FR2829499A1 - Procede de detection de micro-organismes et kit de detection - Google Patents
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Abstract
On propose un procédé de détection d'un micro-organisme par coloration qui comprend les étapes consistant à ajouter et faire réagir, dans un milieu de culture liquide, une solution de sensibilisation aux alcalins et un réactif de coloration comprenant un colorant d'oxydoréduction, le milieu de culture liquide ayant été inoculé avec un échantillon test, permettant ainsi de détecter les micro-organismes par coloration de la réaction. On propose également un procédé de test de la sensibilité médicamenteuse d'un micro-organisme à l'aide du procédé mentionné ci-dessus. En outre, on fournit les kits utilisés dans ces procédés. L'invention est utile pour évaluer rapidement et objectivement la croissance des micro-organismes lors de sa mise en oeuvre, c'est-à-dire qu'elle permet de détecter des micro-organismes dans la nourriture et d'effectuer un test tel que le test de sensibilité médicamenteuse.
Description
véhicule ou excipient acceptable au plan vétérinaire.
PROCEDE DE DETECTION DE MICRO-ORGANISMES ET KIT DE
DETECTION
La présente invention concerne un procédé et un kit de détection de microorganismes dans la nourriture et la réalisation d'un test tel que le test de sensibilité médicamenteuse dans le but de choisir un médicament optimal pour le traitement d'un patient
infecté par un micro-organisme.
Les mycètes (fongi), y compris les mycètes lévuliformes et mycètes filamenteux, sont des pathogènes de détérioration de nourriture et, en particulier, le gène Aspergillus et le gène Penicillium, qui sont des mycètes filamenteux, produisent des mycotoxines cancérigènes telles que les aflatoxines. Ils sont également des agents responsables de la mycose profonde, qui s'est avéré un problème croissant ces dernières années. La détection de ces mycètes est par conséquent très importante d'un point
de vue hygiénique et médical.
On effectue généralement le test de ces mycètes par un procédé de culture en utilisant un milieu de culture en gélose ou un milieu de culture liquide, mais comme le test par le procédé de culture prend entre 2 à 7 jours, la durce du test est un problème. En outre, dans le procédé utilisant un milieu de culture liquide, on mesure principalement le dogré de prolifération à l' aide d'un procédé de turbidité dans lequel on évalue la turbidité du milieu de culture liquide. sien que ce procédé convienne à des bactéries telles que E. coli, il ne convient pas aux mycètes et, en particulier, aux mycètes avec une faible dispersibilité tels que les mycètes filamenteux, et on a identifié le problème de
l'impossibilité de réaliser des mesures précises.
Afin de résoudre ces problèmes, Matrai, et al., se
sont concentrés sur les invertases (-D-
fructofuranosidase) présentes dans le gène Aspergilus et le gène Penicillium, et ont présenté un procédé qui permet de détecter un mycète en 20 à 48 heures par analyse colorimétrique du glocose formé lors de la culture du mycète dans un milieu de culture contenant du suarose (Matrai T., et al., Int. J. Food Microbiol., 61, 187-191, 2000). Cependant, ce procédé nacessite de chauffer le milieu de culture liquide pendant
l'évaluation, compliquant ainsi l'opération.
Récemment, on a développé des procédés de détection rapides qui utilisent différents principes autres que le procédé de culture. Dans l'industrie alimentaire, on a utilisé un dosage de bioluminescence de l'ATP pour l'analyse de l'environnement et le contrôle de la qualité, en accompagnement de l' introduction de HACCP (Journal of the Society for Antibacterial and Antifungal Agents, Japon, 28, 601 609, 2000), et dans le domaine médical, on a commencé à utiliser un dosage PCR ('Genetic Diagnosis of Mycosis', Medicalsense). Cependant, le dosage de l'ATP pose un problème qui est que l'on détecte l'ATP dérivé du matériau nonfongique et, de plus, que l'on a besoin d'un processeur d' image spécifique. Le dosage PCR pose des problèmes de détection d'une réaction d' inhibition due aux composants contaminants et aux gènes de mycètes morts. En ce qui concerne un autre procédé, il existe un procédé de coloration fluorescent (Journal of the SocieCy for Antibacterial and Antifungal Agents, Japan, 28, 601-609, 2000), mais comme les dispositifs disponibles dans le commerce sont coûteux, au moins quelques dizaines de millions de yen, les coûts du test deviennent très élevés, ce qui pose un problème. Dans de telles ciroonstances, on a souhaité pouvoir disposer d'un procédé à faibles coûts pouvant détecter les micro-organismes et, en particulier, les mycètes lévuliformes et les mycètes filamenteux, de manière spécifique, rapide et simple. En ce qui concerne un procédé de test de la sensibilité des médicaments aux mycètes, accompagnant une augmentation dans la fréquence d' apparition de la mycose profonde et l'émergence de souches présentant une résistance aux médicaments fongicides, il est devenu essentiel de choisir un médicament thérapeutique approprié pour cette infection, et on souhaite par conséquent établir un test simple et très fiable basé sur un procédé de mesure du degré de prolifération fongique. Aux Etats-Unis, le Comité national des normes de laboratoire cliniques (NCCLS) a proposé en l997 le procédé de référence pour le test de sensibilité fongicide dans un milieu de dilution en bouillon de mycètes lévuliformes; norme approuvée' (M27-A) comme procédé de test de sensibilité médicamenteuse des mycètes lévuliformes, et en l9g8, le 'procédé de référence pour le test de sensibilité fongicide dans un milieu de dilution en bouillon de mycètes filamenteux à formation de conidie; norme déposée (ci-après M38-P') comme procédé pour le test de sensibilité des mycètes filamenteux. Cependant, ces procédés prennent beaucoup de temps avant de pouvoir fournir des résultats de test car la durée de culture peut être de 2 ou 3 j ours en fonction du type de mycète. En outre, comme ces procédés utilisent tous un procédé de turbidité, ils ne conviennent pas pour un mycète qui prolifère sous forme de blocs et le problème réside dans la difficulté à déchiffrer le point final de croissance fongique (croissance inhibitrice fongique de 80%), en particulier dans le cas d'une pyrrole fongicide. Par conséquent, on souhaite trouver un procédé de déchiffrage du point final de croissance fongique plus
simple et très reproductible.
