CN115418320A

CN115418320A - 一株高产蛋白质的蛋白核小球藻及其培养方法和应用

Info

Publication number: CN115418320A
Application number: CN202210984422.1A
Authority: CN
Inventors: 任茂智; 罗秀媚; 程浩; 伍文宪; 苏浩天; 方琳
Original assignee: Chengdu Tianfu Xingji Agricultural Technology Co ltd; Institute of Urban Agriculture of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Chengdu Tianfu Xingji Agricultural Technology Co ltd; Institute of Urban Agriculture of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-08-17
Filing date: 2022-08-17
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2042-08-17
Also published as: CN115418320B

Abstract

本发明公开了一株高产蛋白质的蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa RLXCh3，在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2022648。还公开了其培养方法：1)藻种活化：将藻株RLXCh3接种到培养基上，23‑27℃、14‑18h光照/6‑10h黑暗条件下培养至单藻落长出；2)种子液培养：将活化藻株接种到液体培养基中于25‑30℃培养；3)液体发酵：将步骤2)得到的种子发酵液按体积百分比6‑14％添加到发酵培养基中于25‑29℃发酵培养。本发明筛选到的蛋白核小球藻RLXCh3蛋白含量高，还公开了蛋白核小球藻RLXCh3在蛋白生产中的应用。

Description

一株高产蛋白质的蛋白核小球藻及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及藻类技术领域，具体涉及一株高产蛋白质的蛋白核小球藻及其培养方法和应用。

背景技术

人类在21世纪面临的关键挑战之一是用有限的自然资源养活不断增长的人口。据估计，当前全球约有九分之一的人营养不良，其中最重要的因素是缺乏适当的热量和蛋白质摄入，也被称为蛋白质-能量营养不良。到2050年，世界人口预计将突破97亿，届时对全球蛋白质供给更是提出了严峻挑战，但是当前尚没有任何粮食解决方案可用于满足预期增加的蛋白质需求。我国优质蛋白源，如鱼类、畜禽等的蛋白饲料资源缺口巨大，长期依赖国外进口。以饲用大豆为例，我国每年需进口大豆1亿吨，对外依存度高达85.5％。我国面临着居民优质蛋白质摄入不足及优质蛋白源饲料供需矛盾紧张的两难境地。

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)是一种单细胞真核微藻，含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质、食物纤维、核酸及叶绿素等，具有营养价值高、保健成分突出等特点，是一种高蛋白、低糖、低脂肪、低热值、维生素和微量元素全面的绿色营养源食品，且具有免疫调节、抗氧化、降血糖和降血脂等医疗保健功效，被联合国世界卫生组织称为“人类二十一世纪最佳基因食品”，也于2012年被我国卫健委批准为“新资源食品”，可应用于食品、医药、保健等领域。高蛋白质含量是将蛋白核小球藻视为非传统蛋白质来源的主要原因之一。与其他植物不同的是，蛋白核小球藻含有人体或动物体内无法合成的必需氨基酸，其氨基酸(赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸和异亮氨酸)含量与鸡蛋或大豆中的氨基酸含量相当，是优质完全蛋白质的替代来源，可以满足发展中国家营养不良人口的需要。据《2013版中国居民膳食营养素参考摄入量》推荐，18-50岁的成年男性蛋白质摄入量为65g，成年女性蛋白质摄入量为55g，因此，每日食用80.88～95.59g 小球藻粉即能满足人体对蛋白质的需求。然而，虽目前蛋白核小球藻藻种丰富，但其蛋白含量参差不齐，筛选高蛋白含量的藻种将为全球粮食安全提供潜在的解决方案，能够以更有效和可持续的方式满足全球对优质蛋白质的需求。

