JP3529453B2 - 大腸菌群の選択的検出方法 - Google Patents
大腸菌群の選択的検出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は食品工業、清涼飲料工業
等の分野で使用する水や飲料水あるいは各種の原料、中
間体、製品等に存在する生菌中の大腸菌群あるいは大腸
菌を選択的に培養することにより該菌由来のアデノシン
５’−三リン酸（以下ＡＴＰと記載する）のルシフェリ
ン−ルシフェラーゼ反応を利用して迅速、簡便、高精度
かつ選択的に該菌を検出する方法に関する。
等の分野で使用する水や飲料水あるいは各種の原料、中
間体、製品等に存在する生菌中の大腸菌群あるいは大腸
菌を選択的に培養することにより該菌由来のアデノシン
５’−三リン酸（以下ＡＴＰと記載する）のルシフェリ
ン−ルシフェラーゼ反応を利用して迅速、簡便、高精度
かつ選択的に該菌を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品工業、清涼飲料工業等の分野では使
用する水特に飲料水、原料、中間体、製品中の生菌の管
理は極めて重要であり、特に大腸菌群の管理は食品衛生
上不可欠な検査項目とされている。このため、従来から
試料中の生菌を寒天平板培地上で培養し、コロニーを作
らせて菌を検出するいわゆるプレート法が最も一般的に
採用されてきている。しかしながら、この方法では検出
・判定まで２４〜４８時間を要するためより迅速な方法
が望まれてきている。また従来から、蛍光発色法、発酵
管法等が菌検出方法として採用されているが一定量以上
の多量の生菌（約１０6 ＣＦＵ／ｍｌ以上）を含む試料
には適用できるものの、少量の菌の存在を判定するのは
困難である。これらの方法に対して、最新の菌検出手法
である酵素免疫抗体法やＤＮＡプローブ法は感度および
生菌の識別においては極めて秀れているので、微量の生
菌を測定できる方法として注目されてきている。しかし
ながら、この方法は高価な試薬と煩雑な操作のため熟練
を要し簡便な迅速検出方法としては必ずしも満足できる
方法とは云えない。既に本発明者らは特に試料中の少量
の生菌を特殊格子付き濾過膜（以下ＭＦとする）を用い
て濾過濃縮し、かかる生菌由来のＡＴＰのルシフェリン
−ルシフェラーゼ反応を利用して発光させ、イメージア
ナライザーで輝点を計測する迅速・簡便・高精度の生菌
検出方法を発明し出願している（特願平３−４０６１５
および特願平５−２３４２０）。しかしながらこの方法
はＭＦに捕捉された少量の生菌の検出ができる上に検出
判定時間も短縮出来る特長はあるものの全生菌を測定対
象にする方法であるため、特定の菌種を選択的に検出す
ることはできない欠点があった。
用する水特に飲料水、原料、中間体、製品中の生菌の管
理は極めて重要であり、特に大腸菌群の管理は食品衛生
上不可欠な検査項目とされている。このため、従来から
試料中の生菌を寒天平板培地上で培養し、コロニーを作
らせて菌を検出するいわゆるプレート法が最も一般的に
採用されてきている。しかしながら、この方法では検出
・判定まで２４〜４８時間を要するためより迅速な方法
が望まれてきている。また従来から、蛍光発色法、発酵
管法等が菌検出方法として採用されているが一定量以上
の多量の生菌（約１０6 ＣＦＵ／ｍｌ以上）を含む試料
には適用できるものの、少量の菌の存在を判定するのは
困難である。これらの方法に対して、最新の菌検出手法
である酵素免疫抗体法やＤＮＡプローブ法は感度および
生菌の識別においては極めて秀れているので、微量の生
菌を測定できる方法として注目されてきている。しかし
ながら、この方法は高価な試薬と煩雑な操作のため熟練
を要し簡便な迅速検出方法としては必ずしも満足できる
方法とは云えない。既に本発明者らは特に試料中の少量
の生菌を特殊格子付き濾過膜（以下ＭＦとする）を用い
て濾過濃縮し、かかる生菌由来のＡＴＰのルシフェリン
−ルシフェラーゼ反応を利用して発光させ、イメージア
ナライザーで輝点を計測する迅速・簡便・高精度の生菌
検出方法を発明し出願している（特願平３−４０６１５
および特願平５−２３４２０）。しかしながらこの方法
はＭＦに捕捉された少量の生菌の検出ができる上に検出
判定時間も短縮出来る特長はあるものの全生菌を測定対
象にする方法であるため、特定の菌種を選択的に検出す
ることはできない欠点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の技術的
な背景のもとに、特にエンテロバクター エアロゲネス
（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ ニューモ
ニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、サイトロバクター
フロインディー（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）およびエシェ
リチア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）等からなる大腸菌群及び
その群の特定な菌即ち大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉの検出にあた
り、迅速性のみならず選択的検出を課題とするものであ
り、更に具体的には大腸菌群、および大腸菌の選択的培
養、かかる菌由来のＡＴＰの抽出特に大腸菌のＡＴＰの
選択的抽出および抽出されたＡＴＰの迅速検出を課題と
するものである。特に、迅速検出という視点からは、上
記した少量の菌存在下、菌検出に好適な菌由来のＡＴＰ
のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく光検出方
法を適用することを課題とした。
な背景のもとに、特にエンテロバクター エアロゲネス
（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ ニューモ
ニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、サイトロバクター
フロインディー（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）およびエシェ
リチア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）等からなる大腸菌群及び
その群の特定な菌即ち大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉの検出にあた
り、迅速性のみならず選択的検出を課題とするものであ
り、更に具体的には大腸菌群、および大腸菌の選択的培
養、かかる菌由来のＡＴＰの抽出特に大腸菌のＡＴＰの
選択的抽出および抽出されたＡＴＰの迅速検出を課題と
するものである。特に、迅速検出という視点からは、上
記した少量の菌存在下、菌検出に好適な菌由来のＡＴＰ
のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく光検出方
法を適用することを課題とした。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは生菌中の選
択的大腸菌群および大腸菌の選択的検出を目的とする上
記課題について鋭意研究を行い以下のような課題解決の
手段を見いだした。即ち少量の大腸菌あるいは大腸菌群
を含む検体に対し、濾過膜例えば特に好ましくは特願平
３−４０６１５（またはＰＣＴ公開ＷＯ９２／１４８３
８号）および特願平５−２３４２０に記載の特殊な格子
付きＭＦを装着した濾過器で生菌を濾過濃縮した後、か
かる生菌付着のＭＦを酵母エキスや乳糖を含有する改良
デオキシコレート選択培地即ち、デオキシコール酸ナト
リウムを含有する通常の大腸菌培養成分に、酵母エキス
や乳糖を加えてなる大腸菌用寒天培地において温度３７
℃のもとに６〜８時間培養することによって、他種の菌
は生育が抑制されても、大腸菌あるいは大腸菌群のみは
選択的に増殖する事を見いだした。ここに、酵母エキス
や乳糖の添加は大腸菌あるいは大腸菌群の増殖を促進し
て大腸菌群の選択的菌培養には極めて効果があることを
発見したことに基づきなされるものである。
択的大腸菌群および大腸菌の選択的検出を目的とする上
記課題について鋭意研究を行い以下のような課題解決の
手段を見いだした。即ち少量の大腸菌あるいは大腸菌群
を含む検体に対し、濾過膜例えば特に好ましくは特願平
３−４０６１５（またはＰＣＴ公開ＷＯ９２／１４８３
８号）および特願平５−２３４２０に記載の特殊な格子
付きＭＦを装着した濾過器で生菌を濾過濃縮した後、か
かる生菌付着のＭＦを酵母エキスや乳糖を含有する改良
デオキシコレート選択培地即ち、デオキシコール酸ナト
リウムを含有する通常の大腸菌培養成分に、酵母エキス
や乳糖を加えてなる大腸菌用寒天培地において温度３７
℃のもとに６〜８時間培養することによって、他種の菌
は生育が抑制されても、大腸菌あるいは大腸菌群のみは
選択的に増殖する事を見いだした。ここに、酵母エキス
や乳糖の添加は大腸菌あるいは大腸菌群の増殖を促進し
て大腸菌群の選択的菌培養には極めて効果があることを
発見したことに基づきなされるものである。
【０００５】例えば、具体的な培地組成としてはデオキ
シコール酸ナトリウム０．２〜１．０ｇ、ペプトン１０
ｇ、クエン酸鉄アンモニウム２．０ｇ、塩化ナトリウム
５．０ｇ、リン酸−水素カリウム２．０ｇ、乳糖１０
ｇ、酵母エキス５．０〜１０ｇ、寒天１５ｇ、水１００
０ｍｌ、ｐＨ７．４なる改良培地が例示し得る。なお、
上記大腸菌用改良培地に用いるデオキシコール酸ナトリ
ウムは大腸菌群の選択的培養には適しているが、高濃度
での存在は後述するルシフェリン−ルシフェラーゼ反応
に基づく発光に影響を与えるので使用に当たっては１ｇ
／ｌ濃度以下にするのが望ましい。
シコール酸ナトリウム０．２〜１．０ｇ、ペプトン１０
ｇ、クエン酸鉄アンモニウム２．０ｇ、塩化ナトリウム
５．０ｇ、リン酸−水素カリウム２．０ｇ、乳糖１０
ｇ、酵母エキス５．０〜１０ｇ、寒天１５ｇ、水１００
０ｍｌ、ｐＨ７．４なる改良培地が例示し得る。なお、
上記大腸菌用改良培地に用いるデオキシコール酸ナトリ
ウムは大腸菌群の選択的培養には適しているが、高濃度
での存在は後述するルシフェリン−ルシフェラーゼ反応
に基づく発光に影響を与えるので使用に当たっては１ｇ
／ｌ濃度以下にするのが望ましい。
【０００６】さらに、検体中に多量のシュードモナス属
細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）やアスペル
ギルス属細菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｓｐｐ．）等の
胞子が混在する場合には大腸菌群と同時に検出されるこ
とが判ったので、これに対しては上記に加え、若干時間
がかかっても嫌気下で培養することにより、胞子由来の
ＡＴＰを実質的に無くすかもしくは著しく減少せしめる
ことを見いだし本願発明を完成するに至った。胞子存在
の場合は例えば市販のＳＣＤ培地（日本製薬製）にデオ
キシコール酸ナトリウムを加え、さらに酵母エキスや乳
糖を添加することにより嫌気下での大腸菌群の培養速度
を早め得ることが判った。
細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）やアスペル
ギルス属細菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｓｐｐ．）等の
胞子が混在する場合には大腸菌群と同時に検出されるこ
とが判ったので、これに対しては上記に加え、若干時間
がかかっても嫌気下で培養することにより、胞子由来の
ＡＴＰを実質的に無くすかもしくは著しく減少せしめる
ことを見いだし本願発明を完成するに至った。胞子存在
の場合は例えば市販のＳＣＤ培地（日本製薬製）にデオ
キシコール酸ナトリウムを加え、さらに酵母エキスや乳
糖を添加することにより嫌気下での大腸菌群の培養速度
を早め得ることが判った。
