JP2015017917A - 生体物質自動定量装置及び生体物質定量方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、測定対象となる生体物質を含む試料の性状によらずに、供給する試薬を一元化できる生体物質自動定量装置を提供する。
【解決手段】本発明の生体物質自動定量装置１は、試料反応部Ａ及び測定部Ｆのそれぞれに所定の試薬を分注する分注機構Ｄと、前記試薬の濃度よりも高い濃度の高濃度試薬３２，３３と、この高濃度試薬３２，３３を希釈する希釈液３１とが配置される試薬類配置部Ｃと、を備え、分注機構Ｄは、試薬類配置部Ｃの高濃度試薬３２，３３と希釈液３１とを所定の割合で混合して所定の試薬を調製し、試料反応部Ａ及び測定部Ｆのそれぞれに所定の試薬を所定の量で分注することを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、生体物質自動定量装置及び生体物質定量方法に関する。

例えば、食品製造工場、医薬品製造工場、医療設備等の施設内での環境や、これら施設内で扱われる製品、その原材料等における微生物の存在の有無の検証、あるいは微生物の定量は、品質・衛生管理のうえで重要な検査項目の一つとなる。
従来、微生物測定法としては、寒天培地を用いたコロニーカウント法や液体培地を用いた濁度計測法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、採取した試料（検体）に含まれる微生物の培養が必要なために、微生物の定量に一日から数日要する問題がある。

これに対して近年、発光試薬や蛍光試薬を用いて微生物の細胞の構成物を特異的に標識し、その発光強度を計測して微生物を定量（計数）する微生物測定方法が提案されている。その一つが微生物の生体物質であるＡＴＰ（アデノシン−３−リン酸）を定量するＡＴＰ法である（例えば、特許文献１参照）。
ＡＴＰ法は、生きた細胞が必ず含有する生体物質であるＡＴＰを微生物量（微生物数）の指標とする方法であり、発光反応を利用する。
このＡＴＰ法では、試料中の微生物から抽出されたＡＴＰにルシフェリン・ルシフェラーゼを反応させた際の発光強度に基づいてＡＴＰ量が測定され、次いでこのＡＴＰ量に基づいて微生物量が求められる。このようなＡＴＰ法によれば、数分から数十分程度で試料中の微生物量を定量することができる。

ところが、採取した試料には、微生物の細胞外に存在するＡＴＰや死菌由来のＡＴＰ（以下、これらのＡＴＰをまとめて「遊離ＡＴＰ」ということがある）も含まれる。この遊離ＡＴＰは、生菌由来の正確なＡＴＰ量の測定を阻害する。
したがって、ＡＴＰ法では、試料にＡＴＰ分解酵素（ＡＴＰ消去試薬）を添加して遊離ＡＴＰを分解した後にＡＴＰ抽出試薬を添加し、微生物の細胞から測定されるべきＡＴＰを抽出する。そして、ＡＴＰ法では、抽出したＡＴＰにＡＴＰ発光試薬を反応させて微生物の定量を行う。ちなみに、試料に添加されたＡＴＰ分解酵素は、その後に試料に添加されるＡＴＰ抽出試薬により失活するため、微生物の細胞から抽出されたＡＴＰがこのＡＴＰ分解酵素により分解されることは避けられる。

特許第３０７０７８０号公報

ところで、使用されるＡＴＰ分解酵素、ＡＴＰ抽出試薬、及びＡＴＰ発光試薬の濃度のバランスは、ＡＴＰの測定感度に大きく影響する。具体的には、採取した試料の性状に応じて試料中の遊離ＡＴＰが多いであろうと思われる場合には、試料中に遊離ＡＴＰが残存するのを防止するために通常よりも高い濃度のＡＴＰ分解酵素が試料に添加される。

しかしながら、このような場合には、遊離ＡＴＰの消去後も試料中にＡＴＰ分解酵素が比較的高濃度で残存することがある。また、ＡＴＰ分解酵素が比較的高濃度で試料中に残存すると、ＡＴＰ抽出試薬により微生物からＡＴＰが抽出される際に、ＡＴＰ分解酵素が完全に失活しない場合がある。そして、試料中に残存したＡＴＰ分解酵素は、微生物から抽出されたＡＴＰをも分解することとなって、正確な生菌由来のＡＴＰ量を測定できない場合がある。

また、測定対象となる微生物が、ＡＴＰ抽出試薬に対して高耐性を有する種類に属するものである場合には、通常よりも高い濃度のＡＴＰ抽出試薬が試料に添加される。
しかしながら、試料に添加するＡＴＰ抽出試薬の濃度が高いと、ＡＴＰ発光試薬が変性して発光量が低下するおそれがある。

一方、ＡＴＰ法では、前記した施設内で扱われる製品、その原材料等が試料（固体試料又は液体試料）として供されることも多い。そして、これらの試料としては、品質・衛生管理上、無菌状態又は準無菌状態が要求される低いＡＴＰレベルのものから、微生物以外の他の有機物（動植物）由来のＡＴＰをも含む高いＡＴＰレベルのものまでが想定される。また、これら試料においては、測定対象となる微生物の種類も多く、ＡＴＰ抽出試薬に対する耐性が微生物の種類ごとに一律ではないことからＡＴＰ抽出難易度にも幅がある。
したがって、性状や測定対象となる微生物の種類が様々な試料についても微生物の定量を高精度かつ高感度で行うためには、各試料の性状等に応じて各試薬の濃度を最適化する必要がある。つまり、あらゆる性状のいずれの試料にも対応できるように、互いに濃度の異なる複数の試薬を、各試薬の種類ごとに予め準備しておく必要がある。

