기 조성물은 색소 조성물 또는 잔토필 색소 조성물일 수 있다.
상기 색소 조성물은 조성물에 포함된 총 색소 100 중량부에 대하여 지아잔틴이 5 내지 15 중량부로 포함된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따라, 클라미도모나스 레인하드티아이 야생형 조류, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주 각 세포당 총 색소 내 지아잔틴의 함량을 측정한 결과, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 경우 야생형과 비교해서도 색소 중 지아잔틴의 함량이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다(도 13의 c).
상기 색소 조성물은 식품 또는 사료의 원료로 사용될 수 있고, 경구 투여를 위한 제제로 사용될 수 있다.
따라서, 상기 조성물 또는 추출물을 포함하는 색소 조성물 또는 잔토필 색소 조성물은 식품, 의약품 또는 사료 등에 포함되는 경구로 공급될 수 있다는 점에서 경구 투여용 조성물일 수 있다.
경구 투여용 조성물의 경우, 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화된 경구용 제제에 포함될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제물을 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 또는 사료에 특별한 목적 용도를 달성하기 위하여 첨가될 수 있으므로, 이러한 측면에서 식품 조성물, 식품첨가제용 조성물, 사료 조성물 또는 사료첨가제용 조성물일 수 있다. 상기 조성물이 사료 또는 식품에 사용되는 경우, 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주에 의해 생산되고 세포에 축적된 잔토필 색소, 특히 지아잔틴 및 루테인에 의하여 체내 건강을 유지 또는 강화할 수 있다. 구체적으로, 상기 지아잔틴 및 루테인은 황반 색소로서 황반의 변성 등을 예방 또는 개선할 수 있어, 황반 변성과 관련된 눈 질환의 예방 또는 개선에 효과적이다. 더욱 구체적으로 상기 지아잔틴 및 루테인은 눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선 효과가 있으므로, 상기 사료 또는 식품 조성물은 상기 증상의 예방 또는 개선, 또는 상기 효과를 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "첨가제용"은 식품 또는 사료에 주원료가 외에 첨가되는 구성이라면 모두 포함되며, 구체적인 예로 식품 또는 사료에서 기능성을 갖는 유효 활성물질 또는 가공식품에서 착색, 보존 등을 위해 첨가되는 식품 의약품 안전처에서 정의하고 있는 식품첨가물일 수 있다.
상기 식품은 건강 기능성 식품일 수 있다. 보다 구체적으로, 눈 건강을 위한 건강 기능성 식품일 수 있다.
상기 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제용 조성물은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물의 활성을 해치지 않는 범위에서 다른 유효성분을 더 포함할 수 있다. 또한, 담체 등의 부가 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 건조 균체, 상기 변이주의 배양물 및 이의 추출물을 포함하고, 추가적으로 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 포함하여 제조할 수 있다. 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 변이주, 상기 변이주의 건조 균체, 상기 조류의 배양물 및 이의 추출물을 포함하여, 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있다. 사일레지는 청예사료와 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 건조 균체, 상기 변이주의 배양물 및/또는 이의 추출물을 혼합하여 제조될 수 있으나, 본 발명의 조성물의 사용이 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 식품 또는 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제 (powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 조성물의 pH는 조성물이 사용되는 약제, 식품 등의 제조조건 등에 따라서 용이하게 변경 가능하다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 상기 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
상기 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 그 자체 또는 건조된 형태로 조성물에 포함될 수 있고, 상기 조류의 배양물은 농축 또는 건조된 형태로 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 상기 건조물은 상기 조류 또는 그 배양물의 건조된 형태를 의미하는 것으로, 동결건조 등에 의해 제조된 분말 형태일 수 있다.
또한, 상기 추출물은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 이의 배양액 또는 이의 건조물로부터 추출하여 얻어진 것을 추출물을 의미하는 것으로, 용매 등을 이용한 추출물, 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 파쇄하여 얻어진 것을 포함한다. 구체적으로 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 세포 내에 축적된 색소를 물리적 또는 화학적 방법으로 추출 및 분리한 것일 수 있다.
상기 추출과정은 통상의 방법에 의하여 수행될 수 있고, 일 예로 추출용매를 가하고 균질화한 후, 균체를 파쇄하여 목적 색소를 추출할 수 있다. 추출 후에는 원심분리하여 조류의 파쇄물을 제거하고, 추출용매는 감압증류 등의 방법으로 제거할 수 있다. 또한 통상의 정제공정을 더 포함할 수 있다. 상기 색소의 경우 물에 녹지않는 성질을 가지므로, 본 발명의 조류로부터 더욱 용이하게 추출될 수 있다.
본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주는 낮은 광도에서 잔토필, 특히 지아잔틴의 우수한 생산능을 가지므로, 상기 변이주 및 이의 부산물을 포함하는 조성물은 신체 활성 향상, 체기능성 유지 및 저하 예방 효과를 가진다. 구체적으로, 상기 잔토필 색소는 황반변성 억제 효과, 항산화, 항암 효과 등이 있는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 조성물은 신체건강 유지용, 구체적으로 상기 잔토필 색소가 관여하는 신체 기능의 유지, 저하 예방 또는 향상을 용도로 식품, 건강 기능식품, 의약품 또는 사료 등에 포함되는 원료로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 이용한 색소 생산방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 또는 사료 원료 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 이용하는 경우 배양되는 상기 조류 내의 잔토필 축적량을 높일 수 있어, 산업적으로 사용되는 원료의 공급 등을 효율적으로 수행할 수 있다.
