FI120538B - Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit - Google Patents

Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit Download PDF

Info

Publication number
FI120538B
FI120538B FI20070677A FI20070677A FI120538B FI 120538 B FI120538 B FI 120538B FI 20070677 A FI20070677 A FI 20070677A FI 20070677 A FI20070677 A FI 20070677A FI 120538 B FI120538 B FI 120538B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
group
ester
moiety
ooc
carboxylic
Prior art date
Application number
FI20070677A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20070677A0 (fi
FI20070677A (fi
Inventor
Veli-Matti Mukkala
Jari Peuralahti
Jari Hovinen
Janne Ketola
Lassi Jaakkola
Paeivi Liitti
Original Assignee
Wallac Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wallac Oy filed Critical Wallac Oy
Priority to FI20070677A priority Critical patent/FI120538B/fi
Publication of FI20070677A0 publication Critical patent/FI20070677A0/fi
Priority to US12/676,604 priority patent/US8221719B2/en
Priority to CN200880105962.6A priority patent/CN101796047B/zh
Priority to PCT/FI2008/050494 priority patent/WO2009030819A1/en
Priority to EP08805417.6A priority patent/EP2195310B1/en
Publication of FI20070677A publication Critical patent/FI20070677A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120538B publication Critical patent/FI120538B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65586—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system at least one of the hetero rings does not contain nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/13—Labelling of peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Description

Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit
Esillä oleva teknologia koskee joukkoa kelatoivia aineita, kelaatteja, näillä kelaateilla tai kelatoivilla aineilla leimattuja biomolekyylejä kuin myös näillä kelaateilla, kelatoivilla 5 aineilla ja leimatuilla biomolekyyleillä konjugoituja kiinteitä kantajia.
Tässä keksinnön taustaa havainnollistamaan käytetyt julkaisut ja muut materiaalit ja erityisesti lisäyksityiskohtia käytön suhteen tarjoavat tapaukset on sisällytetty tähän viitteillä.
10
Pitkäkestoisesti emittoivien lantanidi(III)kelaattileimojen tai koettimien käyttö yhdessä aikaerotteisen fluorometrian kanssa detektoinnissa saa aikaan menetelmän herkkien bioaffiniteettimääritysten muodostamiseksi. Lantanidi(III)kelaatteihin perustuva aikaerotteinen fluoresenssi onkin tullut menestyksekkääksi detektointiteknologiaksi ja sitä 15 on käytetty in vzYro-diagnostiikassa yli kahden vuosikymmenen ajan. Aikaerotteisen fluoresenssin sammumisen määritystä, joka perustuu energiansiirtoon lantanidi(III)kelaatilta ei-fluoresoivalle sammuttajalle, on sovellettu erilaisissa hydrolysoivien entsyymien määrityksissä kuin myös nukleiinihappojen detektoinnissa. Europium-, terbium-, dysprosium- ja samariumkelaattien erilaiset valokemialliset • · 20 ominaisuudet ovat osoittautuneet sopiviksi moniparametristen homogeenisten määritysten • · • # kehitykseen.
• · · • · · • · · • · · • · • · .1” Pysyviin luminoiviin lantanidi(III)kelaatteihin sisältyy yleisesti ligandi, jolla on • · • · · *... reaktiivinen ryhmä kelaatin kovalenttiseksi konjugoimiseksi bioaktiiviseen molekyyliin, • · 25 aromaattinen rakenne, joka absorboi viritysenergian ja siirtää sen lantanidi-ionille sekä φ·#·# lisäksi kelatoivia ryhmiä, kuten karboksyyli- tai fosfonihappo-osia ja amiineja. Toisin kuin • · · • · .···. orgaaniset kromoforit, nämä molekyylit eivät kärsi ei-toivotusta Raman-sironnasta tai • m • · · .·. konsentraatiosammutuksesta. Täten useampia valoa absorboivia rakenneosia sisältävät • e · • · · I.I luminoivat lantanidi(III)kelaatit ovat käyttökelpoisia multipleksointiin.
• · **:*' 30 • · · · ·
Pysyvä luminoiva lantanidi(III)kelaatti on yleensä määritelty molekyyliksi, a) joka on • t *···’ valokemiallisesti pysyvä sekä perustilassa että virittyneessä tilassa, b) joka on kineettisesti pysyvä, c) joka on kemiallisesti pysyvä, d) jolla on suhteellisen korkea viritysaallonpituus, esimerkiksi yli 330 nm, e) jolla on korkea viritysvakio viritysaallonpituudella, f) jonka 2 energiansiirto ligandilta keskusionille on tehokas, g) jolla on suhteellisen pitkä luminesenssin elinikä ja h) joka on liukoinen veteen. Biologisten määritysten formaatteihin käytettynä valittu bioaktiivinen molekyyli olennaisesti säilyttää affiniteetin sitoutumispartneriin, kun se on kytketty pysyvään luminoivaan lantanidi(III)kelaattiin.
5
On tehty joukko yrityksiä aikaerotteisiin fluorometrisiin sovelluksiin sopivien kelaattien valofysikaalisten ominaisuuksien säätämiseksi. Näihin kuuluvat esim. pysyvät kelaatit, joiden energiaa välittävät ryhmät koostuvat pyridiinien [US-patentti 4.920.195, US-patentti 4.801.722, US-patentti 4.761.481, US-patentti 4.459.186, EP-patentti 0 770 610], 10 bipyridiinien[US-patentti 5.216.134], terpyridiinien [US-patenteista 4.859.777, US-patentti 5.202.423, US-patentti 5.324.825] tai erilaisten fenolisten yhdisteiden [US-patentti 4.670.572, US-patentti 4.794.191] johdannaisista ja joissa polykarboksyylihapot ovat kelatoivina osina. Lisäksi on tuotu esille erilaisia dikarboksylaattijohdannaisia [US-patentti 5.032.677, US-patentti 5.055.578, US-patentti 4.772.563], makrosyklistä kryptaatteja [US-15 patentti 4.927.923, EP-patentti] ja makrosyklisiä Schiffin emäksiä [EP-patentti 0 369 000].
On osoitettu, että europium(III)kelaatilla, joka perustuu 1,4,7-triatsasyklononaaniin, johon on kytkettynä kolme fenyylietynyylipyridinyylikromoforia, on hyvät luminesenssiominaisuudet: sen luminesenssisaanto (εΦ) on lähes kaksi suuruusluokkaa • · 20 korkeampi kuin yksittäisestä kromoforista koostuvalla kelaatilla [Heh. Chim. Acta, 1996, • · • # 79, 789]; sen kineettinen ja termodynaaminen stabiilisuus on myös suuri. Esitetty kelaatti • · · • · · ;** ei kuitenkaan ole sopiva biomolekyylien johdannaisten tekoon, koska siitä puuttuu • · • · .*** konjugoimiseen tarvittava reaktiivinen ryhmä. Lisäksi etynyyliryhmät vahingoittuvat • · • · · *... helposti suuren intensiteetin valon vaikutuksesta, mikä on ongelma erityisesti • · 25 fluoresenssimikroskopiaan perustuvissa sovellutuksissa. Alkynyyliryhmät saattavat myös #-t«t reagoida in vzYro-määrityksissä tarvittavien lisäaineiden, etenkin hyvin nukleofilisen atsidi- • · · .···. ionin, kanssa. Yllä mainitut ongelmat ratkaistiin myöhemmin korvaamalla »·· .·. fenyylietynyyliryhmät furyyli- ja trismetoksifenyylialayksiköillä, jolloin saatiin luminoivia • · · • · · eurooppium-ja samarium- [US-patenttihakemus 11/004.061] ja terbium-ja • · 30 dysprosiumkelaatteja [US-patenttihakemus 10/928.143].
• · · · · • · 3 helpommin käyttämällä tavallisia laitteistoja.Korkeampi viritysmaksimi myös vähentäisi taustaluminesenssia. Lisäksi aromaattisten kromoforien lyhyemmät aallonpituudet absorboituvat biologisiin materiaaleihin, kuten nukleiinihappoihin ja aromaattisiin aminohappoihin.
5
On myös ehdotettu atsamakrosyklien kytkemistä pitkän aallonpituuden herkistäjiin, kuten aromaattisiin heterosykleihin [esim. US-patentti 6.344.360, W02006/039505, W02007/055700, J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 2002, 348], Tämän tyyppisten kelaattien emissiospektri jakaantuu usein useisiin piikkeihin. Tämä puolestaan aiheuttaa ongelmia: 10 a) kvanttisaanto on suhteellisen alhainen, kun on käytettävä kapeita suotimia, kuten useamman leiman määrityksissä, b) emission lisäjuovat aiheuttavat taustasignaaleja aikaerotteiseen fluoresenssienergian siirtoon perustuvissa sovellutuksissa ja e) intensiiviset pitkän aallonpituuden emission juovat rajoittavat NIR-akseptorien käyttöä.
15 Vaikka orgaanisilla kelaattoreilla ja niiden substituenteilla on merkittävä vaikutus lantanidi(III)kelaattien valofysikaalisiin ominaisuuksiin, ei saatavilla ole mitään yleistä sääntöä näiden vaikutusten arvioimiseksi. US-patentissa 4.761.481 on ehdotettu, että fenyyli- ja naftyylisubstituoitujen 2,6-[N,N-di(karboksialkyyli)aminoalkyyli]pyridiinien aromaattisten fenyyli- ja naftyyliryhmien elektroneja vapauttavilla substituenteilla on • · I. ’1 20 hyödyllisiä vaikutuksia näiden molekyylien lantanidi-ionikelaattien valofysikaalisiin • · * . ominaisuuksiin. Minkäänlaista kokeellista näyttöä ei kuitenkaan annettu. Myöhemmin on • · · • · · osoitettu, että näin on erilaisilla terbium(III) ja dysprosium(III) kehäteillä [US- • · • · //’ patenttihakemus 11/004.061], mutta vastaavat europium(III)kelaatit ovat käytännöllisesti [... katsoen ei-luminoivia [Hemmilä et ah, J. Biochem. Biophys. Methods, 1993, 26, 283].
• · 25 Lisäksi toisin kuin US-patentissa 4.761.481 on ehdotettu, on osoitettu, että elektroneja . ·. ·. vapauttavia aminosubstituenttej a aromaattisissa rakenneosissa sisältävillä • · · .···. lantanidikelaateilla on huonot kvanttisaannot [Takalo et ah, Helv. Chim. Acta, 1993, 76, Λ 877], • · · • · · · • · T1 30 Useissa sovellutuksissa käytetään kelaattien kovalenttista konjugointia bioaktiivisiin • · · · · molekyyleihin. Tämä suoritetaan yleisimmin liuoksessa antamalla bioaktiivisen • · *···’ molekyylin amino- tai merkaptoryhmän reagoida leiman isotiosyanaatti-, maleimidi- tai N- hydroksisukkinimidijohdannaisten kanssa [Fichna, J., Janecka, A., Bioconjugate Chem., 2003,14, 3]. Koska useissa biomolekyylien leimauksen menettelytavoissa reaktio 4 suoritetaan aktivoidun leiman ylimäärän kanssa, työläitä puhdistusoperaatioita ei voida välttää. Erityisesti kun kiinnitetään useita leimamolekyylejä tai edellytetään paikkaspesifistä leimausta useiden samanlaisen reaktiivisuuden omaavien funktionaalisten ryhmien läsnä ollessa, tuotteena olevan biomolekyylikonjugaatin eristäminen ja 5 karakterisointi on vaikeaa ja usein käytännöllisesti katsoen mahdotonta.
Tavallisesti useissa sovellutuksissa, kuten homogeenisissa sammutukseen perustuvissa määrityksissä käytettävät biomolekyylikonjugaatit puhdistetaan, koska pienetkin määrät fluoresoivia epäpuhtauksia voivat lisätä luminisenssitaustaa ja vähentää siten detektoinnin 10 herkkyyttä. Täten voi olla toivottavaa suorittaa biomolekyylien konjugointi kiinteän faasin pinnalla, koska useimmat epäpuhtaudet voidaan poistaa pesemällä silloin kun biomolekyyli on ankkuroitu kiinteään faasiin. Kun biomolekyylikonjugaatti vapautuu liuokseen, tarvitaan yleensä tarvitaan vain yksi kromatografinen puhdistus.
15 Suurten biomolekyylien, kuten proteiinien, leimaus liuosfaasissa on normaalikäytäntö. Näissä tapauksissa leimausreaktion tulee olla spesifinen ja biomolekyylikonjugaattien puhdistuksen mahdollisimman tehokas.
Esillä olevassa keksinnössä havaittiin, että furyylipyridyylialayksiköitä sisältävien • · 20 lantanidikelaattien valofysikaalisia ominaisuuksia voidaan räätälöidä furyylirenkaan • · * , elektroneja luovuttavilla substituenteilla. Kelaattien vesiliukoisuutta voidaan puolestaan • · · • · · *” parantaa sisällyttämällä karboksyyli- tai sulfonihapporyhmiä furyylirenkaaseen. Samat • · • · substituution vaikutukset voidaan myös saada aikaan vastaavilla tienyylijohdannaisilla.
• · • · · • · · • · • · 25 Tämän mukaisesti esillä olevan keksinnön yhdessä sovelluksessa saadaan aikaan kelatoivia 4·%·4 aineita ja näiden lantanidikelaatteja, jotka ovat käyttökelpoisia biomolekyylien • · · . · · ·. leimaamiseen j a j oita voidaan käyttää koettimina aikaerotteisessa fluoresenssi- • · • · · .·. spektroskopiassa, jolloin kromofori sisältää ainakin yhden furyyli- tai tienyylisubstituoidun • · · • · · pyridyyliryhmän, jossa furyyli- tai tienyyliryhmä on substituoitu yhdellä tai useammalla • · • · Ί* 30 samanlaisella tai erilaisella elektroneja luovuttavalla ryhmällä ja mahdollisesti lisäksi • · · ·· karboksyyli- tai sulfonihapporyhmällä tai näiden happojen esterillä, amidilla tai suolalla.
• · • · • · ·
Yksi tämän keksinnön näkökanta tuo esille kelaatteja, jotka antavat fluoresenssin erilaisten kelatoituneiden lantanidien kanssa.
5
Yksi näkökanta on tuoda esille kelaatteja tai kelatoivia aineita, jotka ovat sopivia biomolekyylien leimaamiseen liuoksessa.
Toinen tavoite on tuoda esille kelaatteja ja kelatoivia aineita, jotka sopivat oligopeptidien, 5 oligonukleotidien ja muiden molekyylien leimaamiseen samalla, kun ne syntetisoidaan kiinten faasin pinnalla.
Eräs toinen tarkoitus on tuoda esille biomolekyylejä ja kiinteitä kantajia, jotka on leimattu näillä kelaateilla ja kelatoivilla aineilla.
10
Siten yhden sovelluksen mukaan keksintö koskee kelaattia, joka käsittää - lantanidi-ionin, Ln3+, - kromoforisen rakenneosan, joka käsittää yhden tai useampia aromaattisia yksiköitä, jolloin ainakin yksi aromaattisista yksiköistä on furyylillä tai tienyylillä substituoitu 15 pyridyyliryhmä, jolloin furyyli- tai tienyyliryhmä on substituoitu yhdellä tai useammalla samanlaisella tai erilaisella elektroneja luovuttavalla ryhmällä ja mahdollisesti lisäksi karboksyyli- tai sulfonihapporyhmällä tai näiden happojen esterillä, amidilla tai suolalla, G, ja jolloin kromoforiset rakenneosat on kytketty .. suoraan toisiinsa muodostaen terpyridyyliryhmän tai ne on kytketty toisiinsa syklisen « · • · · I. 20 tai ei-syklisen N-atomin sisältävän hiilivetyketjun välityksellä, • » • · · ' . - kelatoivan osan, joka käsittää ainakin kaksi karboksyylihappo-tai fosfonihapporyhmää • · · .···. tai näiden happojen esteriä, amidia tai suolaa kiinnittyneenä kromoforisen rakenneosan • · • · · :·. aromaattiseen yksikköön joko suoraan tai syklisen tai asyklisen N-atomin sisältävän • · · .···. hiilivetyketjun välitykselläpä • · • · · 25 - reaktiivisen ryhmän A kytkettynä kromoforiseen rakenneosaan tai kelatoivaan osaan ; V; joko suoraan tai linkkerin L välityksellä, jolloin reaktiivinen ryhmä A mahdollistaa • · sitoutumisen biomolekyyliin tai kiinteällä faasilla olevaan funktionaaliseen ryhmään.