また昨今、ＡＴＰ法を採用したＡＴＰ定量装置においては、操作者の熟練度を問わずにそのさらなる高精度化、高感度化を達成し得るものが望まれており、そのため当該装置の全自動化の要請も高い。
しかしながら、このようなＡＴＰ自動定量装置においては、当該装置に供される試料について想定される前記のＡＴＰレベルの高低幅、及び測定対象となる微生物の種類の多さを考慮すると、予め準備しなければならない試薬の数が膨大なものとなって、各試料の性状等に応じた各試薬の濃度の最適化は極めて困難となる。よって、測定対象となるＡＴＰを含む試料の性状によらずに、供給する試薬を一元化できるものが望まれている。

そこで本発明の課題は、測定対象となる生体物質を含む試料の性状によらずに、供給する試薬を一元化できる生体物質自動定量装置及び生体物質定量方法を提供することにある。

前記課題を解決する本発明の生体物質自動定量装置は、微生物を含む試料から当該微生物を回収し、回収した当該微生物に含まれる生体物質を抽出する試料反応部と、前記微生物から抽出した前記生体物質の量を測定する測定部と、前記試料反応部及び前記測定部のそれぞれに所定の試薬を分注する分注機構と、前記試薬の高濃度試薬とこの高濃度試薬を希釈する希釈液とが配置される試薬類配置部と、前記分注機構の駆動制御を行うと共に、この分注機構による前記試料反応部及び前記測定部に分注する前記所定の試薬の量及び前記所定の試薬の濃度を設定する制御部と、を備え、前記分注機構は、前記制御部の指令に応じて前記試薬類配置部の前記高濃度試薬と前記希釈液とを所定の割合で混合して前記所定の試薬を調製し、前記試料反応部及び前記測定部のそれぞれに前記所定の試薬を所定の量で分注することを特徴とする。

また、前記課題を解決する本発明の生体物質定量方法は、微生物を含む試料から当該微生物を回収し、回収した当該微生物に含まれる生体物質を抽出する生体物質抽出工程と、前記微生物から抽出した前記生体物質の量を測定する測定工程と、を有し、前記生体物質抽出工程で使用される所定の試薬、及び前記測定工程で使用される所定の試薬のそれぞれは、前記生体物質抽出工程及び前記測定工程のそれぞれが行われる際に、前記所定の試薬の濃度よりも高い濃度の高濃度試薬と、これらの高濃度試薬を希釈する希釈液と、を所定の割合で混合してその都度用時調製され、前記所定の試薬の濃度のそれぞれは、前記試料に含まれる前記微生物の細胞外の前記生体物質の濃度に応じて設定されることを特徴とする。

本発明によれば、測定対象となる生体物質を含む試料の性状によらずに、供給する試薬を一元化できる生体物質自動定量装置及び生体物質定量方法を提供することができる。

本発明の実施形態に係る生体物質自動定量装置の構成説明図である。 図１に示す生体物質自動定量装置の制御部が、試料の遊離ＡＴＰの濃度に基づいてＡＴＰ消去試薬の必要濃度を演算するために参照する関数を表すグラフである。 図１に示す生体物質自動定量装置の制御部が、測定対象の微生物に対応するＡＴＰの抽出反応条件を設定する際に参照するテーブルを部分的に表した図表である。 図１に示す生体物質自動定量装置の制御部が、ＡＴＰの検出限界値を演算する際に参照する関数を表すグラフであり、Ｘ軸はＡＴＰ消去試薬の必要濃度を表し、Ｙ軸はＡＴＰ抽出試薬の濃度を表し、Ｚ軸はＡＴＰの検出限界値を表す。 本発明の実施形態に係る生体物質自動定量装置の動作を説明するためのフローチャートである。 本発明の実施形態に係る生体物質自動定量装置の動作を説明するためのフローチャートである。 本発明の実施形態に係る生体物質自動定量装置の動作を説明するためのフローチャートである。

次に、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
本実施形態の生体物質自動定量装置及び生体物質定量方法は、試料に含まれる微生物の生体物質（ＡＴＰ：アデノシン−３−リン酸）の定量に使用する所定の試薬を、その使用時に用時調製することを主な特徴とする。つまり、前記の所定の試薬は、高濃度試薬と希釈液とを所定の割合で混合してその都度調製される。なお、「高濃度試薬」の用語の「高濃度」とは、前記所定の試薬の濃度よりも単に高いことを意味する。
また、本実施形態での高濃度試薬及び希釈液は、後記するように、液体であるものを想定している。
以下では、本発明の実施形態に係る生体物質自動定量装置の全体構成について説明した後に、この生体物質自動定量装置の動作について説明しながら生体物質定量方法について説明する。

＜生体物質自動定量装置＞
本実施形態に係る生体物質自動定量装置は、試料中の微生物に含まれる生体物質としてのＡＴＰを自動的に定量するように構成されている。図１は、本発明の実施形態に係る生体物質自動定量装置の構成説明図である。

