JP2003052392A - 微生物の検出方法および検出キット - Google Patents
微生物の検出方法および検出キットInfo
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 食品中の微生物の検出、および微生物感染し
た患者を治療する上で最適な薬剤を選択することを目的
とした薬剤感受性試験などの検査を行うための、微生
物、特に酵母様真菌および糸状菌の増殖を簡便な操作で
客観的に判定する方法、および該方法を用いた薬剤感受
性試験方法ならびにそれらに用いるキットの提供。 【解決手段】 検体を接種した液体培地において、酸化
還元色素を含む呈色試薬とアルカリ性増感試液とを添加
し反応させて、該反応における呈色によって微生物を検
出する方法、該方法を用いた薬剤感受性試験方法および
それらに使用するキット。
た患者を治療する上で最適な薬剤を選択することを目的
とした薬剤感受性試験などの検査を行うための、微生
物、特に酵母様真菌および糸状菌の増殖を簡便な操作で
客観的に判定する方法、および該方法を用いた薬剤感受
性試験方法ならびにそれらに用いるキットの提供。 【解決手段】 検体を接種した液体培地において、酸化
還元色素を含む呈色試薬とアルカリ性増感試液とを添加
し反応させて、該反応における呈色によって微生物を検
出する方法、該方法を用いた薬剤感受性試験方法および
それらに使用するキット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、食品中の微生物の
検出、および微生物感染した患者を治療する上で最適な
薬剤を選択することを目的とした薬剤感受性試験などの
検査を行うための方法およびキットに関する。
検出、および微生物感染した患者を治療する上で最適な
薬剤を選択することを目的とした薬剤感受性試験などの
検査を行うための方法およびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】酵母様真菌や糸状菌を含む真菌類は食品
腐敗の原因菌となり、特に糸状菌であるAspergillus属
やPenicillium属はアフラトキシンなどの発癌性物質で
あるマイコトキシンを産生する。また、近年増加が問題
となっている深在性真菌症の起因菌でもある。このよう
なことから、これらの菌を検出することは衛生学的およ
び医学的に極めて重要である。
腐敗の原因菌となり、特に糸状菌であるAspergillus属
やPenicillium属はアフラトキシンなどの発癌性物質で
あるマイコトキシンを産生する。また、近年増加が問題
となっている深在性真菌症の起因菌でもある。このよう
なことから、これらの菌を検出することは衛生学的およ
び医学的に極めて重要である。
【０００３】これら菌の検査には通常、寒天培地や液体
培地を用いた培養法が用いられるが、培養法による検査
は２〜７日間の日数を必要とすることから、検査時間の
長さが問題となっている。また、液体培地を用いた方法
において、増殖度の測定は主に培養液の濁りによって判
定する濁度法が採用されている。しかしながら、この方
法は大腸菌などの細菌類には適しているものの、真菌、
特に糸状菌などの分散性が悪い菌種に対しては適してお
らず、正確な測定ができないといった問題が指摘されて
いる。
培地を用いた培養法が用いられるが、培養法による検査
は２〜７日間の日数を必要とすることから、検査時間の
長さが問題となっている。また、液体培地を用いた方法
において、増殖度の測定は主に培養液の濁りによって判
定する濁度法が採用されている。しかしながら、この方
法は大腸菌などの細菌類には適しているものの、真菌、
特に糸状菌などの分散性が悪い菌種に対しては適してお
らず、正確な測定ができないといった問題が指摘されて
いる。
【０００４】これらの問題を解決するために、Matraiら
は Aspergillus属やPenicillium属が持つインベルター
ゼ（β-D-フルクトフラノシダーゼ）に着目し、シュク
ロースを含む培地で培養する際に生じるグルコースを比
色測定することによって、20〜48時間で菌の検出を可能
とする方法を報告している（Matrai T., et.al., Int.
J. Food Microbiol. 61, 187-191, 2000）。しかし、こ
の方法は判定時に培養液を加熱処理する必要があり、操
作が煩雑である。
は Aspergillus属やPenicillium属が持つインベルター
ゼ（β-D-フルクトフラノシダーゼ）に着目し、シュク
ロースを含む培地で培養する際に生じるグルコースを比
色測定することによって、20〜48時間で菌の検出を可能
とする方法を報告している（Matrai T., et.al., Int.
J. Food Microbiol. 61, 187-191, 2000）。しかし、こ
の方法は判定時に培養液を加熱処理する必要があり、操
作が煩雑である。
【０００５】また、近年、培養法に頼らない様々な原理
を応用した迅速な検出法が開発され、すでに食品分野で
はHACCPの導入に伴い環境分析や品質管理のためにATPバ
イオルミネッセンス法が（防菌防黴学会誌, 28,601-60
9, 2000）、また医療の分野では、PCR法が利用され始め
ている（真菌症遺伝子診断、メジカルセンス社）。しか
し、ATP法は菌以外由来のATPも検出してしまうほか、特
殊な画像処理装置を必要とするといった問題があり、ま
た、PCR法では夾雑成分による反応阻害や死滅した菌の
遺伝子も検出してしまう等の問題がある。その他の方法
として蛍光染色法があるが（防菌防黴学会誌, 28,601-6
09, 2000）、市販の装置が数千万円以上と高額であるこ
とから、検査コストが非常に高くつくといった問題があ
る。このようなことから、微生物、特に酵母株真菌およ
び糸状菌を特異的にかつ、迅速、簡便に、さらに安価に
検出できる方法が待望されている。
を応用した迅速な検出法が開発され、すでに食品分野で
はHACCPの導入に伴い環境分析や品質管理のためにATPバ
イオルミネッセンス法が（防菌防黴学会誌, 28,601-60
9, 2000）、また医療の分野では、PCR法が利用され始め
ている（真菌症遺伝子診断、メジカルセンス社）。しか
し、ATP法は菌以外由来のATPも検出してしまうほか、特
殊な画像処理装置を必要とするといった問題があり、ま
た、PCR法では夾雑成分による反応阻害や死滅した菌の
遺伝子も検出してしまう等の問題がある。その他の方法
として蛍光染色法があるが（防菌防黴学会誌, 28,601-6
09, 2000）、市販の装置が数千万円以上と高額であるこ
とから、検査コストが非常に高くつくといった問題があ
る。このようなことから、微生物、特に酵母株真菌およ
び糸状菌を特異的にかつ、迅速、簡便に、さらに安価に
検出できる方法が待望されている。
【０００６】一方、真菌の薬剤感受性試験法において
も、深在性真菌症の発症頻度の上昇や抗真菌薬に耐性を
示す菌株の出現にともない、本感染症に適切な治療薬の
選択が必要不可欠になっていることから、簡便かつ信頼
性の高い菌の増殖度測定法に基づく試験方法の確立が望
まれている。米国では、National Committee for Clini