【０００７】例えば、具体的な培地組成としてはデオキ
シコール酸ナトリウム０．３〜１．０ｇ、ポリペプトン
１５ｇ、ポリペプトンＳ５．０ｇ、塩化ナトリウム５．
０ｇ、乳糖１０ｇ、酵母エキス５．０〜１０ｇ、寒天１
５ｇ、水１０００ｍl 、ｐＨ７．４なる改良培地が例示
し得る。
シコール酸ナトリウム０．３〜１．０ｇ、ポリペプトン
１５ｇ、ポリペプトンＳ５．０ｇ、塩化ナトリウム５．
０ｇ、乳糖１０ｇ、酵母エキス５．０〜１０ｇ、寒天１
５ｇ、水１０００ｍl 、ｐＨ７．４なる改良培地が例示
し得る。
【０００８】ついで、培養後の上記大腸菌群付着のＭＦ
その他の濾過膜を培地から取り出し、その上から先に出
願した特願平３−４０６１５の方法に従って、ＡＴＰ抽
出試薬を噴霧、風乾しさらに発光試薬を噴霧してルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ反応により発光させ、発光をイ
メージアナライザーを用いて輝点として二次元的に撮像
し、その輝点数から菌数を測定する方法を組合せ得るこ
とを見いだした。
その他の濾過膜を培地から取り出し、その上から先に出
願した特願平３−４０６１５の方法に従って、ＡＴＰ抽
出試薬を噴霧、風乾しさらに発光試薬を噴霧してルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ反応により発光させ、発光をイ
メージアナライザーを用いて輝点として二次元的に撮像
し、その輝点数から菌数を測定する方法を組合せ得るこ
とを見いだした。
【０００９】また特に、大腸菌のみの選択的抽出に関し
ては前述の大腸菌用デオキシコレート培地に酵母エキス
や乳糖を添加して３７℃に６〜８時間培養後、大腸菌付
着のＭＦなどの濾過膜に０．５〜５０μＭのエチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウム（以下ＥＤＴＡと略記）、
０．１〜１０μｇ／ｌのリゾチームを含むｐＨ８．０の
トリスバッファー０．１〜０．３ｍｌを霧状に噴霧し
て、３０℃、１０分間処理するが、この際の濾過膜面積
は２０ｃｍ2 前後が適当である。この場合も、胞子が存
在するかまたは予想される場合は上述した市販のＳＣＤ
培地にデオキシコール酸ナトリウムと酵母エキス及びあ
るいは乳糖を添加し６〜９時間の嫌気培養後、以下同様
の操作で大腸菌のみを選択的に抽出可能である。
ては前述の大腸菌用デオキシコレート培地に酵母エキス
や乳糖を添加して３７℃に６〜８時間培養後、大腸菌付
着のＭＦなどの濾過膜に０．５〜５０μＭのエチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウム（以下ＥＤＴＡと略記）、
０．１〜１０μｇ／ｌのリゾチームを含むｐＨ８．０の
トリスバッファー０．１〜０．３ｍｌを霧状に噴霧し
て、３０℃、１０分間処理するが、この際の濾過膜面積
は２０ｃｍ2 前後が適当である。この場合も、胞子が存
在するかまたは予想される場合は上述した市販のＳＣＤ
培地にデオキシコール酸ナトリウムと酵母エキス及びあ
るいは乳糖を添加し６〜９時間の嫌気培養後、以下同様
の操作で大腸菌のみを選択的に抽出可能である。
【００１０】前記濾過膜面にルシフェリン−ルシフェラ
ーゼからなる発光試薬を噴霧して発光させる、以下前述
同様、発光をイメージアナライザーで計測・測定し、輝
点を数えることによって大腸菌数が測定される。
ーゼからなる発光試薬を噴霧して発光させる、以下前述
同様、発光をイメージアナライザーで計測・測定し、輝
点を数えることによって大腸菌数が測定される。
【００１１】さらに、大腸菌の選択的検出を精度良く行
う為に抽出工程においては菌の死滅をもたらす程の乾燥
状態は回避するよう湿潤状態を維持することが肝要であ
る。すなわち、大腸菌からのみＡＴＰを抽出しようとし
ても共存する菌が死滅してＡＴＰを漏出することにより
大腸菌の選択的検出が不可能となることを避けなければ
ならない。湿潤状態の保持は検体に揮発成分が混在する
とか、濾過膜の面積の大小、周辺の湿度などにより左右
されるので一義的には記載し得ないが、別途大腸菌や大
腸菌群の含有量や構成の既知の標準とも言うべき検体で
試行錯誤の実験により湿潤状態から乾燥状態への変遷を
把握しておくことが必要である。尚、使用するリゾチー
ム濃度は０．１〜１０μｇ／ｌが好ましい。以上の方法
を適用することによって各種の生菌を含む試料から大腸
菌群および大腸菌を選択的に検出できることを見出し本
発明を完成した。
う為に抽出工程においては菌の死滅をもたらす程の乾燥
状態は回避するよう湿潤状態を維持することが肝要であ
る。すなわち、大腸菌からのみＡＴＰを抽出しようとし
ても共存する菌が死滅してＡＴＰを漏出することにより
大腸菌の選択的検出が不可能となることを避けなければ
ならない。湿潤状態の保持は検体に揮発成分が混在する
とか、濾過膜の面積の大小、周辺の湿度などにより左右
されるので一義的には記載し得ないが、別途大腸菌や大
腸菌群の含有量や構成の既知の標準とも言うべき検体で
試行錯誤の実験により湿潤状態から乾燥状態への変遷を
把握しておくことが必要である。尚、使用するリゾチー
ム濃度は０．１〜１０μｇ／ｌが好ましい。以上の方法
を適用することによって各種の生菌を含む試料から大腸
菌群および大腸菌を選択的に検出できることを見出し本
発明を完成した。
【００１２】
【作用】本発明はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を
利用する大腸菌あるいは大腸菌群の菌数を測定するに当
たって、濾過膜に濾過捕捉した生菌をデオキシコール酸
ナトリウムと酵母エキスおよび／または乳糖を添加した
例えばＳＣＤ培地を初めとした各種培地にて大腸菌群を
選択培養し、大腸菌群のＡＴＰ抽出については常法のＡ
ＴＰ抽出液、又大腸菌のみの選択的ＡＴＰ抽出について
は湿潤状態を保持してＥＤＴＡとリゾチームを含有する
ＡＴＰの特異的抽出液で抽出し、ついでいずれの抽出Ａ
ＴＰに対してもルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬を添
