JPH11253195A - 細胞内ａｔｐの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】１．以下の工程を含むことを特徴とする細
胞内ＡＴＰの測定方法。 a)細胞を含む試料に、ＡＴＰ増量剤を添加する工程。 b)細胞中のＡＴＰを抽出する工程。 c)抽出されたＡＴＰを測定する方法。 ２．ＡＴＰ増量剤が、糖類、核酸、有機酸、アミノ酸ま
たはイオン勾配調節剤から選ばれる１種類以上の物質で
あることを特徴とする、上記１に記載の細胞内ＡＴＰの
測定方法。 ３．ＡＴＰ増量剤を含むことを特徴とする、細胞内ＡＴ
Ｐの測定用試薬。 【効果】試料にＡＴＰ増量剤を添加すると細胞内ＡＴＰ
が増加するので、細胞内ＡＴＰの測定感度を高感度化す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞内ＡＴＰを高
感度に測定する方法および細胞内ＡＴＰの測定用試薬に
関する。

【０００２】

【従来の技術】各種工業分野、臨床医学、基礎研究等の
現場では、試料中の細胞の有無の判定、あるいは細胞数
の測定等を目的として、細胞内ＡＴＰの測定が一般的に
行なわれている。特に、食品、製薬、化粧品などの分野
では、製品の品質管理上、使用する水・原料・中間体・
製品中の微生物汚染（菌類、細菌類等）による汚染を防
止することが極めて重要である。

【０００３】従来の細胞内ＡＴＰの測定方法としては、
試料にＡＴＰ抽出試薬を添加して細胞内ＡＴＰを抽出し
た後、抽出されたＡＴＰを測定する方法が一般的であ
る。ＡＴＰ抽出試薬としては、トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）、界面活性剤等が使用されている。また、抽出され
たＡＴＰの測定法としては、ルシフェリン、ルシフェラ
ーゼ、マグネシウム等を含む生物発光試薬を試料に添加
して発光させ、その発光量をルミノメーター等の測定器
を用いて測定する方法（ルシフェリン−ルシフェラーゼ
発光反応法）が使用されている。従来法においては、試
料中の細胞数が少ない場合や、細胞中のＡＴＰ量が少な
い場合には、細胞の検出や細胞数の計測ができないとい
う問題があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、高感
度な細胞内ＡＴＰの測定法および細胞内ＡＴＰの測定用
試薬を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、細胞を含
む試料に特定の物質を添加することにより、細胞内ＡＴ
Ｐの高感度な測定が可能となることを見いだし、この知
見に基づいて本発明を完成した。

【０００６】すなはち本発明は、以下の工程を含むこと
を特徴とする細胞内ＡＴＰの測定方法である。 a)細胞を含む試料に、ＡＴＰ増量剤を添加する工程。 b)細胞中のＡＴＰを抽出する工程。 c)抽出されたＡＴＰを測定する方法。 また、本発明はＡＴＰ増量剤を含むことを特徴とする、
細胞内ＡＴＰの測定用試薬である。

【０００７】

【発明の実施の形態】Ｉ．本発明の細胞内ＡＴＰの測定
方法について １．本発明ではまず、細胞を含む試料にＡＴＰ増量剤を
添加する。 本発明でいう細胞としては、例えば、酵母、カビ、キノ
コ、細菌、放線菌、単細胞藻類、ウイルス、原生動物、
動物又は植物の分化していない細胞及び組織培養物等が
挙げられる。試料は、上記の細胞を含むと考えられるも
のであれば、特に限定されないが、例えば、飲食物、医
薬、化粧品、海水、河川水、工業用水、下水、土壌、
尿、糞便、血液、喀痰、膿汁、細胞の培養物等が挙げら
れる。また、上記の試料を適当な溶媒に懸濁した溶液を
試料としてもよい。溶媒としては、例えば、蒸留水、生
理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリ
ウム緩衝液等が挙げられる。試料が固形分を含む場合に
は、該試料を適当な溶媒に懸濁するか、ミキサーなどで
ホモジナイズすれば溶液状のものと同様に扱うことがで
きる。更には、濾過処理によって細胞を捕捉した濾過膜
を試料としてもよい。濾過膜は、細胞を捕捉できるもの
であれば特に限定されず、例えば、市販の親水性及び疎
水性の濾過膜が使用できる。