cal Laboratory Standards （NCCLS）が、１９９７年に
酵母様真菌の薬剤感受性試験法に関してReference Meth
od for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Te
sting of yeasts ; Approved Standard（M27-A）を、ま
た、１９９８年に糸状菌の感受性試験法に関してRefere
nce Method for Broth Dilution Antifungal Susceptib
ility Testing of Conidium-Forming Filamentous Fung
i ; Proposed Standard（以下M38-P）を提案している。
しかし、これらの方法は菌種によっては培養時間が2日
もしくは3日かかるため、試験結果がでるまでに長時間
を要する。また、これらの方法はいずれも濁度法によっ
て行なわれているため、塊状に増殖する真菌には適して
おらず、特にアゾール系薬剤での菌発育終末点（80% 菌
発育抑制）が判読しにくいといった問題点がある。この
ため、より簡便で再現性の高い菌発育終末点の判読方法
が望まれている。
も、深在性真菌症の発症頻度の上昇や抗真菌薬に耐性を
示す菌株の出現にともない、本感染症に適切な治療薬の
選択が必要不可欠になっていることから、簡便かつ信頼
性の高い菌の増殖度測定法に基づく試験方法の確立が望
まれている。米国では、National Committee for Clini
cal Laboratory Standards （NCCLS）が、１９９７年に
酵母様真菌の薬剤感受性試験法に関してReference Meth
od for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Te
sting of yeasts ; Approved Standard（M27-A）を、ま
た、１９９８年に糸状菌の感受性試験法に関してRefere
nce Method for Broth Dilution Antifungal Susceptib
ility Testing of Conidium-Forming Filamentous Fung
i ; Proposed Standard（以下M38-P）を提案している。
しかし、これらの方法は菌種によっては培養時間が2日
もしくは3日かかるため、試験結果がでるまでに長時間
を要する。また、これらの方法はいずれも濁度法によっ
て行なわれているため、塊状に増殖する真菌には適して
おらず、特にアゾール系薬剤での菌発育終末点（80% 菌
発育抑制）が判読しにくいといった問題点がある。この
ため、より簡便で再現性の高い菌発育終末点の判読方法
が望まれている。
【０００７】これらの問題点を解決する手段の一つとし
て、比色により菌の増殖度を測定する比色法が種々開発
されている。これまでに、テトラゾリウム塩である3-
(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazo
lium bromide（MTT）を用いた方法（Meletiadis J. J.
Clin. Microbiol., 38, 2949-2954, 2000）、酸化還元
指示薬であるAlamarBlueTM（Alamar Biosciences Inc.,
Sacramento, Calif.）を用いた方法（Jahn B., J. Cli
n. Microbiol. 34, 2039-2041, 1996）、ニュートラル
レッドを用いた生体染色法（特開平7-107995）などが報
告されている。しかし、MTT法やニュートラルレッド法
は判定時の操作が煩雑であり、AlamarBlueT Mを用いた方
法では菌株により蛍光を生じない場合があり発育阻止濃
度を判定できないという問題がある。
て、比色により菌の増殖度を測定する比色法が種々開発
されている。これまでに、テトラゾリウム塩である3-
(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazo
lium bromide（MTT）を用いた方法（Meletiadis J. J.
Clin. Microbiol., 38, 2949-2954, 2000）、酸化還元
指示薬であるAlamarBlueTM（Alamar Biosciences Inc.,
Sacramento, Calif.）を用いた方法（Jahn B., J. Cli
n. Microbiol. 34, 2039-2041, 1996）、ニュートラル
レッドを用いた生体染色法（特開平7-107995）などが報
告されている。しかし、MTT法やニュートラルレッド法
は判定時の操作が煩雑であり、AlamarBlueT Mを用いた方
法では菌株により蛍光を生じない場合があり発育阻止濃
度を判定できないという問題がある。
【０００８】また、中野らは、薬剤およびテトラゾリウ
ム塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル
サルフェート（1-methoxy PMS）、フェリシアン化カリ
ウムおよびフェロシアン化カリウムを固相化した薬剤感
受性試験用マイクロプレートおよびそれを用いた薬剤感
受性試験方法を報告している（特開平11-287796）。し
かし、該マイクロプレートおよびそれを用いた試験方法
で測定できるのは酵母様真菌のみであり、糸状菌に適用
することは困難であった。
ム塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル
サルフェート（1-methoxy PMS）、フェリシアン化カリ
ウムおよびフェロシアン化カリウムを固相化した薬剤感
受性試験用マイクロプレートおよびそれを用いた薬剤感
受性試験方法を報告している（特開平11-287796）。し
かし、該マイクロプレートおよびそれを用いた試験方法
で測定できるのは酵母様真菌のみであり、糸状菌に適用
することは困難であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、上記の従来技術の問題点に鑑み、食品中の微生
物の検出および微生物感染した患者を治療する上で最適
な薬剤を選択することを目的として薬剤感受性試験など
の検査を行うための、微生物、特に酵母様真菌および糸
状菌の増殖を簡便な操作で客観的かつ短時間に判定する
方法、および該方法を用いた薬剤感受性試験方法ならび
にそれらに用いるキットを提供することにある。
目的は、上記の従来技術の問題点に鑑み、食品中の微生
物の検出および微生物感染した患者を治療する上で最適
な薬剤を選択することを目的として薬剤感受性試験など
の検査を行うための、微生物、特に酵母様真菌および糸
状菌の増殖を簡便な操作で客観的かつ短時間に判定する
方法、および該方法を用いた薬剤感受性試験方法ならび
にそれらに用いるキットを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく種々検討した結果、WST-8（2-（2-メトキシ-
