CN111349565A - 一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法 - Google Patents

一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，具体方法采用将重组菌株进行秸秆糖化、以秸秆糖化液作为廉价原料兼养培养小球藻的方法。所述方法包括以下步骤：(1)热纤梭菌重组菌株活化；(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，添加培养基和重组菌株，进行秸秆糖化；(3)蛋白核小球藻培养液的配制；(4)兼养培养蛋白核小球藻：将适量藻种接入培养液中在适当光强下进行兼养培养。本发明通过热纤梭菌重组菌株，进一步提高热纤梭菌纤维小体降解木质纤维素产葡萄糖的能力；且兼养得到的蛋白核小球藻生物量高、且蛋白质含量高，因此降低了小球藻的生产成本，提高了蛋白核小球藻及其衍生产品的市场竞争力。

Description

一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用将β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株进行秸秆糖化、以秸秆糖化液作为廉价原料兼养小球藻的方法。
背景技术
农作物秸秆产量巨大，仅山东省一年的产量就高达7000多万吨。其中有1500万吨左右的秸秆未经利用直接燃烧，不仅污染环境，而且造成了纤维素资源的极大浪费。秸秆的主要成分是纤维素，使用纤维素酶制剂水解后可制得高浓度的糖液，可以作为廉价的糖源用于微藻培养。
蛋白核小球藻是世界公认的“绿色黄金”，是优质的单细胞蛋白来源微藻，蛋白质含量高达50％以上，而且还含有丰富的不饱和脂肪酸、8种必须氨基酸、多种维生素及矿物质，关键是还含有生长因子CGF，具有提高机体免疫力、抗肿瘤等重要生理及医疗作用，营养价值极高，具有极高的商业应用前景。在发达国家，如日本，已经形成市场化和产业化，广泛用于人体的营养保健领域及动物养殖行业。蛋白核小球藻可以利用光能和二氧化碳进行正常的光合自养生长，也可以利用葡萄糖等有机碳源进行异养生长和兼养生长。异养有利于生物量的积累，但是会导致蛋白质含量的降低；自养正好相反，可以获得较高的蛋白质含量，但是生物量较低。因此，如何在保证较高蛋白质含量的情况下不降低生物量，一直是蛋白核小球藻降低生产成本的关键技术瓶颈之一。
为了降低蛋白核小球藻的生产成本，人们主要尝试采用廉价的原料、多种培养方式来培养蛋白核小球藻。发明专利申请201510858635.X公开了“一种利用秸秆半纤维素培养小球藻的方法”，主要步骤包括：1、利用碱法处理秸秆提取半纤维素；2、以纤维弧菌和小球藻构建一种菌藻共培养系统；3、纤维弧菌以秸秆半纤维素为碳源进行生长代谢，其代谢产物为小球藻的混合营养生长提供有机碳源。该申请是通过纤维弧菌利用秸秆半纤维素后产生的糖为碳源异养培养小球藻，存在藻菌后期分离的问题。
发明专利申请201610976321.4公开了“一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用”。该发明以秸秆为原料，采用机械法、碱法或亚硫酸铵法处理秸秆，去除木质素，添加纤维素酶后制得纤维素水解液。在此基础上，通过添加必需无机营养元素后用作小球藻的异养培养基质。发明专利申请201710248657.3公开了“一种利用秸秆培养异养小球藻的方法”。该发明采用物理法如汽爆法或球磨法破碎秸秆，采用纤维素酶、半纤维素进行酶解产糖，作为小球藻异养培养的碳源。发明专利申请201810305135.7公开了“以甜高粱汁为原料培养微藻的方法”。该发明利用甜高粱汁作为廉价原料培养微藻，主要步骤包括：1、通过添加蛋白酶、超声处理、离心去除沉淀，得到处理后的甜高粱汁；2、添加复合酶进行酶解，并适当稀释糖浓度后，用作碳源；3、添加氮源和其他营养盐，灭菌后用作微藻培养基；4、对微藻进行兼养或异养培养。然而，这三件申请采用的均为商品化的酶，用酶成本高，不利于降低微藻培养过程中的用料成本。
为了解决秸秆糖化的商业化酶价格昂贵所带来的成本问题，发明专利申请201710324806.X公开了“一种纤维素酶制剂及其应用”。该专利申请将β-1,4-葡萄糖苷酶通过共价或非共价的蛋白质相互作用方式或与纤维小体组分融合表达的方式结合在纤维小体复合体中，实现木质纤维素底物的水解产葡萄糖。该专利申请获得的可发酵糖产量为90-500mM，是蛋白核小球藻进行兼养培养的优质碳源；然而该糖化液中除了可发酵糖外，还有高达4g/L的乙酸和5g/L的乙醇，过高的乙酸和乙醇不利于小球藻的生长。如何解决这个问题，是将秸秆糖化技术应用于小球藻生长的关键所在。因此，基于该秸秆糖化技术联产蛋白核小球藻的工艺开发，不仅有利于秸秆资源的高效利用，而且对高品质的微藻蛋白的大规模生产具有重要的应用价值。
发明内容
为了解决目前蛋白核小球藻的生产成本高的问题，本发明提供了一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法；具体方法是采用热纤梭菌“一锅法”原位糖化秸秆，并以秸秆糖化液作为廉价优质碳源，采用兼养方式培养蛋白核小球藻。采用秸秆糖及适当光强对蛋白核小球藻的兼养培养，同时提高了蛋白核小球藻的生物量和蛋白质产量，进一步降低了蛋白核小球藻的生产成本，提高了蛋白核小球藻及其衍生产品的市场竞争力。
本发明的技术方案：一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，包括以下步骤：
(1)热纤梭菌菌株活化：取100-200ul的将β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM1313纤维小体上的重组菌株接种到4ml的厌氧发酵培养基中，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株。所述的厌氧发酵培养基成分为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素2.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:10-1:25添加厌氧发酵培养基，将适量步骤(1)得到的菌株加入厌氧发酵罐中，在45-65℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到11-64g/L。所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为球磨破碎、微生物预降解或亚铵处理手段。