【０００８】本発明でいう「ＡＴＰ増量剤」とは、以下
の（１）または（２）のいずれかの性質を有する物質を
意味する。 （１）細胞内ＡＴＰの測定感度を高感度化することがで
きる物質 （２）細胞の代謝系に作用して細胞内ＡＴＰ量を増加さ
せることができる物質 本発明のＡＴＰ増量剤としては、糖類、核酸、有機酸、
アミノ酸、更には後述するイオン勾配調節剤等が例示さ
れる。これらのＡＴＰ増量剤は、単独または2種類以上
を組み合わせて使用できる。ＡＴＰ増量剤はそのまま試
料に添加してもよいが、操作を簡便にするため、適当な
溶媒に溶解して、溶液状にすることが好ましい。溶媒と
しては、例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝
液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ
る。試料にＡＴＰ増量剤を添加する際の条件は、使用す
るＡＴＰ増量剤の種類、試料の状態・細胞の種類等によ
り適宜設定すればよい。試料とＡＴＰ増量剤の接触時間
は、通常１分以上、好ましくは５〜１５分とすればよ
い。また、細胞を捕捉した濾過膜を試料とする場合は、
ＡＴＰ増量剤の溶液を、濾過膜上に噴霧あるいは滴下す
るか、該溶液に濾過膜を通過させればよい。

【０００９】以下に、各種のＡＴＰ増量剤について、具
体的な物質名および使用法を例示すが、細胞内ATPの測
定感度が高感度化される条件であれば、例示したもの以
外の物質または使用法の採用も可能である。 （１）糖類 糖類としては、単糖類、オリゴ糖類、多糖類等が挙げら
れ、具体的には、グルコース（glucose）、フルクトー
ス（fructose）、スクロース（sucrose）等が挙げられ
る。これらの糖類は、単独または2種類以上を組み合わ
せて使用できる。試料が溶液状である場合は、糖類の終
濃度が０．００１％以上、好ましくは０．０１〜０．５
％となるように添加すればよい。濾過膜を試料とする場
合は、０．００１％以上、好ましくは０．０１〜０．５
％の糖類溶液を濾過膜と接触させればよい。 （２）核酸 核酸としては、ＩＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＴＭＰ及びこ
れらの混合物が例示される。試料が溶液状である場合
は、上記核酸の終濃度が０．１ｍＭ以上、好ましくは１
〜１００ｍＭとなるように添加すればよい。濾過膜を試
料とする場合は、０．１ｍＭ以上、好ましくは１〜１０
０ｍＭの核酸溶液を濾過膜に噴霧または通過させればよ
い。

【００１０】（３）アミノ酸 アミノ酸としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、ア
ルギニン、リジン、プトレシン、チロシン、ヒスチジ
ン、フェニルアラニン及びこれらの混合物が例示され
る。試料が溶液状である場合は、上記アミノ酸の終濃度
が０．１ｍＭ以上、好ましくは、１〜１００ｍＭとなる
ように添加すればよい。濾過膜を試料とする場合は、
０．１ｍＭ以上、好ましくは１〜１００ｍＭのアミノ酸
溶液を濾過膜と接触させればよい。 （４）有機酸 有機酸としては、例えば細胞内のＴＣＡ回路において利
用される有機酸、具体的にはクエン酸、リンゴ酸、コハ
ク酸、シュウ酸及びこれらの混合物が例示される。上記
有機酸は、細胞内の代謝系（ＴＣＡ回路、電子伝達系
等）に作用して、細胞内ＡＴＰ量を増加させるという効
果を有する。試料が溶液状である場合は、有機酸の終濃
度が０．１ｍＭ以上、好ましくは１〜１００ｍＭとなる
ように添加すればよい。濾過膜を試料とする場合は、
０．１ｍＭ以上、好ましくは１〜１００ｍＭの有機酸溶
液を濾過膜と接触させればよい。