目前，全球每年小球藻产能约为5000吨，而随着小球藻在食品、动物饲料等领域深度利用，小球藻配料市场的年复合增长率将达到25.4％，预计2022年小球藻的市场份额将超 7亿美元以上。需求旺盛而供给不足是当前制约小球藻市场进一步发展的关键因素。小球藻既能够通过光合作用进行光能自养，也能够像其他工业微生物一样，利用外源营养异养生长，这样的生长特性决定了其可以在开放或封闭的培养系统中以光自养、异养或混合营养化的方式生长。由于光能自养生产小球藻存在生产成本高、培养时间长、培养密度低等劣势，商业化小球藻生产主要采用异养或混合培养(光自养-异养串联培养)模式。异养培养作为一种更为经济、高效的工业化生产模式，是降低小球藻生产成本、提升产能的有效途径。优化适用于本藻种的异养发酵方式将是提高小球藻产能、解决小球藻市场供需矛盾的最佳途径之一。

中国专利申请201910065782.X公开了一株小球藻Chlorella sorokinianaTX及其高密度快速培养方法，该小球藻Chlorella sorokinianaTX蛋白含量高达到68.9％，可以进行混养生长，可以为水产养殖提供天然优质饵料。中国专利申请201611255690.0也公开了一株高产蛋白的小球藻(Chlorella sorokiniana)BL-ch1，其蛋白含量高，而且对总氮、总磷、氨氮的降解率高。但是这两个专利申请中的小球藻均是Chlorella sorokiniana--即索罗金小球藻，索罗金小球藻在环境中普遍存在，容易分离得到，但是蛋白核小球藻在环境中稀有，难以分离得到；并且索罗金小球藻难以应用于遗传转化中，其遗传转化非常困难。目前，小球藻中只有蛋白核小球藻被批准为新资源食品，在《关于批准蛋白核小球藻等4种新资源食品的公告2012年第19号》公开了：根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》有关规定，现批准蛋白核小球藻、乌药叶、辣木叶为新资源食品，变更新资源食品蔗糖聚酯的食用量，公布梨果仙人掌(Opuntia ficus-indica(Linn.)Mill，米邦塔品种)为普通食品。索罗金小球藻并不属于被批准作为新资源食品的小球藻。

发明内容

本发明的发明人从多份土壤样品中分离到5株小球藻，并从中鉴定到一株高蛋白含量的蛋白核小球藻。基于此，本发明保护如下技术方案：

一株高产蛋白质的蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa RLXCh3，在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2022648。

上述的蛋白核小球藻的培养方法，包括如下步骤：

1)藻种活化：将藻株RLXCh3接种到培养基上，23-27℃、14-18h光照/6-10h黑暗条件下培养至单藻落长出；

2)种子液培养：将活化藻株接种到液体培养基中于25-30℃培养，得到种子发酵液；

3)液体发酵：将步骤2)得到的种子发酵液按体积百分比6-14％添加到发酵培养基中于25-29℃发酵培养。

优选地，所述的培养方法，包括如下步骤：

1)藻种活化：将藻株RLXCh3接种到BG11固体培养基上，24-26℃、15-17h光照 /7-9h黑暗条件下倒置培养至单藻落长出；所述BG11固体培养基配方为：葡萄糖18-22 g/L、硝酸钠1.3-1.7g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.03-0.05g/L、MgSO₄·7H₂O 0.065-0.085g/L、 CaCl₂·2H₂O 0.026-0.046g/L、柠檬酸0.005-0.007g/L、柠檬酸铁铵0.005-0.007g/L、EDTA0.0005-0.0015g/L、碳酸钠0.015-0.025g/L、A5+Co母液0.8-1.2mL/L、琼脂粉13-17g/L、 pH6.0-6.5；所述A5+Co母液含有如下组分：硼酸0.0027-0.0029g/L、MnCl₂·H₂O 0.0017-0.0019g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.00021-0.00023g/L、CuSO₄·5H₂O 0.00007-0.00009g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.0003-0.0005g/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.00004-0.00006g/L；