상기 생산방법은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 생산방법은 상기 배양 단계 이후에, 배양물로부터 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주를 분리하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 분리된 조류는 건조를 포함한 가공 단계를 더 거칠 수 있다.
또한, 상기 생산방법은 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주, 상기 변이주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물로부터 색소를 추출하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 배양은 pH 6.0 내지 8.0 조건의 배지에서 수행될 수 있다. 또한, 약광 조건, 구체적으로 10 내지 2,000 μmol photons/m2s 범위의 광도 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주의 경우 낮은 광도에서도 색소 생산능이 우수하여, 체내 잔토필 함량을 높일 수 있는 바, 고광도의 에너지를 투여하지 않고도 우수한 잔토필 축적을 달성할 수 있어, 산업적으로 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 이러한 추출은 미생물로부터 색소를 추출하는 방법에 대한 통상적인 방법으로 수행할 수 있고, 일 예로 효소법, 초음파 추출법, 기계 추출법 등이 있으며 이에 한정되지 않는다.
상기 생산방법은 배양 단계 외에, 배양 후 조류의 함량을 높이는 농축 단계, 농축 단계를 거친 조류의 수분을 더욱 감소시킴으로써 건조시키는 건조 단계를 더 포함할 수 있다. 그러나 농축단계 또는 건조 단계가 반드시 필요한 것이 아니며, 일반적으로 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 농축 및 건조 방법, 기계를 사용하여 수행할 수 있다.
상기 생산방법은 상기 추출 단계 이후 정제단계를 더 포함하여 수행할 수 있고, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 정제방법에 의하여 수행될 수 있다.
상기 농축 또는 건조 단계를 거쳐 제조된 잔토필은 식품, 건강기능성 식품, 화장품 또는 약제 등의 원료로 사용될 수 있다.
상기 잔토필 생산방법은 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위 내에서 다른 방법을 채용하여 수행될 수 있다.
상기 변이주 및 조성물에 대한 내용은 본 발명의 생산방법에도 준용될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식이 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예
1:
ZEP
유전자 녹아웃 돌연변이체 제작
클라미도모나스 레인하드티아이의 ZEP 유전자(phytozome: Cre02.g082550 또는 NCBI: AY211267.1)[https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!gene?search=1&detail=1&method=4614&searchText=transcriptid:30785220, Chromosome 2번 중 1244277-1250969의 위치에 존재]를 표적하기 위해 sgRNA는 Cas-Designer (www.rgenome.net)을 이용하여 microhomology-driven frameshift 돌연변이를 유도하도록 하는 다섯 개의 sgRNA을 디자인하였으며 이를 In vitro transcription 방법을 통해 합성하였다. 도 3는 ZEP 유전자를 표적하기 위해 제작된 다섯 개의 sgRNA의 타켓 서열에 대한 서술이다. Cas9 단백질 경우 E.coli를 이용하여 recombinant Cas9 protein을 발현시켜 정제를 거쳐 준비하였다. 실험에 사용된 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 mt- 야생형 (CC-4349)은 Chlamydomonas Resource Center(www.chlamycollection.org)를 통해 확보하였다[http://www.chlamycollection.org/product/cc-4349-cw15-mt-goodenough-330a/]. 클라미도모나스 세포는 TAP 배지[표 2 참조]를 이용해 25도에서 50ml flask에 담아 70uE의 광도로 형광등을 이용해 빛을 주며 90 rpm으로 shaking하며 배양하였다. 세포의 농도는 spectrophotometer를 이용하여 측정하며 OD750에서 0.3 ~ 0.5 정도의 활발히 배양 중인 시기의 세포를 사용하였다. RNPs 복합체를 만들기 위해 200ug의 Cas9 단백질(도 5, 서열번호 9)은 140ug의 sgRNA(서열번호 8)와 nuclease-free water에서 섞고 10분간 상온에서 incubation하였다. 결합된 RNPs 복합체는 50ⅹ104개의 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 mt- 야생형 (CC-4349)의 세포와 함께 4mm Electroporation cuvette에서 Biorad Gene Pulser Xcell™ Electroporation Systems을 이용하여 (Voltage 600V, Capacity 50uF) 전기충격을 통해 형질전환시킨 뒤 12시간 동안 dark incubation 후에 gDNA extraction 하여 Targeted deep sequencing하여 분석하였으며, 일부는 2000개의 cell로 dilution하여 TAP agar plate에 도말하여 single colony를 얻었다. 도 4는 Targeted deep sequencing에 의해 RGEN-RNPs에 의해 유도된 ZEP 유전자의 돌연변이를 확인한 결과이다. 가장 형질전환 효율이 높은 세 번째 sgRNA (0.456%)에 의해 유도된 single colony를 분리하여 target gene의 돌연변이를 확인하였다. (도 4의 b는 targeted deep sequencing의 data로, RNP를 이용한 형질전환 실험 후 전체 세포를 모으고 gDNA를 뽑아서 분석했을 때 전체 세포를 대상으로 target 부위의 DNA 가닥에서 일어나는 모든 변이를 분석하여 그 패턴과 frequency를 알 수 있는 실험임. 즉, 도 4의 b는 targeted deep sequencing을 통해 target 부위에서 실제로 확인된 변이의 패턴들이지만, 42 bp 이상의 insertion 같은 큰 사이즈 변화는 targeted deep sequencing의 원리로는 찾아내기 어려움, 실제로 얻어진 single colony와 차이가 있을 수 있음)
이렇게 ZEP 특이적 녹아웃 돌연변이체를 DNA 없는 RGEN RNP를 사용하여 생성한 후에, 페트리 디쉬에서 모든 세포에 대해 Chl 형광을 측정하였고 여러 개의 추정되는 ZEP 녹아웃 세포주를 선별하였다. 적색 원형은 약광(50 μmol photons/m2s) 조건 하에서 TAP 아가 배지 상에서 성장한 추정되는 ZEP 녹아웃 돌연변이체를 가리킨다. NPQ/4 영상은 Imaging PAM(Walz)으로 측정되었다. 야생형 (WT) 및 ΔZEP 돌연변이주의 단일 세포 콜로니들이 약광(50 μmol photons/m2s) 조건 하에서 최소 아가 배지 상에서 성장하였다[도 6의 a, b]. 이렇게 확인된 콜로니 중 황반색소 함량이 증가된 변이주 3개(△Z1, △Z2, △Z3)를 선별하였으며, RGEN RNPs에 의해 발생된 세 개의 ZEP 돌연변이체에서 실제적인 ZEP 유전자 위치의 표적 DNA 서열 변화를 Sanger sequencing을 통해 확인하였다[도 7].