加して発光させ、イメージアナライザーで測定すること
により旧来法に比べ、生菌数の少ないまま、即ち短時間
の培養で簡便、迅速、高精度かつ選択的に大腸菌群ある
いは大腸菌の検出を具現するものである。以下実施例で
本発明を詳しく説明する。
利用する大腸菌あるいは大腸菌群の菌数を測定するに当
たって、濾過膜に濾過捕捉した生菌をデオキシコール酸
ナトリウムと酵母エキスおよび／または乳糖を添加した
例えばＳＣＤ培地を初めとした各種培地にて大腸菌群を
選択培養し、大腸菌群のＡＴＰ抽出については常法のＡ
ＴＰ抽出液、又大腸菌のみの選択的ＡＴＰ抽出について
は湿潤状態を保持してＥＤＴＡとリゾチームを含有する
ＡＴＰの特異的抽出液で抽出し、ついでいずれの抽出Ａ
ＴＰに対してもルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬を添
加して発光させ、イメージアナライザーで測定すること
により旧来法に比べ、生菌数の少ないまま、即ち短時間
の培養で簡便、迅速、高精度かつ選択的に大腸菌群ある
いは大腸菌の検出を具現するものである。以下実施例で
本発明を詳しく説明する。
【００１３】
実施例１
エシェリチア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＩＦＯ ３３０１）およびサイトロバクター フロ
インディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉ
ｉ ＩＦＯ １２６８１）を各々ＳＣＤ培地（日本製薬
製）で３７℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍリ
ン酸バッファー（ｐＨ７．５）で約５０ＣＦＵ／ｍｌに
なるように希釈して試験液とした。特殊格子付き親水性
デュラポア膜（直径４７ｍｍ、孔径０．４５μｍ：日本
ミリポア製）を装着した濾過器（ステルフィル、日本ミ
リポア製）に無菌水２０ｍｌを加え、その上に試験液
０．４ｍｌを加えてよく混合してから吸引濾過する。１
０ｍｌの無菌水で３回洗浄濾過した後、濾過膜を改良デ
オキシコレート培地即ちデオキシコール酸ナトリウム
０．３ｇ、ペプトン１０ｇ、クエン酸鉄アンモニウム
２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、リン酸−水素カリ
ウム２．０ｇ、乳糖１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、寒天１
５ｇ、水１０００ｍｌ（ｐＨ７．４）を含む培地で３７
℃、５時間好気培養した。培養後、濾過膜を取り出し、
超音波式噴霧器（松下電工製）を用いてＡＴＰ抽出試薬
（ＲＭＤ試薬キット、日本ミリポア製）を２０秒間噴霧
する。風乾を行った後、同様な方法で発光試薬（ＲＭＤ
試薬キット、日本ミリポア製）を１０秒間噴霧して発光
させる。直ちにイメージアナライザー（ＲＭＤＳ，日本
ミリポア製）で２分間測定を行った後、輝点を自動計数
した。比較として両菌株を同じ方法で濾過し、同培地で
３７℃、４８時間好気培養して生成したコロニーを計数
した結果を表１に示した。これより従来法と変わらぬ精
度で短時間に菌が検出し得ていることが判る。
ｉ ＩＦＯ ３３０１）およびサイトロバクター フロ
インディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉ
ｉ ＩＦＯ １２６８１）を各々ＳＣＤ培地（日本製薬
製）で３７℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍリ
ン酸バッファー（ｐＨ７．５）で約５０ＣＦＵ／ｍｌに
なるように希釈して試験液とした。特殊格子付き親水性
デュラポア膜（直径４７ｍｍ、孔径０．４５μｍ：日本
ミリポア製）を装着した濾過器（ステルフィル、日本ミ
リポア製）に無菌水２０ｍｌを加え、その上に試験液
０．４ｍｌを加えてよく混合してから吸引濾過する。１
０ｍｌの無菌水で３回洗浄濾過した後、濾過膜を改良デ
オキシコレート培地即ちデオキシコール酸ナトリウム
０．３ｇ、ペプトン１０ｇ、クエン酸鉄アンモニウム
２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、リン酸−水素カリ
ウム２．０ｇ、乳糖１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、寒天１
５ｇ、水１０００ｍｌ（ｐＨ７．４）を含む培地で３７
℃、５時間好気培養した。培養後、濾過膜を取り出し、
超音波式噴霧器（松下電工製）を用いてＡＴＰ抽出試薬
（ＲＭＤ試薬キット、日本ミリポア製）を２０秒間噴霧
する。風乾を行った後、同様な方法で発光試薬（ＲＭＤ
試薬キット、日本ミリポア製）を１０秒間噴霧して発光
させる。直ちにイメージアナライザー（ＲＭＤＳ，日本
ミリポア製）で２分間測定を行った後、輝点を自動計数
した。比較として両菌株を同じ方法で濾過し、同培地で
３７℃、４８時間好気培養して生成したコロニーを計数
した結果を表１に示した。これより従来法と変わらぬ精
度で短時間に菌が検出し得ていることが判る。
【００１４】
【表１】
【００１５】実施例２
エシェリチア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＩＦＯ ３３０１）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で
またサイトロバクター フロインディー（Ｃｉｔｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＩＦＯ １２６８１）
をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３７℃、一夜好気培養し
た液を各々０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）
で約５０ＣＦＵ／ｍｌになるように希釈して試験液とし
た。特殊格子付き親水性デュラポア膜（直径４７ｍｍ、