2)种子液培养：将活化藻株单克隆接种到含18-22g/L葡萄糖的BG11液体培养基中于28-30℃震荡培养6-9天，得到种子发酵液；

3)液体发酵：将步骤2)得到的种子发酵液按体积百分比7-13％或8-12％添加到发酵培养基中于27-28℃、通氧量>60％、搅拌条件下发酵培养6-9天；所述发酵培养基配方为：1000倍的A5培养基母液0.8-1.2mL、葡萄糖18-22g/L、尿素1.26-1.28g/L、KH₂PO₄ 1.0-1.4g/L、MgSO₄1.0-1.4g/L、柠檬酸钠0.15-0.25g/L、pH 6.0-6.5，所述1000倍的A5 培养基母液中含有：MgSO₄·7H₂O 14-18g/L、EDTA·Na₂2.0-2.2g/L、CaCl₂·7H₂O 28-32 g/L、H₃BO₃2.7-3.0g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.21-0.23g/L、MnCl₂·4H₂O 1.7-1.9g/L、Na₂MoO₄ 0.015-0.025g/L、CuSO₄·5H₂O 0.06-0.08g/L。

优选地，步骤1)中所述BG11固体培养基配方为：葡萄糖20g/L、硝酸钠1.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.04g/L、MgSO₄·7H₂O 0.075g/L、CaCl₂·2H₂O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001 g/L、碳酸钠0.02g/L、A5+Co母液1mL/L、琼脂粉 15g/L、pH6.0-6.5；所述A5+Co母液含有如下组分：硼酸0.00286g/L、MnCl₂·H₂O 0.00181 g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.000222g/L、CuSO₄·5H₂O 0.000079g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.00039g/L、Co(NO₃)₂·6H₂O六水硝酸钴0.000049g/L。

优选地，步骤3)中所述发酵培养基配方为：1000倍的A5培养基母液1mL、葡萄糖20g/L、尿素1.268g/L、KH₂PO₄1.2g/L、MgSO₄1.2g/L、柠檬酸钠0.2g/L、pH 6.0-6.5；所述1000倍的A5培养基母液中含有：MgSO₄·7H₂O 16g/L、EDTA·Na₂2.1g/L、 CaCl₂·7H₂O 30g/L、H₃BO₃2.86g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L、MnCl₂·4H₂O 1.81g/L、 Na₂MoO₄0.021g/L、CuSO₄·5H₂O 0.07g/L。

优选地，上述培养方法包括如下步骤：

1)藻种活化：将藻株RLXCh3接种到BG11固体培养基上，25℃、16h光照/8h黑暗条件下倒置培养至单藻落长出；

2)种子液培养：将活化藻株单克隆接种到含20g/L葡萄糖的BG11液体培养基中于28℃震荡培养6-8天或7天，得到种子发酵液；

3)液体发酵：将步骤2)得到的种子发酵液按体积百分比9-11％或10％添加到发酵培养基中于28℃、通氧量>60％、罐压0.05Mpa、搅拌速率80-140或80-120或90-110 或100rpm发酵培养6-8天或7天。

本发明还提供了上述的蛋白核小球藻RLXCh3在蛋白生产中的应用。

优选地，上述的应用，应用方法为：将上述的蛋白核小球藻RLXCh3按上述任一项所述的培养方法进行培养，得到藻液；将藻液离心，浓缩，干燥，即得含有蛋白的藻粉。

本发明还提供了上述的蛋白核小球藻RLXCh3在制备提高蛋白含量的功能性食品中的应用，是将蛋白核小球藻RLXCh3的藻粉加入食品中以增加食品的蛋白含量；优选所述功能性食品包括米、面制品，优选为淀粉发酵食品。

优选地，上述的应用技术方案中，所述淀粉发酵食品为馒头，所述馒头的制作原料为：面粉60％～80％、小球藻粉0.7％～1.2％、食用碱0.08-0.12％、酵母1％～1.6％、泡打粉 0.5％～1.2％、水20％～40％；优选面粉70％、小球藻粉1.2％，优选70％的面粉为45％小麦粉和25％荞麦粉组成。

本发明的有益效果是：本发明筛选到的蛋白核小球藻RLXCh3蛋白含量高，显著高于目前市面上的商业化蛋白核小球藻藻株FACHB-9。经实验验证，将RLXCh3藻粉加入馒头中能显著提高馒头中的蛋白含量，RLXCh3中的蛋白能被有效应用于食品中，为解决世界上优质蛋白质食品供应不足导致的蛋白质-能量营养不良的健康问题提供了一种有效的解决方式。