도 6의 b에 나타낸 바와 같이, 동일한 조건의 광도 하에서 TAP agar plate에서 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형, 그리고 변이주 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3의 colony가 서로 유사한 형태와 크기로 자란 것을 확인할 수 있었다. 또한, HS 배지에서 광합성을 통해 액체 배양된 세포들 경우, 같은 세포수의 농도에서 클라미도모나스 레인하드티아이 야생형은 녹색을 띄는 것에 비해 변이주 ΔZ1, ΔZ2, ΔZ3은 풀색 톤의 유사한 녹색을 띠는 것을 확인할 수 있다[도 6의 c].
선발된 변이주 중 변이주 Z1는 클라미도모나스 레인하드티아이 ZEP 변이주 1(Z1)[Chlamydomonas reinhardtii ZEP mutant 1(△Z1)]로 명명하였으며, 상기 변이주는 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2017년 3월 22일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 13230BP를 부여받았다.
실시예
2: 변이주 배양
1) 독립영양 배양
광합성만을 이용하여 외부의 탄소원 공급이 없는 상태로 배양하는 Autotrophic culture를 하는 경우 최소 배지인 HS 배지에서 5% CO2를 공급하여 배양하였다. 하기 표 1과 같은 조성을 가진 배지를 만든 뒤 Autoclave하여 준비한 다음 활발한 growth stage에 있는 cell을 이용하여 배양액에 106cell/mL의 농도가 되도록 만들어 growth를 시작하였다. 배양용기는 도 9와 같이 유리로 된 column을 사용하여 아래에서 Bubble을 공급하고 양 옆에서 200uE의 광도로 형광등을 이용해 빛을 주었다.
2) 혼합영양 배양
광합성과 탄소원을 같이 공급하여 배양하는 Mixotrophic culture를 하는 경우 TAP 배지에서 아세트산(acetic acid)을 첨가하여 배양하였다. 하기 표 2와 같은 조성을 가진 배지를 만든 뒤 Autoclave하여 준비한 다음 활발한 growth stage에 있는 cell을 이용하여 배양액에 106cell/mL의 농도가 되도록 만들어 growth를 시작하였다. 배양용기는 도 10과 같이 유리로 된 flask나 bottle를 사용하여 큰 volume으로 배양하였으며 magnetic bar를 이용하여 stirring 해주었다. 70uE의 광도로 형광등을 이용해 빛을 함께 주었다.
실시예
4: 변이주의 색소 분석 및 성장 특성 확인
1) 변이주의 색소 분석
실시예 1과 같이 단일 콜로니로 분리 후, 계속 배양하고, 각 콜로니에 대한 HPLC를 이용해 색소 분석을 수행하였다.
구체적으로, 분리된 단일 콜로니들을 TAP 배지에서 70 μmol photons/m2s 조건으로 3일 동안 배양하였고, 구체적인 배양 조건은 실시예 2의 2)의 배양 조건과 같이 수행하였다. 수확된 조류들을 80% 아세톤을 사용하여 색소를 추출하고 원심분리한 상층액을 다시 나일론 필터를 이용하여 여과한 후 HPLC에 주입하여 분석하였다.
구체적으로, 색소를 분리하기 위해 용매의 총 유속은 분당 1.2mL로 하였고, 제0분 내지 제15분까지 pH 8.0의 Tris는 14%, 아세토니트릴은 84%로부터 0%까지 각각 균일하게 감소시키고, 메탄올과 에틸아세테이트는 2%로 시작하여 제15분까지 각각 68%, 32%까지 증가시켰다. 이후 3분 동안(제15분 내지 18분) 이 용매 비율을 그대로 유지시킨 다음, 1분 동안(제18분 내지 제19분) 각 용매의 비율을 시작할 때의 비율로 되돌린 다음 나머지 6분간 그대로 유지하며 포스트-런(postrun)을 하였다. 펌프는 Shimadzu사의 LC-20A Prominence를, 컬럼은 Watera Spherisorb TMS5(DS1 4.6 x 250 mm, 5μm Cartridge Column, USA)을 사용하였고, 컬럼의 온도는 40 ℃로 유지하였다. 검출기는 포토다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector: SPD-M20A, Shimadzu)를 사용하여 데이터를 분석하였고, 지아잔틴을 비롯한 카로티노이드 색소들은 445nm에서, 엽록소 a는 670nm에서 검출된 결과를 DHL(Agern Alle, Horsholm, Denmark)에서 구입한 카로티노이드와 엽록소 a, b를 정량한 표준곡선을 스탠다드로 사용하여 농도를 구하였다.