図１に示すように、生体物質自動定量装置１（以下、単に「定量装置１」と称することがある）は、微生物を含む試料（液体試料）から当該微生物を回収して当該微生物に含まれるＡＴＰを抽出する試料反応部Ａと、ＡＴＰを測定する測定部Ｆと、試料反応部Ａ及び測定部Ｆのそれぞれに後記する所定の試薬を分注する分注機構Ｄと、この分注機構Ｄの駆動制御を行うと共に、この分注機構Ｄによる試料反応部Ａ及び前記測定部Ｆに対する前記所定の試薬の供給量及び前記所定の試薬の濃度を設定する制御部Ｈと、を備えている。
定量装置１は、さらに試料反応部Ａの後記する反応容器１８の内容物をろ過するろ過機構Ｂと、後記する所定の試薬を調製するための試薬原液（高濃度試薬）及び希釈液等が配置される試薬類配置部Ｃと、試料反応部Ａの温度を所定の温度に調節する温度調節機構Ｅと、測定対象となる微生物の種類に応じたＡＴＰの抽出反応条件を入力する入力パネルＧと、を備えている。
以下に、試料反応部Ａ、ろ過機構Ｂ、試薬類配置部Ｃ、分注機構Ｄ、温度調節機構Ｅ、測定部Ｆ、入力パネルＧ、及び制御部Ｈの順番で説明する。

（試料反応部）
試料反応部Ａは、ロート状に形成された反応容器１８と、その底部に配置されたメンブレンフィルタ２２と、を備えて構成されている。
この試料反応部Ａは、後記するろ過機構Ｂの吸引ポンプ９で吸引されることにより、メンブレンフィルタ２２上に微生物を回収し、後記する分注機構ＤにてＡＴＰ抽出試薬が分注されて、微生物からＡＴＰを抽出する。
なお、本実施形態でのメンブレンフィルタ２２は、図示しない親水性メンブレンフィルタと、図示しない疎水性メンブレンフィルタとの二枚重ねになっており、二枚重ねの上側に親水性メンブレンフィルタが配置され、二枚重ねの下側に疎水性メンブレンフィルタが配置されている。

このように構成されたメンブレンフィルタ２２は、後記する吸引ポンプ９を介して吸引しない限りは、反応容器１８に投入された試料Ｓをメンブレンフィルタ２２上に保持するようになっている。また、吸引ポンプ９で吸引すると、メンブレンフィルタ２２は、試料Ｓのうち微生物（図示省略）をメンブレンフィルタ２２上に残して、その液状成分を、メンブレンフィルタ２２を介して吸引ポンプ９側に排出できるようになっている。
ちなみに、反応容器１８は、定量装置１の計測ステージ２０の所定位置に設けられたヒータブロック３ａ（温度調節機構）に対して着脱自在に取り付けられる。

（ろ過機構）
ろ過機構Ｂは、前記の吸引ポンプ９と、図示しない吸引ヘッドを介して試料反応部Ａの反応容器１８に接続される吸引配管７と、この吸引配管７の延在途中に設けられる電磁弁８と、を備えている。
このようなろ過機構Ｂは、吸引ポンプ９が起動することで、前記したように、試料反応部Ａ内の液状成分を、メンブレンフィルタ２２、吸引配管７及び吸引ポンプ９を介して定量装置１の図示しない廃液貯留槽内に排出する。
ちなみに、吸引ポンプ９の駆動及び停止は、後記する制御部Ｈによって制御されることとなる。

（試薬類配置部）
図１に示すように、試薬類配置部Ｃは、ＡＴＰ法の実施に必要な複数の試薬を纏めて配置するものであり、計測ステージ２０上の予め定められた位置に配置される。
この試薬類配置部Ｃには、複数の試薬容器１１，１２，１３，１４が着脱自在に支持されている。具体的には、希釈液３１が貯留された試薬容器１１と、ＡＴＰ消去試薬の原液３２が貯留された試薬容器１２と、ＡＴＰ抽出試薬の原液３３が貯留された試薬容器１３と、ＡＴＰ発光試薬３４が貯留された試薬容器１４と、が試薬類配置部Ｃに支持されている。なお、原液３２，３３は、特許請求の範囲にいう「高濃度試薬」に相当する。

これらの試薬容器１１，１２，１３，１４は、次に説明する分注機構Ｄのノズル２ａが、後記する制御部Ｈの指令に応じて希釈液３１及び原液３２，３３、並びにＡＴＰ発光試薬３４の所定量を分取可能なように位置決めされている。そして、試薬容器１１，１２，１３，１４の計測ステージ２０上の位置（座標）は、後記する制御部Ｈに記憶されている。

希釈液３１としては、ＡＴＰフリーの液体であれば特に制限はないが、中でもバッファ液が望ましい。

ＡＴＰ消去試薬としては、ＡＴＰ分解酵素を使用することができ、例えば、アデノシンリン酸デアミナーゼ溶液、アデノシンリン酸デアミナーゼとその他の酵素（例えば、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノシントリホスファターゼ）との混合溶液等が挙げられる。ＡＴＰ消去試薬の原液３２は、濃度が既知であれば当該濃度を自由に設定することができる。

ＡＴＰ抽出試薬としては、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、過塩素酸、トリス緩衝液等を好適に使用することができる。中でも界面活性剤が望ましく、この界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイルリン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等が挙げられる。ＡＴＰ抽出試薬の原液３３は、濃度が既知であれば当該濃度を自由に設定することができる。

ＡＴＰ発光試薬としては、例えば、ルシフェラーゼ・ルシフェリン試薬が挙げられる。
ＡＴＰ発光試薬は、市販品（例えば、ルシフェールＨＳ（キッコーマンバイオケミファ社製）、BENX0010（バイオエネックス社製）等）を使用することができる。

（分注機構）
分注機構Ｄは、ノズル２ａと、このノズル２ａに所定量の液体を吸引させ、又は排出させる分注ポンプ２ｂと、定量装置１内でノズル２ａを三次元的に移動させるアクチュエータ２ｃと、を備えている。