孔径０．４５μＭ：日本ミリポア製）を装着した濾過器
（ステルフィル、日本ミリポア製）に無菌水２０ｍｌを
加え、その上に試験液０．４ｍｌを加えてよく混合して
から吸引濾過する。１０ｍｌの無菌水で３回洗浄濾過し
た後、濾過膜を市販のＳＣＤ培地を改良した次の組成即
ちデオキシコール酸ナトリウム０．３ｇ、ポリペプトン
１５ｇ、ポリペプトンＳ５．０ｇ、塩化ナトリウム５．
０ｇ、乳糖１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、寒天１５ｇ、水
１０００ｍｌ（ｐＨ７．４）からなる培地で３７℃、８
時間嫌気培養した。培養後、濾過膜を取り出し、超音波
式噴霧器（松下電工製）を用いてＡＴＰ抽出試薬（ＲＭ
Ｄ試薬キット、日本ミリポア製）を２０秒間噴霧する。
同様な方法で発光試薬（ＲＭＤ試薬キット、日本ミリポ
ア製）を１０秒間噴霧して発光させる。直ちにイメージ
アナライザー（ＲＭＤＳ，日本ミリポア製）で２分間測
定を行った後、輝点を自動計数した。比較として両菌株
を同じ方法で濾過し、同培地で３７℃、７２時間嫌気培
養して生成したコロニーを計数した結果を表２に示し
た。胞子の存在しない場合は嫌気培養でも実施例１と同
様の結果が得られることが明らかである。
ｉ ＩＦＯ ３３０１）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で
またサイトロバクター フロインディー（Ｃｉｔｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＩＦＯ １２６８１）
をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３７℃、一夜好気培養し
た液を各々０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）
で約５０ＣＦＵ／ｍｌになるように希釈して試験液とし
た。特殊格子付き親水性デュラポア膜（直径４７ｍｍ、
孔径０．４５μＭ：日本ミリポア製）を装着した濾過器
（ステルフィル、日本ミリポア製）に無菌水２０ｍｌを
加え、その上に試験液０．４ｍｌを加えてよく混合して
から吸引濾過する。１０ｍｌの無菌水で３回洗浄濾過し
た後、濾過膜を市販のＳＣＤ培地を改良した次の組成即
ちデオキシコール酸ナトリウム０．３ｇ、ポリペプトン
１５ｇ、ポリペプトンＳ５．０ｇ、塩化ナトリウム５．
０ｇ、乳糖１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、寒天１５ｇ、水
１０００ｍｌ（ｐＨ７．４）からなる培地で３７℃、８
時間嫌気培養した。培養後、濾過膜を取り出し、超音波
式噴霧器（松下電工製）を用いてＡＴＰ抽出試薬（ＲＭ
Ｄ試薬キット、日本ミリポア製）を２０秒間噴霧する。
同様な方法で発光試薬（ＲＭＤ試薬キット、日本ミリポ
ア製）を１０秒間噴霧して発光させる。直ちにイメージ
アナライザー（ＲＭＤＳ，日本ミリポア製）で２分間測
定を行った後、輝点を自動計数した。比較として両菌株
を同じ方法で濾過し、同培地で３７℃、７２時間嫌気培
養して生成したコロニーを計数した結果を表２に示し
た。胞子の存在しない場合は嫌気培養でも実施例１と同
様の結果が得られることが明らかである。
【００１６】
【表２】
【００１７】実施例３
アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｎｉ
ｇｅｒ ＩＦＯ ３１１２５）の胞子懸濁液をＳＣＤ培
地（日本製薬製）で３０℃、一夜好気培養した液と、シ
ュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ １３２７５）およ
びエシェリチア コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＩＦＯ ３３０１）を各々ＳＣＤ培地（日本製薬
製）で、３７℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍ
リン酸バッファー（ｐＨ７．５）で約１００ＣＦＵ／ｍ
ｌになるように希釈して試験液とした。実施例２と同じ
方法で特殊濾過膜を装着した濾過器で試験液０．２ｍｌ
を濾過し、実施例２と同じ組成の寒天培地上に置いて３
７℃、９時間嫌気培養した後、同様にＡＴＰ抽出試薬と
発光試薬を噴霧して発光させ、イメージアナライザーで
測定した。比較として、各菌株を同じ方法で濾過し、同
培地で３７℃、７２時間嫌気培養して生成したコロニー
を計数した。結果を表３に示す。本願方法とメンブレン
法の結果はほぼ同じ結果を与えたが、比較のために行っ
た実施例２と同一培地での好気培養の結果はすべて輝点
の数が多めに計測され胞子やシュードモナス アエルギ
ノーザに由来するものと推定し得た。
ｇｅｒ ＩＦＯ ３１１２５）の胞子懸濁液をＳＣＤ培
地（日本製薬製）で３０℃、一夜好気培養した液と、シ
ュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ １３２７５）およ
びエシェリチア コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＩＦＯ ３３０１）を各々ＳＣＤ培地（日本製薬
製）で、３７℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍ
リン酸バッファー（ｐＨ７．５）で約１００ＣＦＵ／ｍ
ｌになるように希釈して試験液とした。実施例２と同じ
方法で特殊濾過膜を装着した濾過器で試験液０．２ｍｌ
を濾過し、実施例２と同じ組成の寒天培地上に置いて３
７℃、９時間嫌気培養した後、同様にＡＴＰ抽出試薬と
発光試薬を噴霧して発光させ、イメージアナライザーで
測定した。比較として、各菌株を同じ方法で濾過し、同
培地で３７℃、７２時間嫌気培養して生成したコロニー
を計数した。結果を表３に示す。本願方法とメンブレン
法の結果はほぼ同じ結果を与えたが、比較のために行っ
た実施例２と同一培地での好気培養の結果はすべて輝点