4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジス
ルホフェニル)-2H-テトラゾリウム一ナトリウム塩：wat
er soluble disulfonated tetrazolium salt、Ishiyama
M., et. al., Talanta, 44 : 1299-1305, 1997）など
を初めとする、分解されてホルマザンを生じせしめた
後、アルカリ性条件下において鋭敏に呈色する水溶性テ
トラゾリウム塩などを含む呈色試薬と、シュクロースな
どの非還元糖を含む液体培地を組み合わせることによ
り、簡便にかつ短時間に微生物、特に酵母様真菌および
糸状菌の増殖度を比色法で測定できることを見出し、本
発明を完成するに至った。
解決すべく種々検討した結果、WST-8（2-（2-メトキシ-
4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジス
ルホフェニル)-2H-テトラゾリウム一ナトリウム塩：wat
er soluble disulfonated tetrazolium salt、Ishiyama
M., et. al., Talanta, 44 : 1299-1305, 1997）など
を初めとする、分解されてホルマザンを生じせしめた
後、アルカリ性条件下において鋭敏に呈色する水溶性テ
トラゾリウム塩などを含む呈色試薬と、シュクロースな
どの非還元糖を含む液体培地を組み合わせることによ
り、簡便にかつ短時間に微生物、特に酵母様真菌および
糸状菌の増殖度を比色法で測定できることを見出し、本
発明を完成するに至った。
【００１１】すなわち、本発明は、検体を接種した液体
培地において、酸化還元色素を含む呈色試薬とアルカリ
性増感試液とを添加し反応させて、該反応における呈色
によって微生物を検出する方法に関する。また、本発明
は、微生物が酵母様真菌及び/又は糸状菌であることを
特徴とする、前記検出方法に関する。またさらに、本発
明は、液体培地が、非還元糖を含むことを特徴とする、
前記検出方法に関する。
培地において、酸化還元色素を含む呈色試薬とアルカリ
性増感試液とを添加し反応させて、該反応における呈色
によって微生物を検出する方法に関する。また、本発明
は、微生物が酵母様真菌及び/又は糸状菌であることを
特徴とする、前記検出方法に関する。またさらに、本発
明は、液体培地が、非還元糖を含むことを特徴とする、
前記検出方法に関する。
【００１２】さらに、本発明は、酸化還元色素を含む呈
色試薬、液体培地およびアルカリ性増感試液を含むこと
を特徴とする、微生物を検出するためのキットに関す
る。さらに、本発明は、酸化還元色素が、水溶性のホル
マザンを生成する水溶性テトラゾリウム塩であることを
特徴とする、前記検出用キットに関する。また、本発明
は、水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウム塩が2-
（2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニ
ル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム一ナ
トリウム塩であることを特徴とする、前記検出用キット
に関する。さらに、本発明は、呈色試薬が、電子キャリ
アー、フェリシアン化カリウムおよびフェロシアン化カ
リウムをさらに含むことを特徴とする、前記検出用キッ
トに関する。また、本発明は、電子キャリアーが１−メ
トキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート
であることを特徴とする、前記検出用キットに関する。
さらに、本発明は、液体培地が、非還元糖を含むことを
特徴とする、前記検出用キットに関する。また、本発明
は、非還元糖がシュクロースであることを特徴とする、
前記検出用キットに関する。さらに、本発明は、アルカ
リ性増感試液が、液体培地のｐＨを９以上にするもので
あることを特徴とする、前記検出用キットに関する。ま
た、本発明は、アルカリ性増感試液が水酸化ナトリウム
水溶液であることを特徴とする、前記検出用キットに関
する。
色試薬、液体培地およびアルカリ性増感試液を含むこと
を特徴とする、微生物を検出するためのキットに関す
る。さらに、本発明は、酸化還元色素が、水溶性のホル
マザンを生成する水溶性テトラゾリウム塩であることを
特徴とする、前記検出用キットに関する。また、本発明
は、水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウム塩が2-
（2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニ
ル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム一ナ
トリウム塩であることを特徴とする、前記検出用キット
に関する。さらに、本発明は、呈色試薬が、電子キャリ
アー、フェリシアン化カリウムおよびフェロシアン化カ
リウムをさらに含むことを特徴とする、前記検出用キッ
トに関する。また、本発明は、電子キャリアーが１−メ
トキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート
であることを特徴とする、前記検出用キットに関する。
さらに、本発明は、液体培地が、非還元糖を含むことを
特徴とする、前記検出用キットに関する。また、本発明
は、非還元糖がシュクロースであることを特徴とする、
前記検出用キットに関する。さらに、本発明は、アルカ
リ性増感試液が、液体培地のｐＨを９以上にするもので
あることを特徴とする、前記検出用キットに関する。ま
た、本発明は、アルカリ性増感試液が水酸化ナトリウム
水溶液であることを特徴とする、前記検出用キットに関
する。
【００１３】さらに、本発明は、検体を接種した抗菌薬
を含む液体培地において、酸化還元色素を含む呈色試薬
とアルカリ性増感試液とを添加し反応させて、該反応に
おける呈色から最小発育阻止濃度を判定することを特徴
とする、微生物の薬剤感受性を試験する方法に関する。
また、本発明は、微生物が酵母様真菌及び／又は糸状菌
であることを特徴とする、前記試験方法に関する。
を含む液体培地において、酸化還元色素を含む呈色試薬
とアルカリ性増感試液とを添加し反応させて、該反応に
おける呈色から最小発育阻止濃度を判定することを特徴
とする、微生物の薬剤感受性を試験する方法に関する。
また、本発明は、微生物が酵母様真菌及び／又は糸状菌
であることを特徴とする、前記試験方法に関する。
【００１４】さらにまた、本発明は、液体培地が、非還
元糖を含むことを特徴とする、前記試験方法に関する。
さらに、本発明は、前記検出用キットにさらに抗菌薬を
含むことを特徴とする、微生物の薬剤感受性試験のため
のキットに関する。また、本発明は、抗菌薬が抗真菌薬
であることを特徴とする、前記試験用キットに関する。
元糖を含むことを特徴とする、前記試験方法に関する。
さらに、本発明は、前記検出用キットにさらに抗菌薬を
含むことを特徴とする、微生物の薬剤感受性試験のため
のキットに関する。また、本発明は、抗菌薬が抗真菌薬