附图说明

图1是蛋白核小球藻RLXCh3的细胞形态(A)及系统发育树分析图(B)。

图2是实施例2中的营养强化馒头的制备工艺流程图。

图3是蛋白核小球藻RLXCh3藻粉不同添加量对馒头外观品质的影响对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂如无特殊说明，均为本领域常规试剂，均可商购获得。

实施例1

1实验方法

1.1藻种的分离、筛选

从四川省九寨沟(103°40'59.3″E，32°51'24.6″N)采集土层表面明显绿色的土壤结皮 10份，碾细后用等体积无菌水浸泡、悬浮，并于28℃、150rpm摇床培养3h以充分混匀土壤样品。吸取悬浮液并梯度稀释成10⁰、10^-1、10^-2、10^-3的浓度，震荡混匀。从每个梯度稀释液中分别吸取200μL涂布在含有100mg/L氨苄青霉素、50mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素的BG11固体平板上，每组设置3个重复。将平板置于25℃恒温光照培养箱(16h 光照/8h黑暗)中倒置培养7-15天至单藻落长出。挑取单藻落并通过平板划线在新的含有抗生素(即氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素，与前述BG11固体平板中的含量相同)的 BG11固体平板进一步分离纯化。培养7天左右，观察平板上是否仍有杂菌出现。若有，进一步平板划线分离纯化至只有单藻落；若没有，挑取单克隆至添加有与BG11固体平板中相同抗生素及含量的1mL的BG11液体培养基中，28℃、150rpm摇床培养7天后利用光学显微镜进行藻类形态学观察，并作为初步分类鉴定的判断。

1.2藻种的鉴定

将镜检为小球藻的克隆进行扩大培养。吸取500μL藻液接种到加有抗生素(同1.1中的BG11液体培养基中的抗生素和含量)的100mL的BG11液体培养基中，28℃、150rpm 摇床光照培养7天后5000rpm离心5分钟收集藻体并进一步进行分子鉴定。分子鉴定引物有三对，分别为：

1)扩增ITS区域的N5(SEQ ID NO.1)：5’-TGGTGCCAGCAGCCGCGGTA-3’，

N11R(SEQ ID NO.2)：5’-CTCAGTAAGCTTGATCCTTCCGCAGGTTCACC-3’；

2)扩增核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase large subunit)区域的RcbLZ-F(SEQ ID NO.3)：5’-CAACCAGGTGTTCCASCTGAAG-3’，

RcbLZ-R(SEQ ID NO.4)：5’-CTAAAGCTGGCATGTGCCATAC-3’；

3)扩增翻译延伸因子(translation elongation factor Tu)区域的tufA-F(SEQID NO.5)： 5’-TGAAACAGAAMAWCGTCATTATGC-3’，

tufA-R(SEQ ID NO.6)：5’-CCTTCNCGAATMGCRAAWCGC-3’。

DNA提取方法是：采用生工生物工程股份有限公司的Ezup柱式植物组织基因组DNA抽提试剂盒按照说明书操作提取。

PCR反应体系如下：

Taq酶为生工生物工程股份有限公司的Taq Plus DNA聚合酶。

PCR反应条件采用降落PCR(touch town PCR)，具体如下：

将PCR扩增获得的ITS片段、RcbLZ片段及tufA片段送测序公司测序。

1.3藻种蛋白含量检测

利用GB 5009.5-2016(第一法)《食品安全国家标准-食品中蛋白质的测定》检测筛选获得的蛋白核小球藻中的蛋白含量；利用GB/T 5009.124-2016《食品安全国家标准-食品中氨基酸的测定》检测筛选获得的蛋白核小球藻中的氨基酸含量。以目前国内通用的商业化蛋白核小球藻藻株FACHB-9(F9)为对照。