の数が多めに計測され胞子やシュードモナス アエルギ
ノーザに由来するものと推定し得た。
【００１８】
【表３】
【００１９】実施例４
実施例１と同様にエシェリチア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉＩＦＯ ３３０１）をＳＣＤ培地
（日本製薬製）で、またサイトロバクター フロインデ
ィー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ Ｉ
ＦＯ １２６８１）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３７
℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍリン酸バッフ
ァーで約１００ＣＦＵ／ｍｌになるように希釈し、その
０．２ｍｌを濾過した。実施例１に記載の改良デオキシ
コレート培地を含浸させた培地保持体（Ｐｅｔｒｉ ｐ
ａｄ：日本ミリポア製）上で３７℃、５時間好気培養し
た後、５μＭのＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）、３μ
ｇ／ｌのリゾチーム（シグマ社製）を含む０．０２Ｍト
リスバッファー（ｐＨ８．０）を超音波式噴霧器（松下
電工製）１０秒間噴霧し、１０分間処理する。次いで発
光試薬を１０秒間噴霧して発光させる。直ちにイメージ
アナライザーで測定した。比較として両菌株を同じ方法
で濾過し、同培地で３７℃、４８時間好気培養して生成
したコロニーを計数した結果を表４に示した。本願方法
ではＥ．ｃｏｌｉだけを選択的に検出していることがあ
きらかである。
ｃｈｉａ ｃｏｌｉＩＦＯ ３３０１）をＳＣＤ培地
（日本製薬製）で、またサイトロバクター フロインデ
ィー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ Ｉ
ＦＯ １２６８１）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３７
℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍリン酸バッフ
ァーで約１００ＣＦＵ／ｍｌになるように希釈し、その
０．２ｍｌを濾過した。実施例１に記載の改良デオキシ
コレート培地を含浸させた培地保持体（Ｐｅｔｒｉ ｐ
ａｄ：日本ミリポア製）上で３７℃、５時間好気培養し
た後、５μＭのＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）、３μ
ｇ／ｌのリゾチーム（シグマ社製）を含む０．０２Ｍト
リスバッファー（ｐＨ８．０）を超音波式噴霧器（松下
電工製）１０秒間噴霧し、１０分間処理する。次いで発
光試薬を１０秒間噴霧して発光させる。直ちにイメージ
アナライザーで測定した。比較として両菌株を同じ方法
で濾過し、同培地で３７℃、４８時間好気培養して生成
したコロニーを計数した結果を表４に示した。本願方法
ではＥ．ｃｏｌｉだけを選択的に検出していることがあ
きらかである。
【００２０】
【表４】
【００２１】実施例５
エシェリチア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＩＦＯ ３３０１）およびクレブシエラ ニューモ
ニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の
ＳＣＤ培地（日本製薬製）における３７℃、一夜好気培
養液を各々０．０１Ｍリン酸バッファーで約１００ＣＦ
Ｕ／ｍｌになるように希釈し、その０．２ｍｌを濾過し
た。実施例２に記載の培地を含浸させた培地保持体（Ｐ
ｅｔｒｉｐａｄ：日本ミリポア製）上で３７℃、９時間
嫌気培養した後、湿潤状態を維持したまま、５μＭのＥ
ＤＴＡ（ナカライテスク社製）、３μｇ／ｌのリゾチー
ム（シグマ社製）を含む０．０２Ｍトリスバッファー
（ｐＨ８．０）を超音波式噴霧器（松下電工製）で１０
秒間噴霧し、３０℃で３０分間処理し、これに発光試薬
を１０秒間噴霧して発光させた。直ちにイメージアナラ
イザーで菌数を測定した。比較として両菌株を同じ方法
で濾過し、同培地で３７℃、７２時間嫌気培養して生成
したコロニーを計数した結果を表５に示した。本発明方
法では、Ｅ．ｃｏｌｉのみが検出されメンブレン法と同
様な結果を与え選択的検出を示した。
ｉ ＩＦＯ ３３０１）およびクレブシエラ ニューモ
ニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の
ＳＣＤ培地（日本製薬製）における３７℃、一夜好気培
養液を各々０．０１Ｍリン酸バッファーで約１００ＣＦ
Ｕ／ｍｌになるように希釈し、その０．２ｍｌを濾過し
た。実施例２に記載の培地を含浸させた培地保持体（Ｐ
ｅｔｒｉｐａｄ：日本ミリポア製）上で３７℃、９時間
嫌気培養した後、湿潤状態を維持したまま、５μＭのＥ
ＤＴＡ（ナカライテスク社製）、３μｇ／ｌのリゾチー
ム（シグマ社製）を含む０．０２Ｍトリスバッファー
（ｐＨ８．０）を超音波式噴霧器（松下電工製）で１０
秒間噴霧し、３０℃で３０分間処理し、これに発光試薬
を１０秒間噴霧して発光させた。直ちにイメージアナラ
イザーで菌数を測定した。比較として両菌株を同じ方法
で濾過し、同培地で３７℃、７２時間嫌気培養して生成
したコロニーを計数した結果を表５に示した。本発明方
法では、Ｅ．ｃｏｌｉのみが検出されメンブレン法と同
様な結果を与え選択的検出を示した。
【００２２】
【表５】
【００２３】実施例６
サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ ０２０９）をグ
ルコース ペプトン培地（栄研化学製）で、バチルス
サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ
ＡＭ １０２６）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３０