であることを特徴とする、前記試験用キットに関する。
【００１５】本発明の方法においては、呈色試薬とし
て、アルカリ性増感試液に反応して呈色する成分を用い
るため、微生物の培養後の検出操作における呈色反応を
極めて鋭敏に行わせることができる。この際の呈色は、
目視、あるいは通常の吸光度計によって識別が可能であ
る。また、呈色試薬成分として酸化還元色素、特に水溶
性のものを選択すれば、呈色反応後の有機溶媒の添加お
よび攪拌操作を必要としない。したがって、本発明の方
法によれば、微生物の検出を、極めて簡便かつ正確に行
うことができる。
て、アルカリ性増感試液に反応して呈色する成分を用い
るため、微生物の培養後の検出操作における呈色反応を
極めて鋭敏に行わせることができる。この際の呈色は、
目視、あるいは通常の吸光度計によって識別が可能であ
る。また、呈色試薬成分として酸化還元色素、特に水溶
性のものを選択すれば、呈色反応後の有機溶媒の添加お
よび攪拌操作を必要としない。したがって、本発明の方
法によれば、微生物の検出を、極めて簡便かつ正確に行
うことができる。
【００１６】一方、本発明による微生物検出用キットお
よび薬剤感受性試験用キットは携帯可能である。したが
って、本発明によるキットによれば、実施する場所を限
定されることなく、それぞれの目的を遂行することが可
能である。
よび薬剤感受性試験用キットは携帯可能である。したが
って、本発明によるキットによれば、実施する場所を限
定されることなく、それぞれの目的を遂行することが可
能である。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明の培地に用いられる炭素源
は、ブランク反応を回避するために中性およびアルカリ
性溶液中で還元性を示さない糖であり、かつ、検出しよ
うとする微生物が産生する酵素の作用によって生じた代
謝物が中性およびアルカリ溶液中で還元性を示すもので
ある。これらの例として、例えば、シュクロース、ソル
ビトール、トレハロースがあげられる。検出しようとす
る糸状菌がAspergillus属、Penicillium属の場合には、
これらの菌がインベルターゼを有し還元糖を産生するこ
とから、シュクロースを用いることが好ましい。
は、ブランク反応を回避するために中性およびアルカリ
性溶液中で還元性を示さない糖であり、かつ、検出しよ
うとする微生物が産生する酵素の作用によって生じた代
謝物が中性およびアルカリ溶液中で還元性を示すもので
ある。これらの例として、例えば、シュクロース、ソル
ビトール、トレハロースがあげられる。検出しようとす
る糸状菌がAspergillus属、Penicillium属の場合には、
これらの菌がインベルターゼを有し還元糖を産生するこ
とから、シュクロースを用いることが好ましい。
【００１８】その他の栄養源として酵母エキス、ペプト
ン、Yeast Nitrogen Base（Difco社製）などがあげられ
る。また酵母様真菌や糸状菌のみの検出を目的とする場
合、細菌の発育を抑えるために、クロラムフェニコール
などの抗生物質を加えることも考えられる。本発明の呈
色試薬は、アルカリ条件下で呈色するものであればいず
れでもよいが、酸化還元色素、特に水溶性のものを含有
するものがより好適に用いられる。具体的には、水溶性
のホルマザンを形成するWST-1、WST-3、WST-4、WST-5お
よびWST-8などのテトラゾリウム塩は好ましい。特にWST
-8が好適に用いられる。
ン、Yeast Nitrogen Base（Difco社製）などがあげられ
る。また酵母様真菌や糸状菌のみの検出を目的とする場
合、細菌の発育を抑えるために、クロラムフェニコール
などの抗生物質を加えることも考えられる。本発明の呈
色試薬は、アルカリ条件下で呈色するものであればいず
れでもよいが、酸化還元色素、特に水溶性のものを含有
するものがより好適に用いられる。具体的には、水溶性
のホルマザンを形成するWST-1、WST-3、WST-4、WST-5お
よびWST-8などのテトラゾリウム塩は好ましい。特にWST
-8が好適に用いられる。
【００１９】呈色試薬に含まれるその他の成分として、
呈色試薬に電子を受け渡す機能を有する電子キャリアー
ならびに培地の酸化還元電位を調整するためのフェリシ
アン化カリウムおよびフェロシアン化カリウムがあげら
れる。電子キャリアーとしては、ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）、メルドラブルー、ジアホラーゼおよ
び1-methoxy PMSなどが好適に用いられるが、1-methoxy
PMSが特に好適に用いられる。
呈色試薬に電子を受け渡す機能を有する電子キャリアー
ならびに培地の酸化還元電位を調整するためのフェリシ
アン化カリウムおよびフェロシアン化カリウムがあげら
れる。電子キャリアーとしては、ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）、メルドラブルー、ジアホラーゼおよ
び1-methoxy PMSなどが好適に用いられるが、1-methoxy
PMSが特に好適に用いられる。
【００２０】本発明に用いられるアルカリ性増感試液の
成分としては、培養後の培養液のｐＨを約９以上にする
ものであればいずれでもよいが、WST-8ホルマザンがｐ
Ｈを約９以上にすると青色を呈するため、ｐＨを約９以
上にするものが好適に用いられ、ｐＨを１０以上にする
ものが特に好ましい。好ましく用いられる成分の例とし
て、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどがあげられ
る。中でも、液量の変化や添加のしやすさから水酸化ナ
トリウムが好ましい。この場合には、１〜２mol/l水酸
化ナトリウム水溶液を、培養液の1/20〜1/10量添加する
のが好ましい。
成分としては、培養後の培養液のｐＨを約９以上にする
ものであればいずれでもよいが、WST-8ホルマザンがｐ
Ｈを約９以上にすると青色を呈するため、ｐＨを約９以
上にするものが好適に用いられ、ｐＨを１０以上にする
ものが特に好ましい。好ましく用いられる成分の例とし
て、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどがあげられ
る。中でも、液量の変化や添加のしやすさから水酸化ナ
トリウムが好ましい。この場合には、１〜２mol/l水酸
化ナトリウム水溶液を、培養液の1/20〜1/10量添加する
のが好ましい。
【００２１】本発明の方法により検出可能な微生物は、
上述したような培地中で発育可能なものであればいずれ
でもよい。とりわけ、Aspergillus属、Penicillium属の
糸状菌が好適に検出される。
上述したような培地中で発育可能なものであればいずれ
でもよい。とりわけ、Aspergillus属、Penicillium属の
糸状菌が好適に検出される。
【００２２】本発明の薬剤感受性試験に用いられる抗菌
薬は、真菌を起因菌とする感染症の治療に用いられるも
のであればいずれでもよく、例えば、アムホテリシン
Ｂ、フルシトシン、フルコナゾール、ミコナゾール、イ
トラコナゾール、ケトコナゾールが挙げられる。