Pour résoudre ces problèmes, on a développé plusieurs procédés de colorimétrie afin de mesurer le
degré de prolifération fongique par colorimétrie.
Jusqu'à maintenant, par exemple, on a mentionné un
procédé utilisant le sel de tétrazolium de bromure 3-
(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT), (Meletiadis J., J. Clin. Microbiol., 38, 2949 2954, 2000), un procédé utilisant l'indicateur d'oxydoréduction AlamarBlue_ (Alamar Biosciences Inc., Sacramento, Calif.) (Jahn B., J. Clin. Microbiol., 34, 2039-2041, 1996), et un procédé de coloration vital à l' aide du rouge neutre (JP, 7-107995, A). Cependant, dans le cas du procédé MTT et du procédé au rouge neutre, l'opération d'évaluation s'avère compliquée et le procédé utilisant AlamarBlue_ pose le problème qu'en fonction de la souche, aucune fluorescence n'est produite dans certains cas et on ne peut pas juger la
concentration inLibitrice.
Nakano et al. ont mentionné une microplaque de test de sensibilité médicamenteuse dans laquelle un médicament, un sel de tétrazolium, du méthylsulfate de 1-méthoxy-5-méthylphénazinium (PMS 1-méthoxy), du ferricyanure de potassium et du ferrocyanure de potassium sont constitués en phase solide, et un procédé de test de sensibilité médicamenteuse utilisant cette même microplaque (JP, 11-287796, A). Cependant, cette microplaque et le procédé de test l'utilisant ne conviennent uniquement qu'à la mesure de mycètes lévuliformes, et la mise en _uvre de ces derniers pour
les mycètes filamenteux s'avère difficile.
Par conséquent, la présente invention a été réalisoe en vue des circonstances mentionnées ci dessus, et l'objet de celle-ci est de proposer un procédé pour l'évaluation objective de la prolifération de micro-organismes et, en particulier, la prolifération d'un mycète lévuliforme et d'un mycète filamenteux par une opération simple en une courte durée lors de la mise en _uvre, par exemple, de la détection de micro-organismes dans la nourriture et un test tel qu'un test de sensibilité médicamenteuse pour lè choix d'un médicament optimal dans le traitement d'un patient infecté par un micro-organisme; un test de sensibilité médicamenteuse utilisant le procédé
mentionné ci-dessus; et un kit utilisé à cet effet.
Comme résultats de recherches approfondies menses par les présents inventeurs afin de réaliser l'objet mentionné ci-dessus, on a découvert que l'on pouvait mesurer de façon simple le degré de prolifération d'un micro-organisme, en particulier, d'un mycète lévuliforme et d'un mycète filamenteux, par colorimétrie et pendant une courte durce en combinant un réactif de coloration contenant, par exemple, un sel de tétrazolium soluble dans l'eau tel que le WST-8 (2 (2-méthoxy-4-nitrophényl)-3-(4nitrophényl)-5-(2,4 disulfophényl)-2-tétrazolium, sel de sodium: sel de tétrazolium disulfonaté soluble dans l'eau, Ishiyama M., et al., Talanta, 44, 1299-1305, 1997) qui se décompose pour générer un formazan et qui ensuite présente une sensibilité aux couleurs en conditions alcalines, avec un milieu de culture liquide contenant un sucre non réducteur tel que le suarose. On a par
conséquent réalisé la présente invention.
Autrement dit, la présente invention concerne un procédé de détection de micro-organismes, comprenant les étapes consistant à ajouter et faire réagir, dans un milieu de culture liquide, une solution de sensibilisation aux alcalins et un réactif de coloration comprenant un colorant d'oxydoréduction, le milieu de culture liquide ayant été inoculé avec un échantillon test, permettant ainsi la détection des
micro-organismes par coloration de la réaction.