【００１１】（５）イオン勾配調節剤 「イオン勾配調節剤」とは、それを試料に添加すると細
胞の内外にイオン勾配が生じ、その結果、細胞内ＡＴＰ
を増加させるという効果を有する物質をいう。イオン勾
配調節剤の添加により細胞内外のイオン勾配が生じ、イ
オンポンプであるＡＴＰ合成酵素、例えばＦ₁Ｆ₀ＡＴＰ
ａｓｅ等が活性化され、それに伴って細胞内ATPが増加
すると考えられる。イオン勾配調節剤は、Ｈ⁺、Ｋ⁺、Ｃ
ｌ^-、Ｃａ²⁺、Ｎａ⁺等のイオンの細胞内外におけるイオ
ン勾配を生じさせる物質であれば特に限定されない。イ
オン勾配調節剤としては、例えば、それを試料に添加す
ることにより細胞外ｐＨが細胞内ｐＨより低くなるよう
な試薬、具体的には、酸性溶液（例えば、酢酸溶液、硫
酸溶液、塩酸溶液等）が挙げられる。そのような試薬を
使用する場合、好ましくは、細胞外ｐＨが細胞内ｐＨよ
り２〜５低くなるように添加すればよい。Ｎａ⁺勾配を
生じさせる試薬としては、例えば、ＮａＣｌ、ＣＨ₂Ｃ
ＯＯＮａ等が好適である。これらの物質は、ｐＨを変化
させずにＮａ⁺勾配を生じさせることができるという点
で優れている。また、イオン勾配調節剤としては、細胞
膜に作用してそのイオン透過性を高める働きをする抗生
物質（イオノフォア、ionophore）を利用してもよい。
イオノフォアとしては、特に限定されないが、例えば、
バリノマイシン（valinomycin）、グラミシジン（grami
cidin）等が挙げられる。バリノマイシンを添加すると
細胞膜におけるＫ⁺の透過性が向上し、Ｋ⁺の細胞外への
選択的拡散により細胞膜内外に電位差が生じる。これに
よりイオンポンプ、例えばＡＴＰ合成酵素が活性化され
て細胞内ATPが増加すると考えられる。

【００１２】ＡＴＰ増量剤の添加により、細胞内ＡＴＰ
の測定が高感度化される原因は、ＡＴＰ増量剤が細胞の
代謝系に作用することにより細胞内ＡＴＰが増加するた
めであると思われる。試料が栄養源を含まない緩衝液等
である場合、試料中の細胞は飢餓状態となるので、細胞
内ＡＴＰの濃度は減少する。そのような試料を用いる場
合、ＡＴＰ増量剤の効果は特に顕著である。なお、細胞
内ＡＴＰの抽出に先立ち、試料中に存在する、細胞内Ａ
ＴＰ以外のＡＴＰ（以下「バックグランドＡＴＰ」とい
う）を分解することが望ましい。バックグランドATPを
分解することにより、細胞内ＡＴＰの測定感度が向上す
るという効果が得られる。バックグランドＡＴＰを分解
する方法としては、ＡＴＰ分解酵素を有効成分とする試
薬（以下「ＡＴＰ消去剤」という）を試料に添加する方
法が例示される。ＡＴＰ分解酵素としては、例えば、ア
デノシンリン酸デアミナーゼ、アピラーゼ、アルカリホ
スファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、
アデノシントリホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ
等が挙げられる。これらの酵素は、単独又は2種類以上
を組み合わせて使用できる。

【００１３】濾過膜を試料とする場合、溶液状のＡＴＰ
消去剤を、濾過膜上に噴霧あるいは滴下するか、濾過膜
に該溶液を通過させればよい。

【００１４】バックグランドＡＴＰを消去した後は、試
料中のＡＴＰ消去剤を除去あるいは失活させることが望
ましい。ＡＴＰ消去剤は、該消去剤の阻害剤を作用させ
ることにより失活させることができる。試料が濾過膜で
ある場合、濾過膜を超純水や緩衝液で洗浄することによ
りＡＴＰ消去剤が除去される。