薬は、真菌を起因菌とする感染症の治療に用いられるも
のであればいずれでもよく、例えば、アムホテリシン
Ｂ、フルシトシン、フルコナゾール、ミコナゾール、イ
トラコナゾール、ケトコナゾールが挙げられる。
【００２３】本発明における微生物検出用キットは、呈
色試薬、液体培地およびアルカリ性増感試液からなるも
のであり、呈色試薬と液体培地は混合されていてもよ
い。本発明における薬剤感受性試験用キットは、呈色試
薬、液体培地、アルカリ性増感試液および抗菌薬からな
るものであり、呈色試薬、液体培地および抗菌薬は混合
されていてもよい。
色試薬、液体培地およびアルカリ性増感試液からなるも
のであり、呈色試薬と液体培地は混合されていてもよ
い。本発明における薬剤感受性試験用キットは、呈色試
薬、液体培地、アルカリ性増感試液および抗菌薬からな
るものであり、呈色試薬、液体培地および抗菌薬は混合
されていてもよい。
【００２４】本発明を実施するには、培地に呈色試薬を
添加した後、検体を接種して培養する。もしくは、検体
を培地に接種して培養した後、呈色試薬を添加する。培
養条件は検出しようとする菌種によって異なるが、例え
ば35〜37℃で24〜48時間である。培養後、アルカリ性増
感試液を添加し、5〜10分後の培養液の呈色を目視また
は吸光度計により測定する。この時測定する波長は620
〜660nmである。なお、陰性対照として検体を接種しな
いものを作製するのが好ましい。また、本発明法により
薬剤感受性試験を実施する場合、アムホテリシンＢ、フ
ルシトシン、フルコナゾール、ミコナゾール、イトラコ
ナゾール、ケトコナゾールなどの抗真菌薬、液体培地お
よび呈色試薬を分注したマイクロプレートまたは試験管
に試験菌を接種して培養する。培養後、アルカリ性増感
試液を添加し、培養液の呈色を目視または吸光度より最
小発育阻止濃度を判定する。もしくは、上述する抗真菌
薬、液体培地を分注したマイクロプレートまたは試験管
に試験菌を接種して培養した後、呈色試薬次いでアルカ
リ性増感試液を添加し、培養液の呈色を目視または吸光
度より最小発育濃度を判定する。
添加した後、検体を接種して培養する。もしくは、検体
を培地に接種して培養した後、呈色試薬を添加する。培
養条件は検出しようとする菌種によって異なるが、例え
ば35〜37℃で24〜48時間である。培養後、アルカリ性増
感試液を添加し、5〜10分後の培養液の呈色を目視また
は吸光度計により測定する。この時測定する波長は620
〜660nmである。なお、陰性対照として検体を接種しな
いものを作製するのが好ましい。また、本発明法により
薬剤感受性試験を実施する場合、アムホテリシンＢ、フ
ルシトシン、フルコナゾール、ミコナゾール、イトラコ
ナゾール、ケトコナゾールなどの抗真菌薬、液体培地お
よび呈色試薬を分注したマイクロプレートまたは試験管
に試験菌を接種して培養する。培養後、アルカリ性増感
試液を添加し、培養液の呈色を目視または吸光度より最
小発育阻止濃度を判定する。もしくは、上述する抗真菌
薬、液体培地を分注したマイクロプレートまたは試験管
に試験菌を接種して培養した後、呈色試薬次いでアルカ
リ性増感試液を添加し、培養液の呈色を目視または吸光
度より最小発育濃度を判定する。
【００２５】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。
明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。
【００２６】〔実施例1〕発育培地の選択をするために
以下の内容を実施した。 Ａ．使用菌株Aspergillus fumigatus KM8001を使用した。 Ｂ．試験方法 （１）培地の調製 グルコース添加MOPS緩衝RPMI1640培地 900mlの精製水にRPMI1640粉末培地 （L-グルタミン含
有、炭酸水素ナトリウム不含、フェノールレッド不含、
Gibco社製）10.4g、炭酸水素ナトリウム 2.0g、グルコ
ース 10.0g、モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS） 3
4.53gを溶解し、1N 水酸化ナトリウム水溶液でpH7.0に
した。1000mlにメスアップした後、0.2μmのフィルター
でろ過した。 グルコースYN培地の調製 精製水 約900mLにYN Base (Difco社製) 6.7g、グルコー
ス5gを溶解し、1N 水酸化ナトリウム水溶液により pH5.
3にした。精製水で1000ｍLにメスアップしたのち、0.2
μmのフィルターを用いて濾過滅菌した。 シュクロースYN培地の調製 精製水 約900mLにYN Base (Difco社製) 6.7g、シュクロ
ース20g を溶解し、1N水酸化ナトリウム水溶液により p
H7.0にした。精製水で1000ｍLにメスアップしたのち、
0.2μmのフィルターを用いて濾過滅菌した。
以下の内容を実施した。 Ａ．使用菌株Aspergillus fumigatus KM8001を使用した。 Ｂ．試験方法 （１）培地の調製 グルコース添加MOPS緩衝RPMI1640培地 900mlの精製水にRPMI1640粉末培地 （L-グルタミン含
有、炭酸水素ナトリウム不含、フェノールレッド不含、
Gibco社製）10.4g、炭酸水素ナトリウム 2.0g、グルコ
ース 10.0g、モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS） 3
4.53gを溶解し、1N 水酸化ナトリウム水溶液でpH7.0に
した。1000mlにメスアップした後、0.2μmのフィルター
でろ過した。 グルコースYN培地の調製 精製水 約900mLにYN Base (Difco社製) 6.7g、グルコー
ス5gを溶解し、1N 水酸化ナトリウム水溶液により pH5.
3にした。精製水で1000ｍLにメスアップしたのち、0.2
μmのフィルターを用いて濾過滅菌した。 シュクロースYN培地の調製 精製水 約900mLにYN Base (Difco社製) 6.7g、シュクロ
ース20g を溶解し、1N水酸化ナトリウム水溶液により p
H7.0にした。精製水で1000ｍLにメスアップしたのち、
0.2μmのフィルターを用いて濾過滅菌した。
【００２７】（２）接種菌液の調製と培養
試験菌株をSabouraud Dextrose Agar （OXOID社製）を
用いて35℃で7日間培養した。0.1％ Tween 80含滅菌生
理食塩水2ｍＬを培地上に滴下し、胞子を浮遊させた。
培地上に滴下した上述の生理食塩水を回収し、3〜５分
静置して沈澱物を除去した後ボルテックスミキサーで混
和し、胞子浮遊液を得た。530nmにおける吸光度が0.09
〜0.11になるように希釈した。調製した胞子浮遊液を各
種測定培地で100倍に希釈した後、マイクロプレートの
各ウエルに0.2mlずつ分注し呈色試薬（0.7mmol/L WST-
8、0.0035mmol/L 1-methoxy PMS、0.5mmol/L フェリシ
アン化カリウムおよび0.5mmol/L フェロシアン化カリウ
ムを含む）0.02mＬを加えた。なお陰性対照として胞子
液を接種していない各種測定培地（菌未接種）を調製し