도 11에 각 조류에 색소 프로파일을 나타내는 HPLC 분석 그래프를 나타내었고, HPLC를 이용해 200 μmol photons/m2s 하에서 자란 각 조류들의 지아잔틴 및 루테인 함량을 정량적으로 분석한 그래프를 도 13에 나타내었다.
2) 성장 속도 확인
야생형 클라미도모나스 레인하드티아이 조류, 변이주 △Z1, △Z2, △Z3의 세포 증식 속도 및 최종 생장량을 비교하기 위해 최소 광합성 배지인 HS 배지 [표 1 참조]에서 5% CO2 bubble을 공급한 상태로 200 μmol photons/m2s의 광도 조건에서 배양하였다. 초기 접종 세포 수는 1 x 106cells/ml로서 60시간 동안 12시간 간격으로 세포수를 측정하여 성장 곡선을 그렸다. 도 12는 야생형(WT)과 ZEP 녹아웃 돌연변이체에서 이산화탄소를 이용하는 광합성을 통한 세포 성장률의 비교 실험 결과이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 변이주 △Z1, △Z2, △Z3는 배양기간이 경과함에 따라 야생형과 비슷한 수준의 성장률을 확인하였다.
실시예
5: 색소 생산 확인
도 12의 실험을 수행하면서 동시에 12시간 간격으로 세포의 루테인과 지아잔틴의 색소 함량을 HPLC를 이용하여 정량적으로 분석하였다. 이를 도 13을 통해 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형(WT)과 ZEP 녹아웃 돌연변이체의 시간에 따른 루테인과 지아잔틴 색소 생산량을 비교하였다. 야생형과 비교 시 ZEP 녹아웃 돌연변이체는 루테인 생산량은 비슷한 수준이나 야생형에는 미비하게 존재하는 지아잔틴의 양이 최소 50배 이상 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
하기 표 3 및 도 14는 지아잔틴과 루테인의 함량이 높은 것으로 알려져 있는 고등식물들과 클라미도모나스 레인하드티아이 cw15 야생형(WT), ZEP 녹아웃 돌연변이체와의 지아잔틴과 루테인의 함량 비교한 것이다. 클라미도모나스는 도 12의 36 시간일 때 세포의 건조 중량 대비 루테인과 지아잔틴 색소량 나눠 함량(㎍/100g) 을 계산하였다. 지아잔틴과 루테인의 함량이 높은 것으로 알려져 있는 나머지 고등식물의 색소 함량(㎍/100g)은 USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 23 (2010)을 인용하여 비교하였다. 고등식물과 루테인과 지아잔틴의 함량을 비교 시 클라미도모나스 야생형은 최소 6배 (Nasturtium 대비) 이상의 함량을 보여주며 ZEP 유전자 녹아웃의 돌연변이체는 12배 이상 (Nasturtium 대비)의 높은 함량을 보여주었다. 특히, 고등식물과 지아잔틴 함량을 비교 시 ZEP 유전자 녹아웃의 돌연변이체는 최소 120배 이상 (Orange Pepper 대비)의 높은 함량을 보여주었다.
도 13과 도 14를 통해 높은 생산성과 함량을 확인하였으며 이를 통해 루테인과 지아잔틴 색소 산업의 원료 시장에서 높은 경쟁력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
Product | Lutein + Zeaxanthin (㎍/100 g) |
Chlamydomonas , cw15 -, WT | 274,397 |
Chlamydomonas , ZEP mutant 1 ( ΔZ1 ) | 528,353 |
Chlamydomonas , ZEP mutant 2 ( ΔZ2 ) | 502,520 |
Chlamydomonas , ZEP mutant 3 ( ΔZ3 ) | 544,684 |
Nasturtium (yellow flowers) | 45,000 |
Kale (raw) | 39,550 |
Kale (cooked) | 18,246 |
Dandelion leaves (raw) | 13,610 |
Nasturtium (leaves) | 13,600 |
Turnip greens (raw) | 12,825 |
Spinach (raw) | 12,198 |
Spinach (cooked) | 11,308 |
Swiss chard (raw or cooked) | 11,000 |
Turnip greens (cooked) | 8440 |
Collard greens (cooked) | 7694 |
Watercress (raw) | 5767 |
Garden peas (raw) | 2593 |
Romaine lettuce | 2312 |
Zucchini | 2125 |
Brussels sprouts | 1590 |
Pistachio nuts | 1205 |
Broccoli | 1121 |
Carrot (cooked) | 687 |
Maize/corn | 642 |
Egg (hard boiled) | 353 |
Avocado (raw) | 271 |
Carrot (raw) | 256 |
Kiwi fruit | 122 |
[미생물 기탁 정보]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13230BP
수탁일자 : 20170322
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University
<120> CHLAMYDOMONAS MUTANTS PRODUCED USINGRGEN RNP AND METHOD FOR
PREPARING PIGMENT USING THE SAME
<130> P16U10C2202
<150> KR 10-2016-0049439
<151> 2016-04-22
<160> 9
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 6693
<212> DNA
<213> Chlamydomonas reinhardtii cw15 mt- wildtype CC-4349
<400> 1
gcgacgcacg gctgggccaa attcgccaac ggcaggagac caaatcgatc gaggcgatct 60
tgcgaagttc tcggacaaat cgatcgcacc catagtgatt taagcattac atttgcccaa 120
ggcgtgagaa gtgcgaggcc cgaacggcta tgacgccaat gcgcagctta cgacatttaa 180
agcaaattat tcatacatca tacagcacgc ttatgtgaag aaagccagga ttttaggctc 240
tcgccccgat caagacgatc tccccattgc gaagttctcg gtttctttcc ggttcgcctg 300
ctccgtatga tttacctttg cgctacaaca gcgacttaaa cgacctacgt cgccttactg 360
tgtgcgcgta cgtgtttgta gctgtgagat agttttgtcc gcagcgtacc cgcaaataga 420
atgctcgcga gcacttacac gccctgtggc gttcgccagg tggcaggccg cacggttgca 480
gtgcccagca gcttggtcgc gccagtggca gtcgctcggt cgctggggtt ggcgccctac 540
gtccctgtat gtgagccttc tgcggcgctt ccggcctgcc agcagcctag cgggcgtcgt 600
catgttcaga ctgctgccac tctccgtgcc gacaacccca gctcggtcgc gcagctggtg 660
catcagaatg gaaaggggat gaaggttatt atcgccggcg cgggcatcgg cggcctggtg 720
ctagccgttg cacttctgaa gcagggcttc caggttcagg tctttgagcg cgacctgacg 780
gccatccgcg gcgagggcaa gtaccgtgga cccatccagg tgcgttcgcc ggaacaccaa 840
cgcgcttgtt tttgctgtgc cgcgaccatg aactaggcct tatcttgagg tgttagcatg 900
tttagccagc gttggatctg tgtggcgagg ttggggtgag aacccttcct gtgtacctgc 960
tcgggcgtac cttgtgcccc accgctgact ggcttactta atgacaaaac gcaggttcaa 1020
agcaatgcgc tcgctgcgct ggaggctatc gatcccgagg tggccgcgga ggtgctgcgc 1080
gagggctgca tcactggcga ccgtatcaac gggctctgcg acggcctgac tggcgagtgg 1140
tgagtaggca atccagctgt gcatccagtc gcgcggttgc ggaggtcgtc tcgggaaacg 1200
cgacgtggcg tccactcgcc caaggagtgg tctcccgcag cgtggtctcc cgcagctcgg 1260
gtgcaacacc ctgccccctg ccgcgagcgc gctgcgcttg cttatgttgc gcagcggtgt 1320
gagttacaac agcttctgtt gaagagctgt catacgaagc acggcgcgct gtggcgctgc 1380