En outre, la présente invention concerne le procédé de détection mentionné ci-dessus dans lequel les micro-organismes sont des mycètes lévuliformes
et/ou mycètes filamenteux.
De plus, la présente invention concerne le procédé de détection mentionné ci-dessus dans lequel le milieu
de culture liquide contient un sucre non réducteur.
En outre, la présente invention concerne un kit de détection de microorganismes, comprenant un milieu de culture liquide, une solution de sensibilisation aux alcalins et un réactif de coloration comprenant un
colorant d'oxydoréduction.
De plus, la présente invention concerne le kit de détection mentionné cidessus dans lequel le colorant dioxydoréduction est un sel de tétrazolium soluble dans
l'eau qui forme un formazan soluble dans l'eau.
En outre, la présente invention concerne le kit de détection mentionné cidessus dans lequel le sel de tétrazolium qui forme le formazan soluble dans l'eau est le sel de sodium 2-(2-méthoxy-4-nitrophényl)-3-(4
nitrophényl)-5-(2,4-disulfophényl)-2H-tétrazolium.
De plus, la présente invention concerne le kit de détection mentionné cidessus dans lequel l' agent de coloration comprend en outre un entraîneur délectrons, du ferricyanure de potassium et du ferrocyanure de
potassium.
En outre, la présente invention concerne le kit de détection mentionné cidessus dans lequel l'entraîneur
délectrons est le méthyleulfate 1-méthoxy-5-
méthylphénazinium. De plus, la présente invention concerne le kit de détection mentionné ci-dessus dans lequel le milieu de
culture liquide comprend un suare non réducteur.
En outre, la présente invention concerne le kit de détection mentionné cidessus dans lequel le sucre non
réducteur est le sucrose.
De plus, la présente invention concerne le kit de détection mentionné cidessus dans lequel la solution de sensibilisation aux alcalins est une solution qui permet d'obtenir un pH du milieu de culture liquide
d'au moins 9.
En outre, la présente invention concerne le kit de détection mentionné cidessus dans lequel la solution de sensibilisation aux alcalins est une solution
aqueuse d'hydroxyde de sodium.
De plus, la présente invention concerne un procédé
de test de la sensibilité médicamenteuse à un micro-
organisme, comprenant les étapes consistant à aj outer et faire réagir, dans un milieu de culture liquide, une solution de sensibilisation aux alcalins et un réactif de coloration comprenant un colorant d'oxydoréduction, le milieu de culture liquide comprenant un médicament bactéricide ayant été inoculé avec un échantillon test, déterminant ainsi une concentration inhibitrice
minimale par coloration de la réaction.
En outre, la présente invention concerne le procédé de test mentionné cidessus dans lequel le micro-organisme est un mycète lévuliforme et/ou mycète filamenteux. De plus, la présente invention concerne le procédé de test mentionné ci-dessus dans lequel le milieu de
culture liquide comprend un suare non réducteur.
En outre, la présente invention concerne un kit de test de sensibilité médicamenteuse à un micro-organisme dans lequel le kit de détection mentionné ci-dessus
comprend en outre un médicament bactéricide.
De plus, la présente invention concerne le kit de test mentionné cidessus dans lequel le médicament bactéricide est un médicament fongicide. Dans le procédé de la présente invention, lorsque l'on utilise un composant qui présente une couleur par réaction dans une solution de sensibilisation aux alcalins comme réactif de coloration, on peut effectuer la réaction de coloration dans une opération de détection après culture d'un micro-organisme avec une sensibilité extrême. A ce stade, on peut identifier la coloration à l'_il nu ou à l'aide d'un absorptiomètre normal. En outre, en choisissant comme composant du réactif de coloration un colorant d'oxydoréduction et, en particulier, un colorant d'oxydoréduction soluble dans l'eau, il n'est plus nacessaire d'ajouter un solvant organique et de mélanger une fois la réaction colorce. Selon le procédé de la présente invention, par conséquent, la détection d'un micro-organisme s'avère
une opération extrêmement simple et précise.
De plus, le kit de détection d'un micro-organisme et le kit de test de sensibilité médicamenteuse de la présente invention sont portables. Par conséquent, les kits de la présente invention peuvent accomplir leur objet respectif sans se limiter au lieu o ils sont utilisés. La figure 1 est un graphique qui illustre les modifications d'absorLance relatives à la durce de culture dans le procédé de turUidité, et dans le
procédé de colorimétrie de la présente invention.
La figure 2 est un graphique qui illustre les modifications d'absorLance relatives à la concentration en médicament fongicide lors de la réalisation d'un test de sensibilité médicamenteuse pour A. fumigatus
ATCC26430.
La source carbonée utilisée dans le milieu de culture de la présente invention est un sucre qui ne présente pas d'affaiblissement dans des solutions neutres et alcalines afin d'éviter une réaction à blanc, et le produit métabolique qui est généré par l' action d'un enzyme produit par un micro-organisme qui doit être détecté présente un affaiblissement dans des solutions neutres et alcalines. Des exemples s'y rapportant comprennent le sucrose, le sorbitol et le trébalose. Dans le cas o le mycète filamenteux à détecter appartient au gène Aspergillus ou au gène Penicillium, étant donné que ces mycètes sont des invertétrés et produisent un sucre réducteur, il est
préférable d'utiliser le suarose.