℃、一夜好気培養した液、エシェリチアコリ（Ｅｓｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＦＯ ３３０１）をＳＣＤ
培地（日本製薬製）でサイトロバクター フロインディ
ー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＩＦ
Ｏ １２６８１）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３７
℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）で約１００ＣＦＵ／ｍｌになるよう
に希釈して試験液とした。実施例５と同じ方法で試験液
０．２ｍｌを濾過し、濾過膜を実施例５と同じ改良デオ
キシコレート培地で９時間嫌気培養する。培養後ＥＤＴ
Ａとリゾチームを含む、トリスバッファーを噴霧してＡ
ＴＰを抽出し、さらに発光試薬を噴霧して発光させる。
直ちにイメージアナライザーで測定した。比較として各
菌株を同じ方法で濾過し、同培地で３７℃、４８時間好
気培養して生成したコロニーを計数した。Ｅ．ｃｏｌｉ
だけが両方法で同じ結果を与えたが、他の菌はメンブレ
ン法でのみ検出された。
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ ０２０９）をグ
ルコース ペプトン培地（栄研化学製）で、バチルス
サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ
ＡＭ １０２６）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３０
℃、一夜好気培養した液、エシェリチアコリ（Ｅｓｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＦＯ ３３０１）をＳＣＤ
培地（日本製薬製）でサイトロバクター フロインディ
ー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＩＦ
Ｏ １２６８１）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３７
℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）で約１００ＣＦＵ／ｍｌになるよう
に希釈して試験液とした。実施例５と同じ方法で試験液
０．２ｍｌを濾過し、濾過膜を実施例５と同じ改良デオ
キシコレート培地で９時間嫌気培養する。培養後ＥＤＴ
Ａとリゾチームを含む、トリスバッファーを噴霧してＡ
ＴＰを抽出し、さらに発光試薬を噴霧して発光させる。
直ちにイメージアナライザーで測定した。比較として各
菌株を同じ方法で濾過し、同培地で３７℃、４８時間好
気培養して生成したコロニーを計数した。Ｅ．ｃｏｌｉ
だけが両方法で同じ結果を与えたが、他の菌はメンブレ
ン法でのみ検出された。
【００２４】実施例７
サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ ０２０９）をグ
ルコース ペプトン培地（栄研化学製）で、バチルス
サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ
ＡＭ １０２６）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３０
℃、一夜好気培養した液、エシェリチアコリ（Ｅｓｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＦＯ ３３０１）をＳＣＤ
培地（日本製薬製）でエンテロバクター エアロゲネス
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ Ｉ
ＦＯ １２０１０）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３７
℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）で約１００ＣＦＵ／ｍｌになるよう
に希釈して試験液とした。実施例６と同じ方法で各試験
液０．２ｍｌを濾過し、濾過膜を実施例６と同じ培地で
８時間嫌気培養する。培養後乾燥しない状態のまま直ち
にＥＤＴＡとリゾチームを含む、トリスバッファーを噴
霧してＡＴＰを抽出し、さらに発光試薬を噴霧して発光
させる。直ちにイメージアナライザーで測定した。比較
として各菌株を同じ方法で濾過し、同培地で３７℃、７
２時間嫌気培養して生成したコロニーを計測した。メン
ブレン法ではすべて２０〜３０ＣＦＵ／膜の菌が検出さ
れたが、本発明の方法ではＥ．ｃｏｌｉのみがメンブレ
ン法と同等の結果を与え、選択的抽出に基づく選択的検
出が確認し得た。
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ ０２０９）をグ
ルコース ペプトン培地（栄研化学製）で、バチルス
サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ
ＡＭ １０２６）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３０
℃、一夜好気培養した液、エシェリチアコリ（Ｅｓｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＦＯ ３３０１）をＳＣＤ
培地（日本製薬製）でエンテロバクター エアロゲネス
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ Ｉ
ＦＯ １２０１０）をＳＣＤ培地（日本製薬製）で３７
℃、一夜好気培養した液を各々０．０１Ｍリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）で約１００ＣＦＵ／ｍｌになるよう
に希釈して試験液とした。実施例６と同じ方法で各試験
液０．２ｍｌを濾過し、濾過膜を実施例６と同じ培地で