agccgtgctg tggaaactcc aacacctcca ccgccagcct gcgcacgcac acgcaataca 1440
ctcgcctcgt gtgccccctc ctcacacaac ggcatgtgac actcagtttt aactcttatt 1500
ttgacagctg agagctacac gcttgggtga atggggaggt ccttgatgtt tcgttgcact 1560
ccgtggctcc ggagtccgtg cggaccgtca cccacaaatg ggagcgcacg gctttcttgt 1620
gctgtctgcc ccgttagcca ctaactgcga atgaccttga cagtttactt tgctattttt 1680
ccttccaggt acgtcaagtt cgacacgttc cacccggcgg tcagcaaggg cctgccggtg 1740
acccgcgtca tcagccgcct cacgctgcag cagatcctgg ccaaagccgt ggagcggtga 1800
gccgtgcgcg cggtgtgatg gctttagcgt cagtgctagc atgggggttg gtgggtggta 1860
atcgcggcgc ccatggccgg gtagcagcgg ccgaaagctg gcgcagagcg cgcgttggac 1920
aagcggtcct gttgccggta tgggcacgag cagggcgctg gtgcgggcaa agggcagagt 1980
ggagttgcag agcagcgctg gcgtcggctg tgcgctctcc aaatggcctc gtggcattct 2040
gacgggacac atcctggaaa atagtagcgc acccaactgc tggtggctcc tcgtacaatc 2100
cccccaattt acaatcgctc gttctggctc gcagctacgg cggccccggc accatccaga 2160
acggctgcaa cgtgaccgag ttcacggagc gccgcaacga caccaccggc aacaacgagg 2220
tgagagcgtg ctaagaagag catgcacgtg gagcgtgtaa aattgtgtgg cctgaagcgg 2280
cagtgcctgc ggcatggact aggtggttgc agcatgctgc gcgcgtgggt tgccggtcag 2340
gaaaccgccg gaccgagccg cgcagattca gtcaggagcg gattaggaag tttgaaaaac 2400
agggttcgga gtgtgcaagc gggctcagga gctgtggtgc ctttctacac cggtcgccct 2460
accaggcacc cactgaaact gtaaaaccgt tgctgcgccg gcgatgccct ctacttcact 2520
aggtgactgt gcagctggag gacgggcgca cgtttgcggc cgacgtgctg gtgggcgccg 2580
acggcatctg gtccaagatc cgtaagcagc tcattggcga gaccaaggcc aactacagcg 2640
ggtacacctg ctacaccggt gagattattg accttcaagt tggaaggagg gagcgggggg 2700
agcggaatgg aaggaagcag cgtggacggg gcgcacggag gggaggggac tgcgggtcat 2760
agcgccgcct tgcggggcgt gaggagtgtt gggcggatat tcagttttct ttgcccaaga 2820
tcttcccaca atccgcgtgt gtctgacgcg ggatgtggcc cctgctgcca tggcttcgca 2880
ggcatctcgg actttacgcc ggcggacatt gacattgtgg gctaccgcgt gttcctgggc 2940
aacggccagt actttgtcag cagcgacgtg ggcaacggca agatgcagtg gtgagcggcg 3000
gcgggcgggc gagcgagggc tgcggggtct ggagggtgtg taccgggcgg aagggagggg 3060
aagggagggg aagggaaggc aggatgcagg cgagggcagg atgtgatggt gggaagaggg 3120
cgtggcgagc agcaactgga aaggtggtgg gtaaaaaaat ggtccatgaa tatggctcgg 3180
tacagttcaa agcatggaaa tggaacccgc cgtctgctgc accatgggcg tgagcgggga 3240
gtacgcgact cctggacagc cgtaacaatg cggatggcct caacaagcca ggagcggcac 3300
gaacccagct cacgagcgca cagcgtgcca ggacggcggc cggcaaggat gaaatgtttt 3360
tcctaatata aatgcggact cctgacgcat tatatccatt ttgccactga gccaaagaca 3420
catatataca cgtgcgccgc cgtcctgcgc cacagccgcc tagcgctccg gccgcgcccg 3480
gttccctcgg cgtcatgcgc tggagccccc tcgcaccctg caccgcaaag cccatcaaca 3540
ccacactcgt ccccacaccg cgagtcaccg ccactgcact cgctgtccct caacccgtca 3600
caatctcgcc gacacgcgat aacgaaccca cgcaggtacg gcttccacaa ggagccgtct 3660
ggcggcaccg accccgaggg cagccgcaag gcgcgcctgc tgcagatctt tggccactgg 3720
aacgacaacg tggtggacct gatcaaggcc acgcccgagg aggacgtgct gcgccgcgac 3780
atctttgaca ggtacggaaa aagggagagc ggggtggctg gagggcggga aagggcgaag 3840
gggcggagaa agaaatgact aggggatggt gttcatttgt gggattgaga ggggtccgcg 3900
gatcccggca gagggcgcca gtggcaaggc gtgggagtcg cggggcggac aatgctgggc 3960
caggggcgcc tagtcacccc gggacactgt ctcagtatgc cgccgtcccg gccgcgccgc 4020
acaggccgcc catcttcacc tggagcaagg gccgcgtggc cctgctgggc gacagcgcgc 4080
acgccatgca gcccaacctg ggccagggcg gctgcatggc cattgaggac gcctacgagc 4140
tggccatcga cctcagccgc gccgtgtccg acaaggccgg aaacgcggcg gcggtggacg 4200
tggagggcgt gctgcgcagc taccaggaca gccgcatttt gcgcgtcagc gccattcacg 4260
gcatggcggg tgagagctgc aaccagcgta gtcgggctgg gctgctgtgg gcagggtcgg 4320
gttgggttgg gcgcacgtgg gcggcgagtg tatgtgcagt gtgacgtgca cactatcata 4380
atactttatg ctcaccgcac cgcgccgcgc cgcaccacgc gccacaggca tggctgcctt 4440
catggccagc acctacaagt gctacctggg cgagggctgg agcaagtggg ttgaggggct 4500
gcgcatcccg caccccggcc gcgtggtggg gcggctggtg atgctgctca ccatgcccag 4560
cgtgctggag tgggtgctgg gcggcaacac cgaccacgtg gcgccgcacc gcaccagcta 4620
ctgctcgctg ggcgacaagc ccaaggtgag cggctgccgg gctggggggg ggtggaggga 4680
gaggaggagg attgcgggga gacgagggag ggcaaggcag gcgctgcctt cgtggatgca 4740
ccgccccgtc gttagcagga cctcaggaac tcgtccccaa aaccacaaca gaacccccaa 4800
tatcgcctct tccttcactg cttgtcacgc ctggtccgcc gaccgcaggc tttccccgag 4860
agccgcttcc ccgagttcat gaacaacgac gcctccatca tccgctcctc ccacgccgac 4920
tggctgctgg tggcggagcg cgacgccgcc acggccgccg ccgccaacgt gaacgccgcc 4980
accggcagca gcgccgccgc ggccgccgcc gccgacgtga acagcagctg ccagtgcaag 5040
ggcatctaca tggcggactc ggcggccctg gtgggccgct gcggcgccac ctcgcgcccc 5100
gcgctggccg tggacgacgt gcacgtcgcc gagagtcacg cgcaggtctg gcgcggcctc 5160
gccggcctcc ccccctcctc gtcgtccgcc tccaccgccg ccgcctctgc gtccgccgcc 5220