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液(秸秆糖化液)和残渣，向糖液中加入适量水稀释，使得糖浓度为10-50g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到6.0-7.0，并于在115-121℃下灭菌15-30min，获得培养液。所述的氮源和其他营养物质具体为：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钾0.05g/L，硫酸亚铁0.05g/L，EDTA 0.02g/L。
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照5-10％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度20-30℃，转速50-500r/min，通气量0.3-2.0VVM，光强为50-350μmol photons m-2s-1，培养时间为3-8天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。其中，步骤(2)制备得到的秸秆糖化液可以作为补充液；作为补充液的秸秆糖化液中总糖浓度为培养液中初始糖浓度的1.6-4倍。
所述的藻种是蛋白核小球藻是在糖化液中传代10次后的藻种，具体步骤为：
1)传代培养液配置：采用秸秆糖化液,向糖液中加入适量水，使得葡萄糖浓度为20g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到6.5，并于在118℃下灭菌25min，获得培养液。所述的氮源和其他营养物质具体为：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钾0.05g/L，硫酸亚铁0.05g/L，EDTA0.02g/L。
2)兼养培养蛋白核小球藻：按照10％体积分数的接种量，将藻种接入上述传代培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度25℃，转速200r/min，通气量1.8VVM，光强为150μmol photons m-2s-1，培养时间为4天。
3)传代培养：在上述条件下连续传代10次，发现第10代的蛋白核小球藻具有耐受5g/L的乙醇及利用4g/L的乙酸的特性。
由于糖化液中除了葡萄糖外，还为蛋白核小球藻的生长提供了额外的碳源乙酸(1.5-4.0g/L)以及额外的氮源尿素(0.2-0.9g/L)；所以与纯葡萄糖培养液相比，糖化液更有利于本申请所述的蛋白核小球藻的生长，获得更高的生物量。同时，研究发现，本申请采用的兼养培养有利于蛋白核小球藻蛋白质的积累，从而获得了高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明采用将β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株，该菌株具有将纤维素直接高效降解为葡萄糖的能力，产葡萄糖的量为11-64g/L，解决了现有技术中木质纤维素降解必须通过外源添加纤维素酶的技术问题；而且，克服了现有技术中糖化液不利于小球藻的生长的技术偏见。
(2)采用本发明所述的方法得到的蛋白核小球藻生物量高、且蛋白质含量高，解决了蛋白核小球藻不能同时获得高生物量和高蛋白质含量的关键技术瓶颈；所述的蛋白核小球藻生物质含量为F/2培养基的2-3倍，蛋白质含量为生物质含量的60％-70％，完全可以满足下游产品的不同需求，为蛋白核小球藻的市场化提供了强有力的技术支持。
(3)本发明所述的方法采用低成本的秸秆糖化兼养高价值的蛋白核小球藻高值品的方法，有效降低了蛋白核小球藻培养的原料成本的同时还获得了高生物量和高蛋白量，使得终端产品具有更高的市场竞争性。
具体实施方式
实施例1：
一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，包括以下步骤：
(1)热纤梭菌菌株活化：将100ul的β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株接种到4ml厌氧发酵培养基，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株。所述的厌氧发酵培养基成分为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素2.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:10添加培养基，将适量步骤(1)得到的诱变菌株加入厌氧发酵罐中，在50℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到45g/L。所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为球磨破碎。
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液(秸秆糖化液)和残渣，向糖液中加入适量水，使得糖浓度为25g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到7.0，并于在115℃下灭菌20min，获得培养液。所述的氮源和其他营养物质具体为：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钾0.05g/L，硫酸亚铁0.05g/L，EDTA 0.02g/L。
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照8％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度25℃，转速400r/min，通气量2.0VVM，光强为50μmol photons m-2s-1，培养时间为5天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。其中，所述补充液是步骤(2)制备得到的秸秆糖化液，其总糖浓度为培养液中初始糖浓度的2.2倍。