た。35±1℃にて24時間培養し、主波長450nm、副波長63
0nmにおける吸光度を測定した。その後1.5mol/L 水酸化
ナトリウム水溶液 0.02ｍLを各ウエルに添加し、５分後
に630nmにおける吸光度を測定した。
用いて35℃で7日間培養した。0.1％ Tween 80含滅菌生
理食塩水2ｍＬを培地上に滴下し、胞子を浮遊させた。
培地上に滴下した上述の生理食塩水を回収し、3〜５分
静置して沈澱物を除去した後ボルテックスミキサーで混
和し、胞子浮遊液を得た。530nmにおける吸光度が0.09
〜0.11になるように希釈した。調製した胞子浮遊液を各
種測定培地で100倍に希釈した後、マイクロプレートの
各ウエルに0.2mlずつ分注し呈色試薬（0.7mmol/L WST-
8、0.0035mmol/L 1-methoxy PMS、0.5mmol/L フェリシ
アン化カリウムおよび0.5mmol/L フェロシアン化カリウ
ムを含む）0.02mＬを加えた。なお陰性対照として胞子
液を接種していない各種測定培地（菌未接種）を調製し
た。35±1℃にて24時間培養し、主波長450nm、副波長63
0nmにおける吸光度を測定した。その後1.5mol/L 水酸化
ナトリウム水溶液 0.02ｍLを各ウエルに添加し、５分後
に630nmにおける吸光度を測定した。
【００２８】Ｃ．結果
各発育培地における水酸化ナトリウム水溶液添加前後の
吸光度を測定した結果を表1にまとめた。グルコース添
加MOPS緩衝RPMI1640培地を用い、主波長450nm、副波長6
30nmにおける吸光度を測定した結果、吸光度は0.153と
かなり低かった。そこで、感度を上げるために水酸化ナ
トリウム水溶液を添加して630nmにおける吸光度を測定
した結果、菌未接種においても呈色が認められた。次
に、グルコースYN培地および シュクロースYN培地の水
酸化ナトリウム水溶液の添加前後の630nmにおける吸光
度を測定した。その結果、グルコースYN培地では菌未接
種において呈色する現象がみられた。一方、シュクロー
スYN培地では菌未接種において呈色はほとんど見られ
ず、菌が発育した場合強く呈色した。したがって、本発
明はシュクロースを含む液体培地を用いることにより実
施することができる。
吸光度を測定した結果を表1にまとめた。グルコース添
加MOPS緩衝RPMI1640培地を用い、主波長450nm、副波長6
30nmにおける吸光度を測定した結果、吸光度は0.153と
かなり低かった。そこで、感度を上げるために水酸化ナ
トリウム水溶液を添加して630nmにおける吸光度を測定
した結果、菌未接種においても呈色が認められた。次
に、グルコースYN培地および シュクロースYN培地の水
酸化ナトリウム水溶液の添加前後の630nmにおける吸光
度を測定した。その結果、グルコースYN培地では菌未接
種において呈色する現象がみられた。一方、シュクロー
スYN培地では菌未接種において呈色はほとんど見られ
ず、菌が発育した場合強く呈色した。したがって、本発
明はシュクロースを含む液体培地を用いることにより実
施することができる。
【００２９】
【表1】
【００３０】〔実施例2〕糸状菌の増殖度を測定するた
めに以下の内容を実施した。 Ａ．使用菌株Aspergillus fumigatus ATCC26430、 Aspergillus fumi
gatus KM8001およびAspergillus niger ATCC16404を使
用した。 Ｂ．試験方法 （１）シュクロースYN培地の調製 精製水 約900mLにYN Base (Difco社製) 6.7g、シュクロ
ース20g を溶解し、1N水酸化ナトリウム水溶液により p
H7.0にした。精製水で1000ｍLにメスアップしたのち、
0.2μmのフィルターを用いて濾過滅菌した。 （２）接種菌液の調製と培養 試験菌株をSabouraud Dextrose Agar （OXOID社製）を
用いて35℃で7日間培養した。0.1％ Tween 80含滅菌生
理食塩水2ｍＬを培地上に滴下し、胞子を浮遊させた。
培地上に滴下した上述の生理食塩水を回収し、3〜５分
静置して沈澱物を除去した後ボルテックスミキサーで混
和し、胞子浮遊液を得た。530nmにおける吸光度が0.09
〜0.11になるように希釈した。調製した胞子浮遊液0.1m
lをマイクロピペットにて採取し、0.1mg/mLクロラムフ
ェニコール含シュクロースYN培地10mlに加え、ボルテッ
クスミキサーにて充分撹拌し、接種菌液を調製した。
めに以下の内容を実施した。 Ａ．使用菌株Aspergillus fumigatus ATCC26430、 Aspergillus fumi
gatus KM8001およびAspergillus niger ATCC16404を使
用した。 Ｂ．試験方法 （１）シュクロースYN培地の調製 精製水 約900mLにYN Base (Difco社製) 6.7g、シュクロ
ース20g を溶解し、1N水酸化ナトリウム水溶液により p
H7.0にした。精製水で1000ｍLにメスアップしたのち、
0.2μmのフィルターを用いて濾過滅菌した。 （２）接種菌液の調製と培養 試験菌株をSabouraud Dextrose Agar （OXOID社製）を
用いて35℃で7日間培養した。0.1％ Tween 80含滅菌生
理食塩水2ｍＬを培地上に滴下し、胞子を浮遊させた。
培地上に滴下した上述の生理食塩水を回収し、3〜５分
静置して沈澱物を除去した後ボルテックスミキサーで混
和し、胞子浮遊液を得た。530nmにおける吸光度が0.09
〜0.11になるように希釈した。調製した胞子浮遊液0.1m
lをマイクロピペットにて採取し、0.1mg/mLクロラムフ
ェニコール含シュクロースYN培地10mlに加え、ボルテッ
クスミキサーにて充分撹拌し、接種菌液を調製した。
【００３１】（３）濁度法
マイクロプレートの各ウエルに（１）で調製した接種菌
液を0.2ｍＬずつ分注した。プレートに蓋をした後、35
±1℃にて培養した。一定時間毎に630nmにおける吸光度
を測定した。 （４）比色法（本発明による方法） マイクロプレートの各ウエルに呈色試薬（0.7mmol/L WS
T-8、0.0035mmol/L 1-methoxy PMS、0.5mmol/L フェリ
シアン化カリウムおよび0.5mmol/L フェロシアン化カリ
ウムを含む）0.02mLと、（１）で調製した接種菌液を0.
2mLずつ分注した。プレートに蓋をした後、35±1℃にて
培養した。12時間培養後、3時間間隔で順次培養中のウ
エルに1.2mol/L 水酸化ナトリウム水溶液0.02mLを各ウ
エルに添加し、10分後に630nmにおける吸光度を測定し
た。なお、ブランクとして接種菌液のかわりにシュクロ
ースYN培地を添加した。
液を0.2ｍＬずつ分注した。プレートに蓋をした後、35
±1℃にて培養した。一定時間毎に630nmにおける吸光度
を測定した。 （４）比色法（本発明による方法） マイクロプレートの各ウエルに呈色試薬（0.7mmol/L WS
T-8、0.0035mmol/L 1-methoxy PMS、0.5mmol/L フェリ
シアン化カリウムおよび0.5mmol/L フェロシアン化カリ
ウムを含む）0.02mLと、（１）で調製した接種菌液を0.
