JP4775397B2

JP4775397B2 - 微生物計測システム

Info

Publication number: JP4775397B2
Application number: JP2008082888A
Authority: JP
Inventors: 野恵大里; 龍介後藤田
Original assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Current assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Priority date: 2008-03-27
Filing date: 2008-03-27
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2028-03-27
Also published as: JP2009232744A

Description

本発明は微生物計測システムに係り、特にＡＴＰ法を用いた微生物計測システムに関する。

微生物数の計測は、食品衛生や医薬品環境などの分野で重要であり、高感度かつ迅速な方法を用いて、製品や環境中の微生物をオンラインで計測することが求められている。

従来の微生物の計測法としては、寒天培地を用いたコロニーカウント法や液体培地を用いた濁度法などが知られている。しかし、これらの方法では、培養に一日から数日の時間を要するという問題があった。さらに、濁度法においては、死菌や塵埃と生菌との区別ができないという問題もあった。

これに対して、近年では、迅速で感度の高い微生物計測方法として、発光試薬や蛍光試薬を用いて微生物細胞の構成物を特異的に標識し、その発光強度を計測して微生物数を求める方法が提案されている。このうち、ＡＴＰ法は、生きた細胞が必ず含有する化学物質ＡＴＰ（アデノリン−３−リン酸）を微生物数の指標とする方法である。この方法を利用すれば、数〜数十分程度で微生物数の計測が可能である。

ＡＴＰ法は、特許文献１に記載されるように、生物由来の酵素であるルシフェラーゼとその基質タンパク質であるルシフェリンによる生物発光を利用している。最初に微生物を含む試料からＡＴＰを抽出し、次いで、ＡＴＰにルシフェリン−ルシフェラーゼ混合液を添加して発光させ、その発光強度からＡＴＰ量を求める。

微生物細胞が含有する１細胞当たりのＡＴＰ量は微生物の種類により異なるため、既知量の微生物を含む試料を用いて作成した検量線を利用し、微生物細胞数へ変換することができる。

ＡＴＰは微生物以外の細胞にも含まれている。また、死んだ細胞から環境中に遊離するため、空気中の塵埃や水中にもＡＴＰが存在する。特許文献２や特許文献３に記載されるＡＴＰ法は、微生物以外の細胞由来のＡＴＰを選択的に抽出し、これと遊離ＡＴＰをＡＴＰ分解試薬により消去し、その後、微生物由来のＡＴＰを抽出し発光させることにより、対象とする微生物由来のＡＴＰ量のみを計測して微生物量を求めている。
特許第３０７０７８０号公報特許第２９０５７２７号公報特開２００１−１３６９９９号公報

しかしながら、前述の方法では、試料中の微生物を担体に捕集してから発光計測するまでの一連の処理中に混入する微生物由来のＡＴＰは除去できない。

また、ＡＴＰ分解試薬によりＡＴＰを消去した後に混入するＡＴＰも発光測定試料に含まれてしまうことから、試料本来の微生物由来のＡＴＰを正確に測れない可能性があるという問題がある。

また、こうした混入汚染の可能性に対しては、微生物を含まない清浄空気を試料とした時にＡＴＰが検出されないことを確認する必要がある。しかし、従来法では無菌水などをサンプルとしてゼロ校正を行なっている。そのため、混入汚染が起きていないことを確実に保証する方法がないという問題があった。

本発明はこのような事情に鑑みて成されたもので、微生物の混入汚染を防ぎ、かつ、混入汚染がないことを保証するゼロ校正用の清浄空気を提供することにより、精度の高い微生物計測システムを提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の微生物計測システムは、試料を吸引口から吸引する吸引手段と、計測ユニットと、該計測ユニットは前記吸引された試料中の微生物を所定の担体に捕集する捕集手段と、前記捕集された微生物に所定の試薬を供給することによって前記微生物の細胞内のＡＴＰを発光反応させる発光反応手段と、前記発光反応させた微生物の発光強度を計測する光学計測手段と、前記光学計測手段で計測された発光強度の計測値を、ＡＴＰ量と任意の微生物の細胞数に換算し、これらの換算値に基づいて運転条件を変更する演算制御手段を有し、前記計測ユニットの内部を殺菌処理し、かつゼロ校正に適用可能な清浄空気を前記計測ユニットに提供する殺菌機構と、を備えていることを特徴とする。

発明によれば、計測ユニット内部を殺菌することにより、試料中の微生物を担体に捕集してから発光計測するまでの一連の処理における混入汚染の可能性を低減することができる。また、殺菌機構により作成した微生物を含まない清浄空気が試料として計測ユニットに供給され、ＡＴＰ測定が実施される。一連の処理における混入汚染が起きていないことが確実に保証される。

本発明の微生物計測システムは、前記発明において、試料中の微生物の細胞数を換算処理、殺菌処理、及びゼロ校正処理の各処理が切り替え可能であるよう構成されることを特徴とする。

微生物の細胞数を換算処理、殺菌処理、及びゼロ校正処理の各処理が切り替え可能なので、各処理を確実に行なうことができる。

本発明の微生物計測システムは、前記発明において、前記殺菌機構は、殺菌性の化学物質、ラジカル、イオン、又は電界を発生する殺菌ユニットを備えたことを特徴とする。

殺菌機構として化学物質、ラジカル、イオン、又は電界を発生させる殺菌ユニットを好適に使用することができる。

本発明によれば、計測ユニット内部を殺菌することにより、試料中の微生物を担体に捕集してから発光計測するまでの一連の処理における混入汚染の可能性を低減することができ、また、この殺菌機構により作成した微生物を含まない清浄空気を試料として計測ユニットでＡＴＰ測定を行い、一連の処理における混入汚染が起きていないことを確実に保証することができる。