1.4异养发酵优化及发酵体系建立

蛋白核小球藻的培养受多方面的影响，主要包括C源、N源、pH、温度等，这些培养条件不仅会影响藻细胞的生长，也会影响营养成分的组成。目前，大量文献已证实葡萄糖是小球藻最好的C源，但征对不同藻种，其最优N源各异。氮源充足时，碳源和ATP(三磷酸腺苷)会促进蛋白质和核酸的合成，保证藻细胞正常的新陈代谢，大大提高蛋白质的含量；但在氮源缺乏的情况下，碳源和ATP主要用于抵抗逆境。硝酸盐和尿素是工业上最主要的N源，当硝酸盐中的N被消耗后会使pH上升，反之尿素中的N被消耗后会使pH上升，从而影响藻液中的溶氧量。因此，发酵中需要实时监测pH值并进行调节，使其稳定在不影响藻类生长的范围(pH6-8)。温度是影响酶活的重要因素，只有在适宜的温度下培养，才能更好的保证藻细胞的生长及代谢网络的正常运行。通常小球藻的最适温度在25-28℃之间。

发酵条件的优化和发酵体系的建立对小球藻工业化生产和应用至关重要。

2实验结果

2.1藻种的筛选鉴定

经分离筛选及形态学观察，获得5株形态差异的小球藻。其中一株小球藻的ITS序列、 RcbLZ序列及tufA序列在线提交到GeneBank中进行Blastn比对后，发现其与蛋白核小球藻对应序列的一致性分别为99.83％、99.89％、100％；该藻株的ITS、RcbLZ及tufA核苷酸序列分别如SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9所示；将该株小球藻命名为RLXCh3(藻落形态如图1A所示)。这三个序列的联合进化树分析表明RLXCh3与蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)处于同一进化分支(系统发育树如图1B所示)。综合形态观察与测序结果分析，本实验保存的从土壤中分离获得的藻类样本RLXCh3为蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)。

藻种RLXCh3的保藏信息如下：

将藻种RLXCh3于2022年5月送中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年5月16 日；保藏编号：CCTCC NO:M 2022648；分类命名为：Chlorellapyrenoidosa RLXCh3。

2.2RLXCh3各营养成分含量

RLXCh3中蛋白含量占细胞干重的68.37％；对照藻种F9中蛋白含量占细胞干重的53.45％(表1)。氨基酸由游离氨基酸(21种)和水解氨基酸(16种)两类组成。因藻类细胞中含蛋白质，检测水解氨基酸的含量更能准确反应样品中氨基酸的组成。本实施例共检测水解氨基酸16种，包括7种必需氨基酸(表2中下划线标注的氨基酸)，氨基酸组分在 RLXCh3中为89.06mg/g(鲜重)，在F9中为76mg/g(鲜重)(表1)。RLXCh3和F9鲜重中的各氨基酸含量如表2所示。

表1.小球藻RLXCh3中蛋白含量占细胞干重的比例及氨基酸组分总计

	F9	RLXCh3
			蛋白质含量(％)	53.45	68.37**
氨基酸组分总计(mg/g)	76.00	89.06***

表2.小球藻RLXCh3中各氨基酸组分的含量(下划线标记为必需氨基酸)

2.3发酵体系的建立

最适碳源含量的确定：已有大量研究表明，葡萄糖是微藻培养最适的C源，然而征对不同藻种，其最适C源含量不同。以BG11液体培养基为基础培养基，分析不同含量的葡萄糖对RLXCh3生长的影响，培养基pH为7.0，28℃，200rpm，培养7d，其结果如表3所示。

表3.不同葡萄糖浓度对RLXCh3生长的影响

葡萄糖浓度(g/L)	0	10	20	30	40	50
							生物量(g/L)	3.19±0.08	6.20±0.52	6.72±0.81	5.87±1.05	5.49±0.15	4.87±0.56

最适pH值的确定：以BG11液体培养基加20g/L葡萄糖为基础培养基，分析不同pH值对RLXCh3生长的影响。其结果如表4所示。

表4.不同pH值对RLXCh3生长的影响

pH值	5.5	6.0	6.5	7.0	7.5	8.0
							生物量(g/L)	6.19±0.14	8.0±0.69	7.76±0.23	6.80±0.41	6.32±0.27	5.95±0.45