【００１５】アデノシンリン酸デアミナーゼを有効成分
とするＡＴＰ消去剤を試料に添加する場合、該消去剤の
阻害剤としては、例えば、コホルマイシンが使用でき
る。コホルマイシンはアデノシンリン酸デアミナーゼの
阻害剤として知られている物質である（THE JOURNAL OF
ANTIBIOTICS,SER.A Vol20 No.4 227-231）。なお、バ
ックグランドＡＴＰの分解工程とＡＴＰ増量剤の添加工
程とはどちらを先に行ってもかまわない。また、操作の
簡便化のため、両工程を同時に実施してもよい。

【００１６】２．次いで、細胞内ＡＴＰを抽出する。 細胞内ＡＴＰの抽出方法としては、例えば、試料にＡＴ
Ｐ抽出試薬を添加し、細胞内ＡＴＰを細胞外に抽出する
方法が例示される。ＡＴＰ抽出試薬としては、公知の試
薬、すなわちＴＣＡ、リゾチーム、エタノールとアンモ
ニアの混合液、メタノール、エタノール、界面活性剤
（塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、トリト
ンＸ１００等）、トリクロル酢酸、過塩素酸等が使用で
きる。ＡＴＰ抽出試薬としては、市販の試薬、例えば、
ルシフェールＬＵプラス(キッコーマン社製)に付属のＡ
ＴＰ抽出試薬を使用することができる。試料が溶液状で
ある場合は、該ＡＴＰ抽出試薬を試料に添加すればよ
く、また、試料が濾過膜である場合は、ＡＴＰ抽出試薬
を濾過膜上に滴下あるいは噴霧すればよい。

【００１７】３．抽出されたＡＴＰを測定する方法 抽出されたＡＴＰの測定法としては、公知の方法、例え
ば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応法を採用し
得る。ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応法では、
まず、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム等
を含む生物発光試薬を試料に添加する。生物発光試薬と
ＡＴＰが反応して発光が生じるので、その発光量をルミ
ノメーター等の測定器を用いて測定する。生物発光試薬
としては、市販の試薬、例えば、ルシフェールＬＵ(キ
ッコーマン社製)に付属の生物発光試薬を使用すること
ができる。

【００１８】本発明のルシフェリンおよびルシフェラー
ゼとしては、例えば、昆虫（ゲンジボタル、ヘイケボタ
ル、北米産ホタル、ヒカリコメツキムシ、ツチボタル
等）を由来とするものが使用できる。

【００１９】ルシフェラーゼは、上記生物の発光組織か
ら精製した天然型ルシフェラーゼや、遺伝子工学的手法
により調製した天然型ルシフェラーゼ、さらには天然型
ルシフェラーゼのアミノ酸配列中の１または複数のアミ
ノ酸に付加、欠失、置換等の変異を導入した変異型ルシ
フェラーゼを使用することができる。試料または濾過膜
上に生じる発光量を測定することにより、試料中の細胞
の有無の判定、あるいは細胞数の測定が可能となる。発
光量は、ルミノメーター、例えばアロカ社製ルミネッセ
ンスリーダーＢＬＲ−２０１（改良型）により測定する
ことができる。また、生物発光画像解析システム装置、
例えばＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ〔テーパーファイバー
付：浜松ホトニック（株）社製〕を用いて濾過膜上の輝
点を撮像することにより、濾過膜上の細胞数を測定する
ことも可能である。なお、ルシフェリン−ルシフェラー
ゼ発光反応法の変法として、ピルベートオルトホスフェ
ートジキナーゼ（以下「ＰＰＤＫ」という）を含む生物
発光試薬を用いる方法を採用できる（特開平９−２３４
０９９号公報）。ＰＰＤＫは、マグネシウムイオン存在
下で、ＡＭＰ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及
びピロリン酸に作用して、ＡＴＰ、ピルビン酸及びリン
酸を生じる反応を触媒し、その逆の反応も触媒する公知
酵素である。ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応法
では、生物発光試薬とＡＴＰとの反応産物として、ＡＭ
Ｐが生成する。従って、反応系のＡＴＰが消費されると
発光量は減衰する。しかしながら、ＰＰＤＫを含む生物
発光試薬（以下「ＰＰＤＫ発光試薬」）を用いると、細
胞内ＡＭＰからＡＴＰが新たに生成され、かつ発光反応
において消費されたＡＴＰも再生される。その結果、細
胞内ＡＴＰおよびＡＭＰが発光反応に関与するので、発
光量および発光時間が増大する。ＰＰＤＫ発光試薬を用
いることにより、測定感度の更なる向上が可能となる。
ＰＰＤＫ発光試薬とは、例えば、次の（イ）〜（ヘ）の
物質を含む試薬である。