所述的藻种是蛋白核小球藻在糖化液中传代10次后的藻种，具体步骤为：
1)传代培养液配置：采用秸秆糖化液,向糖液中加入适量水，使得葡萄糖浓度为20g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到6.5，并于在118℃下灭菌25min，获得培养液。所述的氮源和其他营养物质具体为：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钾0.05g/L，硫酸亚铁0.05g/L，EDTA0.02g/L。
2)兼养培养蛋白核小球藻：按照10％体积分数的接种量，将藻种接入上述传代培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度25℃，转速200r/min，通气量1.8VVM，光强为150μmol photons m-2s-1，培养时间为4天。
3)传代培养：在上述条件下连续传代10次，发现第10代的蛋白核小球藻具有耐受5g/L的乙醇及利用4g/L的乙酸的特性。
实施例2：
与实施例1不同的是，一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，包括以下步骤：
(1)热纤梭菌菌株活化：将150ul的β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株接种到4ml厌氧发酵培养基，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株。
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:12添加培养基，将适量步骤(1)得到的诱变菌株加入厌氧发酵罐中，在53℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到60g/L。所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为微生物预降解。
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液(秸秆糖化液)和残渣，向糖液中加入适量水，使得糖浓度为30g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到6.0，并于在118℃下灭菌24min，获得培养液。
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照9％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度28℃，转速450r/min，通气量0.3VVM，光强为100μmol photons m-2s-1，培养时间为6天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。其中，所述补充液是步骤(2)制备得到的秸秆糖化液，其总糖浓度为培养液中初始糖浓度的2.5倍。
实施例3：
与实施例1不同的是，一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，包括以下步骤：
(1)热纤梭菌菌株活化：将120ul的β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株接种到4ml厌氧发酵培养基，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株。
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:14添加培养基，将适量步骤(1)得到的诱变菌株加入厌氧发酵罐中，在55℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到64g/L。所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为亚铵预处理。
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液(秸秆糖化液)和残渣，向糖液中加入适量水，使得糖浓度为40g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到7.0，并于在121℃下灭菌28min，获得培养液。
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照10％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度30℃，转速500r/min，通气量0.5VVM，光强为150μmol photons m-2s-1，培养时间为7天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。其中，所述补充液是步骤(2)制备得到的秸秆糖化液，其总糖浓度为培养液中初始糖浓度的2.0倍。
实施例4：
与实施例1不同的是，一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，包括以下步骤：
(1)热纤梭菌菌株活化：将200ul的β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株接种到4ml厌氧发酵培养基，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株。
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:16添加培养基，将适量步骤(1)得到的诱变菌株加入厌氧发酵罐中，在58℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到35g/L。所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为球磨破碎。
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液(秸秆糖化液)和残渣，向糖液中加入适量水，使得糖浓度为11g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到6.0，并于在116℃下灭菌30min，获得培养液。