この分注機構Ｄのアクチュエータ２ｃは、後に詳しく説明するように、制御部Ｈからの指令に応じてノズル２ａを、反応容器１８と試薬容器１１，１２，１３との間、反応容器１８と測定部Ｆとの間、試薬容器１４と測定部Ｆとの間で、三次元的に移動させる。

そして、アクチュエータ２ｃが前記のようにノズル２ａを移動させる際に、分注機構Ｄの分注ポンプ２ｂは、制御部Ｈからの指令に応じてノズル２ａを介し、試料Ｓの一部を反応容器１８から測定部Ｆに分注するとともに、所定量のＡＴＰ発光試薬３４を試薬容器１４から測定部Ｆに分注する。また、分注機構Ｄの分注ポンプ２ｂは、制御部Ｈからの指令に応じて、所定量の希釈液３１及びＡＴＰ消去試薬の原液３２を、試薬容器１１，１２のそれぞれから反応容器１８へとノズル２ａを介して分注する。

また、分注機構Ｄの分注ポンプ２ｂは、制御部Ｈからの指令に応じて、所定量の希釈液３１及びＡＴＰ抽出試薬の原液３３を、試薬容器１１，１３のそれぞれから反応容器１８へとノズル２ａを介して分注する。また、分注機構Ｄの分注ポンプ２ｂは、制御部Ｈからの指令に応じて、所定量のＡＴＰ含有液を反応容器１８から測定部Ｆへとノズル２ａを介して分注するとともに、所定量のＡＴＰ発光試薬３４を試薬容器１４から測定部Ｆへとノズル２ａを介して分注する。

（温度調節機構）
図１に示すように、温度調節機構Ｅは、ヒータブロック３ａと、このヒータブロック３ａ内に埋設される図示しないヒータ及び温度センサとを備えている。ヒータブロック３ａは、略直方体で形成され、その中央部には反応容器１８の下部が挿嵌される中央孔を有している。このヒータブロック３ａは、良熱伝導材料からなるものが望ましい。
この温度調節機構Ｅは、図示しないヒータに通電するように所定のインバータ等に後記する制御部Ｈが指令を出力することでヒータブロック３ａが昇温する。そして、制御部Ｈは、前記温度センサから出力される温度検出信号に基づいて前記ヒータをオンオフする。これにより反応容器１８内の試料Ｓは、後記する温度に調節されることとなる。

（測定部）
図１に示すように、測定部Ｆは、後記する、あたり試験の発光反応を行わせる第１測定チューブ１６と、この第１測定チューブ１６を着脱自在に支持するホルダ５と、試料Ｓに含まれる微生物から抽出したＡＴＰの発光反応を行わせる第２測定チューブ１７と、第２測定チューブ１７を着脱自在に支持するホルダ６と、第１測定チューブ１６及び第２測定チューブ１７の両方にアクセス可能な光電子倍増管４と、を備えている。

第１測定チューブ１６には、前記したように、反応容器１８から分注された試料Ｓの一部と、試薬容器１４から分注されたＡＴＰ発光試薬３４が分注される。これにより遊離ＡＴＰは、その濃度に応じた発光量で発光する。

第２測定チューブ１７には、前記したように、反応容器１８内で微生物から抽出されたＡＴＰを含むＡＴＰ含有液と、試薬容器１４のＡＴＰ発光試薬３４とが分注される。これによりＡＴＰ含有液の抽出ＡＴＰは、その濃度に応じた発光量で発光する。

光電子倍増管４は、第１測定チューブ１６での発光反応時の発光強度、及び第２測定チューブ１７での発光反応時の発光強度をそれぞれ検出し、その検出信号を制御部Ｈに出力する。

（入力パネル）
入力パネルＧは、前記したとおり、ＡＴＰの抽出反応条件を入力するものであり、図示しないが、測定対象となる微生物の種類が選択可能なタッチパネル式の液晶画面で構成されている。具体的には、グラム陽性菌（例えば、コリネバクテリウム、ミクロコッカス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、セレウス菌、枯草菌等）、グラム陰性菌（例えば、シトロバクター、大腸菌、緑膿菌、セラチア菌等）、真菌（例えば、コウジカビ、アオカビ、アズキイロカビ、カンジタ菌等）等の各種微生物の名称が個別に表示された液晶画面で構成されている。この液晶画面の選択すべき微生物の名称の表示部分を操作者が触れることで、定量装置１で測定対象となる当該微生物におけるＡＴＰの抽出反応条件、つまりＡＴＰ抽出試薬の濃度、抽出温度（反応温度）、抽出時間（反応時間）が設定されるようになっている。

（制御部）
制御部Ｈは、中央演算処理部（図示省略）、記憶部（図示省略）等を備えて構成され、所定のプログラムによって本実施形態に係る定量装置１の動作を総合的に制御するものである。
また、本実施形態での制御部Ｈは、後に詳しく説明するように、あたり試験で求めた試料Ｓの遊離ＡＴＰの濃度に基づいて「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」を設定する。

制御部Ｈは、試料Ｓの遊離ＡＴＰの濃度に基づいて「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」を設定する際に、図２に示す関数を参照する。図２は、制御部Ｈが、試料Ｓの遊離ＡＴＰ量に基づいてＡＴＰ消去試薬の必要濃度を演算するために参照する関数を表すグラフである。
そして、制御部Ｈは、試料Ｓの「遊離ＡＴＰ量［ａｍｏｌ］」に対応する「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度［％］」を図２の関数より求めてこれを反応容器１８に分注するＡＴＰ消去試薬の必要濃度［％］に設定する。なお、前記濃度の単位［％］は質量％であり、以下に記載の単位［％］についても特に区別して規定する以外は質量％を意味する。