• ti • · • · · • · · • · . ·· ·. Töisen tämän keksinnön näkökannan mukaisesti keksintö koskee kelatoivaa ainetta, joka • · · * , 30 käsittää • · p^ - kromoforisen rakenneosan, j oka käsittää yhden tai useampia aromaattisia yksiköitä, • « jossa ainakin yksi aromaattisista yksiköistä on furyylillä tai tienyylillä substituoitu pyridyyliryhmä, jolloin furyyli- tai tienyyliryhmä on substituoitu yhdellä tai 6 useammalla samanlaisella tai erilaisella elektroneja luovuttavalla ryhmällä ja mahdollisesti lisäksi karboksyyli- tai sulfonihapporyhmällä tai näiden happojen esterillä, amidilla tai suolalla, G, ja jolloin kromoforiset rakenneosat on kytketty suoraan toisiinsa muodostaen terpyridyyliryhmän tai on kytketty toisiinsa syklisen tai 5 ei-syklisen N-atomin sisältävän hiilivetyketjun välityksellä, - kelatoivan osan, joka käsittää ainakin kaksi karboksyylihappo- tai fosfonihapporyhmää tai näiden happojen esteriä, amidia tai suolaa kiinnittyneenä kromoforisen rakenneosan aromaattiseen yksikköön joko suoraan tai syklisen tai asyklisen N-atomin sisältävän hiili vetyketj un välityksellä, ja 10 - reaktiivisen ryhmän A kytkettynä kromoforiseen rakenneosaan tai kelatoivaan osaan joko suoraan tai linkkerin L välityksellä reaktiivisen ryhmän A mahdollistaessa sitoutumisen biomolekyyliin tai kiinteällä faasilla olevaan funktionaaliseen ryhmään.
Toisen näkökannan mukaan keksintö koskee biomolekyyliä konjugoituna tämän keksinnön 15 kelaatin tai kelatoivan aineen kanssa.
Toisen näkökannan mukaan keksintö koskee kiinteää kantajaa, joka on konjugoitu kelaatin, kelatoivan aineen tai tämän keksinnön mukaisesti leimatun biomolekyylin kanssa.
• · • · · *. 20 Toisen näkökannan mukaan tämä keksintö koskee leimattua oligopeptidiä tai orgaanista • · • · · molekyyliä saatuna kiinteän faasin synteesillä liittämällä sopiva tämän keksinnön • · · • · · XI mukainen kelatoiva aine oligopeptidin rakenteeseen oligopeptidi-syntetisaattorissa, minkä • · jälkeen suojaryhmät poistetaan ja mahdollisesti edelleen lisätään metalli-ioni.
• · · • · · • · • · * * * 25 Toisen näkökannan mukaan tämä keksintö koskee leimattua oligonukleotidia, joka on saatu kiinteän faasin synteesillä lisäämällä sopiva tämän keksinnön mukainen kelatoiva • · · • · .***. aine oligonukleotidin rakenteeseen oligonukleotidisyntetisaattorissa, minkä jälkeen ··· suojaryhmät poistetaan ja mahdollisesti edelleen lisätään myös metalli-ioni.
• · · • · • · · • · • · • * ^ 30 Kuten tässä on määritelty, viittaa ’’elektronej a luovuttava ryhmä” alkyyli- j a alkoksi- ryhmään. Alkyyliryhmä voi olla suoraketjuinen tai haaroittunut, kuten metyyli, etyyli, n- • · • · *** propyyli, z-propyyli, «-butyyli, Z-butyyli ja seft-butyyli. Alkoksiryhmä voi olla suoraketj uinen tai haaroittunut kuten metoksi, etoksi, «-propoksi, z-propoksi, «-butoksi, t-butoksi ja .vek-butoksi. Elektroneja luovuttava ryhmä voi myös olla kytkeytynyt elektroneja 7 puoleensa vetäviin ryhmiin kuten hydroksyyliin, karboksyyli-ja sulfonihapporyhmiin, jos elektroneja vetävä ryhmä on erotettu furaani- tai tiofeenirenkaasta yhdellä tai useammalla metyleeni-ryhmällä.
5 Tässä kuvatut kelaatit ja kelatoivat aineet sisältävät kromoforisen rakenneosan, joka on bivalenttinen aromaattinen rakenne, joka käsittää yhden tai useamman furyylillä tai tienyylillä substituoidun pyridyyliryhmän, jolloin furyyli- tai tienyyliryhmissä on lisäksi muita substituentteja. Furyylillä tai tienyylillä substituoitu pyridyyliryhmä pystyy absorboimaan valoa tai energiaa ja siirtämään viritysenergiaa kelatoituneelle lantanidi-10 ionille antaen vahvan fluoresenssin. Furyylillä tai tienyylillä substituoidun pyridyyliryhmän tai -ryhmien lisäksi voi kromoforinen yksikkö käsittää substituoimattomia pyridyyliryhmiä, muita substituentteja ja/tai aromaattisia ryhmiä sisältäviä pyridyyli-ryhmiä.
15 Furyyli- tai tienyyliryhmä voi olla kiinnittynyt pyridiinirenkaaseen sen C2-atomin välityksellä, tai sen C3-atomin välityksellä käyttämällä synteesistrategiassa reagensseina esim. 3-(dihydroksiboryyli)furaani- tai 3-(dihydroksiboryyli)tiofeenijohdannaisia 2-(dihydroksiboryyli)furaani- tai vastaavasti 2-(dihydroksiboryyli)tiofeenijohdannaisten sijaan. Tässä olevilla spesifisillä esimerkeillä havainnollistetuissa yhdisteissä • · J. *' 20 pyridyyliryhmän 4-asema sisältää furyyli- tai tienyylisubstituentin. Muutkin • · • · · * . pyridiinirenkaan asemat voivat olla käyttökelpoisia substituution kannalta.
• · · • · · • · · • ·· • · • · .!" Yhden sovellutusmuodon mukaan kromoforinen rakenneosa käsittää yhden, kaksi tai • ·· kolme pyridyyliryhmää, jolloin ainakin yksi näistä on furyyli- tai tienyylisubstituoitu, • · 25 jolloin tämä furyyli- tai tienyyliryhmä on substituoitu yhdellä tai useammalla samalla tai erilaisella elektroneja luovuttavalla ryhmällä. Erityisessä sovellutusmuodossa elektroneja • 9 9 • · .···. luovuttavat ryhmät ovat suoraketjuisia tai haaroittuneita alkyyliryhmiä, kuten metyyli, • · ··« etyyli, «-propyyli, /-propyyli, «-butyyli, /-butyyli ja se£-butyyli.
♦ · ♦ • · · • · ··· • · ♦ · *1* 30 Pyridyyliryhmät voivat kytkeytyä suoraan toisiinsa muodostaen terpyridyyliryhmän.
«
Vaihtoehtoisesti pyridyyliryhmät ovat kytkeytyneet toisiinsa N:n sisältävien hiilivety- • · *···* ketjujen välityksellä. N:n sisältävä hiilivety ketju voi olla joko syklinen tai ei-syklinen.
Eräässä erityisessä sovellutusmuodossa on N:n sisältävä hiilivetyketju syklinen. Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet, jotka käsittävät kolme kromoforista rakenneosaa, jolloin 8 kromoforiset rakenneosat ovat kytkeytyneet toisiinsa syklisen N-atomin sisältävän hiilivetyketjun välityksellä, esim. atsakruunuun perustuvat yhdisteet, ovat sopivia määrityksissä, jotka perustuvat energiansiirtoon tai sammumiseen, sillä niiden emissiospektrissä 615 nm lähellä oleva piikki on vallitseva.
5
Yhden sovellutusmuodon mukaan kromoforinen rakenneosa käsittää yhden, kaksi tai kolme karboksyyli- tai sulfonihapporyhmää tai näiden happojen esteriä, amidia tai suolaa, G. Karboksyyli- tai sulfonihapporyhmä parantaa kelaatin vesiliukoisuutta. Ryhmää G voidaan käyttää myös kelaatin kovalenttiseksi tai ei-kovalenttiseksi kytkemiseksi 10 bioaktiivisiin molekyyleihin ja kiinteälle alustalle.
Tässä kuvatut kelatoivat aineet ja kelaatit sisältävät reaktiivisen ryhmän A, joka mahdollistaa sen, että käyttäjä voi esimerkiksi sitoa kelatoivan aineen tai kelaatin kovalenttisesti biomolekyyliin tai kiinteälle alustalle. On kuitenkin olemassa sellaisia 15 sovellutuksia, joissa minkäänlainen kovalenttinen sitoutuminen ei ole tarpeen. Siten tässä kuvattua kelatoivaa ainetta tai kelaattia voidaan käyttää sellaisissa sovellutuksissa, joissa ei tarvita minkäänlaista reaktiivista ryhmää. Yksi esimerkki tämänkaltaisesta teknologiasta on esitetty esim. julkaisussa Blomberg et ah, J Immunological Methods, 1996,193, 199. Toinen esimerkki, jossa ei tarvita minkäänlaista reaktiivista ryhmää A, on eosinofiilisten ja • · ” 20 basofiilisten solujen erottaminen [W02006/072668], Tässä sovellutuksessa positiivisesti ja • · • · · ' . negatiivisesti varautuneet kelaatit sitoutuvat negatiivisesti ja vastaavasti positiivisesti • · · • · · *** varautuneille solupinnoille.
• · • · • · « • · • · • · · Tässä kuvatut kelatoivat aineet ja kelaatit voivat sisältää linkkeriryhmän L, joka • · 25 mahdollistaa sen, että käyttäjä voi esimerkiksi muuttaa steerisiä vuorovaikutuksia kelatoivan aineen tai kelaatin osien välillä. Kelatoivat aineet ja kelaatit ovat kuitenkin « · · • · .···. käyttökelpoisia ilman linkkeriryhmää. Minkäänlaista linkkeriä ei tarvita esimerkiksi • · • · · valmistettaessa voimakkaasti luminoivia partikkeleja yksinkertaisesti adsorboimalla • · · • · · M kelaatteja polymeeriin, kuten on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Soukka et ah, Anal.
• · **:** 30 Chem., 2001, 73,2254.
• · · · · • · • · · * · · * * Vaikka useissa sovelluksissa reaktiivinen ryhmä A voitaisiin periaatteessa kiinnittää suoraan kromoforiseen ryhmään tai kelatoivaan osaan, steeristen syiden vuoksi on toivottavaa, että reaktiivisen ryhmän A ja kromoforisen ryhmän tai vastaavasti kelatoivan 9 osan välissä on linkkeri L. Linkkeri L voidaan kiinnittää myös karboksyyli- tai sulfonihapporyhmään G amidisidoksen välityksellä. Linkkeri on käyttökelpoinen sellaisissa tapauksissa, joissa kelaattia käytetään oligopeptidien ja oligonukleotidien kiinteän faasin synteesin aikana, mutta voi olla toivottava myös silloin, kun 5 biomolekyylejä leimataan liuoksessa.
Yhden sovellutusmuodon mukaan linkkeri L on muodostunut välillä yhdestä kymmeneen rakenneosaa, joista kukin rakenneosa on valittu joukosta, joka koostuu fenyleenistä, 1-12 hiiliatomia sisältävästä alkyleenistä, etynydiyylistä (-C=C-), etyleenidiyylistä (-C=C-), 10 eetteristä (-0-), tioeetteristä (-S-), amidista (-CO-NH-, -CO-NR’-, -NH-CO-ja -NR’-CO), karbonyylistä (-CO-), esteristä (-COO-ja -OOC-), disulfidista (-SS-), sulfonamidista (-SO2-NH-, -S02-NR’-), sulfonista (-SO2-), fosfaatista (-O-PO2-O-), diatsasta (-N=N-) ja tertiäärisestä amiinista, jolloin R’ edustaa alkyyliryhmää, joka sisältää vähemmän kuin 5 hiiliatomia.
15
Yhden sovellutusmuodon mukaan reaktiivinen ryhmä A on valittu joukosta, joka koostuu isotiosyanaatista, bromiasetamidistä, jodiasetamidista, maleimidistä, 4,6-dikloori-l,3,5-triatsinyyli-2-aminosta, pyridyyliditiosta, tioesteristä, amino-oksista, atsidista, hydratsidista, aminosta, alkyynistä, polymerisoituvasta ryhmästä ja karboksyylihaposta tai • · ·, 20 happohalidista tai karboksyylihapon aktiivisesta esteristä.
• · • ·· • · · • · · ”1 Siinä tapauksessa, että kelatoiva aine on kiinnitetty kiinteälle kantajalle, joka on partikkeli, • · • · .1" kuten mikropartikkeli tai nanopartikkeli tämän partikkelin valmistusprosessin aikana, • ·· ]... ^ reaktiivinen ryhmä A on polymerisoituva ryhmä, kuten metakryyliryhmä.
• · 25
Partikkeleihin polymerisoitava kelaatti tai kelatoiva aine on yleensä liukoinen orgaanisiin • · · • · . · · ·. liuottimiin. Tätä piirrettä voidaan parantaa j ättämällä karboksyyli- tai sulfonihappo-ryhmä • · • · · G pois keksinnön mukaisten kelaattien rakenteista. Edelleen tämä mahdollistaa kolmannen • · · • · · elektroneja luovuttavan ryhmän lisäämisen näiden kelaattien furyyli- tai • · “1 30 tiofeenialayksiköihin.
• · • · · • · ’1··’ Siinä tapauksessa, että kelaatti tai kelatoitava aine on tarkoitus kiinnittää kiinteälle kantajalle, kuten nanomateriaaliin, biomolekyyliin ja erilaisiin orgaanisiin molekyyleihin, käyttämällä kupari(I):n katalysoimaa Huisgen-Sharplessin dipolaarista [2+3] sykloadditio- reaktiota, reaktiivinen ryhmä A voi olla joko atsidi tai terminaalinen alkyyni.
10
On ehdotettu [US-patentti 5.985.566], että oligonukleotidit, DNA, RNA, oligopeptidit, 5 proteiinit ja lipidit voidaan tilastollisesti muuntaa käyttämällä leimamolekyylejä, jotka on kytketty platinajohdannaisiin. Nukleiinihapoissa nämä molekyylit reagoivat pääasiallisesti guaniinitähteiden N7:n kanssa. Tämän teknologian soveltamiseksi tässä kuvatuille kelaateille ja kelatoiville aineille reaktiivinen ryhmä A on o HN ta 10 A" ^ jossa kaavassa A’ on lähtevä ligandi, kuten Cl, (CL^SO, H2O ja NO3
Ryhmä A-L- voidaan kytkeä molekyyliin eri tavoilla. Se voidaan kytkeä kelatoivaan osaan, 15 aromaattiset osat yhdistävään N:n sisältävään ketjuun tai aromaattiseen yksikköön.
Viimeksi mainitussa tapauksessa ryhmä A-L- on kytketty furyyli- tai tienyylisubstituenttiin joko suoraan tai karboksyyli- tai sulfonihappo-johdannaisen G välityksellä.
• · • · • ·· 3+ ·. Yhden sovellutusmuodon mukaan kelatoitu metalli-ioni Ln on europium(III), * · · [ 20 samarium(III), terbium(III) tai dysprosium(III). Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa • · · •·· t o. t .···. kelatoitu metalli-ioni Ln on europium(III) ja samarium(III).
• · • · · • · • · • · · .···. Esimerkkeinä spesifisistä tämän keksinnön mukaisista kelaateista ovat seuraavat rakenteet: • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · · • · · 1 · • · · • · • · • · · 11
^zR| A
XX XkXX RfeR, XV
i Ln^ 1 rN L" , ΑνΛ HN'L'A
A-Lv Ί Γ Ί II A-L-G^>7 I I Γ1 < LA
I § § § § § A § I Ooc 'nIAi [Ar^ OOC^X|g? 1 g^. rVn?S G- ^ G/r)l r2^0,£di coo-coo-coo-coo· r2^3£ri A ί Λ ^ Xk Ά * Ά' LA-AA 4>£r, Λ\ο°°' fS ί Λ L Ln3+ A rA ΛΓΤ ΑνΑ/Νχ^λνλί
Γ Ί X X^NLn .N. Ln3"*· N
% % IIO0C N'-o°<= Acoff 11 II °oc>Afe£R1 O Q p a I fi -¾. .¾.. £«.·
1„ A?·» „&Ar-£“ r^XjAA
M . Λ-& rW r*i AAa ooc " A I § Is :··.. oocAA TOCXfe£R, • Φ • ·
• M
• A-L-G ~ : : ' Az ··· R2i>A-r1 g =:::= /1 A Ά r::· aa coo‘ xAVi xiScx
·..·· All X |_n3+> H p in in π I
oocAlJ, £ L„„ Γνί ΤνΊ - n .. . ^ Hoi oo £3o o oo *::;· -oocA^igz 8 § § 8 o o 99 : : R ^g-l-a ··· • · • · · • · · • · • · · • · • · *·· 5 joissa kaavoissa R1 ja R2 ovat elektroneja luovuttavia ryhmiä, L, G, R’ ja A on määritelty • · .···. kuten patenttivaatimuksessa 1 ja Z on joko O tai S furyylin ja vastaavasti tienyylin • · · kohdalla.