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照5％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度20℃，转速50r/min，通气量0.8VVM，光强为200μmol photons m-2s-1，培养时间为8天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。其中，所述补充液是步骤(2)制备得到的秸秆糖化液，其总糖浓度为培养液中初始糖浓度的4倍。
实施例5：
与实施例1不同的是，一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，包括以下步骤：
(1)热纤梭菌菌株活化：将110ul的β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株接种到4ml厌氧发酵培养基，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株。
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:18添加培养基，将适量步骤(1)得到的诱变菌株加入厌氧发酵罐中，在62℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到30g/L。所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为微生物预降解。
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液(秸秆糖化液)和残渣，向糖液中加入适量水，使得糖浓度为18g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到7.0，并于在120℃下灭菌15min，获得培养液。
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照6％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度22℃，转速100r/min，通气量1.0VVM，光强为250μmol photons m-2s-1，培养时间为3天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。其中，所述补充液是步骤(2)制备得到的秸秆糖化液，其总糖浓度为培养液中初始糖浓度的2.1倍。
实施例6：
与实施例1不同的是，一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，包括以下步骤：
(1)热纤梭菌菌株活化：将160ul的β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株接种到4ml厌氧发酵培养基，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株。
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:20添加培养基，将适量步骤(1)得到的诱变菌株加入厌氧发酵罐中，在65℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到25g/L。所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为亚铵预降解。
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液(秸秆糖化液)和残渣，向糖液中加入适量水，使得糖浓度为20g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到6.0，并于在117℃下灭菌18min，获得培养液。
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照7％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度24℃，转速200r/min，通气量1.3VVM，光强为300μmol photons m-2s-1，培养时间为4天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。其中，所述补充液是步骤(2)制备得到的秸秆糖化液，其总糖浓度为培养液中初始糖浓度的1.6倍。
实施例7：
与实施例1不同的是，一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，包括以下步骤：
(1)热纤梭菌菌株活化：将170ul的β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株接种到4ml厌氧发酵培养基，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株。
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:22添加培养基，将适量步骤(1)得到的诱变菌株加入厌氧发酵罐中，在45℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到20g/L。所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为球磨破碎。
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液(秸秆糖化液)和残渣，向糖液中加入适量水，使得糖浓度为15g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到7.0，并于在119℃下灭菌20min，获得培养液。
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照8％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度26℃，转速300r/min，通气量1.5VVM，光强为350μmol photons m-2s-1，培养时间为5天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。其中，所述补充液是步骤(2)制备得到的秸秆糖化液，其总糖浓度为培养液中初始糖浓度的1.7倍。