tcctctgccg ccagcggcac cgccagcacc ctgggcagct cggagggcta ctggctccgc 5280
gacctgggca gcggccgcgg cacctgggtc aacggcaagc gcctgcccga cggcgccacg 5340
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actcggcggc cctggtgggc cgctgcggcg ccacctcgcg ccccgcgctg gccgtggacg 5160
acgtgcacgt cgccgagagt cacgcgcagg tctggcgcgg cctcgccggc ctccccccct 5220
cctcgtcgtc cgcctccacc gccgccgcct ctgcgtccgc cgcctcctct gccgccagcg 5280
gcaccgccag caccctgggc agctcggagg gctactggct ccgcgacctg ggcagcggcc 5340
gcggcacctg ggtcaacggc aagcgcctgc ccgacggcgc cacggtgcag ctgtggcccg 5400
gcgacgcggt ggagttcggc cggcacccca gccacgaggt gttcaaggtg aagatgcagc 5460
acgtgacgct gcgcagcgac gagctcagcg gccaggccta caccacgctc atggtgggca 5520
agatccggaa caacgactac gtcatgcccg agtcgcggcc ggacggcggc agccagcagc 5580
cgggccgcct ggtgacggct taagcggcgc cgtgcgtaag ggccggctta cgggggcggc 5640
agtgtcgctg tggagggatg gtctggggtg ggaggaatgg gaggagagcg gcgggagccc 5700
gaggagcgga gcgctggagg cttgcggagc ggcagcttgg gaagagctgc ggagagagga 5760
aggagcgcag ggcgcttgga gcacgcgcca gattacgatc acggcagcgc gaggcgcgcg 5820
tctgacttcg aagtggtaag gaagatttca tgtatgattg cgtcgaggga caccgcaagt 5880
tttacgcgcg gcggagggag ccttggggca tacaacagta cgagcgggcg ttggtgagaa 5940
ggtggtcact ccgtatgaga agatggttac tccgtacctt cgtgagaagc tgctgcgcac 6000
aagttacgaa cctatctgtg tggagagccc ggtagtatat caggggcgag ggtcatgaac 6060
gcgagtggcg agtctgtgag cgccaatttg ttatgcggca taatttcgca tcggggtatt 6120
acgtctacaa aatgttgagc tggcttagcg caggaggcaa cacctcaggc agaatgtacg 6180
aatgtgtgca gaagggcaga gtcaaggcag aggcggagaa gttgtcaggg ctgtgtgtgg 6240
tttggtcagg gcgtggctag atggatatga gacccgccgc cgtctccaga ttgtggcgga 6300
ggtggaactc tcggcccccg cgccagtccc cgcggccagc gcatcccgcc atgcgggttg 6360
ttggctggtg catcgcgcgg ggtgtgctat gagtgtggaa acactatgtc gcgtgtcgtg 6420
ctgaggtctg ttgagaggtt tcgtcgtttg tgcatgtcct gtcccggttg gagtttgagc 6480
gaggtggttc aaagtttttg gatcgcgtgg gagagactga aacggtttgg tgagaatggt 6540
tgagacagag gttgggcttg gaaactggag gagaggagca gcgtaactcg aggacgatgc 6600
agtagatgca ccacaacagt tgtggtgggc gcctggagta acacgcgtgc caccaacacg 6660
caattacaga gatccgtcat acaggaggga tcatatgcga tttaattttg gttttgcatt 6720
tgtaagacgt tttcaca 6737
<210> 6
<211> 6694
<212> DNA
<213> Chlamydomonas reinhardtii ZEP mutant 3
<400> 6
gcgacgcacg gctgggccaa attcgccaac ggcaggagac caaatcgatc gaggcgatct 60
tgcgaagttc tcggacaaat cgatcgcacc catagtgatt taagcattac atttgcccaa 120
ggcgtgagaa gtgcgaggcc cgaacggcta tgacgccaat gcgcagctta cgacatttaa 180
agcaaattat tcatacatca tacagcacgc ttatgtgaag aaagccagga ttttaggctc 240
tcgccccgat caagacgatc tccccattgc gaagttctcg gtttctttcc ggttcgcctg 300
ctccgtatga tttacctttg cgctacaaca gcgacttaaa cgacctacgt cgccttactg 360
tgtgcgcgta cgtgtttgta gctgtgagat agttttgtcc gcagcgtacc cgcaaataga 420
atgctcgcga gcacttacac gccctgtggc gttcgccagg tggcaggccg cacggttgca 480
gtgcccagca gcttggtcgc gccagtggca gtcgctcggt cgctggggtt ggcgccctac 540
gtccctgtat gtgagccttc tgcggcgctt ccggcctgcc agcagcctag cgggcgtcgt 600
catgttcaga ctgctgccac tctccgtgcc gacaacccca gctcggtcgc gcagctggtg 660
catcagaatg gaaaggggat gaaggttatt atcgccggcg cgggcatcgg cggcctggtg 720
ctagccgttg cacttctgaa gcagggcttc caggttcagg tctttgagcg cgacctgacg 780
gccatccgcg gcgagggcaa gtaccgtgga cccatcacag gtgcgttcgc cggaacacca 840
acgcgcttgt ttttgctgtg ccgcgaccat gaactaggcc ttatcttgag gtgttagcat 900
gtttagccag cgttggatct gtgtggcgag gttggggtga gaacccttcc tgtgtacctg 960
ctcgggcgta ccttgtgccc caccgctgac tggcttactt aatgacaaaa cgcaggttca 1020
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ttcctaatat aaatgcggac tcctgacgca ttatatccat tttgccactg agccaaagac 3420
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accacactcg tccccacacc gcgagtcacc gccactgcac tcgctgtccc tcaacccgtc 3600
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cgacctgggc agcggccgcg gcacctgggt caacggcaag cgcctgcccg acggcgccac 5340
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caaggtgaag atgcagcacg tgacgctgcg cagcgacgag ctcagcggcc aggcctacac 5460
cacgctcatg gtgggcaaga tccggaacaa cgactacgtc atgcccgagt cgcggccgga 5520
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gagctgcgga gagaggaagg agcgcagggc gcttggagca cgcgccagat tacgatcacg 5760
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ctcaggcaga atgtacgaat gtgtgcagaa gggcagagtc aaggcagagg cggagaagtt 6180
gtcagggctg tgtgtggttt ggtcagggcg tggctagatg gatatgagac ccgccgccgt 6240
ctccagattg tggcggaggt ggaactctcg gcccccgcgc cagtccccgc ggccagcgca 6300
tcccgccatg cgggttgttg gctggtgcat cgcgcggggt gtgctatgag tgtggaaaca 6360
ctatgtcgcg tgtcgtgctg aggtctgttg agaggtttcg tcgtttgtgc atgtcctgtc 6420