2mLずつ分注した。プレートに蓋をした後、35±1℃にて
培養した。12時間培養後、3時間間隔で順次培養中のウ
エルに1.2mol/L 水酸化ナトリウム水溶液0.02mLを各ウ
エルに添加し、10分後に630nmにおける吸光度を測定し
た。なお、ブランクとして接種菌液のかわりにシュクロ
ースYN培地を添加した。
【００３２】Ｃ．結果
培養12、15、18、21、24時間後に測定した吸光度を図1
に示した。図１の縦軸は630nmにおける吸光度、横軸は
培養時間を示す。本発明では培養時間にともなって吸光
度が増加しており、発育の程度を測定することができ
た。また濁度がほとんど変化していない18時間でも呈色
しており、短時間に検出することが可能であった。した
がって、本発明の測定キットおよび測定方法により糸状
菌の増殖度を簡便に測定できることが明らかになった。
に示した。図１の縦軸は630nmにおける吸光度、横軸は
培養時間を示す。本発明では培養時間にともなって吸光
度が増加しており、発育の程度を測定することができ
た。また濁度がほとんど変化していない18時間でも呈色
しており、短時間に検出することが可能であった。した
がって、本発明の測定キットおよび測定方法により糸状
菌の増殖度を簡便に測定できることが明らかになった。
【００３３】〔実施例3〕抗真菌薬感受性試験への適用
性検討のため、以下の内容を実施した。 Ａ．使用菌株Aspergillus fumigatus ATCC26430を使用した。 Ｂ．試験用マイクロプレート アムホテリシンＢ（Amphotericin B ;AMPH）、イトラコ
ナゾール（Itraconazole；ITCZ）の2薬剤を対象とし
た。AMPH 0.3〜160μg/ml、ITCZ 0.16〜80μg/mLの２倍
連続希釈系列をジメチルスルホキシドおよび精製水を使
用して調製した。調製した薬剤溶液0.02ml／ウエルずつ
プレートに分注し、24時間減圧下にて乾燥・固相化した
後、同ウエルに呈色試薬（0.7mmol/L WST-8、0.0035mmo
l/L 1-methoxy PMS、0.5mmol/L フェリシアン化カリウ
ムおよび0.5mmol/L フェロシアン化カリウムを含む）を
0.02ml／ウエルづづ分注し、24時間減圧下にて再度乾燥
・固相化した。
性検討のため、以下の内容を実施した。 Ａ．使用菌株Aspergillus fumigatus ATCC26430を使用した。 Ｂ．試験用マイクロプレート アムホテリシンＢ（Amphotericin B ;AMPH）、イトラコ
ナゾール（Itraconazole；ITCZ）の2薬剤を対象とし
た。AMPH 0.3〜160μg/ml、ITCZ 0.16〜80μg/mLの２倍
連続希釈系列をジメチルスルホキシドおよび精製水を使
用して調製した。調製した薬剤溶液0.02ml／ウエルずつ
プレートに分注し、24時間減圧下にて乾燥・固相化した
後、同ウエルに呈色試薬（0.7mmol/L WST-8、0.0035mmo
l/L 1-methoxy PMS、0.5mmol/L フェリシアン化カリウ
ムおよび0.5mmol/L フェロシアン化カリウムを含む）を
0.02ml／ウエルづづ分注し、24時間減圧下にて再度乾燥
・固相化した。
【００３４】Ｃ．試験方法
（１）濁度法
比較例として、NCCLS M-38P（0.2ml培養系のミクロ液体
希釈法）にしたがって実施した。 （２）本発明のマイクロプレート法 １）シュクロースYN培地の調製 精製水 約900mLにYN Base (Difco社製) 6.7g、シュクロ
ース20g を溶解し、1N水酸化ナトリウム水溶液により p
H7.0にした。精製水で1000ｍLにメスアップしたのち、
0.2μmのフィルターを用いて濾過滅菌した。 ２）接種菌液の調製と培養 試験菌株をSabouraud Dextrose Agar （OXOID社製）を
用いて35℃で7日間培養した。0.1％ Tween 80含滅菌生
理食塩水2ｍＬを培地上に滴下し、胞子を浮遊させた。
培地上に滴下した上述の生理食塩水を回収し、3〜５分
静置して沈澱物を除去した後ボルテックスミキサーで混
和し、胞子浮遊液を得た。530nmにおける吸光度が0.09
〜0.11になるように希釈した。調製した胞子浮遊液0.1m
lをマイクロピペットにて採取し、シュクロースYN培地2
0mlに加え、ボルテックスミキサーにて撹拌し、接種菌
液を調製した。Ｂ記載の試験用マイクロプレートの各ウ
エルに接種菌液を0.2mlずつ分注し、プレートに蓋をし
た後、35±1℃にて24時間培養した。なお、ブランクと
して接種菌液のかわりにシュクロースYN培地を添加し
た。 ３）判定方法 24時間後に各ウエルに1.5mol/L 水酸化ナトリウム水溶
液0.02mLを添加し、添加5分後に630nmにおける吸光度を
測定した。 １．AMPHは陰性コントロールと同等またはそれ以下の吸
光度を示した最小濃度を最小発育阻止濃度（MIC）とし
た。 ２．ITCZは 80% 発育阻止濃度（IC80）を判定した。以
下の計算式により求めた吸光度に相当するかそれ以下の
値を示すウエルの薬剤濃度をMICとした。（IC80＝（陽
性コントロール−陰性コントロール）×0.2＋陰性コン
トロール）
希釈法）にしたがって実施した。 （２）本発明のマイクロプレート法 １）シュクロースYN培地の調製 精製水 約900mLにYN Base (Difco社製) 6.7g、シュクロ
ース20g を溶解し、1N水酸化ナトリウム水溶液により p
H7.0にした。精製水で1000ｍLにメスアップしたのち、
0.2μmのフィルターを用いて濾過滅菌した。 ２）接種菌液の調製と培養 試験菌株をSabouraud Dextrose Agar （OXOID社製）を
用いて35℃で7日間培養した。0.1％ Tween 80含滅菌生
理食塩水2ｍＬを培地上に滴下し、胞子を浮遊させた。
培地上に滴下した上述の生理食塩水を回収し、3〜５分
静置して沈澱物を除去した後ボルテックスミキサーで混
和し、胞子浮遊液を得た。530nmにおける吸光度が0.09
〜0.11になるように希釈した。調製した胞子浮遊液0.1m
lをマイクロピペットにて採取し、シュクロースYN培地2
0mlに加え、ボルテックスミキサーにて撹拌し、接種菌
液を調製した。Ｂ記載の試験用マイクロプレートの各ウ
エルに接種菌液を0.2mlずつ分注し、プレートに蓋をし
た後、35±1℃にて24時間培養した。なお、ブランクと
して接種菌液のかわりにシュクロースYN培地を添加し
た。 ３）判定方法 24時間後に各ウエルに1.5mol/L 水酸化ナトリウム水溶
液0.02mLを添加し、添加5分後に630nmにおける吸光度を
測定した。 １．AMPHは陰性コントロールと同等またはそれ以下の吸
光度を示した最小濃度を最小発育阻止濃度（MIC）とし
た。 ２．ITCZは 80% 発育阻止濃度（IC80）を判定した。以
下の計算式により求めた吸光度に相当するかそれ以下の
値を示すウエルの薬剤濃度をMICとした。（IC80＝（陽
性コントロール−陰性コントロール）×0.2＋陰性コン
トロール）
【００３５】Ｄ．結果
本発明により薬剤感受性を実施し、吸光度を測定した結
果を図2に示す。横軸は抗真菌薬の濃度、縦軸は630nmに
おける吸光度を示す。AMPHでは、0.25μg/ml以下、ITCZ
では、0.06μg/ml以下で吸光度の上昇が認められた。目