En ce qui concerne les autres sources nutritives, on peut citer l'extrait de levure, la peptone, la base azotée de levure (fabriquse par Difco), etc. Dans le cas o l'objet est de ne détecter qu'un mycète lévuliforme ou un mycète filamenteux, on peut également envisager l'ajout d'un antibiotique tel que le chloramphénicol pour supprimer la croissance des bactéries. On peut utiliser n'importe quel réactif de coloration dans la présente invention tant qu'il présente une couleur en conditions alcalines, mais on préférera utiliser un colorant contenant un colorant d'oxydoréduction et, en particulier, un colorant d'oxydoréduction soluble dans l'eau. On préférera plus particulièrement un sel de tétrazolium tel que WST-1, WST-3, WST-4, WST-5 ou WST-8 qui forme un formazan soluble dans l'eau. En particulier, on préfère utiliser
WST-8.
En ce qui concerne les autres composants contenus dans le réactif de coloration, on peut citer un porteur d'électrons ayant pour fonction de donner un électron au réactif de coloration, et le ferricyanure de potassium et ferrocyanure de potassium pour compenser le potentiel d'oxydoréduction dans le milieu de culture. En ce qui concerne les porteurs le tréhalose d'électrons, on utilisera de préférence le PMS (méthosulfate de phénazine), le bleu de Meldola, le diaphorase et le PMS 1-méthoxy, etc., et en
particulier, on utilisera de préférence le PMS 1-
méthoxy. En ce qui concerne un composant de la solution de sensibilisation aux alcalins utilisée dans la présente invention, on peut utiliser tout composant permettant d'obtenir un pH du liquide de culture à peu près égal ou supérieur à 9, et comme le formazan ST-8 présente une couleur blene lorsque le pH est à peu près égal à 9 ou plus, on utilisera de préférence un composant permettant d'obtenir un pH à peu près égal ou supérieur à 9, et en particulier, on préférera un composant permettant d'obtenir un pH de 10 ou plus. Des exemples de composants utilisés de préférence comprennent l'hydroxyde de sodium et lhydroxyde de potassium. On préfère parmi eux l'hydroxyde de sodium en terme de modifications de la quantité de liquide et de la facilité d'ajout. Dans ce cas, on préférera ajouter une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium de 1 à 2 mol/1 en une quantité de 1/20 à 1/10 de la quantité du
liquide de culture.
Les micro-organismes auxquels le procédé de détection de la présente invention peut s'appliquer ne sont pas limités tant que leur croissance est possible dans le type de milieu de culture précisé ci-dessus. En particulier, on peut facilement détecter les mycètes filamenteux tels que ceux du gène Aspergillus et du
gène Peni ci 11 i um.
Les médicaments bactéricides utilisés dans le test de sensibilité médicamenteuse de la présente invention ne sont pas limités tant qu'ils sont utilisés pour le traitement d'une infection o l' agent responsable est un mycète, et de tels exemples comprennent l'Amphotéricine B. la Flucytosine, le Fluconazole, le
Miconazole, l'Itraconazole et le Cétoconazole.
Le kit de détection d'un micro-organisme utilisé dans la présente invention comprend un réactif de - coloration, un milieu de culture liquide et une solution de sensibilisation aux alcalins, et on peut mélanger à l'avance le réactif de coloration et le
milieu de culture liquide.
Le kit de test de sensibilité médicamenteuse de la présente invention comprend un réactif de coloration, un milieu de culture liquide, une solution de sensibilisation aux alcalins, et un médicament bactéricide, et on peut mélanger à l'avance le réactif de coloration, le milieu de culture liquide et le
médicament bactéricide.
Afin de mettre en _uvre la présente invention, une fois que l'on a ajouté le réactif de coloration dans le milieu de culture, on inocule le milieu de culture à un échantillon test et on le met en culture. En variante, après avoir inoculé le milieu de culture à un échantillon test et l'avoir mis en culture, on ajoute le réactif de coloration. Bien que les conditions de culture dépendent du type de mycète à détecter, on met en culture, par exemple, à des températures comprises entre 35 C et 37 C pendant 24 à 48 heures. Après culture, on ajoute la solution de sensibilisation aux alcalins, et on observe la couleur du milieu de culture liquide après 5 à 10 minutes à l'_il nu ou on le mesure à l' aide d'un absorptiomètre. La longueur d'onde utilisée pour cette mesure est comprise entre 620 et 660 nm. On préfère préparer un témoin négatif qui n'a
pas été inoculé avec l'échantillon test.