12
Yhdessä sovellutusmuodossa kelaatti on valittu seuraavista rakenteista g ^ a-l-G-o.
R2teRi R2teR' aV0 c00'
Av AnA h%-a Av / N \ L II ^K,Ln3A JL il _A -OOC^N^A/N_N.
-οο=ΑΆρ, g '00C^fetR,
Av r2"5^R1 A-L-G^ r2aTr1 ga jfx r2^r1 G R^sAf N C0° a-L G f\ r^r, xYj00' λ αλ ä, M™
jfS C.rf+y "OOC "N^N % f^S
-OOC _jS N^|j ^ OOcYAl^A_jS
N |1 OOC^^AAA2 nA| ooc^fe'Z , ^R1 'ooc^r^&
K 0^T-R1 K U=ir~G-L-A
5 ♦ ♦ 12 ♦ · joissa kaavoissa R ja R ovat samanlaisia tai erilaisia elektroneja luovuttavia ryhmiä, L, G, ·· • · • ** R’ ja A ovat kuten määritelty yllä ja Z on joko O tai S furyylin tai vastaavasti tienyylin ·· • ** kohdalla.
♦ • · « • · · # ·♦ • · //· 10 Kelatoivat aineet käytettäväksi peptidisynteesissä • « • ♦· * · « • · • ♦ **’ Yhden sovellutusmuodon mukaan tämän keksinnön mukainen kelatoiva aine on sopiva . . käytettäväksi oligopeptidin synteesissä. Tässä sovelluksessa reaktiivinen ryhmä A on • · · 1/. liittynyt kelatoivaan aineeseen linkkerin L välityksellä, ja A on karboksyylihappo tai sen * * ·* 15 suola, happohalidi tai esteri tai aminohappotähde -CH(NHR3)R4, jossa R3 on väliaikainen • · ♦ *·]·* suojaryhmä ja R4 on karboksyylihappo tai sen suola, happohalidi tai esteri. Esimerkkeinä • · ·;·' kelatoivista aineista ovat seuraavat rakenteet • · « · « • « • » 13 .¾. *&R,
riXi XxaX, r^z XXfO
Α_ίΤΝΊ η ΓΊ γνί ?\Γ\ mx-A
π π π *J * * R2^R1 * ^ Κ·Ά'ΛΆ J*> Ä ,¾ ,
a Λ· Λ- a, Q- ex R
ÄiA A ^,aä X n A fvfc; A ί Λ
ΓΊ ΓΊ rii/ T An^n^nA
tj ό T3 "o /X/k_,N ,N.
|T ir ir A R n n f \/\K._—Ί 9 9 9 9 1 "R n—^ 1..
O o O o N -^Ίι \ j j _· j R''^Ain? to nj »o R2\jr_r--pi aar, $* r&r, r^R- *%A q^r'· ΧχΧΧ ,jOl« ,x4x n n Γ·:· -¾ -4¾ • · · • · · • · · • · · lx’ A'L1'®z R%X, : ·· r2aza-ri r a^r1 • *· A^>i fT^4 v^\\ r^i X j_X XXI 1 XX XX1 ΛνΑΑλ r n
:V: A A ‘AA A
:.: * * i i • · • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · 12 *·;·’ 5 joissa kaavoissa R , R , L ja Z ovat kuten määritelty yllä ja A on karboksyylihappo tai sen ‘•**: suola, happohalidi tai esteri tai aminohappotähde -CH(NHR )R , jossa R on väliaikainen • · · *...* suojaryhmä, R4 on karboksyylihappo tai sen suola, happohalidi tai esteri, R” on alkyyliesteri tai allyyliesteri ja R’” on alkyyliryhmä ja G’ on karboksyyli- tai sulfonihappoesteri tai -amidi.
14
Eräässä erityisessä sovellutusmuodossa valitut kelatoivat aineet ovat seuraavat rakenteet: G/\ r-
rii k J r^S / N \ L~A
R"^N^L_jk R. A-MLJh
flG. nA
R' rJ^r, A-L-G'x/. Q- r¥vnc1r" A- 1 11 G- A .
\\. r2^-r' r 'ι^0£κ, • · • · • · · » • * · 1 2 *·:·* 5 joissa kaavoissa R , R , L, G’ ja Z ovat kuten määritelty yllä ja A on karboksyylihappo tai • · [···* sen suola, happohalidi tai esteri tai aminohappotähde -CH(NHR3)R4, jossa R3 on • · •>#[* väliaikainen suojaryhmä ja R4 on karboksyylihappo tai sen suola, happohalidi tai esteri, • · ’** missä R on väliaikainen suojaryhmä, joka on valittu joukosta, joka koostuu ryhmistä . . Fmoc (fluorenyylimetoksikarbonyyli), Boc (tm-butyylioksikarbonyyli), tai Bsmoc (1,1- • · · • · · 10 dioksobentso[b]tiofen-2-yylimetyylioksikarbonyyli), ja R” on karboksyylihapon • · *·’ alkyyliesteri tai allyyliesteri ja G’ on karboksyyli- tai sulfonihappoesteri tai -amidi.
• · • · · *·*·* Kelatoiva aine voidaan lisätä biomolekyyleihin peptidisyntetisaattorin avulla. Kelatoiva • i ··· aine voidaan kytkeä aminokytketylle kiinteälle kantajalle tai immobilisoituun *·**· aminohappoon aktivaattorin läsnä ollessa. Kun kondensointivaihe on viety loppuun ··· • · 15 leimausreagenssin väliaikainen aminoryhmän suojaryhmä poistetaan materiaalin ollessa edelleen kiinnitettynä kiinteälle kantajalle (esim. piperidiinillä Fmoc-suojaryhmän tapauksessa). Sitten suoritetaan toinen kytkeminen kelatoivalla aineella tai muulla 15 reagenssilla (esim. sopivasti suojattu aminohappo, steroidi, hapteeni tai orgaaninen molekyyli) kuten yllä. Kun halutun yhdisteen synteesi on viety loppuun, materiaali irrotetaan kiinteältä kantajalta ja suojaryhmät poistetaan. Puhdistaminen voidaan suorittaa HPLC-tekniikoilla. Lopulta puhdistettu ligandi muunnetaan vastaavaksi lantanidi(III)-5 kelaatiksi lisäämällä tunnettu määrä lantanidi(III)ionia.
Kelatoivat aineet käytettäväksi oligonukleotidisynteeissä
Toisen sovellutusmuodon mukaan tämän keksinnön mukainen kelatoiva aine on sopiva 10 käytettäväksi oligonukleotidin synteesiin. Tässä tapauksessa reaktiivinen ryhmä A on liitetty kelatoivaan aineeseen linkkerin L välityksellä ja A on -Z2-0-PZ3-0-R5 15 jossa toinen happiatomeista on mahdollisesti korvattu rikillä, Z3 on kloori tai NR6R7, R5 on suojaryhmä, R6 ja R7 ovat alkyyliryhmät, jotka käsittävät 1 - 8 hiiltä, ja Z2 ei ole läsnä tai se on piiriiniemäksen tai pyrimidiiniemäksen tai minkä tahansa muun modifioitujen oligonukleotidien synteesiin sopivan modifioidun emäksen radikaali. Emäs on kytketty happiatomiin joko i) suojatulla hydroksimetyyliryhmällä substituoidun hiilivetyketjun 20 välityksellä tai ii) modifioitujen oligonukleotidien synteesiin sopivan furaanirenkaan tai Γ ·.. pyraanirenkaan tai j onkin modifioidun tiiraani- tai pyraanirenkaan välityksellä.
• · • · • · · * 9 L:.: Kelatoiva aine voidaan lisätä oligonukleotideihin oligonukleotidisyntetisaattorin avulla.
• · · Käyttökelpoinen menetelmä on esitetty US-patentissa 6.949.639 ja EP-patentissa • · : *·· 25 1 308 452. Patenttijulkaisuissa on kuvattu menetelmä liittää haluttu määrä ··· *... * konj ugaattiryhmiä oligonukleotidin rakenteeseen ketj un kokoamisen aikana.
Synteesistrategian avainreaktio nukleosidisten ja asyklonukleosidisten oligonukleotidien • · · • · · ’·* * rakennusyksiköiden tuottamiseksi on Mitsunobun alkylaatio, joka mahdollistaa erilaisten ··· • · '•ym kelatoivien aineiden lisäämisen asyklonukleosidiin tai nukleosidiin ja lopulta *.:. ’ 30 oligonukleotidirakenteeseen. Kelatoivat aineet lisätään ketjun kokoamisen aikana.
·** *... · Muunnos lantanidikelaatiksi tapahtuu synteesin j älkeen suoj aryhmien poiston yhteydessä.
• · · • · · • · ·
Yhden sovellutusmuodon mukaan on Z2 jonkin tyrniini-, urasiili-, adeniini- tai sytosiini emäksen radikaali ja emäs liitetään happiatomiin i) suojatulla hydroksimetyyliryhmällä 16 substituoidun hiilivetyketjun välityksellä tai ii) 4-asemassaan suojatun hydroksimetyyli-ryhmän ja mahdollisesti lisäksi hydroksyylin, suojatun hydroksyylin tai modifioidun hydroksyylin 2-asemassaan omaavan furaanirenkaan välityksellä.
5 Yhden sovellutusmuodon mukaisesti reaktiivinen ryhmä -Z2-0-P(NR6R7)-0-R5 on valittu joukosta, joka koostuu ryhmistä o o -nV13
, DMTrtX I DMTrO. I
r< Vn V°^J
DMTrO O Ny J \_/ (,-Pr)2N'^o^CN ? ? (/-Pr)2N'P'O/V/CN (ι-Ργ)2Ν'Ρ'Ό^/ ^na. ογΝγο 0ΐτ" γ o1V r-/N^CH3 DMTrO Ο DMTrO^b DMTrtTp DMTr° ?
(/-Pr)2N'P^0^'CN (/-Pr)2N'P''0^x^CN (,-Pr)2N'%^^CN N
10 jossa - on L-linkkerin asema ja DMTr on dimetoksitrityyli.
• · • · · • · • · • ” Yhden sovellutusmuodon mukaan kelatoiva aine on valittu tätä käyttöä varten jostakin alla • · · • · · ”1 esille tuoduista spesifisistä rakenteista • · • · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · 4 4 4 44··· • · ·· • · 4 4 • · · 17 Ä A ,&R.
A ΑΆ-, A·0
«-LY"a α-ΝΊ r'N'l /S Λ M HN'L-A
t ί n r ί n πι < > L Λ
* X. 1. 3? 7! a? Ri^y^p, aj a? R..>»N'Jv^li_jN
Χχ n?Ä β. ex X X G' R-^Är, <f~)Z 2ÖAZ Γ ^ Γ ^ <Χ\Ζ R2\y,-Ri A R2^-ri R” R- R" R·· R2\Ö£ri
rfX L fX 2<P)Z (f) Z
JL An A JL g^\ X i R Ar1 a RX^r1 γνί γνί AA /ΧΆ
1ί 1ί Ή·1Κ Ν ΐΠ Γ A
3 3 3 3 1 R- ,Ν^ R- Ο ο Ο ο Ν |Ί \ * 1 1 1 JL iG;^ R” ro^ N) ro N. R2Xlr_Xp1
A A AA
r&r, A- %A A- A; A
:1· Π < > f | ( ) f] f]
; X ; il g, VTlA
’:::1 R" ^ rAr1 r” r2Ari • · • · • · · • · • · * "1 A-L-GV^ °χ\ O r^£r, kXR, :’:1: Γ n" "n ' "N l
• 1 N N A-L^N N
:"·: ΓΊ f Ί T Ί ΓΊ *:1 TT τ τ ^ ^ ^ ^ • · · • · · • · • · · • · • · *·1 5 ····· • · · · • · • · ’ 1 1 joissa kaavoissa R’ ’ on karboksyylihapon alkyyliesteri tai allyyliesteri ja R’ ” on alkyyliryhmä ja joissa R1, R2, L ja G’ ovat kuten määritelty aiemmin ja A on -Z2-0-P(NR6R7)-0-R5 kuten määritelty yllä.
18
Eräässä erityisessä sovellutusmuodossa kelatoiva aine on valittu seuraavista spesifisistä rakenteista R2$£r1 r&r, g^\ Xl g- rii
ÄRVtL-AR" ^R1 r»V
Λ ^ λ ΥΛ hn'l-a r.A^L5S κ.Λ^ϊ_ϊ^ r-A^r1 A-L-Gk^ G' -^R. R2^£R1 -%r>[^r"
1-1 I R ^ N |_|A
f: -¾¾ • · · 5 • · · • · [···1 joissa kaavoissa R” on alkyyliesteri tai allyyliesteri tai karboksyylihappo ja joissa R1, R2, • · i il 2 6 7 5 · _ L ja G’ ovat kuten määritelty aiemmin ja A on -Z -0-P(NR R )-0-R kuten määritelty yllä.
• · • · • · · . . Yhteen ainoaan leimamolekyyliin kytkettyjen oligonukleotidikonjugaattien • · · *·1·1 2 ... 10 valmistamiseksi Z voidaan jättää pois rakenteesta.
• · m · *·’·’ Biomolekyylit • · • · Tämän keksinnön mukaisen kelatoivan aineen tai kelaatin kanssa konjugoitu biomolekyyli '...' 15 on oligopeptidi, oligonukleotidi, DNA, RNA, modifioitu oligo- tai polynukleotidi, kuten fosforimonotionaatti, fosforiditioaatti, fosforiamidaatti ja/tai sokerin tai emäksen osalta 19 modifioitu oligo- tai polynukleotidi, proteiini, oligosakkaridi, polysakkaridi, fosfolipidi, PNA, LNA, vasta-aine, steroidi, hapteeni, lääke, reseptoriin sitoutuva ligandi tai lektiini.
Kiinteän kantajan konjugaatit 5 Tämän keksinnön mukaiset kelaatit, kelatoivat aineet ja biomolekyylit voidaan konjugoida kiinteälle kantajalle. Kiinteä kantaja voi olla partikkeli, kuten nanopartikkeli tai mikropartikkeli, lasilevy, levy tai kiinteän faasin oligonukleotidi- tai oligopeptidisynteesiin sopiva hartsi.
10
Siinä tapauksessa, että kelaatilla tai kelatoivalla aineella on polymerisoiva ryhmä reaktiivisena ryhmänä, kelaatti tai kelatoiva aine voidaan lisätä kiinteälle kantajalle, esimerkiksi partikkeliin, samanaikaisesti partikkelien valmistuksen kanssa [Org. Biomol. Chem., 2006, 4, 1383]. Kun johdannaisten valmistukseen käytetään kupari(I):n 15 katalysomaa Huisgen-Sharpless-reaktiota, kytketään kelaatti atsidiryhmään ja kiinteästä kantajasta tehdään johdannaiset, joissa on terminaaliset alkyynit, tai päinvastoin.
Kiinteän kantajan kanssa joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti konjugoitu biomolekyyli on leimattu oligopeptidi, joka on saatu kiinteän faasin synteesillä, lisäämällä kelatoiva aine • · ** 20 oligopeptidin rakenteeseen oligopeptidisyntetisaattorilla, mitä seuraa suojaryhmien poisto • · • # ja mahdollisesti lisäksi metalli-ionin lisääminen. Vaihtoehtoisesti kiinteän kantajan kanssa • · · • ♦ · *** joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti konjugoitu biomolekyyli on leimattu • · • · .*** oligonukleotidi, joka on saatu kiinteä faasin synteesillä, lisäämällä kelatoiva aine • · • · · oligonukleotidin rakenteeseen oligonukleotidisyntetisaattorilla, mitä seuraa suojaryhmien • · 25 poistoja mahdollisesti lisäksi myös metalli-ionin lisääminen. Vaihtoehtoisesti kiinteän kantajan kanssa joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti konjugoitu biomolekyyli on • · · • « .···. DNA, RNA, oligopeptidi, oligonukleotidi, polypeptidi, polynukleotidi tai proteiini ·»« .·. leimattuna tämän keksinnön mukaisella kelaatilla.