【００２０】（イ）ＰＰＤＫ （ロ）ホスホエノールピルビン酸 （ハ）ピロリン酸 （ニ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン （ホ）ルシフェリン （へ）ルシフェラーゼ 本発明では、ＰＰＤＫ発光試薬にさらにピルビン酸キナ
ーゼを加えてもよい。ピルビン酸キナーゼは、マグネシ
ウムイオン存在下で、ＡＤＰおよびホスホエノールピル
ビン酸に作用して、ＡＴＰ、ピルビン酸を生じる反応を
触媒する酵素である。この場合、ＡＭＰのみならず、Ａ
ＤＰからもＡＴＰが生成する。ピルビン酸キナーゼを含
むＰＰＤＫ発光試薬を使用することにより、細胞内ＡＴ
Ｐ、ＡＤＰおよびＡＭＰが発光反応に関与するので、Ｐ
ＰＤＫ発光試薬を使用した場合に比べ、発光量がさらに
増大する。 II.本発明の細胞内ＡＴＰの測定用試薬について 本発明における細胞内ＡＴＰの測定用試薬は、ＡＴＰ増
量剤を含むことを特徴とする。

【００２１】細胞内ＡＴＰの測定用試薬は、ＡＴＰ増量
剤を含むものであれば、その形状、試薬に含まれるＡＴ
Ｐ増量剤以外の成分等は特に限定されない。試薬の形状
は、溶液状でもよく、また粉末状や顆粒状であってもよ
い。試薬を溶液状とする場合は、ＡＴＰ増量剤を適当な
溶液（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、
トリス緩衝液）に溶解すればよい。ＡＴＰ増量剤以外の
成分としては、例えば、ｐＨ調製や試薬の保存性向上に
関与する物質が挙げられ、具体的には、ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ、ジチオスレイトール（DTT）、硫酸アンモニウム、
２−メルカプトエタノール、HEPES、Tricine、Tris等が
挙げられる。本発明の測定用試薬は、ＡＴＰ増量剤と、
細胞内ＡＴＰの測定方法の各工程において使用される他
の試薬との混合物であってもよい。他の試薬とは、例え
ば、バックグランドATPの分解のために使用するＡＴＰ
消去剤等である。