Lors de la mise en _uvre du test de sensibilité médicamenteuse à l' aide du procédé de la présente invention, on pipette le réactif de coloration, le milieu de culture liquide et un médicament fongicide tel que l'Amphotéricine B. la Flucytosine, le Fluconazole, le Miconazole, l'Itraconazole ou le Cétoconazole dans une microplaque ou un tube à essai, on inocule le mélange à un micro-organisme test et on met en culture le micro-organisme test. Après culture, on ajoute la solution de sensibilisation aux alcalins et on détermine la concentration inhibitrice minimale en observant la couleur du milieu de culture liquide à l'_il nu ou par absorbance. En variante, après inoculation dans une microplaque ou tube à essai, dans lesquels on a pipetté le médicament fongicide et le milieu de culture liquide, avec un micro-organisme test et la culture des micro-organismes tests, on ajoute le réactif de coloration et ensuite la solution de sensibilisation aux alcalins, et on détermine la concentration inhibitrice minimale par observation de la couleur du milieu de culture liquide à l'_il nu ou
par absorbance.
On explique ci dessous plus en détails la présente invention en faisant référence à des exemples, mais la présente invention ne se limite en aucune façon à ces
exemples.
EXEMPLE 1
Afin de choisir un milieu de culture de croissance, on a réalisé les procédures suivantes A. Souche utilisse
On a utilisé Aspergillus fumigatus KM8001.
B. Procédé de test (1) Préparation du milieu de culture 1) Milieu de culture RPMI 1640 tamponné avec du MOPS et supplémenté avec un aj out de glucose On a dissous 10, 4 g de poudre de milieu de culture RPMI 1640 (contenant du L-glutamine, pas d'hydrogénocarbonate de sodium et pas de rouge de phénol, fabriqué par Gibco), 2,0 g d'hydrogénocarbonate de sodium, 10,0 g de glucose et 34, 53 g d'acide 3 morpholinopropnesulphonique (MOPS) dans 900 mL d'eau purifiée et on a ajusté le pH à 7,0 avec une solution aqueuse 1N d'hydroxyde de sodium. On a reconstitué la solution jusqu'à 1000 mL et on l'a ensuite filtrée à
l' aide d'un filtre de 0,2 m.
2) Préparation d'un bouillon de glucose YN On a dissous 6, 7 g de base YN (fabriquée par Difco) et 5 g de glucose dans 900 mL d'eau purifiée et on a ajusté le pH à 5,3 avec une solution aqueuse 1N d'hydroxyde de sodium. On a constitué la solution jusqu'à 1000 mL avec de l'eau purifiée et on l'a ensuite filtrce et stérilisée à l' aide dun filtre de
0,2 m.
3) Préparation d'un bouillon de sucrose YN On a dissous 6,7 g de base YN (fabriquée par Difco) et 20 g de sucrose dans 900 mL d'eau purifice et on a ajusté le pH à 7,0 avec une solution aqueuse 1N d'hydroxyde de sodium. On a reconstitué la solution jusqu'à 1000 mL avec de l'eau purifiée et on l'a ensuite filtrée et stérilisée à l' aide d'un filtre de
0,2 m.
(2) Préparation de l'inoculum et culture On a cultivé une souche expérimentale avec du Dextrose en gélose Sabouraud (fabriqué par OXOID) à C pendant 7 j ours. On a ajouté gouLte à gouLte 2 mL de solution physiologique stérile contenant 0,1% de Twean 80 dans le milieu de culture afin de mobiliser les spores. On a recouvert la solution physiologique stérile mentionnée ci-dessus qui a été ajoutée gouLte à gouLte au milieu de culture et on l'a laissée reposer pendant 3 à 5 minutes, on a retiré les précipités et on l'a mélangée ensuite avec un mixer Vorvex pour obtenir une suspension de spores. On l'a diluée afin d'obtenir une absorbance à 530 nm comprise entre 0,09 et 0,11. On a diluée 100 fois la suspension de spores préparée de cette facon avec différents milieux de culture tests, on a pipetté 0, 2 mL de chaque dans un puits de microplaque et on a ajouté 0, 02 mL d'un réactif de coloration (contenant 0,7 mmol/L de WST-8, 0,0035 mmol/L de PMS 1-méthoxy, 0, 5 mmol/L de ferricyanure de
potassium et 0, 5 mmol/L de ferrocyanure de potassium).
Comme témoins négatifs, on prépare différents milieux de culture tests qui n'ont pas été inoculés à un
liquide sporal (non inoculé avec des micro-organismes).
On met en culture à 35 C +/- 1 C pendant 24 heures, et on mesure l' absorbance à une longueur d'ondes primaire de 450 nm et une longueur d'ondes secondaire de 630 nm. Par la suite, on ajoute 0, 02 mL d'une solution aqueuse à 1, 5 mmol/L d'hydroxyde de sodium à chacun des puits et on mesure l' absorbance à 630 nm 5
minutes après.