最适氮源含量的确定：以1000倍的A5培养基母液1mL、葡萄糖20g/L、KH₂PO₄1.2 g/L、MgSO₄1.2 g/L、柠檬酸钠0.2g/L、pH 6.0为基础培养基，以C/N比等于16为基准分析不同N源对RLXCh3生长的影响。所述1000倍的A5培养基母液中含有：MgSO₄·7H₂O 16g/L、EDTA·Na₂2.1g/L、CaCl₂·7H₂O 30g/L、H₃BO₃2.86g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L、 MnCl₂·4H₂O1.81g/L、Na₂MoO₄0.021g/L、CuSO₄·5H₂O 0.07g/L。不同N源及其含量如表5所示，其对RLXCh3生物量的影响如表6所示。

表5.不同N源及其含量

不同N源	KNO<sub>3</sub>	NaNO<sub>3</sub>	尿素	NH<sub>4</sub>Cl
					N源含量(g/L)	3.61	3.04	1.07	1.42

表6.不同N源对RLXCh3生长的影响

不同N源	KNO<sub>3</sub>	NaNO<sub>3</sub>	尿素	NH<sub>4</sub>Cl
					生物量(g/L)	18.06±2.56	14.52±1.11	22.55±1.25	11.33±0.68

经过上述对比实验，发现：适用于RLXCh3异养培养的最适C源为葡萄糖，含量为 10～20g/L；最适N源为尿素，含量为0.5～1.5g/L；最适pH为6.0-6.5；最适温度为28～30℃。异养发酵体系如下：

(1)藻种活化：将藻株RLXCh3接种到含20g/L葡萄糖的BG11固体培养基上，25℃、16h光照/8h黑暗倒置培养至单藻落长出。BG11固体培养基配方为：葡萄糖20g/L、硝酸钠1.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.04g/L、MgSO₄·7H₂O 0.075g/L、CaCl₂·2H₂O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001g/L、碳酸钠0.02g/L、A5+Co母液1 mL/L、琼脂粉15g/L、pH 6.0-6.5。A5+Co母液含有如下组分：硼酸0.00286g/L、MnCl₂·H₂O 0.00181g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.000222g/L、CuSO₄·5H₂O 0.000079g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.00039g/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.000049g/L。

(2)种子液培养：将活化藻株单克隆接种到含20g/L葡萄糖的BG11液体培养基(配方同步骤(1)中的BG11固体培养基，但不含琼脂粉)中，28℃，200rpm，培养7d，得到种子发酵液。

(3)液体发酵：将步骤(2)得到的种子发酵液按10％(体积百分比)添加到发酵培养基中，发酵温度28℃，罐压0.05Mpa，搅拌速率100rpm，通氧量>60％，发酵时间 7d。发酵培养基配方为：1000倍的A5培养基母液1mL、葡萄糖20g/L、尿素1.268g/L、 KH₂PO₄1.2g/L、MgSO₄1.2g/L、柠檬酸钠0.2g/L、pH 6.0-6.5。1000倍的A5培养基母液配方为：MgSO₄·7H₂O16g/L、EDTA·Na₂2.1g/L、CaCl₂·7H₂O 30g/L、H₃BO₃2.86g/L、 ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L、MnCl₂·4H₂O 1.81g/L、Na₂MoO₄0.021g/L、CuSO₄·5H₂O 0.07g/L。