図２に示す関数は、予めシミュレーション試験を行って「遊離ＡＴＰ量」とこれを完全に消去する「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」との関係を求めて得られたものである。なお、本実施形態では、反応容器１８に対するＡＴＰ消去試薬の分注量を予め定めた一定量とすることを前提に、「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」を設定しているが、これに代えて「ＡＴＰ消去試薬の必要量（絶対量）」を求めて設定することもできる。

また、制御部Ｈは、後に詳しく説明するように、操作者が選択した測定対象となる微生物の種類に応じてＡＴＰの抽出反応条件、つまり反応容器１８に分注するＡＴＰ抽出試薬の濃度、反応温度、及び反応時間を設定する。

操作者が、前記入力パネルＧ（図１参照）を介して測定対象となる微生物の名称を選択すると、制御部Ｈは、この選択に応じて図３に示す図表を参照する。図３は、制御部Ｈが、測定対象の微生物に対応するＡＴＰの抽出反応条件を設定する際に参照するテーブルを部分的に表した図表である。
具体的には、操作者が測定対象として、例えば「大腸菌」を入力パネルＧにて選択した場合には、制御部Ｈは、測定対象の微生物が「グラム陰性菌」に属するものであることを認識する。そして制御部Ｈは、図３に示す図表を参照して、「グラム陰性菌」に対応する抽出反応条件である、ＡＴＰ抽出試薬の濃度（ｂ［％］）、抽出時の反応温度（ｘ［℃］）、及び抽出に要する反応時間（β［ｍｉｎ］）をそれぞれ設定する。ちなみに、各微生物に対するＡＴＰの抽出反応条件は、予め行われたシミュレーション試験によって最も好適な抽出反応条件として選定されたものであり、制御部Ｈは、これらの抽出反応条件のデータを格納している。

また、制御部Ｈは、「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」及び「ＡＴＰ抽出試薬の濃度」に基づいて、「ＡＴＰの検出限界値」を演算する。
図４は、制御部Ｈが、ＡＴＰの検出限界値を演算する際に参照する関数を表すグラフであり、Ｘ軸はＡＴＰ消去試薬の必要濃度を表し、Ｙ軸はＡＴＰ抽出試薬の濃度を表し、Ｚ軸はＡＴＰの検出限界値を表す。

図４のＺ軸で表される「ＡＴＰの検出限界値」は、定量装置１の検出し得るＡＴＰの最低濃度（又は最小質量）であり、この「ＡＴＰの検出限界値」は、「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」の大きさ及び「ＡＴＰ抽出試薬の濃度」の大きさに応じて変動する。具体的には、図４に示すように、Ｘ軸で表される「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」、及びＹ軸で表される「ＡＴＰ抽出試薬の濃度」がそれぞれ大きくなるほど（高濃度になるほど）、「ＡＴＰの検出限界値」は大きくなる。つまり、定量装置１の検出し得るＡＴＰの最低濃度（又は最小質量）は高くなっていく。

制御部Ｈは、「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」（図２参照）、及び「ＡＴＰ抽出試薬の濃度」（図３参照）に基づいて、図４を参照して「ＡＴＰの検出限界値」を演算することができる。なお、図４に示す「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」及び「ＡＴＰ抽出試薬の濃度」、並びに「ＡＴＰの検出限界値」の関係は、予めシミュレーション試験を行って求めたものである。
この制御部Ｈの実行する手順については、次に説明する定量装置１の動作説明とともに説明する。

＜定量装置の動作＞
次に、定量装置１の動作について説明しながら、この定量装置１が行う生体物質定量方法について説明する。
図１に示した定量装置１では、測定対象となる試料Ｓを有する反応容器１８が計測ステージ２０に配置される。次いで操作者が図示しない起動スイッチをオンにすることで制御部Ｈが次の手順を実行する。図５から図７は、定量装置１の動作を説明するためのフローチャートである。

図５に示すように、制御部Ｈは、まず定量装置１の既定の初期設定を行う（ステップＳ１０１）。その後、制御部Ｈは、図示しないスタートボタンが操作者によりオンにされるまで待機する。
一方、操作者が入力パネルＧ（図１参照）を介して測定対象となる微生物を入力すると、制御部Ｈは測定対象となる微生物の種類を特定し（ステップＳ１０２）、当該種類を記憶する。そして、後記する生体物質抽出工程で微生物からＡＴＰを抽出する際の、前記した抽出反応条件を設定する。

次に、制御部Ｈは、操作者によってスタートボタンがオンになったと判断すると（ステップＳ１０３）、生体物質抽出工程の実施を開始する。まず制御部Ｈは、試料Ｓ（図１参照）の一部を測定部Ｆ（図１参照）の第１測定チューブ１６（図１参照）に分注するように分注機構Ｄ（図１参照）に指令する（ステップＳ１０４）。これに応じて、分注機構Ｄのアクチュエータ２ｃ（図１参照）は、初期位置のノズル２ａ（図１参照）を反応容器１８（図１参照）に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して反応容器１８から試料Ｓの一部を分取する。ちなみに、この分取量は、予め定められており制御部Ｈに記憶されている。
そして、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを反応容器１８から第１測定チューブ１６に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して第１測定チューブ１６に試料Ｓを分注する。