C. Résultats Les résultats obtenus par mesure de l'absorLance de chaque milieu de culture de croissance, avant et après l'ajout de la solution aqueuse d'hydroxyde de sodium sont résumés dans le tableau 1. Lors de la mesure de l'absorLance à la longueur d'onde primaire de 450 nm et la longueur d'onde secondaire de 630 nm à l'aide d'un milieu de culture RPMI 1640 tamponné avec du MOPS et supplémenté avec du glucose, le résultat était de 0, 153, ce qui correspond à une valeur - considérablement faible. Lorsque l'on a ajouté la solution aqueuse d'hydroxyde de sodium afin diaugmenter la sensibilité, et que l'on a mesuré l' absorbance à 630 nm, on a également observé une coloration dans les échantillons non inoculés. On a alors mesuré labsorbance à 630 nm pour le bouillon de glucose YN et le bouillon de sucrose YN, avant et après 1'ajout de la solution aqueuse d'hydroxyde de sodium. On a découvert la présence d'une coloration dans l'échantillon inoculé au bouillon de glucose YN. D'un autre coté, on n'a observé aucune coloration pour l'échantillon non inoeulé au bouillon de sucrose YN, mais à la croissance
des micro-organismes, une forte coloration apparaît.
Par conséquent, on peut mettre en _uvre la présente invention à l' aide d'un milieu de culture
liquide contenant du suarose.
Tableau 1 AbsorLance avant et après 1'aout d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium pour différents milieux de culture Ajout de solution Mesure de longueur Milieu de culture Bouillon de Bouillon de aqueuse d'onde RPMI 1640 glucose YN sucrose YN d'hydroxyde de eampOnné avec du sodium MOPS et supplémenté avec du glucose Non inoculé avec Avant 630 nm 0,045 0,015 0,013 des micro- Après 630 nm 0,976 1 0, 968 0,089 organismes Inoculé avec des Avant Longueur d'onde 0,153 0,024 0, 017 micro-organismes primaire 450 nm Longueur d'onde secondaire 630 nm Avane 630 nm 0,206 0,132 0,262 Après 630 nm 0,836 0,827 0,767
EXEMPLE 2
Afin de mesurer le dogré de prolifération d'un mycète filamenteux, on a réalisé les procédures suivantes: A. Souches utilisées On a utilisé Aspergillus fumigatus ATCC26340, Asperigillus fumigatus KM8001 et Aspergillus niger
ATCC16404
B Procédé de test (1) Préparation du bouillon de sucrose YN On a dissous 6,7 g de base YN (fabriquée par Difco) et 20 g de sucrose dans 900 mL d'eau purifiée et on a ajusté le pH à 7,0 avec une solution aqueuse 1N d'hydroxyde de sadium. On a reconstitué la solution jusqu'à 1000 mL avec de l'eau purifiée et on l'a ensuite filtrce et stérilisée à l'aide d'un filtre de
0,2 m.
(2) Préparation de l'inoculum et culture On a cultivé une souche expérimentale avec du Dextrose en gélose Sabouraud (fabriqué par OXOID) à C pendant 7 j ours. On a ajouté goutte à gouLte 2 mL de solution physiologique stérile contenant 0,1% de Tween 80 dans le milieu de culture afin de mobiliser les spores. On a recouvert la solution physiologique stérile mentionnée ci-dessus qui a été ajoutée gouLte à gouLte au milieu de culture et on l'a laissée reposer pendant 3 à 5 minutes, on a retiré les précipités et on l'a mélangée ensuite avec un mixer Vorvex pour obtenir une suspension de spores On l'a diluse afin d'obtenir une absorbance à 530 nm comprise entre 0,09 et 0,11. On a pris à l' aide d'une micro-pipette 0,1 mL de la suspension de spores préparée de cette façon, que l'on a ajouté à 10 mL du bouillon de suarose YN contenant 0,1 mg/mL de chloramphénicol et on a bien mélangé à l' aide d'un mixer Vorvex pour obtenir un inoculum (3) Procédé de turbidité On pipette 0,2 mL de l'inoculum préparé dans (2) dans chaque puits de la microplaque. Une foisla plaque recouverte, on la met en culture à 35 C + 1 C. On mesure l' absorbance à 630 nm à des intervalles prédéterminés. (4) Colorimétrie (procédé de la présente invention) On pipette 0,02 mL d'un réactif de coloration (contenant 0,7 mmol/L de WST-8, 0,0035 mmol/L de PMS 1 méthoxy, 0,5 mmol/L de ferricyanure de potassium et 0,5 mmol/L de ferrocyanure de potassium) et 0,2 mL de l'inoculum préparé dans (2) dans chaque puits de la microplaque. Une fois la plaque recouverte, on la cultive à 35 C + 1 C. Après 12 heures de culture, on ajoute en séquence toutes les 3 heures 0,02 mL d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 1,2 mmol/L dans les puits mis en culture, et on mesure l' absorbance à 630 nm 10 minutes après l'ajout. Comme essai à blanc, on ajoute le milieu de culture de
sucrose YN à la place de 1'inoculum.
C. Résultats La figure 1 présente l'absortance mesurée après une culture de 12, 15, 18, 21 et 24 heures. L'axe des ordonnées de la figure 1 représente l'absortance à 630 nm et l'axe des abscisses représente la durée de culture. Dans la présente invention, l'absortance augmente avec la durée de culture, et il est possible de mesurer le degré de prolifération. En outre, on montre une coloration après 18 heures alors que la turbidité change à peine et il est possible de la
détecter en un temps plus court.