• · · • · » • · • ♦ 30 Kuvio 1 esittää 6,6,,6”-[(oktahydro-lH-l,4,7-triatsoniini-l,4,7- «···» triyyli)tris(metyleeni)]tris[4-(4-karboksi-3,5-dimetyylifuran-2-yyli)pyridiini-2- • · *···* karboksyylihapon] europium-kelaatin (14c) viritys-ja emissiospektriä.
Keksintöä havainnollistetaan seuraavilla ei-rajoittavilla esimerkeillä.
20
ESIMERKIT
Keksintöä valaistaan edelleen seuraavilla esimerkeillä. Kokeellisessa osassa käytetyt 5 rakenteet ja synteesireitit on kuvattu kaavioissa 1 - 6. Kaavio 1 havainnollistavat kromoforien 6a - c ja 11 synteesiä. Kokeelliset yksityiskohdat on annettu esimerkeissä 1 - 17. Kaavio 2 havainnollistaa myös etyyli-6-bromimetyyli-4-(4’-metyyli-5’-etoksi-karbonyylitien-2’-yyli)pyridiini-2-karboksylaatin valmistusta alkaen kaupallisesti saatavilla olevasta 3-metyylitiofeeni-2-karboksyylihaposta. Kaaviot 3-5 havainnollistavat 10 kelaattien 14 ja 22 - 24 synteesiä. Kokeelliset yksityiskohdat on annettu esimerkeissä 18 - 37. Yhdisteet 12b sekä 14b eivät täytä patenttivaatimuksissa esitettyjä tunnusmerkistöjä.
Kokeelliset menettelytavat 15
Adsorptio-pylväskromatografia suoritettiin pylväässä, joka oli täytetty silikageelillä 60 (Merck). NMR-spektrit määritettiin joko Bruckerin 250- tai Jeolin LA-600-spektrometreillä toimien 250 ja vastaavasti 650 MHz:llä 'H:n osalta. Me4Si:tä käytettiin sisäisenä standardina. Kytkeytymisvakiot on annettu yksikköinä Hz. Elektrosumutus- • · • · | ’* 20 massaspektrit määritettiin Applied Biosystemsin Mariner ESI-TOF-laitteella. HPLC- * *' puhdistukset suoritettiin käyttämällä Shimazun LC 10 AT-laitetta varustettuna • · · *;* diodirividetektorilla, fraktionkeräimellä ja käänteisfaasikolonnilla (LiChrocart 125-3 • · • · .*** Purospher RP-18e 5 pm). Liikkuva faasi: (puskuri A): 0,02 M trietyyliammoniumasetaatti • · *... (pH 7,0); (puskuri B): A 50 % (til./til.) asetonitriilissä. Gradientti: 0 - 1 min 95 % A, 1 - 31 • · • · 25 min 95 % A - 100 % B. Virtausnopeus oli 0,6 ml min"1. Kaikki kuivat liuottimet olivat
Merckiltä ja niitä käytettiin sellaisenaan. Fluoresenssispektrit määritettiin PerkinElmer LS- • · · • m .···. 5 5-laitteella.
• · • · · • · • · · • · · *.! Esimerkki 1 • · • · *1* 30 Dietyyli-4-jodipyridiini-2,6-dikarboksylaatin (1) synteesi «IM* • · *···’ Seosta, jossa oli 4-bromipyridiini-2,6-dikarboksylaattia (8,36 g, 27,7 mmol), 57 % (paino/paino) jodivetyhapon vesiliuosta (31,05 g, 138,4 mmol) ja EtOH:a (67 ml), sekoitettiin 50 °C:ssa 1 tunnin ajan ja neutraloitiin kylläisellä NaHC03-liuoksella. Tuote 21 uutettiin vesifaasista CH2Cl2:lla (2 x 300 ml). Yhdistetyt orgaaniset fraktiot kuivattiin Na2S04:llä ja haihdutettiin kuiviin. Saanto oli 5,24 g (54 %).
ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. CnHi3IN04+:lle 349,99, havaittu 349,99.
'H NMR (600 MHz, CDCI3): δ 8,63 (s, 2H); 4,50 (q, J = 7,2 Hz, 4H); 1,46 (t, J = 7,2 Hz, 5 6H).
Esimerkki 2
Etyyli-6-hydroksimetyyli-4-jodipyridiini-2-karboksylaatin (2) synteesi 10 Yhdiste 1 (5,24 g, 15,0 mmol) liuotettiin EtOH:iin (270 ml) 40 °C:ssa. Lisättiin varovaisesti NaBH4 (0,57 g, 15,0 mmol) ja seosta sekoitettiin 40 min ajan. Reaktio pysäytettiin säätämällä pH 3:ksi 28 % (paino/paino) jodivetyhapon vesiliuoksella. Seos neutraloitiin kylläisellä NaHCOa-liuoksella ja haihdutettiin kuiviin. Jäännös suspensoitiin veteen (150 ml) ja tuote uutettiin vesifaasista 10 % EtOH/CH2Cl2-liuoksella (3 x 150 ml).
15 Yhdistetyt orgaaniset fraktiot kuivattiin Na2S04:M ja haihdutettiin kuiviin. Puhdistus silikageelillä (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti 2:5) antoi 2,89 g (63 %) otsikon yhdistettä.
ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C9H,,IN03+:lle 307,98, havaittu 307,98.
’H NMR (600 MHz, CDC13): δ 8,37 (s, 1H); 7,95 (s, 1H); 4,83 (d,J= 3,0 Hz, 2H); 4,47 (g, ’* 20 J= 7,2 Hz, 2H); 3,29 (s, 1H); 1,44 (f, J= 7,2 Hz, 3H).
• · • · · • · · • · · *” Esimerkki 3 • · • · .1“ Etyyli-6-(tetrahydropyran-2-yylioksimetyyli)-4-jodipyridiini-2-karboksylaatin (3) synteesi • · · « · · • · • · 25 Seosta, jossa oli 2 (2,89 g, 9,4 mmol), 3,4-dihydro-27/-pyraania (1,19 g, 14,1 mmol), pyridiini-p-tolueenisulfonaattia (0,236 g, 0,94 mmol) ja CH2CI2 (50 ml), sekoitettiin yön • ♦ · .···. yli huoneenlämmössä. Liuotin haihdutettiin ja tuote puhdistettiin silikageelillä • ·♦ (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti 2:5), jolloin saatiin 3,18 g (86 %) otsikon « · · • · · *.* yhdistettä.
• · T* 30 ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. Ci4H,9IN04+:lle 392,04, havaittu 392,04.
‘H NMR (600 MHz, CDC13): δ 8,36 (d, J = 1,5 Hz, 1H); 8,08 (d, J = 1,5 Hz, 1H); 4,96 (d, J = 14,3 Hz, 1H); 4,77 (t, J = 3,6 Hz, 1H); 4,70 (d, J = 14,8 Hz, 1H); 4,47 (q, J = 7,2 Hz, 2H); 3,91 - 3,84 (m, 1H); 3,59 - 3,54 (m, 1H); 1,94 - 1,86 (m, 1H); 1,84 - 1,78 (m, 1H); 1,77-1,71 (m, 1H); 1,66 - 1,54 (m, 3H); 1,43 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
Esimerkki 4 22
Etyyli“6-(tetrahydropyran-2-yylioksimetyyli)-4-(4,-metoksikarbonyyli-5’-metyylifuran-2’-yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (4a) synteesi 5
Seoksesta, jossa oli 3 (220 mg, 0,56 mmol), metyyli-2-metyyli-3-furaanikarboksylaattia (315 mg, 2,25 mmol), KO Ac (110 mg, 1,12 mmol), tetrabutyyliammoniumjodidia (208 mg, 0,56 mmol), Pd(OAc)2 (6,3 mg, 0,028 mmol), tri-2-furyylifosfiinia (13,0 mg, 0,056 mmol) ja kuivaa DMF:ää (3,8 ml), ilma poistettiin argonilla ja sitä sekoitettiin 24 tunnin 10 ajan 120 °C:ssa. Suodatuksen ja haihduttamisen jälkeen tuote puhdistettiin silikageelillä (5 % EtOH/CH2Cl2 + 1 % trietyyliamiinia) Jolloin saatiin 150 mg (66 %) otsikon yhdistettä. ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C2iH26N07+:lle 404,17, havaittu 404,17.
Esimerkki 5 15 Etyyli-6-(tetrahydropyran-2-yylioksimetyyli)-4-(4’-metoksikarbonyylifuran-2’- yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (4b) synteesi
Otsikon yhdiste syntetisoitiin kuten kuvattu 4a:n osalta mutta käyttämällä 3-furaanikarboksylaattia.
: 20 • · • · * Esimerkki 6 • · · • · * * * * Etyyli-6-(tetrahydropyran-2-yylioksimetyyli)-4-(4 ’ -metoksikarbonyyli-3 ’ ,5 ’ - • · • · dimetyylifuran-2’-yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (4c) synteesi • · • ·♦ • « » • · • · 25 Seos, jossa oli 3 (3,7 g, 9,5 mmol), etyyliasetoasetaattia (1,2 ml, 9,5 mmol) ja metyyliprop- #·#·# 2-ynyylikarbonaattia (1,1 g, 9,5 mmol), joka syntetisoitiin kuten tuotu esille julkaisussa J.
• · · .···. Org. Chem., 2005, 70, 6980, liuotettiin kuivaan DMF:ään (97 ml) ja siitä poistettiin ilma ··· .·. argonilla. Lisättiin Pd(PPh3)4 (0,56 g, 0,48 mmol) ja K2CO3 (2,6 g, 19 mmol) ja seosta • · ♦ • · · !.* sekoitettiin yön yli pimeässä 85 °C:ssa. Seos suodatettiin ja jäännös haihdutettiin kuiviin.
*Γ 30 Jäännös liuotettiin CF^C^een ja liuos pestiin kylläisellä NaHC03:lla. Puhdistus silikageelillä (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti 2:5) antoi 1,1 g (27 %) otsikon • · *···* yhdistettä.
ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C23H3oN07+:lle 432,20, havaittu 432,22.
23 *H NMR (600 MHz, CDC13): δ 8,23 (d, J = 1,2 Hz, 1H); 7,89 (s, 1H); 5,03 (d, J = 14,1 Hz, 1H); 4,82 (m, 1H); 4,79 (m, 1H); 4,51 (q, J = 7,1,2H); 4,35 (q, J = 7,1 Hz, 2H); 3,94 - 3,88 (m, 1H); 3,58 - 3,55 (m, 1H); 2,66 (s, 3H); 2,53 (s, 3H); 1,94 - 1,51 (m, 6H); 1,45 (t, J = 7,0 Hz, 3H); 1,40 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
5
Esimerkki 7
Etyyli-6-hydroksimetyyli-4-(4’ -metoksikarbonyyli-5 ’ -metyylifuran-2 ’ -yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (5a) synteesi 10 Seosta, jossa oli 4a (300 mg, 0,74 mmol), p-tolueenisulfonihappomonohydraattia (141 mg, 0,74 mmol) ja EtOH (30 ml), sekoitettiin 4 tunnin ajan huoneenlämmössä. Liuos haihdutettiin ja tuote puhdistettiin silikageelillä (5 % EtOH/CHzCL + 1 % trietyyliamiini) , jolloin saatiin 148 mg (63 %) otsikon yhdistettä.
ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. Ci6H,8N06+:lle 320,11, havaittu 320,13.
15
Esimerkki 8
Etyyli-6-hydroksimetyyli-4-(4’-metoksikarbonyyli-5,-furan-2’-yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (5b) synteesi • · • · ** 20 4b muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 7 esitettyä menetelmää.
• · • · · • · ·
Esimerkki 9 • · • · . * Etyyli-4-(4 ’ -etoksikarbonyyli-3' ,5 ’ -dimetyylifuran-2 ’ -yyli)-6-(hydroksimetyyli)pyridiini- • · • · · 2-karboksylaatin (5c) synteesi =...= 25 #·#·# Yhdiste 4c (1,11 g, 2,57 mmol) liuotettiin etanoliin (84 ml) ja lisättiinp- • · · • · .···. tolueenisulfonihapon monohydraattia (0,49 g, 2,57 mmol). Seosta sekoitettiin yön yli • ♦ ··· huoneenlämmössä. Puhdistus silikageelillä (petrolieetteri, kp. 40 - 60 • · · °C/etyyliasetaatti/trietyyliamiini 10:1:1 —» 5:2:1 —> 3:5:1) antoi 0,69 g (77 %) otsikon *!' 30 yhdistettä.
ESI-TOF-MS [M+Hf: lask. C18H22N06+:lle 348,14, havaittu 348,15.
« · · : ‘H NMR (600 MHz, CDC13): δ 8,23 (s, 1H); 7,69 (s, 1H); 4,89 (s, 2H); 4,49 (q, J = 7,2 Hz, 2H); 4,35 (q, J = 7,2 Hz, 2H); 2,65 (s, 3H); 2,53 (s, 3H); 1,46 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 1,39 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
24
Esimerkki 10
Etyyli-6-bromimetyyli-4-(4’-metoksikarbonyyli-5’-metyylifuran-2’-yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (6a) synteesi 5 Seosta, jossa oli fosforitribromidia (125 mg, 0,46 mmol) ja kuivaa DMF:a, sekoitettiin 0 °C:ssa kunnes muodostui valkoinen saostuma. Lisättiin liuos, jossa oli 5a (148 mg, 0,46 mmol) seoksessa, jossa oli DMF (6 ml) ja CH2CI2 (0,2 ml). Seosta sekoitettiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja neutraloitiin kylläisellä NaHCOa-liuoksella. Liuotin haihdutettiin ja tuote puhdistettiin silikageelillä (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti 2:5), jolloin 10 saatiin 113 mg (64 %) otsikon yhdistettä.
ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. 382,02, havaittu 382,02.
Esimerkki 11
Etyyli-6-bromimetyyli-4-(4’-metoksikarbonyylifuran-2,-yyli)pyridiini-2-karboksylaatin 15 (6b) synteesi 5b muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 10 esitettyä menetelmää. Esimerkki 12 • · • · •# ’* 20 Etyyli-6-(bromimetyyli)-4-(3’,5,-dimetyyli-4,-etoksikarbonyylifuran-2’-yyli)pyridiini-2- • · * , karboksylaatin (6c) synteesi • · · • · · • ·· 1»· • · • · .!'* 5c muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 10 esitettyä menetelmää.
• · ·
Puhdistus silikageelillä (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti 5:1) antoi 0,28 g (36 • · 25 %) otsikon yhdistettä.
ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. Ci8H2iBrN05+:lle 410,06, havaittu 410,06.
• · · .···. 'H NMR (600,13 MHz, CDC13): δ 8,24 (d, J = 1,2 Hz, 1H); 7,85 (d, J = 1,2 Hz, 1H); 4,68 • · Λ (s, 2H); 4,52 (q, J = 7,1 Hz, 2H); 4,35 (q, J = 7,1 Hz, 2H); 2,66 (s, 3H); 2,54 (s, 3H); 1,46 • · · (t, J = 7,0 Hz, 3H); 1,40 (t, J = 7,0 Hz, 3H).
• · 30 • · • · · • · • · • · · 25
Esimerkki 13
Ftyyli-6-(fe/V-butyylidifenyylisilyylioksimetyyli)-4-bromipyridiini-2-karboksylaatin (7) synteesi 5 Esikuivattu etyyli-6-hydroksimetyyli-4-bromipyridiini-2-karboksylaatti (1,4 g, 5,4 mmol) ja imidatsoli (1,1 g, 6,5 mmol) liuotettiin kuivaan DMF:ään (1,7 ml). TBDPS-kloridi (1,78 g, 6,5 mmol) lisättiin erissä ja reaktion annettiin edetä 3 tunnin ajan huoneenlämmössä. Reaktioseos laimennettiin Et20:lla (50 ml) ja pestiin vedellä ja kyll. NaHC03:lla. Orgaaninen faasi kuivattiin Na2S04:M ja haihdutettiin kuiviin. Puhdistus silikageelillä 10 (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti 5:2) antoi 2,5 g (92 %) otsikon yhdistettä. ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C25H29BrN03Si+:lle 520,09, havaittu 520,06.
*H NMR (600 MHz, CDC13): δ 8,14 (d, J < 1 Hz, 1H); 8,04 (d, J < 1 Hz, 1H); 7,66 (d, J = 9,4 Hz, 4H); 7,43 (m, 2H); 7,38 (t, J = 9,4 Hz, 4H); 4,93 (s, 2H); 4,44 (q, J = 7,1 Hz, 2H); 1,39 (t, J = 7,1 Hz, 3H); 1,15 (s, 9H).