【００２２】

【実施例】以下、実施例で本発明を説明する。

【００２３】[実施例１] １．試薬等 （１）ＡＴＰ増量剤 糖類として、グルコース（glucose：和光純薬社製）、
フルクトース（fructose：和光純薬社製）、スクロース
（sucrose：和光純薬社製）を使用。その他のＡＴＰ増
量剤として、ＩＭＰ（シグマ社製）、クエン酸(citric
acid：和光純薬社製)、グルタミン酸(glutamic acid：
シグマ社製)を使用。 （２）ＡＴＰ消去剤 アデノシンリン酸デアミナーゼ及びアピラーゼ（シグマ
社製）を使用。なお、アデノシンリン酸デアミナーゼと
しては、Aspergillus属に属する微生物の培養物から精
製した酵素を使用した。 （３）ＡＴＰ抽出試薬 ルシフエールＬＵプラス(キッコーマン社製)に付属のＡ
ＴＰ抽出試薬を使用。 （４）生物発光試薬 ルシフエールＬＵプラス(キッコーマン社製)に付属の発
光試薬を使用。 （５）検定菌 Escherichia coli（E．coli） Lactobacillus brevis（L．brevis） Staphyllococcus aureus（S. aureus） Bacillus subtilis（B. subtilis） ２．細胞内ＡＴＰの測定 （１）試料の調製 各検定菌を、標準培地（0．25％酵母エキス、0．5％ト
リプトン、0．1％グルコース、pH7．1）8mlに一白金耳
植菌し、35℃で一晩静置培養した．この培養液1mlを遠
心にて集菌し、0．6mMリン酸ナトリウムbuffer（pH7．
2）1mlにて3回洗浄した。菌体を、0．6mMリン酸緩衝液
（pH7．2）にて適宜懸濁・希釈し、希釈液を試料とし
た。 （２）細胞内ＡＴＰの測定 試料に、ATP消去剤としてアデノシンリン酸デアミナー
ゼ（終濃度O．05∪／ml）、及びアピラーゼ（終濃度O．
05∪／ml）を添加した。同時に各糖類を終演度0．037％
で添加した。また、糖類以外のＡＴＰ増量剤は、終濃度
10mMになるように添加した。その後、室温にて5分、10
分、20分、30分放置し経時的に100μｌずつ採取した。
採取した試料に、ATP抽出試薬100μｌを添加し、20秒後
に発光試薬100μｌを添加した後、キッコーマン社製ル
ミテスターK−100にて発光量を測定した．一方、標準寒
天培地（0．25％酵母エキス、0．5％トリプトン、0．1
％グルコース、寒天1．5％、ｐＨ７．1）を用いて、混
釈培養法にて行ったプレート法から求めた菌数から、一
菌体（一細胞）あたりのATP量（mol／cell）を算出し
た。また、試料にATP増量剤を添加してから３０分経過
しても菌数が増加しないことを混釈培養法により確認し
た。

【００２４】３.結果および考察 各検定菌における細胞内ＡＴＰの測定結果を図１から図
6に示す。図の縦軸は細胞内ATP量を、横軸はATP増量剤
を添加してからの経過時間を表す。また、図中，ｂｌａ
ｎｋとはATP増量剤を添加しなかった時の細胞内ＡＴＰ
量を示す。各検定菌において、ATP増量剤を添加して10
分後には、細胞内ＡＴＰの顕著な増加が観察された。AT
P増量剤を添加して10分後における細胞内ＡＴＰ量を表1
に示す。表中の数字は、１細胞当たりのＡＴＰのモル数
を示す。また、カッコ内の数字は、各検定菌における、
ＡＴＰ増量剤無添加時の細胞内ATP量に対する倍率を示
す。

【００２５】

【表１】

【００２６】（１）糖類 表１から明らかな通り、検定菌がE．coliである場合、
糖類（glucose、fructose、sucrose）を添加して10分後
の細胞内ATP量は、無添加の場合の約４〜５．６倍程度
に増加した。また、検定菌がL．brevisである場合、ｇ1
ucoseまたはfructoseを添加して10分後の細胞内ATP量
は、無添加の場合の約２０倍または４７倍に増加した。
Staphyllococcus aureus及びBacillus subtilisの場
合、ｇ1ucoseを添加して10分後の細胞内ATP量は、ｇ1uc
oseを添加しなかった場合の約２倍に増加した。 （２）ＩＭＰ E．coliまたはL．brevisの場合、ＩＭＰを添加して10分
後の細胞内ATP量は、無添加の場合の約２倍または４５
倍に増加した（表１）。 （３）グルタミン酸 L．brevisの場合、グルタミン酸を添加して10分後の細
胞内ATP量は、無添加の場合の約３倍に増加した（表
１）。 （４）クエン酸 L．brevisの場合、クエン酸を添加して10分後の細胞内A
TP量は、無添加の場合の約２倍に増加した（表１）。