I1 est par conséquent évident que le kit de mesure et le procédé de mesure de la présente invention permettent de mesurer de façon simple le degré de
prolifération d'un mycète filamenteux.
EXEMPLE 3
Afin d'étudier l' aptitude à la mise en _uvre du test de sensibilité aux médicaments fongicides, on a réalisé les procédures suivantes: A. souche utilisoe
On utilise Aspergillus fumigatus ATCC26430.
B. Microplaque utilisée pour le test On etudie deux médicaments, l'Amphotéricine B (AMPH) et l'Itraconazole (ITCZ). On prépare une série de dilution double d'AMPH (0,3 à 160 g/mL) et d'ITCZ (0,16 à 80 g/mL) à l' aide de sulfoxyde de diméthyl et d'eau purifice. On pipette les solutions médicamenteuses préparces de la sorte et on les place dans une plaque à 0,02 mL/puits et on les fait sécher jusqu'à obtenir un solide sous pression réduite pendant 24 heures. On pipette un agent de coloration (contenant 0,7 mmol/L de WST-8, 0,0035 mmol/L de PMS 1-méthoxy, 0,5 mmol/L de ferricyancre de potassium et 0,5 mmol/L de ferrocyanure de potassium) et on l'intègre dans chacun des puits à 0,02 mL/puits puis on les fait de nouveau sécher jusqu'à obtenir un solide sous pression
réduite pendant 24 heures.
C. Procédé du test (1) Procédé de turbidité On a mis en _uvre un exemple comparatif selon NCCLS M-38P (procédé de dilution en bouillon sur
système de culture à 0,2 mL).
(2) Procédé de microplaque de la présente invention 1) Préparation du bouillon de sucrose YN On a dissous 6,7 g de base YN (fabriquée par Difco) et 20 g de sucrose dans 900 mL d'eau purifiée et on a ajusté le pH à 7,0 avec une solution aqueuse 1N d'hydroxyde de sodium. On a reconstitué la solution jusqu'à 1000 mL avec de l'eau purifiée et on l'a ensuite filtrée et stérilisée à l' aide d'un filtre de
0,2 m.
(3) Préparation de l'inoculum et culture On a cultivé une souche expérimentale avec du Dextrose en gélose Sabouraud (fabriqué par OXOID) à C pendant 7 j ours. On a ajouté gouLte à gouLte 2 mL de solution physiologique stérile contenant 0,1% de Twean 30 dans le milieu de culture afin de mobiliser les spores. On a recouvert la solution physiologique stérile mentionnse ci-dessus qui a été ajoutée gouLte à goutte au milieu de culture et on l'a laissée reposer pendant 3 à 5 minutes, on a retiré les précipités et on l'a mélangée ensuite avec un mixer Vorvex pour obtenir une suspension de spores. On l'a diluée afin d'obtenir une absorLance à 530 nm comprise entre 0,09 et 0,11. On prend à l' aide d'une micro-pipette 0,1 mL de la suspension de spores préparée de cette façon, que l'on a ajoutée à 20 mL du bouillon de sucrose YN et on mélange bien à l'aide d'un mixer Vorvex pour obtenir un inoculum. On pipette 0,2 mL de l'inoculum dans chacun des puits de la microplaque pour le test décrit dans B. on recouvre la plaque et on fait une culture à 35 C + 1 C pendant 24 heures. Comme essai à blanc, on ajoute le milieu de culture de sucrose YN à la place de l'inoculum. 3) Procédé d'évaluation Après 24 heures, on ajoute 0,02 mL d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 1,5 mmol/L dans chaque puits, et on mesure l'absorLance à 630 nm 5 minutes
après l'ajout.
1. Pour l'AMPH, la concentration minimale permettant d'obtenir une absorbance égale ou inférieure à celle du témoin nagatif est définie comme la
concentration minimale inhibitrice (MIC).
2. Pour 1'ITCZ, on détermine la concentration inhibitrice à 80% (IC80). La concentration médicamenteuse d'un puits qui permet d'obtenir une absorbance égale ou inférieure à celle obtenue par
l'équation suivante est définie comme MIC.
(IC80 = (témoin positif - témoin négatif) x 0,2 + témoin négatif) D. Résultats La figure 2 illustre les résultats de mesure de l'absortance lors de l'évaluation de la sensibilité
médicamenteuse conformément à la présente invention.