15
Esimerkki 14
Etyyli-6-(ter/-butyylidifenyylisilyylioksimetyyli)-4-(5,-karboksitien-2’-yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (8) synteesi • · • · j# *’ 20 Yhdiste 7 (0,97 g, 1,94 mmol), 5-(dihydroksiboryyli)-2-tiofeenikarboksyylihappo (0,4 g, • · * . 2,33 mmol), CS2CO3 (0,82 g, 2,52 mmol) ja (PPh3)4Pd (45 mg, 3,88 pmol) liuotettiin • · · • · · )** kuivaan DMF:ään (7 ml) ja tästä poistettiin ilma argonilla. Reaktio kuumennettiin 95 • · • · °C:seen ja annettiin edetä yön yli. Reaktioseoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpöön ja • · · kaikki kiinteät materiaalit poistettiin suodattamalla. Haihtuvat aineet poistettiin • · 25 alipaineessa ja raakatuote puhdistettiin silikageelillä (10 % MeOH/CH2Cl2 + 0,1 % HOAc) ,·#·, jolloin saatiin 0,25 g (20 %) otsikon yhdistettä.
• · * .···. ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C3oH32N05SSi+:lle 546,18, havaittu 546,61.
• · • · • · · • · · M Esimerkki 15 • · • · ’!* 30 Etyyli-6-(reH-butyylidimetyylisilyylioksimetyyli)-4-(5,-etoksikarbonyyliitien-2’- yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (9) synteesi • · • · • · ·
Yhdiste 8 (200 mg, 0,37 mmol) liuotettiin dikloorimetaaniin (200 μΐ). Lisättiin DCC (83 mg, 0,44 mmol, esiliuotettuna 9,5 ml:aan THF) ja katalyyttinen määrä DMAP:ia ja seosta 26 sekoitettiin 5 min ajan huoneenlämmössä, jonka jälkeen lisättiin kuivaa EtOH (64 μΐ, 0,55 mmol). Reaktion annettiin edetä 3 tunnin ajan huoneenlämmössä, minkä jälkeen muodostunut DCU suodatettiin pois ja suodos haihdutettiin kuiviin. Puhdistus silikageelillä (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti 5:3) antoi 73 mg (35 %) otsikon yhdistettä.
5 ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C32H36BrN05SSi+:lle 574,21, havaittu 574,35.
Esimerkki 16
Etyyli-6-hydroksimetyy li-4-(5 ’ -etoksikarbonyylitien-2 ’ -yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (10) synteesi 10
Yhdiste 9 (70 mg, 0,12 mmol) liuotettiin kuivaan THF:ään (2 ml). Lisättiin TBAF (64 mg, 0,24 mmol) ja seosta sekoitettiin 5 tunnin ajan huoneenlämmössä. Seos haihdutettiin kuiviin ja puhdistettiin silikageelillä (5 % MeOH/CHhCL) Jolloin saatiin 25 mg (61 %) otsikon yhdistettä.
15 ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. Ci6H18N05S+:lle 336,09, havaittu 336,12.
Esimerkki 17
Etyyli-6-bromimetyyli-4-(5 ’ -etoksikarbonyylitien-2 ’ -yyli)pyridiini-2-karboksylaatin (11) synteesi Γ·“ 20 • · • · * . Yhdiste 10 muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 10 esitettyä • · · II! menetelmää. Puhdistus silikageelillä (5 % MeOH/CELCL) antoi 20 mg (67 %) otsikon • · .1*’ yhdistettä.
• · *... ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. Ci6Hi7BrN04S+:lle 398,01, havaittu 398,03.
:-! 25
Esimerkki 18 • · . · · ·. 1,4,7-tris {[6 ’ -etoksikarbonyyli-4 ’ -(4 ” -metoksikarbonyyli-5 ’ ’ -metyylifuran-2 ’ ’ - • · · yyli)pyridin-2,-yyli]metyyli}-l,4,7-triatsasyklononaanin (12a) synteesi • · • · · *·* 30 Seosta, jossa oli 6a (30 mg, 0,078 mmol), 1,4,7-triatsasyklononaania (3,4 mg, 0,026 mmol), K2CO3 (18,1 mg, 0,13 mmol), MeCN (1,2 ml) ja CH2CI2 (0,2 ml) sekoitettiin yön • · *·* yli huoneenlämmössä. Liuottimet haihdutettiin ja tuote puhdistettiin preparatiivisella TLC:llä (10 % EtOH/CELC^ + 1 % TEA), jolloin saatiin 24 mg (89 %) otsikon yhdistettä. ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C54H61N60i5+:lle 1033,42, havaittu 1033,42.
27
Esimerkki 19 1.4.7- tris {[6 ’ -etoksikarbonyyli-4 ’ -(4 ” -metoksikarbonyylifuran-2 ’ ’ -yyli)pyridin-2 ’ -yyli]metyyli}-l,4,7-triatsasyklononaanin (12b) synteesi 5 6b muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 18 esitettyä menetelmää.
Esimerkki 20 1.4.7- tris {[6 ’ -metoksikarbonyyli-4 ’ -(4 ” -etoksikarbonyyli-3 ” ,5 ” -dimetyylifuran-2 ’ ’ -yyli)pyridin-2,-yyli]metyyli}-l,4,7-triatsasyklononaanin (12c) synteesi 10 6c muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 18 esitettyä menetelmää. Tuote puhdistettiin preparatiivisella TLC:llä (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti/trietyyliamiini 3:5:1) Jolloin saatiin 30 mg (47 %) otsikon yhdistettä. ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C57H67N60,5+:lle 1075,47, havaittu 1075,50.
15 'H NMR (600 MHz, CDCI3): δ 8,21 (s, 3H); 7,99 (s, 3H); 4,33 (q, J = 7,1 Hz, 6H); 4,03 - 3,97 (m, 6H); 4,00 (s, 9H); 3,02 (bs, 8H); 2,94 (bs, 4H); 2,57 (s, 3H); 2,55 (s, 6H); 2,48 (s, 3H), 2,46 (s, 6H), 1,38 (t, J = 7,0 Hz, 9H).
Esimerkki 21 • · • · *. 20 6,6’ ,6”-[(oktahydro-\H-1,4,7-triatsoniini-1,4,7-triyyli)tris(metyleeni)tris[4-(4-karboksi-5- • · • · · * . metyylifuran-2-yyli)]pyridiini-2-karboksyylihapon (13a) synteesi • · · • · · • · · • · · • · • · 12a liuotettiin 0,5 M KOH/MeOH:iin (1,6 ml) ja lisättiin 0,2 ml vettä. Seosta sekoitettiin • · · # ·. · # yön yli j a haihdutettiin kuiviin.
• · • · · 25
Esimerkki 22 • · · • · . · 1 ·. 6,6’ ,6 ’ ’ -[(oktahydro-1 H-1,47-triatsoniini-1,4,7-triyyli)tris(metyleeni)tris[4-(4- • · · karboksifuran-2-yyli)]pyridiini-2-karboksyylihapon (13b) synteesi • · · • · · • · ··· • · • · ·1 30 12b muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 21 esitettyä menetelmää.
• · • · · • · • · • · · 28
Esimerkki 23 6,6’ ,6” -[(oktahydro-\H-1,47-triatsoniini-l ,4,7-triyy]i)tris(metyleeni)tris[4-(4-karboksi- 3.5- dimetyylifuran-2-yyli)]pyridiini-2-karboksyylihapon (13c) synteesi 5 12c muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 21 esitettyä menetelmää.
Esimerkki 24 6,6’,6”-[(oktahydro-l//-l,47-triatsoniini-l ,4,7-triyyli)tris(metyleeni)tris[4-(4-karboksi-5-metyylifuran-2-yyli)pyridiini-2-karboksyylihappo] europium(III):n (14a) synteesi 10 13a (23 pmol) liuotettiin veteen (2 ml) ja pH säädettiin 9:ksi 6 M HCl-liuoksella. Lisättiin 0,2 M europium(III)sitraattia ja seosta sekoitettiin huoneenlämmössä 72 tunnin ajan. Tuote saostettiin säätämällä pH 4:ksi 1 M HCl-liuoksella.
ESI-TOF-MS [M+H]': lask. C45H38EuN60,5':lle 1055,15 havaittu 1055,12.
15
Esimerkki 25 6,6’,6”-[(oktahydro-l//-l,4,7-triatsoniini-l,4,7-triyyli)tris(metyleeni)tris[4-(4-karboksimetyylifuran-2-yyli)pyridiini-2-karboksyylihappo] europium(III):n (14b) synteesi ·· • · •# 20 13b muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 24 esitettyä menetelmää.
• · • · · • · ·
Esimerkki 26 • · • · 6,6 ’ ,6 ” - [(oktahydro-1 H-1,4,7-triatsoniini-1,4,7-triyyli)tris(metyleeni)tris [4-(4-karboksi- • · · 3.5- dimetyylifuran-2-yyli)pyridiini-2-karboksyylihappo] europium(III):n (14c) synteesi • · • · · 25 .·,·. 13c muunnettiin otsikon yhdisteeksi käyttämällä esimerkissä 24 esitettyä menetelmää.
• · · .··. ESI-TOF-MS [M+Na]+: lask. C48H45EuN6NaO|5+:lle 1121,20 havaittu 1121,20.
• · • · · 1 · • · · • · · I.I Esimerkki 27 !'"! 30
Metyyli-2-(metoksikarbonyyli)-8-(trityylioksi)oktanoaatin (15) synteesi • · • · • · ·
Natriummetoksidi (1,42 g, 26,2 mmol) liuotettiin kuivaan MeOH:iin (90 ml). Lisättiin dimetyylimalonaattia (3,0 ml, 26,2 mmol) ja seosta sekoitettiin huoneenlämmössä yhden 29 tunnin ajan. Lisättiin (6-bromiheksyylioksi)trifenyylimetaani (3,7 g, 8,7 mmol) ja seosta refluksoitiin yön yli. Seos jäähdytettiin huoneenlämpöön ja lisättiin 50 ml 10 % sitruunahappoa. Seosta sekoitettiin sitten huoneenlämmössä 5 min ajan. Tuote uutettiin CL^Cbdla (3 x 100 ml) ja haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin CL^C^reen ja 5 kuivattiin Na2S04:llä. Puhdistus silikageelillä (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti 10:1) antoi 2,3 g (56 %) otsikon yhdistettä.
ESI-TOF-MS [M+Na]+: lask. C3oH34Na05+:lle 497,23, havaittu 497,23.
'HNMR (250 MHz, CDC13): δ 7,46 - 7,42 (m, 6H); 7,33 - 7,19 (m, 9H); 3,73 (s, 6H); 3,34 (t, J = 7,6 Hz, 1H); 3,03 (t, J = 6,6 Hz, 2H); 1,88 (q, J = 7,2 Hz, 2H); 1,60 (kvintetti, 2H), 10 1,41 - 1,25 (m, 6H).
Esimerkki 28
Metyyli-8-hydroksi-2-(metoksikarbonyyli)oktanoaatin (16) synteesi 15 Jodi (1,0 g, 7,9 mmol) liuotettiin MeOHriin (100 ml). Lisättiin yhdiste 15 (4,5 g, 9,5 mmol) ja seosta sekoitettiin 50 °C:ssa yhden tunnin ajan. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin CH2Cl2:een ja pestiin 10 % Na2S03:lla (40 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin Na2S04:llä ja haihdutettiin kuiviin. Puhdistus silikageelillä (petrolieetteri, kp. 40 - 60 °C/etyyliasetaatti 10:1—>5:3) antoi 1,96 g (89 %) otsikon yhdistettä.
!. ** 20 ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. CnH2i05+:lle 233,14, havaittu 233,16.
• · • · · i * ·
Esimerkki 29 • · • · .!'* Metyyli-2-(metoksikarbonyyli)-8-(4-nitrofenoksi)oktanoaatin (17) synteesi • ♦♦ • · · • · • · 25 Yhdiste 16 (1,92 g, 8,3 mmol), 4-nitrofenoli (1,39 g, 10,0 mmol) ja trifenyylifosfiini (2,62 g, 10,0 mmol) liuotettiin kuivaan THF:ään (100 ml) ja ilma poistettiin tästä argonilla. Di- • · · .··♦. isopropyyliatsodikarboksylaatti (2,0 ml, 10,0 mmol) lisättiin kymmenessä erässä argonin • · ··· alla ja seosta sekoitettiin 3 päivän ajan huoneenlämmössä. Seos haihdutettiin kuiviin ja • · · ♦ ♦ · 1/. puhdistettiin silikageelillä (CH2CI2) , jolloin saatiin 2,6 g (89 %) otsikon yhdistettä.
• ♦ **:·* 30 ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. Ci7H24N07+:lle 354,15, havaittu 354,22.
'H NMR (600 MHz, CDC13): δ 8,20 (d, 2H); 6,94 (d, 2H); 4,04 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 3,74 (s, *···: 6H); 3,37 (t, J = 7,6 Hz, 1H); 1,92 (q, J = 7,6 Hz, 2H); 1,81 (kvintetti, J = 7,0, 2H); 1,48 (kvintetti, 2H); 1,43 - 1,33 (m, 4H).
Esimerkki 30 30 2-[6-(4-aminofenoksi)heksyyli]propaani-l,3-diolin (18) synteesi
Yhdiste 17 (1,19 g, 3,4 mmol) liuotettiin kuivaan THF:ään (50 ml). Lisättiin L1BH4 (0,44 5 g, 20,2 mmol) ja seosta refluksoitiin yön yli. Seoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpöön ja lisättiin MeOH (10 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 30 min huoneenlämmössä. Seos haihdutettiin kuiviin. Lisättiin kylläistä NaHCCLia ja seosta refluksoitiin yhden tunnin ajan. Seoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpöön ja suodatettiin sitten. Saostuma pestiin vedellä ja puhdistettiin silikageelillä (10 % MeOH/CH2Cl2) Jolloin saatiin 0,60 g (67 %) 10 otsikon yhdistettä.
ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. CLiH26NOj:lle 268,19, havaittu 268,20.
'H NMR (600 MHz, CDCI3): δ 6,63 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 6,49 (d, J = 8,7 Hz, 2H); 4,56 (s, 2H); 3,79 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 3,35 (m, 4H); 1,74 (m, 4H); 1,63 (kvintetti, 2H); 1,48 (kvintetti, 2H); 1,37 (kvintetti, 2H), 1,37 (kvintetti, 2H); 1,31 - 1,22 (m, 6H).
15
Esimerkki 31 2- { 6-[4-(ter/-butoksikarbonyyliamino)fenoksi]heksyyli} propaani-1,3-diolin (19) synteesi Yhdiste 18 (0,55 g, 2,1 mmol) liuotettiin kuivaan DMF:ään. Lisättiin trietyyliamiinia (0,36 • · L 20 ml, 2,5 mmol) ja Boc-anhydridiä (0,53 ml, 2,3 mmol) ja seosta sekoitettiin 50 °C:ssa yhden • · I ·« • „ tunnin ajan. Seos haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 30 % MeOHmn CH2Cl2:ssa (50 • · · • · · *1* ml) ja pestiin kylläisellä NaHC03:n vesiliuoksella. Orgaaninen faasi erotettiin ja vesifaasi • · • · uutettiin CHaCLilla (2 x 50 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin Na2S04:llä. Puhdistus tehtiin • m • ·· silikageelillä (30 % MeOH/CH2Cl2) , jolloin saatiin 0,23 g (30 %) otsikon yhdistettä.
25 'H NMR (600 MHz, CDC13): δ 7,24 (d, 2H); 6,82 (d, 2H); 3,91 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 3,81 (d, 2H); 3,65 (t, 2H); 1,78 - 1,72 (m, 3H); 1,51 (s, 9H); 1,45 (kvintetti, 2H), 1,35 (kvintetti, • ♦ Φ .···. 4H); 1,25- 1,24 (m, 2H).
• ♦ ·«· • · • · · !,! Esimerkki 32 • · • · *Γ 30 l,4,7-tris(2-nitrobentseenisulfonyyli)-9-{6-[4-(tert- butoksikarbonyyliamino)fenoksi]heksyyli}-l,4,7-triatsasyklodekaanin (20) synteesi • · • · ···
Yhdiste 19 (0,21 mg, 0,57 mmol) liuotettiin kuivaan THF:ään (8 ml). Lisättiin trifenyylifosfiini ja per(nosyloitu) dietyleenitriamiini (0,38 g, 0,57 mol) ja seoksesta 31 poistettiin ilma argonilla. Lisättiin di-isopropyyliatsodikarboksylaatti (0,34 ml, 1,71 mmol) kymmenessä erässä argonin alla. Seosta sekoitettiin yön yli huoneenlämmössä.