【００２７】図及び表で示した通り、実施例において用
いたATP増量剤により、細胞内ＡＴＰが２〜４７倍程度
に増加した。ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応法
を用いて細胞内ＡＴＰを測定する場合は、細胞内ＡＴＰ
量が増加することにより、発光量も増加する。従って、
本発明のＡＴＰ増量剤を用いることにより、細胞内ＡＴ
Ｐの測定感度の高感度化が可能であることが明らかであ
る。また、本発明により、従来法で測定できなかった条
件（試料中の細胞数や、細胞中のＡＴＰ量が少ない場合
等）でも、細胞の検出や細胞数の計測が可能であること
が示された。実施例において用いたATP増量剤の試料へ
の添加量は、糖類では０．０３７％、その他のＡＴＰ増
量剤では終濃度１０ｍＭである。このようなごく低濃度
の使用量であっても測定感度の向上が可能であることが
示された。なお、同じ種類のＡＴＰ増量剤であっても、
各検定菌に対する効果は異なる。また、用いるＡＴＰ増
量剤の種類によっても、同じ検定菌に対する効果は異な
る。これは、検定菌によってATP増量剤の取り込み系や
代謝系が異なるためであると考えられる。従って、試料
の種類や、試料中の細胞の種類によっては、複数のＡＴ
Ｐ増量剤を混合して使用することが必要である。

【００２８】［実施例２］実施例２では、細胞内ＡＴＰ
の測定用試薬として、ＰＰＤＫ発光試薬を使用して、細
胞内ＡＴＰおよびＡＭＰを測定した。また、ピルビン酸
キナーゼ入りＰＰＤＫ発光試薬を使用して、細胞内ＡＴ
Ｐ、ＡＤＰおよびＡＭＰを測定した。 １．試薬等 （１）ＡＴＰ増量剤 グルコース(和光純薬社製)を使用。 （２）ＡＴＰ消去剤 アデノシンリン酸デアミナーゼ（実施例１と同様の方法
で精製したもの）を使用。 （３）ＡＴＰ抽出試薬 99％ エタノール 1％アンモニア 15μM コホルマイシン（Calbiochem社製） （４）生物発光試薬 a)ＰＰＤＫ発光試薬（ATP＋AMP測定用） 2∪／m1 ＰＰＤＫ 5mｇ／m1 ルシフェラーゼ 1．5mM ルシフェリン 4．2mM PEP l．OmM EDTA・2Na l．OmM DTT 15mM硫酸マグネシウム 7．5mM硫酸アンモニウム 210μMピロリン酸ナトリウム O．37％ sucrose 0．1∪／m1 アデノシンリン酸デアミナーゼ 50mM HEPES（pH7．0） b)ピルビン酸キナーゼ入りＰＰＤＫ発光試薬（ATP＋ADP
＋AMP測定用） PPDK発光試薬に、500∪／mlでピルピン酸キナーゼを添
加したもの （５）検定菌 Escherichia coli（E．coli） ２．細胞内ＡＴＰの測定 （１）試料の調製 検定菌（E．coli）を標準培地8mlに植菌後、35℃で一晩
静置培養した。この培養液1mlを遠心にて集菌し、0．6m
Mリン酸ナトリウムbuffer（pH7．2）1mlにて3回洗浄し
た。菌体を、0．6mMリン酸buffer（pH7．2）にて適宜懸
濁・希釈し、希釈液を試料とした。 （２）ＰＰＤＫ発光試薬を用いた細胞内ATPおよびAMPの
測定 試料にアデノシンリン酸デアミナーゼを終濃度0．05∪
／mlになるように添加し、同時にグルコースを終濃度1
％になるように添加した。その後、試料を室温にて10
分、30分放置し、経時的に10μｌずつ採取した。採取し
た試料に、ＡＴＰ抽出試薬1mlを添加し、200μｌずつ遠
心チューブに分注した。チューブを真空遠心乾燥機にて
40℃、40分間処理して、エタノールとアンモニアを揮発
させた。その後、乾燥試料を超純水200μｌに溶解し
た。PPDK発光試薬100μｌに0．3mMコホルマイシン液5μ
ｌを添加し、30秒間放置後に試料10μｌを添加した。ベ
ルトールド社製ルミノメーターLB9501にて5秒待ち3秒積
算して発光量を測定し、次いであらかじめ作成した検量
線から試料中のATP＋AMPの量を算出した。 （３）ピルピン酸キナーゼ入りＰＰＤＫ発光試薬を用い
た細胞内ATP、ADPおよびAMPの測定 ＰＰＤＫ発光試薬の代わりに、ピルピン酸キナーゼ入り
ＰＰＤＫ発光試薬を使用した以外は、上記（２）と同様
の操作を行い、発光量を測定した。次いであらかじめ作
成した検量線から試料中のATP＋ADP＋AMPの量を算出し
た。一方、標準寒天培地（0．25％酵母エキス、0．5％
トリプトン、0．1％グルコース、寒天1．5％、pH7．1）
を用いて、混釈培養法にて行ったプレート法から求めた
菌数から、１細胞当たりのATP＋AMP量、ATP＋ADP＋AMP
量を算出した。また、試料１０μｌに、ルシフエールＬ
Ｕプラス(キッコーマン社製)に付属の発光試薬１００μ
ｌを添加し、ベルトールド社製ルミノメーターLB9501に
て5秒待ち3秒積算して発光量を測定した。次いで、あら
かじめ作成した検量線から試料中のATP量を算出した。
さらに、試料にATP増量剤を添加してから３０分経過し
ても菌数が増加しないことを混釈培養法により確認し
た。 ３．結果および考察 測定結果を、表2に示す。表中の数字は、１細胞当たり
のＡＴＰのモル数を示す。また、カッコ内の数字は、試
料調製時点での細胞内ＡＴＰ量、ATP＋AMP量あるいはAT
P＋ADP＋AMP量に対する倍率を示す。