次に、制御部Ｈは、ＡＴＰ発光試薬３４（図１参照）を測定部Ｆの第１測定チューブ１６に分注するように分注機構Ｄに指令する（ステップＳ１０５）。これに応じて、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬類配置部Ｃ（図１参照）の試薬容器１４（図１参照）に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して試薬容器１４からＡＴＰ発光試薬３４を分取する。ちなみに、この分取量は、予め定められており制御部Ｈに記憶されている。
その後、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬容器１４から第１測定チューブ１６に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して第１測定チューブ１６にＡＴＰ発光試薬３４を分注する。

これにより、第１測定チューブ１６では、試料Ｓに含まれる遊離ＡＴＰとＡＴＰ発光試薬３４とが反応することにより、試料Ｓは遊離ＡＴＰの濃度に応じた発光量で発光する。
そして、光電子倍増管４（図１参照）は、第１測定チューブ１６の発光強度を検出して発光強度信号を制御部Ｈに出力する。つまり、測定部Ｆは、制御部Ｈに向けて発光強度信号を出力する。

制御部Ｈは、測定部Ｆから出力された発光強度信号を入力するとともに（ステップＳ１０６）、入力した発光強度信号に基づいて試料Ｓの遊離ＡＴＰ量を演算する（ステップＳ１０７）。
ちなみに、制御部Ｈは、入力した発光強度検出信号をデジタル処理し、単一光子計数法に基づいて発光強度を測定する。そして、制御部Ｈは、予め記憶しているＡＴＰ量と、発光強度との関係を示す検量線に基づいて、測定した前記の発光強度に対応するＡＴＰ量を求めることで、試料Ｓ中の遊離ＡＴＰ量を演算する。

次に、制御部Ｈは、ステップＳ１０７で演算した遊離ＡＴＰ量に基づいて、「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」を演算する（ステップＳ１０８）。
本実施形態での「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」は、反応容器１８内の試料Ｓに含まれる遊離ＡＴＰを完全に消去するために必要なＡＴＰ消去試薬の最低濃度であり、予めのシミュレーション試験で求めたものである。ちなみに、ＡＴＰ消去試薬によるＡＴＰ消去時間は、設計上の微生物定量時間（全体時間）に応じて適宜に設定することができる。

続くステップＳ１０９では、制御部Ｈは、演算した「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」となるように、（１）希釈液３１の供給量（分注量）、及び（２）ＡＴＰ消去試薬の原液３２の供給量（分注量）の設定を行う。これら（１）及び（２）のそれぞれでの供給量（分注量）の設定は、（１）希釈液３１の供給量（分注量）を、予め設定した一定量とし、（２）ＡＴＰ消去試薬の原液３２の供給量（分注量）を増減してＡＴＰ消去試薬を調製してもよいし、（２）ＡＴＰ消去試薬の原液３２の供給量（分注量）を、予め設定した一定量とし、（１）希釈液３１の供給量（分注量）を増減してＡＴＰ消去試薬を調製してもよい。

その一方で、制御部Ｈは、ろ過機構Ｂに指令して、反応容器１８の内容物をろ過する（ステップＳ１１０）。これにより微生物は、メンブレンフィルタ２２上に、ろ取される。

次に制御部Ｈは、図６に示すように、分注機構Ｄに対して、反応容器１８に前記（１）の供給量（分注量）で希釈液３１を分注するように指令する（ステップＳ１１１）。これに応じて、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬類配置部Ｃ（図１参照）の試薬容器１１（図１参照）に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して試薬容器１１から希釈液３１を分取する。その後、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬容器１１から反応容器１８に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して反応容器１８に希釈液３１を分注する。

また、制御部Ｈは、反応容器１８に前記（２）の供給量（分注量）でＡＴＰ消去試薬の原液３２を分注するように指令する（ステップＳ１１２）。これに応じて、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬類配置部Ｃ（図１参照）の試薬容器１２（図１参照）に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して試薬容器１２からＡＴＰ消去試薬の原液３２を分取する。その後、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬容器１２から反応容器１８に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して反応容器１８にＡＴＰ消去試薬の原液３２を分注する。これにより反応容器１８内には、前記の必要濃度のＡＴＰ消去試薬が調製されるとともに、微生物は、このＡＴＰ消去試薬と接触する。試料Ｓに含まれる遊離ＡＴＰはＡＴＰ消去試薬で消去される。

次に制御部Ｈは、ステップＳ１０２で特定した微生物の種類に応じたＡＴＰ抽出試薬の濃度となるように、（３）希釈液３１の供給量（分注量）、及び（４）ＡＴＰ抽出試薬の原液３３の供給量（分注量）の設定を行う（ステップＳ１１３）。これら（３）及び（４）のそれぞれでの供給量（分注量）の設定は、（３）希釈液３１の供給量（分注量）を、予め設定した一定量とし、（４）ＡＴＰ抽出試薬の原液３３の供給量（分注量）を増減してＡＴＰ抽出試薬を調製してもよいし、（４）ＡＴＰ抽出試薬の原液３３の供給量（分注量）を、予め設定した一定量とし、（３）希釈液３１の供給量（分注量）を増減してＡＴＰ抽出試薬を調製してもよい。

また、制御部Ｈは、ステップＳ１０２で特定した微生物の種類に応じた「ＡＴＰ抽出試薬の濃度」、及びステップＳ１０９で演算した「ＡＴＰ消去試薬の必要濃度」、並びに図４に示す関数に基づいて、「ＡＴＰの検出限界値」を演算し、これを格納する。