经初步发酵罐发酵培养，最终获得40g/L的鲜重生物量。

实施例2应用实例

馒头是我国人民常见的传统主食之一，在当今家庭膳食结构中仍占据着重要的地位。传统馒头大多以小麦粉为原料，主要成分是淀粉，蛋白质、膳食纤维及其他营养元素的含量偏少，长期食用易引发高血压、高血脂、糖尿病和肥胖症等“生活习惯病”。随着我国经济的迅速发展和人民生活水平的提高，人民群众饮食观念从吃得饱，到吃得好、吃得健康发生转变，需要丰富多样、营养健康的食物供应。营养丰富、保键的功能性馒头逐渐受到消费者青睐。尽管目前已有在馒头中添加红枣粉、玫瑰粉、玉米粉、螺旋藻粉等应用，其组分复杂，潜在过敏原较多，营养不够均衡，加工技术复杂；将蛋白核小球藻添加到馒头中，辅之以低碳化合物的荞麦粉，经酵母深度发酵，实现营养价值“1+1>2”的效果，营养均衡而强化，馒头色泽青绿，藻香风味，食欲性强；制备工艺简单易行，适于工厂化生产，具有较大的应用价值和市场前景。蛋白核小球藻营养强化馒头也是符合当前“大食物观”的绿色优质食品。关于蛋白核小球藻营养强化的馒头研究及应用还很少，亟待开发利用。

将本发明的蛋白核小球藻应用到制作营养强化馒头中，制备功能性食品，能够解决现有传统馒头中蛋白质等营养成分含量不高、附加值较低等关键技术问题。

将实施例1中的RLXCh3的发酵液经高速离心(13000rpm,10min)，收集藻泥，再经喷雾干燥机(150-200℃)干燥，得到小球藻粉，室温(25-28℃)避光保存。

利用本发明的蛋白核小球藻制作的营养强化馒头包含以下几种主要组分：按质量百分比计，小麦粉40％～60％、荞麦粉20％～40％、小球藻粉0.7％～1.2％、食用碱0.1％、酵母 1％～1.6％、泡打粉0.5％～1.2％、水20％～40％。将面粉、酵母粉、泡打粉加入和面机中持续搅拌；将蛋白核小球藻粉和食用碱加入水中，经超声破碎后，加入和面机中，搅拌均匀；将和好的面团放置在压面机上压制充分；面团经刀切馒头成型机切割，馒头成型；将馒头置于蒸笼内，发酵充分(温度30℃-45℃、60％-80％湿度)，蒸制即可食用。

制作的馒头充分利用了新资源绿色食品蛋白核小球藻的高蛋白、低糖、低脂的营养特性，辅之以低碳水化合物的荞麦粉，经食用碱护色处理以及酵母深度发酵，馒头颜色青绿，营养得到强化，绿色健康，具有补充营养、改善健康、提高食欲的功效。其香气独特、麦香与藻香交织，色泽淡绿，有食欲，口感松软可口。

通过不同配方比较，小麦粉45％、荞麦粉25％、蛋白核小球藻粉1.2％、食用碱0.1％、酵母1％、泡打粉0.5％及余量的水配比下制作的馒头营养品质及口感、色泽等最佳，经营养指标检测及感官评价分析，该最佳配方下的馒头能量为1000kJ/100g，蛋白含量为13.26 g/100g，脂肪含量为0.8g/100g，碳水化合物为30.8g/100g，钠为46.7mg/100g，其蛋白质含量显著高于对照配方(小麦粉45％、荞麦粉25％、食用碱0.1％、酵母1％、泡打粉0.5％及余量的水)制作的馒头蛋白质含量(7.8g/100g)以及市场普通白面馒头(蛋白质含量3-8g/100g)，碳水化合物及钠含量显著低于市场普通白面馒头(纯小麦粉馒头) 的碳水化合物、钠的含量(碳水化合物含量40-65g/100g、钠含量100-200mg/100g)，品质优越。

本实施例馒头制作的工艺流程如图2所示，蛋白核小球藻粉不同添加量下馒头的外观品质如图3所示。

Claims

1.一株高产蛋白质的蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa RLXCh3，在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2022648。