【００２９】

【表２】

【００３０】グルコース無添加の場合はATP量もATP＋AM
P量もATP＋ADP＋AMP量もほとんど変化は無かったが、グ
ルコースを添加した場合は、わずか10分後にATP＋AMP量
は2．7倍、ATP＋ADP＋AMP量は1．8倍に増加した。また、
30分後では、ATP＋AMP量は3．13倍、ATP＋ADP＋AMP量は
1．8倍であった。この結果から、グルコースを添加した
場合、細胞内ではATPだけではなく、ADPおよびAMPも増
加することがわかる。本発明が、ルシフェリン−ルシフ
ェラーゼ発光反応法の変法（ＰＰＤＫ発光試薬またはピ
ルビン酸キナーゼ入りＰＰＤＫ発光試薬を使用する方
法）でも好適に使用できることが示された。

【００３１】

【発明の効果】本発明は、微生物等の細胞を含む試料に
糖類等のＡＴＰ増量剤を添加することにより、細胞内Ａ
ＴＰ量を増加させ、高感度に細胞内ＡＴＰを測定する方
法に関する。また、本発明は上記方法において使用され
る細胞内ＡＴＰの測定用試薬に関する。本発明を用いる
ことにより、試料中の細胞数が少ない場合や、細胞中の
ＡＴＰ量が少ない場合であっても、細胞の検出や細胞数
の計測が可能である。本発明は、細胞内ＡＴＰの測定が
行われる各種工業分野、臨床医学、基礎研究等の現場に
おいて好適に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Escherichia coliの細胞内ATP量に対する各種A
TP増量剤の添加効果を示す図。

【図２】Lactobacillus brevisの細胞内ATP量に対する
各種ATP増量剤の添加効果を示す図。

【図３】Escherichia coliの細胞内ATP量に対する各種A
TP増量剤の添加効果を示す図。

【図４】Lactobacillus brevisの細胞内ATP量に対する
各種ATP増量剤の添加効果を示す図。

【図５】Staphyllococcus aureusの細胞内ATP量に対す
る各種ATP増量剤の添加効果を示す図。

【図６】Bacillus subtilisの細胞内ATP量に対する各種
ATP増量剤の添加効果を示す図。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の工程を含むことを特徴とする細胞内
   ＡＴＰの測定方法。 a)細胞を含む試料に、ＡＴＰ増量剤を添加する工程。 b)細胞内ＡＴＰを抽出する工程。 c)抽出されたＡＴＰを測定する方法。
2. 【請求項２】ＡＴＰ増量剤が、糖類、核酸、有機酸、ア
   ミノ酸またはイオン勾配調節剤から選ばれる１種類以上
   の物質であることを特徴とする、請求項１記載の細胞内
   ＡＴＰの測定方法。
3. 【請求項３】ＡＴＰ増量剤を含むことを特徴とする、細
   胞内ＡＴＰの測定用試薬。