实施例8：
与实施例1不同的是，一种低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，包括以下步骤：
(1)热纤梭菌菌株活化：将180ul的β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株接种到4ml厌氧发酵培养基，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株。
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:25添加培养基，将适量步骤(1)得到的诱变菌株加入厌氧发酵罐中，在48℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到11g/L。所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为亚铵预降解。
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液(秸秆糖化液)和残渣，向糖液中加入适量水，使得糖浓度为9g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到6.0，并于在118℃下灭菌25min，获得培养液。
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照6％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度25℃，转速350r/min，通气量1.8VVM，光强为200μmol photons m-2s-1，培养时间为7天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。其中，所述补充液是步骤(2)制备得到的秸秆糖化液，其总糖浓度为培养液中初始糖浓度的1.6倍。
表1.实施例1-8产葡萄糖的量以及蛋白核小球藻的参数
Figure BDA0001915227270000101
由表1可知，本发明采用β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株将纤维素直接降解为葡萄糖，用高效液相色谱测定产葡萄糖的量为11-64g/L。此外，采用本发明所述的方法得到的蛋白核小球藻，用称重法测定的生物质含量为F/2培养基的2-3倍，用凯氏定氮仪测定的蛋白质含量为生物质含量的60％-70％，因此，可以满足下游产品的不同需求，为蛋白核小球藻的市场化提供了强有力的技术支持。

Claims (6)

1.低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)热纤梭菌重组菌株：取100-200ul的将β-1,4-葡萄糖苷酶整合到热纤梭菌DSM 1313纤维小体上的重组菌株，接种到4ml的厌氧发酵培养基中，50℃，活化18小时，之后再活化一次后直接用作糖化菌株；
(2)秸秆糖化：将预处理后的秸秆转移至厌氧发酵体系，并按照固液质量比1:10-1:25添加培养基，将适量步骤(1)得到的诱变菌株加入厌氧发酵罐中，在45-65℃的温度条件下进行秸秆糖化，得到以葡萄糖为主的糖化液，葡萄糖浓度达到11-64g/L；
(3)蛋白核小球藻培养液：离心处理，分离步骤(2)得到的糖液和残渣，向糖液中加入适量水，使得糖浓度为10-50g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到6.0-7.0，并于在115-121℃下灭菌15-30min，获得培养液；
(4)兼养培养蛋白核小球藻：按照5-10％体积分数的接种量，将藻种接入步骤(3)得到的培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度20-30℃，转速50-500r/min，通气量0.3-2.0VVM，光强为50-350μmol photons m-2s-1，培养时间为3-8天；培养过程中根据需要添加补充液，以保证微藻的生长。
2.根据权利要求1所述的低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，其特征在于：步骤(2)所述的预处理后的秸秆为木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的秸秆底物；所述预处理的方法为球磨破碎、微生物预降解或水热处理手段。
3.根据权利要求1所述的低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，其特征在于：步骤(2)所述的厌氧发酵培养基成分为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，其特征在于：步骤(3)所述的氮源和其他营养物质具体为：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钾0.05g/L，硫酸亚铁0.05g/L，EDTA 0.02g/L。
5.根据权利要求1所述的低成本、高生物量和高蛋白量的蛋白核小球藻培养方法，其特征在于：所述的藻种是蛋白核小球藻在糖化液中传代10次后的藻种，具体步骤为：
1)传代培养液配置：采用秸秆糖化液,向糖液中加入适量水，使得葡萄糖浓度为20g/L；然后添加氮源和其他营养物质，用NaOH调节pH值到6.5，并于在118℃下灭菌25min，获得培养液；
2)兼养培养蛋白核小球藻：按照10％体积分数的接种量，将藻种接入上述传代培养液中进行兼养培养；设定培养条件为：温度25℃，转速200r/min，通气量1.8VVM，光强为150μmol photons m-2s-1，培养时间为4天；
3)传代培养：在上述条件下连续传代10次，发现第10代的蛋白核小球藻具有耐受5g/L的乙醇及利用4g/L的乙酸的特性。
6.根据权利要求1所述的热纤梭菌糖化秸秆兼养小球藻的方法，其特征在于：步骤(2)制备得到的秸秆糖化液可以作为步骤(4)所述的补充液，作为补充液的秸秆糖化液中总糖浓度为培养液中初始糖浓度的1.6-4倍。
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