Seos haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin CH2Cl2:een ja se pestiin kylläisellä NaHCC>3:n vesiliuoksella. Orgaaninen faasi kuivattiin Na2S04:llä ja puhdistettiin 5 silikageelillä (CH2CI2), jolloin saatiin 0,35 g (63 %) otsikon yhdistettä.
ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C42H52N7015S3+:lle 990,27, havaittu 990,27.
Esimerkki 33 1.4.7- tris{ [6’-(etoksikarbonyyli)-4’-(4”-etoksikarbonyyli-3 ”,5”-dimetyylifuran-2”- 10 yyli)pyridin-2 ’ -yylijmetyyli} -9- {6- [4-(ter/-butoksikarbonyyliamino)fenoksi]heksyyli} - 1.4.7- triatsasyklodekaanin (21) synteesi
Yhdiste 20 (0,12 g, 0,12 mmol) liuotettiin kuivaan DMF:ään. Lisättiin CS2CO3 (0,27 g, 0,84 mmol) ja seoksesta poistettiin ilma argonilla. Seokseen lisättiin 3-(3-15 merkaptofenyyli)propanamidimetyylipolystyreeniä (0,24 g, hartsin kapasiteetti 1,54 mmol/g) ja seosta sekoitettiin 3,5 tunnin ajan huoneenlämmössä. Lisättiin 0,24 g lisäerä 3-(3-merkaptofenyyli)propanamidimetyylipolystyreeniä ja seosta sekoitettiin yön yli huoneenlämmössä. Seos suodatettiin ja jäännös haihdutettiin kuiviin. Kuivaan DMF:ään (2 ml) lisättiin 3-(3-merkaptofenyyli)propanamidimetyylipolystyreeniä (0,24 g) ja CS2CO3 « · ** 20 (0,14 g, 0,43 mmol). Seoksesta poistettiin ilma argonilla. Nosyyli-suojattu yhdiste • ♦ • # liuotettiin kuivaan DM Ikään (2 ml) ja liuos lisättiin 3-(3- • · · • · · *** merkaptofenyyli)propanamidimetyylipolystyreenin seokseen. Seosta sekoitettiin • · • · huoneenlämmössä 3 päivän ajan. Seos suodatettiin ja suodos haihdutettiin kuiviin. Jäännös • · • · · *... liuotettiin kuivaan DMF:ään (4 ml). Lisättiin CS2CO3 (0,16 g, 0,49 mmol) ja 6c (R4 = Et) • · 25 (0,15 g, 0,36 mmol) ja seosta sekoitettiin yön yli huoneenlämmössä. Reaktioseos SS, haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin CHhCEieen ja pestiin vedellä. Orgaaninen kerros • · · .···. kuivattiin Na2S04:llä. Tuote puhdistettiin preparatiivisella TLCdlä (10 % EtOH/CH2Cl2), • · • t* jolloin saatiin 39 mg (23 %) otsikon yhdistettä.
• * · *:!:* ESI-TOF-MS [M+H]+: lask. C78HiooN70,8+ 1422,71, havaittu 1422,73.
• · **:** 30 • · • · · • · • · «· · 32
Esimerkki 34 6,6,,6”-{{9-[6-(4-aminofenoksi)heksyyli]dekahydro-l,47-triatsesiini-l,4,7-triyyli} tris(metyleeni)tris [4-(4-karboksi-3,5 -dimetyylifuran-2-yyli)pyridiini-2-karboksyylihappo] europium(III):n (22a) synteesi 5
Yhdiste 21 (7 mg, 4,9 μηιοί) liuotettiin etyyliasetaattiin (700 μΐ) ja lisättiin 37 % HC1 (300 μΐ). Seosta sekoitettiin huoneenlämmössä 2 tunnin ajan. Seos haihdutettiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 0,5 M KOH/MeOH:iin (1 ml). Lisättiin 10 M KOH vedessä (100 μΐ) ja liuosta sekoitettiin huoneenlämmössä 3 päivän ajan. Metanoli poistettiin reaktioseoksesta 10 alipaineessa ja pH säädettiin 8:ksi 1 M HCkllä. Lisättiin 0,2 M europium(III)-sitraatti (30 μΐ) ja seosta sekoitettiin yön yli huoneenlämmössä. Tuote puhdistettiin HPLCdlä ESI-TOF-MS [M-2H]2': lask. CeiHgiEuNyO^2' 650,67, havaittu 650,71.
Esimerkki 35 15 6,6\6’’-{{9-[6-(4-(4,6-dikloori-l,3,5-triatsinyyliamino)fenoksi]heksyyli}dekahydro-l,4,7-triatsesiini-l,4,7-triyyli}tris(metyleeni)tris[4-(4-karboksi-3,5-dimetyylifuran-2-yyli)pyridiini-2-karboksyylihappo] europium(III):n (22b) synteesi
Yhdiste 22 (2,5 mg, 1,7 μηιοί) liuotettiin 1 ml:aan 0,1 M CH3COONa:a(pH 6,5).
• · ** 20 Syanuurikloridi (0,4 mg, 2,1 μηιοί) liuotettiin asetoniin (1 ml) ja lisättiin 0,3 ml vettä.
• · • · · * . Liuokset yhdistettiin, pH säädettiin 6,5:ksi 0,1 M NaOH-liuoksella ja seosta sekoitettiin • · · • · · I** huoneenlämmössä 2 tunnin ajan. Tuote seostettiin säätämällä pH 4:ksi 1 M HCkllä.
• · • ·
Saostuma pestiin kahdesti asetonilla ja kuivattiin alipainekuivaimessa.
• · ESI-TOF-MS [M-2H]2': lask. CeÄiCbEuN^O^2' 724,14, havaittu 724,09.
25
Esimerkki 36 • · .···. 2-{4,7-bis{[4-(4-karboksi-3,5-dimetyylifuran-2-yyli)]-6-karboksipyridin-2-yylimetyyli}- • · · .*. l,4,7-triatsasyklononan-l-yylimetyyli}-4-[4-(4-aminobutyyli)aminokarbonyyli-3,5- ).* dimetyylifuran-2-yyli]pyridiini-2-karboksyylihappo europium(III):n 23 synteesi **:*’ 3o • · · · ·
Seosta, jossa oli yhdistettä 14c (5 μιηοΐ), 1,4-diaminobutaani (0,45 mg, 5 μηιοί), ED AC *···’ (1,1 mg, 5,5 μηιοί) ja A-hydroksisukkinimidiä (0,5 mg) 1,2 rnlrssa DMF/vesi (4:1), sekoitettiin yön yli huoneenlämmössä. Tuote puhdistettiin HPLCdlä.
ESI-TOF-MS [M+2H]2+: lask. 585,16, havaittu 585,17.
33
Esimerkki 37 2-{4,7-bis{[4-(4-karboksi-3,5-dimetyylifuran-2-yyli)]-6-karboksipyridin-2-yylimetyyli}- l,4,7-triatsasyklononan-l-yylimetyyli}-4-{4-[4-(4,6-dikloori-l,3,5-triatsinyyli)aminobutyyli]aminokarbonyyli-3,5-dimetyylifuran-2-yyli]pyridiini-2-5 karboksyylihappo europium(III):n 24 synteesi
Yhdiste 23 (4,5 mg, 3,9 pmol) liuotettiin 1 mkaan 0,1 M ChhCOONaia (pH 6,5). Syanuurikloridi (0,8 mg, 4,2 pmol) liuotettiin asetoniin (1 ml) ja lisättiin 0,3 ml vettä. Liuokset yhdistettiin, pH säädettiin 6,5:ksi 0,1 M NaOH-liuoksella ja seosta sekoitettiin 20 10 min ajan huoneenlämmössä. Tuote saostettiin säätämällä pH 3:ksi 1 M HCldlä. Saostuma pestiin kahdesti 2 ml :11a asetonia ja kuivattiin alipainekuivaimessa.
Esimerkki 38 PT66-antifosfotyrosiinin leimaus kelaatilla 24 15
Yhdisteen 24 vesiliuokseen (100 mM, NaHCCLm vesiliuoksessa pH 8,3) lisättiin vasta-aine (0,8 mg) ja pH säädettiin 9,3:ksi NallCOidla. Reaktion annettiin edetä yön yli pimeässä 4 °C:ssa. Leimattu vasta-aine puhdistettiin alustavasti Centricon 30-suppilolla (4500 rpm 30 min ajan käyttämällä 50 mM TSA:ta eluenttina (4 x 1 ml)) ja tämän jälkeen • · • · · L 20 pylväskromatografialla DNA-tasoisella Sephadex G50:llä (50 cm x 1 cm) käyttämällä 50 • · • · · ’ . mM TSA:ta eluenttina. Haluttua tuotetta sisältävät fraktiot (määritettynä • · · • · · !!! fluoresenssispektrometrialla) yhdistettiin ja suodatettiin 0,2 pm suotimen läpi.
• · • · · • · ... Esimerkki 39 • · • · * * * 25 Kinaasimääritys • * * • · · .·*·. Positiivista kontrollia (2 nM Eu-leimattua PT66 ja 10 mM fosforyloitua peptidiä: biotinyyli-8-aminokapryyli-Glu-Pro-Gln-Tyr(P03H2)-Glu-Glu-Ile-Pro-Ile-Tyr-Leu-OH; • · · !.! Bachem) ja negatiivista kontrollia (2 nM Eu-leimattua PT66 + 20 nM SA-Alexa647; 4,3 • · *·* 30 Alexa/SA) inkuboitiin 30 min ajan huoneenlämmössä. Mittaus suoritettiin Victor 3 ····· monileimalaskimella (PerkinElmer LAS) käyttämällä 50 ps viivettä/100 ps TR-ikkunaa ·” 665 nm:ssä ja 615 nm:ssä energiansiirtosignaalia ja vastaavasti europium-signaalia varten.
34
Energiansiirtosignaali 665 nm:ssä kelaatti/IgG__Keskim. Pos__Keskim. Neg__S/B_ 1,3 20108 700 28,7 2.0 __27951__974__28/7_ 2.6 __35871__1115__32,2_ 3.2 33960 1200 28,3
Eu-signaali 615 nm:ssä kelaatti/IgG__Keskim. Pos__Keskim. Neg__E_ "U 154487 208766 0/26 2.0 237086 311151 0,24 2.6 __273813__362397__0/24_ 3.2 291881 385378 0,24 • · • · • · · • · • · · • · · • · · • · · • · · • · • e • · · • · • · · • · · • · • · • · · • 1 · • · · • · • · • · · • · · · • · • · · · · « · • · 35
Br !
AHI (57% vesiliuos) NaBH4 l| I
E10H ‘ A X W X'AcOOR,
. ___ COOR4 R4OOC N COOR4 OH
1 2 R1 COOMe I MeOOCyRi )=/ 3,4-dihydro-2H-pyraam pyridnni- p-tolueeni- sulfonaatti /^N^COOR4 nj/rtA ^ f
_^ I Pd(OAc)2 II I
ch2ci2 ? K0Ac f" COOR4 tri-2-furyylifosfiim q O0 3 r A«-> 00 0
-AA0^ I V
\ /COOEt °0^ ίΓι |/^N^nOOOR4 ί: σ * • · · • · · • · ·
Rt COOR3 Rl COOR3
. 4a.c -TSQH. °γ R2 PBX a: R4= R3 = CH3 R2 = H
EtOH /L DMF A, b:R1=R2 = H;R3 = CH3 fl Ai || c: R-j= R2 = CH3; R3 = Et XL XL aX R4-· CH3 tai Et |^N COOR4 f N COOR4 OH Br ·...· 5a-c 6a-c : V: KAAVIO 1 • m • · · • · • 9 • · · • · · · · • · « · · « « • · ··* 36 COOH HOOC_
Br Br Sy^j
TBDMS-CI li^l (HO)2B
^N^COOEt “ /-N^COOEt ' ^N^COOEt
OH OTBDMS 34 OTBDMS
f CS2CO3 g
EtOOC EtOOC EtOOC
S\^ Sy
DCC ΊΓ TBAF T PBrs JL
boh X X 1 x X X
f N COOEt i^N COOEt f N COOEt OTBDMS OH Br 9 10 11
EtOOC /
COOH COOEt , JjX
Ys m y< 3 . Y
Y/ EtOH Y/S Pd(OAc)2 KOAc 1 X^ tri-2-furyy lifosfiini | N COOEt
Bu4NI o DMF Λο
I**·· XX
• · • · • · ·
EtOOC _/ EtOOC /
*···1 sO
r. TsOH J PBr3 Y
:***: EtOH (ίη DMF rYY
* 1 1 JU I
[ n COOEt f'N^COOEt OH Br • · · • · · KAAVIO 2 • · • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • nti • · · · • · • · • · · 37 R3°°c r2
Ri—Λ JL ,COOR4
1 4 7-triatsasyklononaam U I
K2C03 __ R1 CH2CI2/MeCN \Γ P1 ^ y ft coor4 r3°oc\ r2 V-nV V Rz j r4ooc -00c R Rl 12a-c
W2 a Ri = R3=CH3,R2 = H
R —\ \\ ΓΟΟ' b! Ri1 2 3 R2 “ ” ^^3 1 ° li1V COOR4 c. Ri= R2= CH3; Rs = Et II N R4= CH3 taiEt T /Rl I I —\ P~Λ Eu-sitraatti KOH/MeOH Y^V^O^COO- -~ -°ocv r2 VnV UY r2 //Y -ooc
R,V
13a-c COO·
‘DOC a: Rl= CH3· R2 = H
OU \ ,R2 b-R1=R2 = H
// c: R-|= R2= CH3 R^-\ L· /COO- °·Vr T Rl rN Eu3" T^y^V^Y'COO' -°°cv r2 VnV ^ r2 /TY -ooc
·· R^ JL J
: 0 III
j·. VN 14a-c
• ·· I
• 000’ • · · • · · *·1 O KAAVIO 3 « · * · • ·· • · 1 • · • · • · · • · • · 1 • · · • 1 »·« • · • · ··1 • · • · · • · · • · ··1 • · • ·
«M
· 2 • · · • · • · 3 38
° O
V—OMe l2 y—OMe 4-nitrofenoli
TrO(CH2)6 ( -- HO(CH2)6 ( --
V-OMe MeOH V-OMe Ph3P, DIAD
15 O 16 O
O
n—λ y— OMe LiBH4 f/ / ®H
02N-/ \-0(CH2)6—( -- H2N~( _Vo(CH2)6-Y
VoMe 18 ^0H
17 cf 18
Ns
Ns-NH N HN-Ns
Boc20 r.—λ )—OH ^ ^—f - BocHN—(! V- 0(CH2)6—{ -►
' OH Ph3P, DIAD
19 1. 3-(3-merkaptofenyyli)-
Nsv /v. propanamidometyyli-
Λ—λ /—N ^ polystyreeni, Cs2C03, DMF
BocHN—v y—0(CH2)6—( N—Ns
\=/ V_N \ 2. 6c, Cs2C03, DMF
20 Ns ^ KAAVIO 4 • · • · · • · • · • · · • · · • · · • ·· ··· • · • · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · « • · • · · • · · • · • · · • · • · * · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • i»«t • · 1 · · • · • · • · · 39 COOEt
0 X
/ y—COOEt )=N 1. H+ \ 2 HO- /—M^y r-*-
BocHN—V V-0(CH2)6—( N-v 3- Eu-sitraatti '^EtOOC '—N > V^v 0-^/
Vm N_/—Of \ J ' ) / /OOOEt )=7 EtOOC ' \=( 21
jLyO
EtOOC
COO' \_ 22a: R = NH2 - y—COO' V=N pi syanuuri- / u\ kloridi \ λ“Ν \ Λ\ 22b: R = N x)—NH----
/7~\ /^N , / )=N
R-f ^ 0(CH2)6 ( Eu3+ N-v ci ^=7 ooc '—n A y-^ o^y
N 9—<C N
)=7 V-COCV
OOC 7 22a,b • · • ·· • · · • · · .1-. KAAVIO 4 j atk.
• · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • * « • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · MM· • · M« • « • · ·
OOC
40 \)1γ^00°·
LyN
EDAC, NHS L I-1 /
14C -1" 7n N
butaani-1,4-diamiim \ Eu + 7 //
°°c Vnv γ T I
OOC
Li 23 coo-
syanuuri- OOC
kloridi 7~~i| " "<0Jy^coo-
Cl
\l l_^-x 0-/ μ N^N
on,
'oocy, vnv y To H
_//T OOC
°Vr 24
/yN
coo- KAAVIO 5 • · • · • · · :. 5 • · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · • · # # · • · · • · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · · · • · · · • · • · • · · 41
Tiettyjen tämän keksinnön mukaisten kelaattien valoiysikaaliset ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Kelaattien valoiysikaaliset ominaisuudet määritettiin mittaamalla viritys- ja emissiospektrit ja fluoresenssin elinaika TS-puskurissa (50 mM tris, 150 mM NaCl, pH 7,75) LS-55-luminisenssispektrometrillä (PerkinElmer Instruments, Connecticut, USA).
5 Mittaukset tehtiin sopivilla konsentraatioilla aina fluoresenssin intensiteetin mukaan.
Taulukko 1. Syntetisoitujen kelaattien valoiysikaaliset ominaisuudet
Yhdiste Viritys Emissio maksimi / nm aallonpituus / nm ~ä) 328 6Ϊ8 14a ~~338 618 ~14b 330 6Ϊ7 ~14c 347~ 6Ϊ8 ~b) 316 6Ϊ6 ΤΠ 6Ϊ6 "24 ~ ~323 616 10 a) 6,6’,6”-[(oktahydro-\H-1,4,7-triatsoniini-1,4,7-triyyli)tris(metyleeni)]-tris[(furan-2-yyli)pyridiini-2-karboksyylihappo] europium(III), syntetisoitu kuten tuotu esille • · : 1· julkaisussa W02005/021538 • · : I' b) 2,2,,2”,2’”-{[4-(tien-2’-yyli)pyridiini-2,6-diyyli]bis(metyleeninitriili)}- • · · * · | · * tetrakis(Qtikkahappo) europium(III), syntetisoitu kuten tuotu esille artikkelissa • · ];*·’ 15 Latva et ai., J Luminescence, 1997, 35, 149.
• · *...’ c) 2,2’,2”,2” {[4-(fur-2’-yyli)pyridiini-2,6-diyyli]bis(metyleeninitriili)}- • · • · ’ * * teira£«(etikkahappo) europium(III), syntetisoitu kuten tuotu esille julkaisussa W02005/021538 • · · • · · 14h ei keksinnön mukainen malliyhdiste • · • · · 20 • · · * ” * On ymmärrettävä, että esillä olevan keksinnön menetelmät voidaan toteuttaa erilaisissa • · • · ** sovellutusmuodoissa, joista ainoastaan joitakin on tuotu tässä esille. Vaikka esimerkit on • ·· *.* ' esitetty pääasiassa furyylijohdannaisille, voidaan samoja synteesitapoja soveltaa yhtä hyvin t · • · · " vastaaville tienyyli-johdannaisille.
42
Vaikka tässä on esitetty ainoastaan europium(III) kelaattien synteesi, on selvää, että ammattilainen pystyy valmistamaan vastaavat samarium(III)-, terbium(III)- ja dysprosium(III)-kelaatit käyttämällä tässä esille tuotuja menetelmiä korvaamalla europium(III)suola halutulla lantanidi(III)-suolalla. Alan ammattilaiselle on selvää, että 5 muitakin sovellutusmuotoja on olemassa eivätkä ne poikkea tämän keksinnön hengestä. Siten esitetyt sovellutusmuodot ovat havainnollistavia eikä niitä pitäisi pitää rajoittavina.
t · • · • · · • · t · • ·· • · · • · · • · · • ·· • · • · • · · • · • · • · · • · · • · • · ·· · • 9 • 99 • 99 • 9 9 · 9 9 9 9 9 • 9· • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 99 9 9 9 9 99 9 • • · ·· · • · M· • · • · 99 9

Claims (20)

1. Kelaatti, j oka käsittää - lantanidi-ionin, Ln3+, 5. kromoforisen rakenneosan, - kelatoivan osan, joka käsittää ainakin kaksi karboksyylihappo- tai fosfonihappo-ryhmää tai näiden happojen esteriä, amidia tai suolaa kiinnittyneenä kromoforisen rakenneosan aromaattiseen yksikköön joko suoraan tai syklisen tai asyklisen N:n sisältävän hiilivetyketjun välityksellä, ja 10. reaktiivisen ryhmän A kytkettynä kromoforiseen rakenneosaan tai kelatoivaan osaan joko suoraan tai linkkerin L välityksellä reaktiivisen ryhmän A mahdollistaessa sitoutumisen biomolekyyliin tai kiinteällä faasilla olevaan funktionaaliseen ryhmään, tai ei ole läsnä, jolloin i. reaktiivinen ryhmä A on valittu joukosta, joka koostuu isotiosyanaatista, 15 bromiasetamidista, jodiasetamidista, maleiini-imidistä, 4,6-dikloori-1,3,5-triatsin-2- yyliaminosta, pyridyyliditiosta, tioesteristä, amino-oksista, atsidista, hydratsidista, aminosta, alkyynistä, polymerisoituvasta ryhmästä ja karboksyylihaposta tai happohalidista tai näiden aktiivisesta esteristä tai : *·· f~~\ !’·- %'Γ 20. v • · · • · · • · · • · • · ··, jossa A’ on lähtevä ligandi, kuten Cl, (CE^SO, H2O ja NO3 ja jossa - on L- • · · . · · ·, linkkerin asema, • · IM ii. linkkeri L on muodostunut välillä yhdestä kymmeneen rakenneosasta, joista kukin 25 rakenneosa on valittu joukosta, joka koostuu fenyleenistä, 1 - 12 hiiliatomia • · ;***; sisältävästä alkyleenistä, etynydiyylistä (-C^C-), etyleenidiyylistä (-C=C-), • · · eetteristä (-0-), tioeetteristä (-S-), amidista (-CO-NH-, -CO-NR’-, -NH-CO- ja - • · · ,···. NR’-CO-), karbonyylistä (-CO-), esteristä (-COO- ja -OOC-), disulfidista (-SS-), • · • . sulfonamidista (-SO2-NH-, -SO2-NR’-), sulfonista (-SO2-), fosfaatista (-O-PO2-O-), MIM • · ... 30 diatsasta (-N=N-) ja tertiäärisestä amiinista, missä R’ edustaa alkyyliryhmää, joka • · • · sisältää vähemmän kuin 5 hiiliatomia, iii. kromoforinen rakenneosa käsittää yhden tai useampia aromaattisia yksiköitä, jossa ainakin yksi aromaattisista yksiköistä on furyylillä tai tienyylillä substituoitu pyridyyliryhmä, jossa furyyli- tai tienyyli-ryhmä on substituoitu yhdellä tai useammalla samanlaisella tai erilaisella elektroneja luovuttavalla ryhmällä ja 5 mahdollisesti lisäksi karboksyyli- tai sulfonihapporyhmällä tai näiden happojen esterillä, amidilla tai suolalla, G, ja jossa kromoforiset rakenneosat on kytketty suoraan toisiinsa muodostaen terpyridyyliryhmän tai on kytketty toisiinsa syklisen tai ei-syklisen N:n sisältävän hiilivetyketjun välityksellä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kelaatti, tunnettu siitä, että se on valittu joukosta, joka koostuu rakenteista ·· • · • · · ·· • · • ·· • · · • · · • · · • · · • · • 1 • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · · t · · • · • · • · · fez 1 1 ,¾2 R2-\VjA.r1 K ^ r a K R2^VA-.r1 & Xx.nJv^ Xv A-L^N.Ln3 m N Ln N 1 R>M HN., _λ T ^ Γ Ί ΓΊ A"L'GiAz f ^ f^\ o o O O O Q r2«X. O O _„^S. o o o O O o K ^p~-R1 O O OOC N I I > q o q o q q q q I -ooc-^lg? r G /N. LnVnn r R Ri R2\0£ni Λ rAAri coo-coo-coo-coo· tftQL·, A ( Λ 3 A "Ά A "Ά· Α^ΆΑ, R!!g£ M» X X X - η AAr ΛαΑΛ 1! 11 ™Λ αχ A a*"^n o o O O *? ||_ \ π π χ π JL JiG~ C00- 80. q -ooc^^ZRi A-L-G^-s GX>7 G ^ A-L-G a A a*· A* „,ίζ)£ , Γ-'ζΧοοο- R!£>iR1\ [ n coo ......I An R ANA An / NA /n-n OOC ^n-n jTl<NLn3;> X jL>Ln3A I I Ln3» Γ 1 ooAn-^AjS ooc N I—Π 8 8 8 8 A nA Q O q q -oocAAG^Zri ooc^4^Zr1 • ♦· ·· : "·· A-L-G^ • ·’♦ R2fcAi _ .=. A Ai, A„. r¥ rvU ίΓΑ Γ4i rAi ill ill fn : ·* A /W A J-ί XX JL ΛνΑ^νΛ °°c vM_JS i L„. ^-^"Ί “* (Λ I>U 88 8888 88 ::: ooc^AA? q q q q q 9 • · K '—^G-L-A ··· • ♦ • · ··· • · t t *1*2 · ί#ί#ϊ joissa kaavoissa R jaR ovat elektroneja luovuttavia ryhmiä, L, G, R’ ja A on määritelty ·«· :M1! kuten patenttivaatimuksessa 1 ja Z on joko O tai S furyylin ja vastaavasti tienyylin osalta. ....: 5 % · ·***; 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kelaatti, tunnettu siitä, että on valittu joukosta, ··· joka koostuu rakenteista G λ. A"L·‘^v^s R2fe£Ri R2^Ri r^>?r, f^V R^ip.^C/'000' ΧΒΛ~Λ λ Υ"Λ Γ 11 On3;/ L JL ^NLn3+N^ oocO^N N> -ooc^N^N JN> -°-M&R, -°“Μ^£κ, G.^7 R2^^R1 A-L-G^, Ό v ' Ä riMr’ Äxr XÄ R^R>dN co°- [^S| /, Or OOC ^ 0]| /^N3+\ ™AJvW Λ «A^ ώχ -^¾ Λ,. ‘OOC^OO? 1 R \— R1 r \— G-L-A joissa kaavoissa R1 ja R2 ovat elektroneja luovuttavia ryhmiä, L, G, R’ ja A on määritelty 5 kuten patenttivaatimuksessa 1 ja Z on joko O tai S furyylin ja vastaavasti tienyylin osalta. • · : ** 4. Patenttivaatimuksien 1 - 3 mukainen kelaatti, tunnettu siitä, että lantanidi-ioni • · * 1 ·3 i ♦ t ** Ln on europium, samarium, terbium tai dysprosium. • ♦ ♦ • · · ··· • · · *···1 10 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kelaatti, t u n n e 11 u siitä, että lantanidi-ioni Ln3+on ♦ · • ** europium tai samarium. • · • · ···
6. Patenttivaatimuksien 1-5 mukainen kelaatti, tunnettu siitä, että elektroneja • · · • · · *.1 luovuttavat ryhmät on valittu joukosta metyyli, etyyli, zz-propyyli, z-propyyli, n-butyyli, t- • » • « *11 15 butyyli, .se^-butyyli, metoksi, etoksi, zz-propoksi, z-propoksi, zz-butoksi, Z-butoksi ja sek- • · • · · *·1♦1 butoksi. ··1 • · • · • · · ϊ 1 1 1 7. Kelatoi va aine, j oka käsittää • · φ ·...· - kromoforisen rakenneosan, 20. kelatoivan osan, joka käsittää ainakin kaksi karboksyylihappo- tai fosfonihappoesteriä, tai mainittujen happojen amidia kiinnittyneenä kromofoorisen rakenneosan aromaattiseen yksikköön joko suoraan tai syklisen tai asyklisen N:n sisältävän hiilivetyketjun välityksellä, ja - reaktiivisen ryhmän A kytkettynä kromofooriseen rakenneosaan tai kelatoivaan osaan joko suoraan tai linkkerin L välityksellä, mainitun reaktiivisen ryhmän A 5 mahdollistaessa sitoutumisen biomolekyyliin tai kiinteällä faasilla olevaan funktionaaliseen ryhmään, tai ei ole läsnä, jolloin i. reaktiivinen ryhmä A on karboksyylihappo tai sen suola, happohalidi tai esteri tai aminohappotähde -CH(NHR3)R4, jossa R3 on väliaikainen suojaryhmä ja R4 on karboksyylihappo tai sen suola, happohalidi tai esteri, 10 ii. linkkeri L on muodostunut välillä yhdestä kymmeneen rakenneossa, joista kukin rakenneosa on valittu joukosta, joka koostuu fenyleenistä, 1 -12 hiiliatomia sisältävästä alkyleenistä, etynydiyylistä (-C=C-), etyleenidiyylistä (-C=C-), eetteristä (-0-), tioeetteristä (-S-), amidista (-CO-NH-, -CO-NR’-, -NH-CO-ja -NR’-CO-), karbonyylistä (-CO-), esteristä (-COO- ja -OOC-), disulfidista (-SS-), 15 sulfonamidista (-SO2-NH-, -SC^-NR’-), sulfonista (-SO2-), fosfaatista (-O-PO2-O-), diatsasta (-N=N-) ja tertiäärisestä amiinista, jossa R’ edustaa alkyyliryhmää, joka sisältää vähemmän kuin 5 hiiliatomia, iii. kromoforinen rakenneosa käsittää yhden tai useampia aromaattisia yksiköitä, jossa ainakin yksi aromaattisista yksiköistä on furyylillä tai tienyylillä substituoitu • « *. 20 pyridyyliryhmä, missä furyyli- tai tienyyli-ryhmä on substituoitu yhdellä tai • · • · · ' . useammalla samanlaisella tai erilaisella elektroneja luovuttavalla ryhmällä ja • · · • · · III mahdollisesti lisäksi karboksyyli- tai sulfonihapporyhmällä tai näiden happojen • · .!** esterillä, amidilla tai suolalla, G, ja jossa kromoforiset rakenneosat on kytketty • · · \^ suoraan toisiinsa muodostaen terpyridyyliryhmän tai on kytketty toisiinsa syklisen • · 25 tai ei-syklisen N:n sisältävän hiilivetyketjun välityksellä. • · * • · · .···. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kelatoiva aine, t u n n e 11 u siitä, että elektroneja .·. luovuttavat ryhmät on valittu joukosta metyyli, etyyli, u-propyyli, i-propyyli, n-butyyli, t- • · · • · · I.I butyyli, sec-butyyli, metoksi, etoksi, n-propoksi, /-propoksi, n-butoksi, f-butoksi ja sek- • · *1* 30 butoksi. • · · · · • · ***** 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kelatoiva aine, tunnettu siitä, että se on valittu joukosta, joka koostuu rakenteista Mi#. Μ^Μψ# ;^£ri Ä jfer (Qro A-L N N. .N. N K V RVi,x\ HN. t ί n n ^-¾¾ η λ l-a *. ^ *» *. ^ R2\0Ar1 ^ R”^N^^fL jK j£l Au g:, ax xs ,n βχ R r!^N’ *&* A R^R' R" R” R” R" r2^Ri g. 0. j^UQl <&., Λ r/$£r’a «ψ* r N Α A? r»^r A t A, γΊ n ,3 JS -ο V η,.Λ,ΛθΝ nC /N. .nl TT TT TT T R ^ N A X \^\Ki____ A > O O O O - I ..A N----\x 1., x x x x K,-Nv R / R oo oo N il \ * ^ JLJ^vs R" _= j _= j R"^^vinz a^r, ^/¾. Ml# (&* R%R,ifA R' .NQ XM Cl Cl r A^r, • · • · • · · :*·.. a-l-ga (fa :... R2fc£R, r^r. *** An J\ an fNN A, AN =:::= XWX ΛΚ^Λ •:.:;· γνί γΊ αΎί γνί :: i * i i » » * * ··♦ ; j ; ; « - » • · · • · · ;]t' joissa kaavoissa R1 ja R2 ovat elektroneja luovuttavia ryhmiä, L on kuten määritelty * « * * * patenttivaatimuksessa 7, ja suojaryhmä R3 on valittu joukosta, joka koostuu ryhmistä *. i. * 5 Fmoc, Boc tai Bsmoc, ja R” on alkyyliesteri tai allyyliesteri, R” ’ on alkyyliryhmä, ja • · · *...* joissa Z on joko O tai S, ja G'on karboksyyli- tai sulfonihappoesteri tai -amidi. • · · • · · • · · • ·
10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kelatoiva aine, tunnettu siitä, että se on valittu ryhmästä, joka koostuu <ν\ r. Är, Μκ, RfeR, Λ ΛΤ λ A η%-λ p-AA^JS pA^-W
1 IIg- A “3&, ,&* r&r, A^r" R>% ? r^R- A ΛΛ λ /"Λ r..an^n_n p-AJou^ r,.a1X%2;z ^01¾ Är’ r"^V^£r, joissa kaavoissa R1 ja R2 ovat elektroneja luovuttavia ryhmiä, L on kuten määritelty patenttivaatimuksessa 7, j a suoj aryhmä Ron valittu j oukosta, j oka koostuu ryhmistä j\# 5 Fmoc, Boc tai Bsmoc, ja R” on alkyyliesteri tai allyyliesteri, ja joissa Z on joko O tai S, ja : ·*; G'on karboksyyli- tai sulfonihappoesteri tai -amidi. • · · • · · • · • · • · · j’·.. 11. Kelatoiva aine, joka käsittää • · · • ί - kromoforisen rakenneosan • · · 10. kelatoivan osan, j oka käsittää ainakin kaksi karboksyylihappo- tai • · · V · fosfonihappoesteriä, tai mainittujen happojen amidia kiinnittyneenä kromoforisen • · · rakenneosan aromaattiseen yksikköön joko suoraan tai syklisen tai asyklisen N:n ::: sisältävän hiilivetyketjun välityksellä, j a • · · :: - reaktiivisen ryhmän A kytkettynä kromofooriseen rakenneosaan tai kelatoivaan : * j * · 15 osaan j oko suoraan tai linkkerin L välityksellä mainitun reaktiivisen ryhmän A : * ·. · mahdollistaessa sitoutumisen biomolekyyliin tai kiinteällä faasilla olevaan • · funktionaaliseen ryhmään, jolloin i. reaktiivinen ryhmä A on -Z2-0-PZ3-0-R5 5 jossa yksi tai kaksi happiatomeista on mahdollisesti korvattu rikillä, Z3 on kloori tai NR6R7, R5 on suojaryhmä, R6 ja R7 ovat alkyyliryhmät, jotka käsittävät 1 - 8 hiiltä,
10 Z2 ei ole läsnä tai on puriiniemäksen tai pyrimidiiniemäksen tai minkä tahansa muun modifioitujen oligonukleotidien synteesiin sopivan modifioidun emäksen radikaali, mainitun emäksen ollessa kytketty happiatomiin joko a) suojatulla hydroksimetyyliryhmällä substituoidun hiilivetyketjun 15 välityksellä tai b) modifioitujen oligonukleotidien synteesiin sopivan furaanirenkaan tai pyraanirenkaan tai jonkin modifioidun furaani-tai pyraanirenkaan välityksellä ii. linkkeri L on muodostunut välillä yhdestä kymmeneen rakenneossa, joista • · 20 kukin rakenneosa on valittu joukosta, joka koostuu fenyleenistä, 1 - 12 • · * * * * , hiiliatomia sisältävästä alkyleenistä, etynydiyylistä (-C=C-), etyleenidiyylistä • · · “I (-C=C-), eetteristä (-0-), tioeetteristä (-S-), amidista (-CO-NH-, -CO-NR’-, • · -NH-CO- ja -NR’-CO-), karbonyylistä (-CO-), esteristä (-COO- ja -OOC-), disulfidista (-SS-), sulfonamidista (-SO2-NH-, -S02-NR’-), sulfonista (-SO2-), • · 25 fosfaatista (-O-PO2-O-), diatsasta (-N=N-) ja tertiäärisestä amiinista, jossa R’ edustaa alkyyliryhmää, joka sisältää vähemmän kuin 5 hiiliatomia • · · • · .···. iii. kromoforinen rakenneosa käsittää yhden tai useampia aromaattisia • · ··» . ·. yksiköitä, j oissa ainakin yksi aromaattisista yksiköistä on furyylillä tai • · · • · · M tienyylillä substituoitu pyridyyliryhmä, missä furyyli- tai tienyyliryhmä on • · • · 30 substituoitu yhdellä tai useammalla samanlaisella tai erilaisella elektroneja • · * · · luovuttavalla ryhmällä ja mahdollisesti lisäksi karboksyyli- tai • · *···’ sulfonihapporyhmällä tai näiden happojen esterillä, amidilla tai suolalla, G, ja missä kromofooriset rakenneosat on kytketty suoraan toisiinsa muodostaen terpyridyyliryhmän tai on kytketty toisiinsa syklisen tai ei-syklisen N:n sisältävän hiilivetyketjun välityksellä.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen kelatoiva aine, tunnettu siitä, että elektroneja luovuttavat ryhmät on valittu joukosta metyyli, etyyli, rc-propyyli, /-propyyli, «-butyyli, t- 5 butyyli, seAbutyyli, metoksi, etoksi, n-propoksi, z-propoksi, «-brutoksi, /-butoksi ja sek-butoksi.