2.权利要求1所述的蛋白核小球藻的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)藻种活化：将藻株RLXCh3接种到BG11固体培养基上，24-26℃、15-17h光照/7-9h黑暗条件下倒置培养至单藻落长出；所述BG11固体培养基配方为：葡萄糖18-22g/L、硝酸钠1.3-1.7g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.03-0.05g/L、MgSO₄·7H₂O 0.065-0.085g/L、CaCl₂·2H₂O 0.026-0.046g/L、柠檬酸0.005-0.007g/L、柠檬酸铁铵0.005-0.007g/L、EDTA0.0005-0.0015g/L、碳酸钠0.015-0.025g/L、A5+Co母液0.8-1.2mL/L、琼脂粉13-17g/L、pH 6.0-6.5；所述A5+Co母液含有如下组分：硼酸0.0027-0.0029g/L、MnCl₂·H₂O 0.0017-0.0019g/L、ZnSO₄·7H₂O0.00021-0.00023g/L、CuSO₄·5H₂O 0.00007-0.00009g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.0003-0.0005g/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.00004-0.00006g/L；

3)液体发酵：将步骤2)得到的种子发酵液按体积百分比7-13％或8-12％添加到发酵培养基中于27-28℃、通氧量>60％、搅拌条件下发酵培养6-9天；所述发酵培养基配方为：1000倍的A5培养基母液0.8-1.2mL、葡萄糖18-22g/L、尿素1.26-1.28g/L、KH₂PO₄1.0-1.4g/L、MgSO₄ 1.0-1.4g/L、柠檬酸钠0.15-0.25g/L、pH 6.0-6.5，所述1000倍的A5培养基母液中含有：MgSO₄·7H₂O 14-18g/L、EDTA·Na₂ 2.0-2.2g/L、CaCl₂·7H₂O 28-32g/L、H₃BO₃ 2.7-3.0g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.21-0.23g/L、MnCl₂·4H₂O 1.7-1.9g/L、Na₂MoO₄0.015-0.025g/L、CuSO₄·5H₂O 0.06-0.08g/L。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：步骤1)中所述BG11固体培养基配方为：葡萄糖20g/L、硝酸钠1.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.04g/L、MgSO₄·7H₂O 0.075g/L、CaCl₂·2H₂O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001 g/L、碳酸钠0.02g/L、A5+Co母液1mL/L、琼脂粉15g/L、pH 6.0-6.5；所述A5+Co母液含有如下组分：硼酸0.00286g/L、MnCl₂·H₂O 0.00181g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.000222g/L、CuSO₄·5H₂O 0.000079g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.00039g/L、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.000049g/L。

5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：步骤3)中所述发酵培养基配方为：1000倍的A5培养基母液1mL、葡萄糖20g/L、尿素1.268g/L、KH₂PO₄ 1.2g/L、MgSO₄ 1.2g/L、柠檬酸钠0.2g/L、pH 6.0-6.5；所述1000倍的A5培养基母液中含有：MgSO₄·7H₂O 16g/L、EDTA·Na₂ 2.1g/L、CaCl₂·7H₂O 30g/L、H₃BO₃ 2.86g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L、MnCl₂·4H₂O 1.81g/L、Na₂MoO₄ 0.021g/L、CuSO₄·5H₂O 0.07g/L。

6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

3)液体发酵：将步骤2)得到的种子发酵液按体积百分比9-11％或10％添加到发酵培养基中于28℃、通氧量>60％、罐压0.05Mpa、搅拌速率80-140或80-120或90-110或100rpm发酵培养6-8天或7天。

7.权利要求1所述的蛋白核小球藻RLXCh3在蛋白生产中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用方法为：将权利要求1所述的蛋白核小球藻RLXCh3按权利要求2至6任一项所述的培养方法进行培养，得到藻液；将藻液离心，浓缩，干燥，即得含有蛋白的藻粉。

9.权利要求1所述的蛋白核小球藻RLXCh3在制备提高蛋白含量的功能性食品中的应用，其特征在于：是将蛋白核小球藻RLXCh3的藻粉加入食品中以增加食品的蛋白含量；优选所述功能性食品包括米、面制品，优选为淀粉发酵食品。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述淀粉发酵食品为馒头，所述馒头的制作原料为：面粉60％～80％、小球藻粉0.7％～1.2％、食用碱0.08-0.12％、酵母1％～1.6％、泡打粉0.5％～1.2％、水20％～40％；优选面粉70％、小球藻粉1.2％，优选70％的面粉为45％小麦粉和25％荞麦粉组成。