ccggttggag tttgagcgag gtggttcaaa gtttttggat cgcgtgggag agactgaaac 6480
ggtttggtga gaatggttga gacagaggtt gggcttggaa actggaggag aggagcagcg 6540
taactcgagg acgatgcagt agatgcacca caacagttgt ggtgggcgcc tggagtaaca 6600
cgcgtgccac caacacgcaa ttacagagat ccgtcataca ggagggatca tatgcgattt 6660
aattttggtt ttgcatttgt aagacgtttt caca 6694
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Chlamydomonas reinhardtii CC-4349
<400> 7
cccatccagg tgcgttcgcc gga 23
<210> 8
<211> 96
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA
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uccggcgaac gcaccuggau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
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<211> 1406
<212> PRT
<213> CAS9 protein
<400> 9
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Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile
20 25 30
Arg Ile Pro Gly Glu Lys Pro Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp
35 40 45
Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys
50 55 60
Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser
65 70 75 80
Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr
85 90 95
Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg
100 105 110
Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met
115 120 125
Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu
130 135 140
Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile
145 150 155 160
Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu
165 170 175
Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile
180 185 190
Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile
195 200 205
Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile
210 215 220
Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn
225 230 235 240
Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys
245 250 255
Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys
260 265 270
Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro
275 280 285
Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu
290 295 300
Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile
305 310 315 320
Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp
325 330 335
Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys
340 345 350
Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln
355 360 365
Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys
370 375 380
Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr
385 390 395 400
Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro
405 410 415
Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn
420 425 430
Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile
435 440 445
Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln
450 455 460
Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys
465 470 475 480
Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly
485 490 495
Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr
500 505 510
Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser
515 520 525
Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys
530 535 540
Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn
545 550 555 560
Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala
565 570 575
Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys
580 585 590
Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys
595 600 605
Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg
610 615 620
Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys
625 630 635 640
Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp
645 650 655
Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu
660 665 670
Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln
675 680 685
Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu
690 695 700
Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe
705 710 715 720
Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His
725 730 735
Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser
740 745 750
Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser
755 760 765
Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu
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Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu
785 790 795 800
Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg
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Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys
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Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln
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Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu
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Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys
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Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly
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Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val
945 950 955 960
Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg
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Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe
995 1000 1005
Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp
1010 1015 1020
Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro
1025 1030 1035 1040
Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val
1045 1050 1055
Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala
1060 1065 1070
Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile
1075 1080 1085
Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn
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Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr
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Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1125 1130 1135
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg
1140 1145 1150
Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys
1155 1160 1165
Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val
1170 1175 1180
Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu
1185 1190 1195 1200
Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro
1205 1210 1215
Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu
1220 1225 1230
Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg
1235 1240 1245
Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu
1250 1255 1260
Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr
1265 1270 1275 1280
Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe
1285 1290 1295
Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser
1300 1305 1310
Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val
1315 1320 1325
Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala
1330 1335 1340
Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala
1345 1350 1355 1360
Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1365 1370 1375
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly
1380 1385 1390
Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1395 1400 1405
Claims (17)
- 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 삽입한 ZEP 유전자 변이를 가지며, 잔토필 생산능을 갖는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
- 제 1 항에 있어서,
서열번호 3으로 표시되는 ZEP 유전자 변이를 가지는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
- 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 삽입한 ZEP 유전자 변이를 가지며, 잔토필 생산능을 갖는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
- 제 3 항에 있어서,
서열번호 5로 표시되는 ZEP 유전자 변이를 가지는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
- 서열번호 1로 표시되는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)의 ZEP 유전자 서열에서 816번째 염기와 817번째 염기 사이에 염기 A를 삽입한 ZEP 유전자 변이를 가지며, 잔토필 생산능을 갖는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
- 제 5 항에 있어서,
서열번호 6으로 표시되는 ZEP 유전자 변이를 가지는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변이주는 루테인(lutein)과 지아잔틴(zeaxanthin); 그리고 엽록소 b(chlorophyll b), 엽록소 a(chlorophyll a) 및 베타-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 색소의 생산능을 갖는 클라미도모나스 레인하드티아이 변이주.
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 대한 변이주의 배양물.
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 대한 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 색소 조성물.
- 제 9 항에 있어서,
상기 색소 조성물은 총 색소 100 중량부에 대하여 지아잔틴을 5 내지 15 중량부로 포함하는 것인, 색소 조성물.
- 삭제
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 대한 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 또는 식품첨가제용 조성물.
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 대한 변이주의 배양물, 이의 건조물 및 이의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 눈 건강 강화 또는 유지; 황반변성 예방 또는 개선; 눈의 기능 저하 예방 또는 개선; 망막의 손상 개선 또는 예방; 노화 억제; 망막 건강 유지; 황반변성 발병 위험 감소; 또는 시력감퇴 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항의 변이주를 이용한 색소 생산방법.
- 제 14 항에 있어서,
상기 변이주, 상기 변이주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물로부터 색소를 추출하는 단계;를 포함하는 색소 생산방법.
- 제 14 항에 있어서,
상기 색소는 잔토필 색소인, 색소 생산방법.
- 제 1 항, 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항의 변이주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 또는 사료 원료 생산방법.
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