13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen kelatoiva aine, tunnettu siitä, että Z2 on jonkin tyrniini-, urasiili-, adeniini-, guaniini- tai sytosiiniemäksen radikaali, ja mainittu 10 emäs on kytketty happiatomiin i) suojatulla hydroksimetyyliryhmällä substituoidun hiilivetyketjun välityksellä tai ii) sellaisen furaanirenkaan välityksellä, joka sisältää suojatun hydroksimetyyliryhmän 4-asemassaan ja mahdollisesti lisäksi hydroksyylin, suojatun hydroksyylin tai modifioidun ryhmän 2-asemassaan. 15
14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen kelatoiva aine, tunnettu siitä, että -Z2-0-P(NR6R7)-0-R5 on valittu joukosta, joka koostuu rakenteista WH3 "Λ : ·* o*V tfV . DMTrO. DMTrO. : ** V0^ </-Pr)2NA0—CN ? ? γρ^^ο"'—'2N a- Pr)2N'p"0^CN • · !···: -nVh> -A νγ °tY «V X> rTA γΑ* .·.·. rA f—ΓΛ *.·.* DMTrO O DMTrO O DMTrO O DMTr0 ? (/-Pr)2N'K0~CN ()_pr)2N'%^CN (,-Pr)2hAo~CN • · • · · • · · • · • · · • · m m ..!.i 20 joissa - on L-linkkerin asema ja DMTr on dimetoksitrityyli. • · • · « • ·
15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen kelatoiva aine, tunnettu siitä, että se on valittu joukosta, joka koostuu rakenteista r2®r1 a r2^r1 R2&ri A A*A *, A° “A Λ 0--5,3,. Π OxCO"'" * Λ π * * * R2A>-R1 : = R'^N^^i_A A . A*. Ä, 4 ¢, f * - - -¾. «, o. λ v Λ g, Ax “Ά* rAri A-a^aa λ Aa Λ t Λ A. η Α CA νΑΑ-νΆΑ A 33 r-Aa-nl_jo r v/A Is s s A Γ^ R' M 5j r-^a1ö-z, R %, R ,¾¾ -&, A" ’Ψ)Κ'" r-A Υ·ΐ An / \ 1¾. JL nA II J, R-^N^L^O 33 ^ :*·.. y^i] g; XTibvN. :. R--J^2<hz R"^v2i6,z , : ·.. R r2AAri r ^^r1 • · · • · * O a'l'/Bz *€£ 3 :·. r2AAri r Aor1 ·**· A/ufl jO-O-Ol γΊ γΊ A_LTN1 rNi *·· -Li. 3331 X 33 X ?? • · · ^ xi *i *i xx :: ·«· • · • · ·«· • % , T :,;.· 5 joissa R” on karboksyylihapon alkyyhesteri tai allyyliesteri ja R’” on alkyyliryhmäja R • · · :...: ja R2 ovat elektroneja luovuttavat ryhmät, L on kuten määritelty patenttivaatimuksessa 11 :T: ja A on -Z2-0-P(NR6R7)-0-R5 kuten määritelty patenttivaatimuksessa 14 ja Z on O tai S • · ϊ.ja G'on karboksyyli- tai sulfonihappoesteri tai -amidi.
16. Patenttivaatimuksen 11 mukainen kelatoiva aine, tunnettu siitä, että se on valittu joukosta, joka koostuu rakenteista ' ^ A o· Λ Λ a λλ ην- r.,An3qn Ν (I . ΝΥ r2^-r' r r4Q£r, “SÄ,, AQ .,¾ • · • · • #· • 5 joissa R’’ on karboksyylihapon alkyyliesteri tai allyyliesteri ja R1 ja R2 ovat elektroneja : luovuttavat ryhmät, L on kuten määritelty patenttivaatimuksessa 11 ja A on -Z2-0- P(NR6R7)-0-R5 kuten määritelty patenttivaatimuksessa 14jaZonOtaiS ·· • *·· ja G'on karboksyyli- tai sulfonihappoesteri tai -amidi. ··· • · • · ···
17. Biomolekyyli, tunnettu siitä, että se on konjugoitu jonkin patenttivaatimuksen 1 - ··· * 5 mukaisen kelaatin kanssa. • · · • · • · • · · • t ::: 18. Biomolekyyli, tunnettu siitä, että se on konjugoitu jonkin patenttivaatimuksen 1 - • · · 5 mukaisen kelaatin kanssa, jolloin biomolekyyli on valittu joukosta, joka koostuu :*·*; 15 oligopeptidistä, oligonukleotidista, polysakkaridista, fosfolipidistä, PNA:sta, LNAista, :*·.· vasta-aineesta, steroidista, hapteenista, lääkkeestä, reseptoriin sitoutuvasta ligandista ja • · lektiinistä.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen biomolekyyli, tunnettu siitä, että modifioitu oligo- tai polynukleotidi on fosforimonotioaatti, fosforiditioaatti, fosforiamidaatti ja/tai sokeri- tai emäsmodifioitu oligo- tai polynukleotidi.
20. Kiinteä alusta, tunnettu siitä, että se on konjugoitu jonkin patenttivaatimuksen 1 - 5 mukaisen kelaatin kanssa.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen kiinteä alusta, tunnettu siitä, että kelaatti on immobilisoitu mainitulle kiinteälle alustalle joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti. 10
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen kelaatin kanssa konjugoitu kiinteä alusta, tunnettu siitä, että mainittu kiinteä alusta on valittu joukosta, joka koostuu nanopartikkelista, mikropartikkelista, lasilevystä, levystä tai oligonukleotidi- tai oligopeptidisynteesiin sopivasta kiinteästä faasista. 15
23. Leimattu biomolekyyli, tunnettu siitä, että se on saatu synteesillä kiinteällä faasilla lisäämällä jonkin patenttivaatimuksen 7-10 kelatoiva aine oligopeptidin rakenteeseen oligopeptidisyntetisaattorissa, minkä jälkeen sen suojaryhmät poistetaan ja mahdollisesti lisäksi lisätään myös metalli-ioni. **' 20 • · • · • · · ' # 24. Leimattu oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se on saatu synteesillä kiinteällä • · · faasilla lisäämällä jonkin patenttivaatimuksen 11-16 kelatoiva aine oligonukleotidin • m • m .Γ* rakenteeseen, minkä jälkeen suojaryhmät poistetaan ja mahdollisesti lisäksi lisätään myös • · • ·· *... metalli-ioni. 25
25. Patenttivaatimuksen 22 mukaisen oligopeptidin tai patenttivaatimuksen 23 mukaisen • · · • · .···. oligonukleotidin kanssa konjugoitu kiinteä alusta, tunnettu siitä, että mainittu ··· oligopeptidi tai oligonukleotidi on immobilisoitu kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti • · · • · » l.l mainitulle kiinteälle alustalle. • * **:*' 30
26. Tämän keksinnön mukaisella kelaatilla leimatun DNA:n, RNA:n, oligopeptidin, • · *···* oligonukleotidin, polypeptidin, polynukleotidin tai proteiinin kanssa konjugoitu kiinteä alusta.
FI20070677A 2007-09-05 2007-09-05 Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit FI120538B (fi)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20070677A FI120538B (fi) 2007-09-05 2007-09-05 Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit
US12/676,604 US8221719B2 (en) 2007-09-05 2008-09-05 Luminescent lanthanide (III) chelates, chelating agents and conjugates derived thereof
CN200880105962.6A CN101796047B (zh) 2007-09-05 2008-09-05 发光的镧系(iii)螯合物、螯合剂及其衍生的轭合物
PCT/FI2008/050494 WO2009030819A1 (en) 2007-09-05 2008-09-05 Luminescent lanthanide (iii) chelates, chelating agents and conjugates derived thereof
EP08805417.6A EP2195310B1 (en) 2007-09-05 2008-09-05 Luminescent lanthanide (iii) chelates, chelating agents and conjugates derived thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20070677 2007-09-05
FI20070677A FI120538B (fi) 2007-09-05 2007-09-05 Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20070677A0 FI20070677A0 (fi) 2007-09-05
FI20070677A FI20070677A (fi) 2009-03-06
FI120538B true FI120538B (fi) 2009-11-30

Family

ID=38572875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20070677A FI120538B (fi) 2007-09-05 2007-09-05 Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8221719B2 (fi)
EP (1) EP2195310B1 (fi)
CN (1) CN101796047B (fi)
FI (1) FI120538B (fi)
WO (1) WO2009030819A1 (fi)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI120538B (fi) 2007-09-05 2009-11-30 Wallac Oy Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit
US20150307774A1 (en) 2012-09-24 2015-10-29 Qi Wang Chelates, chelating agents, conjugates derived thereof and their use
WO2014147288A1 (en) 2013-01-31 2014-09-25 Kaivogen Oy Luminescent triazacyclononane-based lanthanide chelate complexes as labelling reagents
US9834808B2 (en) 2016-01-21 2017-12-05 SeLux Diagnostics, Inc. Methods for rapid antibiotic susceptibility testing
EP3845663A1 (en) 2016-01-21 2021-07-07 Selux Diagnostics Inc. Methods for rapid antimicrobial susceptibility testing
CA3048213A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Eric Stern Methods for improved rapid antimicrobial susceptibility testing
CN112250699A (zh) * 2020-09-24 2021-01-22 桂林理工大学 4,4,4-三氟-1-苯基-1,3-丁二酮单核铕配合物的制备、结构及荧光

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2536783A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Wallac Oy Novel chelating agents and chelates and their use
FI120538B (fi) 2007-09-05 2009-11-30 Wallac Oy Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit

Also Published As

Publication number Publication date
CN101796047B (zh) 2014-12-03
WO2009030819A1 (en) 2009-03-12
EP2195310B1 (en) 2016-06-01
EP2195310A1 (en) 2010-06-16
FI20070677A0 (fi) 2007-09-05
US20100204442A1 (en) 2010-08-12
FI20070677A (fi) 2009-03-06
CN101796047A (zh) 2010-08-04
US8221719B2 (en) 2012-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120538B (fi) Kelaatit, kelatoivat aineet sekä niistä johdetut konjugaatit
AU2005280581B2 (en) Long wavelength thiol-reactive fluorophores
EP1658282B1 (en) Novel chelating agents and chelates and their use
JP5818990B2 (ja) ３つの発色団を有する発光ランタニドキレート及びそれらの使用
US20150090936A1 (en) Large stokes shift dyes
JP5837419B2 (ja) Ｏ６−アルキルグアニン−ｄｎａアルキルトランスフェラーゼ及びその変異体
DK3137573T3 (en) NEW CHROMOPHORE STRUCTURES FOR LANTHANIDE CHELATES
WO2010055207A1 (en) Chelating, chelating agents and conjugates deriver thereof
US9944657B2 (en) Luminescent lanthanide chelates having three chromophores an their use
WO2014147288A1 (en) Luminescent triazacyclononane-based lanthanide chelate complexes as labelling reagents
ES2605384T3 (es) Nuevos complejos basados en iridio para ECL
JP6480579B2 (ja) 大環状ランタニドキレートのための新規発色団構造
Leygue et al. Design of novel tripyridinophane-based Eu (iii) complexes as efficient luminescent labels for bioassay applications
KR101125057B1 (ko) 물질 표지용 화합물 및 그 제조방법
EP2897967A1 (en) Chelates, chelating agents, conjugates derived thereof and their use
JP6924780B2 (ja) 結合アッセイのバックグラウンド遮断剤
KR101125058B1 (ko) 물질 표지용 화합물 및 그 제조방법
FI128833B (fi) Luminoivat lantanidi(III) kelaatit
EP2794812B1 (en) Novel luminescent lanthanide chelates with enhanced excitation properties
JP2020523397A (ja) 水溶性トリメトキシフェニルピリジン型錯化剤および対応するランタニド錯体

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120538

Country of ref document: FI