８時間嫌気培養する。培養後乾燥しない状態のまま直ち
にＥＤＴＡとリゾチームを含む、トリスバッファーを噴
霧してＡＴＰを抽出し、さらに発光試薬を噴霧して発光
させる。直ちにイメージアナライザーで測定した。比較
として各菌株を同じ方法で濾過し、同培地で３７℃、７
２時間嫌気培養して生成したコロニーを計測した。メン
ブレン法ではすべて２０〜３０ＣＦＵ／膜の菌が検出さ
れたが、本発明の方法ではＥ．ｃｏｌｉのみがメンブレ
ン法と同等の結果を与え、選択的抽出に基づく選択的検
出が確認し得た。
【００２５】
【発明の効果】本願発明によれば、大腸菌群あるいは大
腸菌を含む少量の菌混合物に対してデオキシコール酸ナ
トリウムと酵母エキスおよび／または乳糖を必須構成成
分として添加した常用のＳＣＤ培地その他で培養するこ
とにより大腸菌あるいは大腸菌群のみを選択培養し得、
さらに培養した大腸菌群からＡＴＰを抽出するにあた
り、湿潤状態を維持しＥＤＴＡとリゾチームを含有する
抽出剤を適用することにより大腸菌からのみ効率的にＡ
ＴＰを抽出し得、抽出したＡＴＰのルシフェリン−ルシ
フェラーゼ反応により発光せしめ、大腸菌のみの検出を
可能ならしめた。また、胞子が混入する場合には嫌気下
で上記一連の操作を行なって、検出の精度への悪影響を
抑制することも可能となった。
腸菌を含む少量の菌混合物に対してデオキシコール酸ナ
トリウムと酵母エキスおよび／または乳糖を必須構成成
分として添加した常用のＳＣＤ培地その他で培養するこ
とにより大腸菌あるいは大腸菌群のみを選択培養し得、
さらに培養した大腸菌群からＡＴＰを抽出するにあた
り、湿潤状態を維持しＥＤＴＡとリゾチームを含有する
抽出剤を適用することにより大腸菌からのみ効率的にＡ
ＴＰを抽出し得、抽出したＡＴＰのルシフェリン−ルシ
フェラーゼ反応により発光せしめ、大腸菌のみの検出を
可能ならしめた。また、胞子が混入する場合には嫌気下
で上記一連の操作を行なって、検出の精度への悪影響を
抑制することも可能となった。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平３−123497（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−34351（ＪＰ，Ａ)
特公 昭48−33198（ＪＰ，Ｂ１)
特表 平８−509601（ＪＰ，Ａ)
国際公開92／014838（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/00 - 1/70
ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (3)
- 【請求項１】 生菌含有検体中の大腸菌のアデノシン
５’−三リン酸抽出において、該検体を濾過膜により濾
過濃縮して生菌を捕捉しデオキシコール酸ナトリウムと
酵母エキスおよび乳糖を添加した培地にて培養し、該濾
過膜の湿潤状態を保持しかつエチレンジアミン四酢酸二
ナトリウムとリゾチームを添加したアデノシン５’−三
リン酸抽出剤溶液で処理することを特徴とする大腸菌の
アデノシン５’−三リン酸抽出方法。 - 【請求項２】 生菌含有検体中の大腸菌の検出におい
て、該検体を濾過膜により濾過濃縮して生菌を捕捉しデ
オキシコール酸ナトリウムと酵母エキスおよび乳糖を添
加した培地にて培養し該濾過膜の湿潤状態を保持しかつ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムとリゾチームを添
加したアデノシン５’−三リン酸抽出剤溶液で処理して
大腸菌のアデノシン５’−三リン酸を抽出しルシフェリ
ン−ルシフェラーゼ発光試薬を添加、反応させ発光せし
め、イメージアナライザーで光子の蓄積を行い輝点数を
測定することを特徴とする大腸菌の検出方法。 - 【請求項３】 培養を嫌気下で行う請求項１又は２に記
載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25163994A JP3529453B2 (ja) | 1993-12-06 | 1994-09-21 | 大腸菌群の選択的検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33917193 | 1993-12-06 | ||
| JP5-339171 | 1993-12-06 | ||
| JP25163994A JP3529453B2 (ja) | 1993-12-06 | 1994-09-21 | 大腸菌群の選択的検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07213297A JPH07213297A (ja) | 1995-08-15 |
| JP3529453B2 true JP3529453B2 (ja) | 2004-05-24 |
Family
ID=26540292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25163994A Expired - Fee Related JP3529453B2 (ja) | 1993-12-06 | 1994-09-21 | 大腸菌群の選択的検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3529453B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011087571A (ja) * | 2009-09-28 | 2011-05-06 | Sysmex Corp | 細菌分析装置および細菌分析方法 |
-
1994
- 1994-09-21 JP JP25163994A patent/JP3529453B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07213297A (ja) | 1995-08-15 |
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