その一方で、制御部Ｈは、ステップＳ１０２で特定した微生物の種類に応じた反応温度となるように反応容器１８を昇温する（ステップＳ１１４）。つまり制御部Ｈは、前記したように、温度調節機構Ｅ（図１参照）のヒータブロック３ａの温度を昇温させることで反応容器１８を昇温させる。

次に制御部Ｈは、分注機構Ｄに対して、反応容器１８に前記（３）の供給量（分注量）で希釈液３１を分注するように指令する（ステップＳ１１５）。これに応じて、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬類配置部Ｃ（図１参照）の試薬容器１１（図１参照）に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して試薬容器１１から希釈液３１を分取する。その後、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬容器１１から反応容器１８に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して反応容器１８に希釈液３１を分注する。

また、制御部Ｈは、反応容器１８に前記（４）の供給量（分注量）でＡＴＰ抽出試薬の原液３３を分注するように指令する（ステップＳ１１６）。これに応じて、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬類配置部Ｃ（図１参照）の試薬容器１３（図１参照）に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して試薬容器１３からＡＴＰ抽出試薬の原液３３を分取する。その後、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬容器１３から反応容器１８に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して反応容器１８にＡＴＰ抽出試薬の原液３３を分注する。これにより反応容器１８内には、前記の必要濃度のＡＴＰ抽出試薬が調製されるとともに、微生物は、このＡＴＰ抽出試薬と接触する。

そして、制御部Ｈは、ステップＳ１０２で特定した微生物の種類に応じた反応時間が経過するまで待機する（ステップＳ１１７）。これにより試料Ｓに含まれる微生物からＡＴＰが効率よく抽出され、反応容器１８内にはＡＴＰ含有液が生成する。
これにより生体物質抽出工程が終了し、制御部は、次の測定工程の実施を開始する。

制御部Ｈは、反応容器１８のＡＴＰ含有液を測定部Ｆの第２測定チューブ１７（図１参照）に分注するように分注機構Ｄに指令する（ステップＳ１１８）。これに応じて、分注機構Ｄのアクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを反応容器１８に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して反応容器１８からＡＴＰ含有液の一部を分取する。ちなみに、この分取量は、予め定められており制御部Ｈに記憶されている。
そして、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを反応容器１８から第２測定チューブ１７に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して第２測定チューブ１７にＡＴＰ含有液を分注する。

次に、制御部Ｈは、図７に示すように、ＡＴＰ発光試薬３４を測定部Ｆの第２測定チューブ１７に分注するように分注機構Ｄに指令する（ステップＳ１１９）。これに応じて、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬類配置部Ｃの試薬容器１４に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して試薬容器１４からＡＴＰ発光試薬３４を分取する。ちなみに、この分取量は、予め定められており制御部Ｈに記憶されている。
その後、アクチュエータ２ｃは、ノズル２ａを試薬容器１４から第２測定チューブ１７に移動させ、分注ポンプ２ｂは、ノズル２ａを介して第２測定チューブ１７にＡＴＰ発光試薬３４を分注する。

これにより、第２測定チューブ１７では、ＡＴＰ含有液に含まれるＡＴＰ量とＡＴＰ発光試薬３４とが反応することにより、ＡＴＰ含有液はＡＴＰ量に応じた発光量で発光する。そして、光電子倍増管４は、第２測定チューブ１７の発光強度を検出して発光強度信号を制御部Ｈに出力する。つまり、測定部Ｆは、制御部Ｈに向けて発光強度信号を出力する。

制御部Ｈは、測定部Ｆから出力された発光強度信号を入力する（ステップＳ１２０）。そして、制御部Ｈは、入力した発光強度信号に基づいてＡＴＰ含有液のＡＴＰ量を演算する。この際、制御部Ｈは、演算したこのＡＴＰ量と、格納している前記「ＡＴＰの検出限界値」とを比較してＡＴＰ量が「ＡＴＰの検出限界値」以上である場合には、定量装置１は、このＡＴＰ量を出力する。また、ＡＴＰ量が「ＡＴＰの検出限界値」未満である場合には、定量装置１はその旨を出力する。
また、制御部Ｈは、「ＡＴＰの検出限界値」以上であるとして出力されたＡＴＰ量に基づいて微生物の定量を行って（ステップＳ１２１）、測定工程を終了し、本実施形態に係る微生物定量方法の一連の工程が完結する。
なお、試料Ｓ中の微生物の数は、演算したＡＴＰ量に基づいて試料Ｓに含まれる微生物等量のＡＴＰ換算値にて求められる。

以上のような本実施形態によれば、次のような作用効果を奏することができる。
従来、多様な性状の試料に対応するＡＴＰの自動定量装置を構築するためには、試料に含まれる遊離ＡＴＰのレベルの高低幅、及び測定対象となる微生物の種類の多さを考慮すると、予め準備しなければならない試薬の数が膨大なものとなる。よって、従来の自動定量装置においては各試薬の濃度の最適化が極めて困難であり、試料の性状によって測定精度や測定感度が不十分となる問題もあった。

これに対して、本実施形態によれば、使用する試薬を高濃度試薬と希釈液とを所定の割合で混合してその都度調製するので、供給する試薬を一元化することができる。
よって、本実施形態によれば、管理コストを削減することができるとともに、試薬を安定供給することができる。
また、本実施形態によれば、試料の性状に対応するように試薬の濃度を自由に設定することができるので、測定精度及び測定感度を一段と向上させることができる。
また、本実施形態によれば、測定対象の微生物の種類に応じてＡＴＰの抽出反応条件を自由に設定することができるので、測定精度及び測定感度を一段と向上させることができる。
また、本実施形態によれば、あたり試験で予め測定した遊離ＡＴＰ量に基づいてＡＴＰ消去試薬の濃度を設定するので、測定精度及び測定感度を一段と向上させることができる。