視においては、AMPHの場合0.25μg/ml以下で青色〜濃青
色を呈し、0.5μg/ml以上ではほとんど呈色せず、ITCZ
の場合0.06μg/ml以下で青色〜濃青色を呈し、0.12μg/
ml以上ではほとんど呈色しなかった。また、NCCLS M-38
P法および本発明法により反復して薬剤感受性試験を実
施し、判定したMICを表2にまとめた。表中、許容範囲と
はNCCLS M38-Pに記載されている参照値をいう。この結
果、本発明で判定したMICはNCCLS M38-Pに記載されてい
る許容範囲と一致した。また、目視で判定したMICは吸
光度で判定した結果と同様であった。さらに、NCCLS M3
8-P法では判定時間が46〜50時間であるが、本発明では
約半分の24時間でおこなうことができた。したがって、
本発明の測定試薬および測定方法は糸状菌の抗真菌薬感
受性試験に有用である。
果を図2に示す。横軸は抗真菌薬の濃度、縦軸は630nmに
おける吸光度を示す。AMPHでは、0.25μg/ml以下、ITCZ
では、0.06μg/ml以下で吸光度の上昇が認められた。目
視においては、AMPHの場合0.25μg/ml以下で青色〜濃青
色を呈し、0.5μg/ml以上ではほとんど呈色せず、ITCZ
の場合0.06μg/ml以下で青色〜濃青色を呈し、0.12μg/
ml以上ではほとんど呈色しなかった。また、NCCLS M-38
P法および本発明法により反復して薬剤感受性試験を実
施し、判定したMICを表2にまとめた。表中、許容範囲と
はNCCLS M38-Pに記載されている参照値をいう。この結
果、本発明で判定したMICはNCCLS M38-Pに記載されてい
る許容範囲と一致した。また、目視で判定したMICは吸
光度で判定した結果と同様であった。さらに、NCCLS M3
8-P法では判定時間が46〜50時間であるが、本発明では
約半分の24時間でおこなうことができた。したがって、
本発明の測定試薬および測定方法は糸状菌の抗真菌薬感
受性試験に有用である。
【００３６】
【表2】
【００３７】
【発明の効果】本発明の検出方法および検出キットによ
れば、微生物、特に酵母様真菌および糸状菌の検出を簡
便に行うことができる。また、本発明による薬剤感受性
試験方法およびそのためのキットは、糸状菌の液体希釈
法による抗真菌薬感受性試験に有用である。
れば、微生物、特に酵母様真菌および糸状菌の検出を簡
便に行うことができる。また、本発明による薬剤感受性
試験方法およびそのためのキットは、糸状菌の液体希釈
法による抗真菌薬感受性試験に有用である。
【図１】 濁度および本発明の比色法における培養時間
に対する吸光度の変化を示したグラフである。
に対する吸光度の変化を示したグラフである。
【図２】 A.fumigatus ATCC26430 の薬剤感受性試験を
行なった際の抗真菌薬の濃度に対する吸光度の変化を示
したグラフである。
行なった際の抗真菌薬の濃度に対する吸光度の変化を示
したグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2G054 AA10 CE01 EA06 GB01
4B063 QA18 QA19 QQ07 QR41 QR44
QR66 QS24 QX01
4B065 AA58X AA72X AC20 BB02
BB03 BB11 BB12 BB16 BB37
BC02 CA46
Claims (17)
- 【請求項１】 検体を接種した液体培地において、酸化
還元色素を含む呈色試薬とアルカリ性増感試液とを添加
し反応させて、該反応における呈色によって微生物を検
出する方法。 - 【請求項２】 微生物が酵母様真菌及び／又は糸状菌で
あることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 液体培地が、非還元糖を含むことを特徴
とする、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 酸化還元色素を含む呈色試薬、液体培地
およびアルカリ性増感試液を含むことを特徴とする、微
生物を検出するためのキット。 - 【請求項５】 酸化還元色素が、水溶性のホルマザンを
生成する水溶性テトラゾリウム塩であることを特徴とす
る、請求項４に記載のキット。 - 【請求項６】 水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリ
ウム塩が2-（2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニト
ロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリ
ウム一ナトリウム塩であることを特徴とする、請求項５
に記載のキット。 - 【請求項７】 呈色試薬が、電子キャリアー、フェリシ
アン化カリウムおよびフェロシアン化カリウムをさらに
含むことを特徴とする、請求項４〜６のいずれかに記載
のキット。 - 【請求項８】 電子キャリアーが１−メトキシ−５−メ
チルフェナジニウムメチルサルフェートであることを特
徴とする、請求項７に記載のキット。 - 【請求項９】 液体培地が、非還元糖を含むことを特徴
とする、請求項４〜８のいずれかに記載のキット。 - 【請求項１０】 非還元糖がシュクロースであることを
特徴とする、請求項９に記載のキット。 - 【請求項１１】 アルカリ性増感試液が、液体培地のｐ
Ｈを９以上にするものであることを特徴とする、請求項
４〜１０のいずれかに記載のキット。 - 【請求項１２】 アルカリ性増感試液が水酸化ナトリウ
ム水溶液であることを特徴とする、請求項４〜１１に記
載のキット。 - 【請求項１３】 検体を接種した抗菌薬を含む液体培地
において、酸化還元色素を含む呈色試薬とアルカリ性増
感試液とを添加し反応させて、該反応における呈色から
最小発育阻止濃度を判定することを特徴とする、微生物
の薬剤感受性を試験する方法。 - 【請求項１４】 微生物が酵母様真菌及び／又は糸状菌
であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 液体培地が、非還元糖を含むことを特
徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項４〜１２のいずれかに記載の検
出用キットにさらに抗菌薬を含むことを特徴とする、微
生物の薬剤感受性試験のためのキット。 - 【請求項１７】 抗菌薬が抗真菌薬であることを特徴と
する、請求項１６に記載のキット。
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|---|---|---|---|
| JP2001244586A JP2003052392A (ja) | 2001-08-10 | 2001-08-10 | 微生物の検出方法および検出キット |
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|---|---|---|---|
| JP2001244586A JP2003052392A (ja) | 2001-08-10 | 2001-08-10 | 微生物の検出方法および検出キット |
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