L' axe des abscisses représente la concentration en médicaments fongicides, et l'axe des ordonnéss représente l' absorbance à 630 nm. L' absorbance augmente lorsque la concentration passe à 0, 25 g/mL ou moins pour l' AMPH, et 0,06 g/mL ou moins pour l'ITCZ. A l'_il nu, l'AMPH présente une coloration bleue à bleue foncée à 0, 25 g/mL ou moins et presque aucune coloration à 0, 5 g/mL ou moins et 1'ITCZ présente une coloration bleue à bleue foncée à 0,06 g/mL ou moins et presque aucune coloration à 0,12 g/mL ou moins. On réalise le test de sensibilité médicamenteuse de manière répétée à l' aide du procédé NCCLS M38-P et le procédé de la présente invention, et les valeurs MIC obtenues sont présentéss dans le tableau 2. Dans le tableau, la gamme autorisée représente les valeurs de référence décrites dans NCCLS M38-P. On a découvert que la MIC déterminée dans la présente invention coïncidait avec la gamme autorisée décrite dans NCCLS M38-P. En outre, les valeurs de MIC déterminces à l'_il nu sont les mêmes que celles déterminces à l' aide de l' absorbance. De plus, la durce de détermination utilisée pour le procédé de NCCLS M38-P était de 46 à heures, tandis que la présente invention n'utilise que la moitié de la durce mentionnée ci-dessus, à
savoir, 24 heures.
Le réactif de mesure et le procédé de mesure de la présente invention sont par conséquent utiles pour le test de la sensibilité aux médicaments fongicides d'un
mycète filamenteux.
Tableau 2 MIC (unités g/mL) de A. fumiatus ATCC 26430 Procédé de mesure MIC Gamme autorisce AMPH M-38P (procédé de 0,5 - 2,0 turbidité) 0, 5 - 2,0 Colorimétrie 0,5 -1,0 ITCZ M-38P (procédé de 0,12 - 0,25 turbidité) 0, 12 -1,0 Colorimétrie 0,12 - 0,25 Effets de l' invention Selon le procédé de détection et le kit de détection de la présente invention, on peut facilement détecter les micro-organismes et, en particulier, les mycètes lévuliformes et mycètes filamenteux. En outre, le procédé de test de sensibilité médicamenteuse et le kit de la présente invention s'y rapportant sont utiles pour le test de la sensibilité aux médicaments fongicides d'un mycète filamenteux par un procédé de
dilution en bouillon.
Claims (17)
1. Procédé pour la détection d'un micro-organisme comprenant les étapes consistant à: aj outer et faire réagir, dans un milieu de culture liquide, une solution de sensibilisation aux alcalins et un réactif de coloration comprenant un colorant d'oxydoréduction, le milieu de culture liquide ayant été inoculé avec un échantillon test, permettant ainsi de détecter les micro-organismes par coloration de la réaction.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-organisme est un mycète lévuliforme et/ou un
mycète filamenteux.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le milieu de culture liquide comprend un sucre
non réducteur.
4. Kit de détection d'un micro-organisme comprenant: un réactif de coloration comprenant un colorant d'oxydoréduction; un milieu de culture liquide; et
une solution de sensibilisation aux alcalins.
5. Kit selon la revendication 4, dans lequel le colorant d'oxydoréduction est un sel de tétrazolium soluble dans l'eau qui forme un formazan soluble dans
l'eau.
6. Kit selon la revendication 5, dans lequel le sel de tétrazolium qui forme un formazan soluble dans l'eau est le sel de sodium 2-(2-méthexy-4nitrophényl) 3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfophécyl)-2H-tétrasolium.
7. Kit selon l'une quelconque des revendications 4
à 6, dans lequel le réactif de coloration comprend en outre un porteur d'électrons, du ferricyanure de
potassium et du ferrocyanure de potassium.
8. Kit selon la revendication 7, dans lequel le
porteur d'électrons est le méthylsulfate de 1-méthoxy-
-méthylphénazinium.
9. Kit selon l'une quelcouque des revendications 4
à 8, dans lequel le milieu de culture liquide comprend
un sucre non réducteur.
10. Kit selon la revendication 9, dans lequel le
sucre non réducteur est le sucrose.
11. Kit selon l'une quelconque des revendications
4 à 10, dans lequel la solution de sensibilisation aux alcalins est une solution qui permet d'obtenir un pH
d'au moins 9 pour le milieu de culture liquide.
12. Kit selon l'une quelcouque des revendications
4 à 11, dans lequel la solution de sensibilisation aux alcalins est une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium.
13. Procédé pour tester la sensibilité médicamenteuse d'un micro-organisme, comprenant les étapes consistant à: ajouter et faire réagir, dans un milieu de culture liquide, une solution de sensibilisation aux alcalins et un réactif de coloration comprenant un colorant d'oxydoréduction, le milieu de culture liquide comprenant un médicament bactéricide et ayant été inoculé avec un échantillon test, permettant ainsi de déterminer une concentration minimale inhibitrice par
coloration de la réaction.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le micro-organisme est un mycète lévuliforme et/ou un
mycète filamenteux.
15. Procédé selon l'une ou l'autre des
revendications 13 et 14, dans lequel le milieu de
culture liquide comprend un sucre non réducteur.
16. Kit pour tester de la sensibilité médicamenteuse d'un micro-organisme, dans lequel le kit de détection selon l'une quelconque des revendication 4
à 12 comprend en outre un médicament bactericide.
17. Kit selon la revendication 16, dans lequel le
médicament bactericide est un médicament antifongique.
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