以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は前記実施形態に限定されず、種々の形態で実施することができる。
前記実施形態では、生体物質としてＡＴＰを想定しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、微生物から抽出したＤＮＡ、ＲＮＡ、ＮＡＤ等の生体物質に適用することもできる。

また、前記実施形態では、生体物質に生体物質発光試薬を反応させた際の発光強度を測定することを想定しているが、本発明は生体物質に励起光を照射して生じさせた蛍光に基づいて生体物質の定量を行うこともできる。

また、生体物質としてグラム陰性菌の細胞膜に含まれるエンドトキシンを定量する場合には、発光試薬としては、リムルスを使用することができる。

また、本発明の生体物質定量方法は、試料を予め濃縮してから定量装置１に供することもできる。

１ 生体物質自動定量装置
１１ 試薬容器
１２ 試薬容器
１３ 試薬容器
１４ 試薬容器
１６ 第１測定チューブ
１７ 第２測定チューブ
１８ 反応容器
３１ 希釈液
３２ ＡＴＰ消去試薬の原液（高濃度試薬）
３３ ＡＴＰ抽出試薬の原液（高濃度試薬）
３４ ＡＴＰ発光試薬
Ａ 試料反応部
Ｂ ろ過機構
Ｃ 試薬類配置部
Ｄ 分注機構
Ｅ 温度調節機構
Ｆ 測定部
Ｇ 入力パネル
Ｈ 制御部
Ｓ 試料

Claims (6)

1. 微生物を含む試料から当該微生物を回収し、回収した当該微生物に含まれる生体物質を抽出する試料反応部と、
   前記微生物から抽出した前記生体物質の量を測定する測定部と、
   前記試料反応部及び前記測定部のそれぞれに所定の試薬を分注する分注機構と、
   前記試薬の濃度よりも高い濃度の高濃度試薬と、この高濃度試薬を希釈する希釈液とが配置される試薬類配置部と、
   前記分注機構の駆動制御を行うと共に、この分注機構による前記試料反応部及び前記測定部に分注する前記所定の試薬の量及び前記所定の試薬の濃度を設定する制御部と、
   を備え、
   前記分注機構は、前記制御部の指令に応じて前記試薬類配置部の前記高濃度試薬と前記希釈液とを所定の割合で混合して前記所定の試薬を調製し、前記試料反応部及び前記測定部のそれぞれに前記所定の試薬を所定の量で分注することを特徴とする生体物質自動定量装置。
2. 請求項１に記載の生体物質自動定量装置において、
   前記生体物質は、アデノシン−３−リン酸であり、
   前記試料反応部に分注される前記所定の試薬は、アデノシン−３−リン酸消去試薬及びアデノシン−３−リン酸抽出試薬であり、前記測定部に分注される前記所定の試薬は、アデノシン−３−リン酸発光試薬であって、
   前記試料反応部に分注される前記アデノシン−３−リン酸消去試薬の濃度は、前記試料に含まれる前記微生物の細胞外の前記アデノシン−３−リン酸の濃度に応じて前記制御部が設定することを特徴とする生体物質自動定量装置。
3. 請求項２に記載の生体物質自動定量装置において、
   前記試料反応部に分注される前記アデノシン−３−リン酸抽出試薬の濃度は、測定対象となる微生物の耐抽出性の程度に応じて予め定められていることを特徴とする生体物質自動定量装置。
4. 請求項３に記載の生体物質自動定量装置において、
   前記分注機構は、前記試料反応部の前記試料の一部を前記測定部に分注し、
   当該測定部は、当該試料に含まれる前記微生物の細胞外の前記アデノシン−３−リン酸の濃度を測定すると共に、当該濃度を規定する濃度信号を前記制御部に出力し、
   当該制御部は、前記濃度信号に基づいて前記試料反応部に分注される前記アデノシン−３−リン酸消去試薬の濃度を設定することを特徴とする生体物質自動定量装置。
5. 微生物を含む試料から当該微生物を回収し、回収した当該微生物に含まれる生体物質を抽出する生体物質抽出工程と、
   前記微生物から抽出した前記生体物質の量を測定する測定工程と、
   を有し、
   前記生体物質抽出工程で使用される所定の試薬、及び前記測定工程で使用される所定の試薬のそれぞれは、前記生体物質抽出工程及び前記測定工程のそれぞれが行われる際に、前記所定の試薬の濃度よりも高い濃度の高濃度試薬と、これらの高濃度試薬を希釈する希釈液と、を所定の割合で混合してその都度用時調製され、前記所定の試薬の濃度のそれぞれは、前記試料に含まれる前記微生物の細胞外の前記生体物質の濃度に応じて設定されることを特徴とする生体物質定量方法。
6. 請求項５に記載の生体物質定量方法において、
   前記生体物質は、アデノシン−３−リン酸であり、
   前記生体物質抽出工程で使用される前記所定の試薬は、アデノシン−３−リン酸消去試薬及びアデノシン−３−リン酸抽出試薬であり、
   前記測定工程で使用される前記所定の試薬は、アデノシン−３−リン酸発光試薬であって、
   前記生体物質抽出工程で使用される前記アデノシン−３−リン酸消去試薬の濃度は、前記試料に含まれる前記微生物の細胞外のアデノシン−３−リン酸の濃度に応じて設定されることを特徴とする生体物質定量方法。

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