以下添付図面に従って本発明に係る微生物計測システムの好ましい実施形態について説明する。

図１は微生物計測システムの構成を模式的に示している。同図に示す微生物計測システム１０は、対象室１２内に浮遊する浮遊微生物を測定対象とするシステムであり、対象室１２の内部には、測定口１４及びセンサ１６が設けられる。

センサ１６は、対象室１２内の人の存在を感知するセンサであり、後述する計測ユニット２０の演算・制御機構３０に電気的に接続される。測定口１４は浮遊微生物をエアとともに吸引するための開口であり、搬送路１８を介して計測ユニット２０の捕集機構２２に接続される。

計測ユニット２０は、捕集機構２２、反応機構２４、試薬供給機構２６、光学計測機構２８、及び演算・制御機構３０を備えており、前述した搬送路１８は捕集機構２２に接続される。捕集機構２２は、エア中に浮遊する微生物を所定の担体に捕集する装置であり、捕集された微生物はポンプ３２によって供給管３４に送られる。供給管３４は、反応機構２４の反応容器３６に接続されており、この反応容器３６に微生物が供給されてＡＴＰが検出される。

反応容器３６には、試薬供給機構２６が接続されており、この試薬供給機構２６によって、ルシフェリン−ルシフェラーゼ混合液が反応容器３６に添加される。これにより、反応機構２４では、微生物からＡＴＰが抽出されるとともに、ルシフェリン−ルシフェラーゼ混合液の添加によって生物発光反応が行なわれる。

反応機構２４の反応容器３６には、光学計測機構２８が接続されており、この光学計測機構２８によって、反応容器３６内での生物発光反応の発光量が計測される。光学計測機構２８は、演算・制御機構３０に電気的に接続されており、光学計測機構２８の計測値のデータが演算・制御機構３０に出力され、表示機構４０に表示される。

演算・制御機構３０には、入力機構３８が接続されており、この入力機構３８によって、演算に必要な基準値等が測定に先立って入力される。演算・制御機構３０は、入力機構３８で入力されたデータ、センサ１６の測定値、光学計測機構２８で測定した発光強度に基づいて制御を行う。

図２は殺菌機構５０の構成を示す詳細図である。殺菌機構５０は、殺菌ユニット５５と送風機構５４及び給気口５３から構成され、測定口１４および反応機構２４とダクト５７，５８で接続している。

殺菌ユニット５５はダクト５７，５８と搬送路１８と供給管３４で形成される循環ダクト内を殺菌可能な、化学物質、ラジカル、イオン、電界などを発生する。送風機構５４は循環ダクト内の微生物を含む空気の殺菌ユニット５５への搬送、殺菌ユニット５５によって殺菌処理された清浄空気の搬送路１８への供給および給気口５３からの外気取込みを行なう。

給気口５３はゼロ校正用の清浄空気を供給する際の外気取込口であり、外気はＨＥＰＡフィルタを通過して取込まれる。

ダクト５７，５８と測定口１４、反応機構２４との接続部分、および測定口１４と対象室１２の間にはそれぞれ気密弁５２，５６，５１が設けられており、微生物計測システム１０の動作に応じて開閉する。

次に上記の如く構成された微生物計測システム１０の作用について図１〜図３に基づいて説明する。なお、図３の表は各動作状態における殺菌機構の各部の状態を示している。

試料測定時には、気密弁５２，５６および給気口５３は閉じ、送風機構５４と殺菌ユニット５５は停止している。測定口１４の気密弁５１は開口しており、サンプル空気は測定口１４から搬送路１８を経て捕集機構２２に到達し、捕集機構２２において微生物捕集、反応機構２４においてＡＴＰ抽出され光学計測機構２８のおける発光測定を経て、結果が表示機構４０に表示される。

演算・制御機構３０では、例えば以下の処理が行なわれる。

まず、制御を行うにあたり、許容清浄度Ａ（ＣＦＵ／ｍ^３）、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂ（ｍｏｌ／ＣＦＵ）が設定される。許容清浄度Ａとは、対象室１２の清浄度の許容値（微生物濃度規格）であり、たとえば無菌医薬品製造施設の場合には、グレードＢである５ＣＦＵ／ｍ^３に設定される。

微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂは、一般に空中浮遊菌として存在する微生物の値であり、たとえば一般的な室内環境菌である Bacillus subtilis (Bacillus spizizenii) ATCC 9372 の値として7.13が適用される。なお、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂは、N.hattori et al./Analytical Biochemistry 319 287-295(2003)に示されているように、微生物の種類によって異なっている。図４の表は、一般的な室内環境菌１細胞あたりのＡＴＰ量の一例を示しており、本実施の形態では、この表１の微生物の中から対象となる微生物を選択することによって、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂを決定する。なお、微生物の選択は、対象室１２の浮遊菌を別装置で測定し、測定された微生物を選択するとよい。また、入力機構３８等によって、測定毎に微生物を選択するようにしてもよい。ただし、微生物（試料の中身）が全く未知である場合には、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂを示す一般的な値として、１ mol (1×10^-18mol)が入力される。

次いで、発光強度を用いて、ＡＴＰ量換算値Ｘ（mol/m³）が演算される。そして、求めた換算値Ｘを用いて、菌数換算値Ｐ(＝Ｘ／Ｂ)が計算され、その菌数換算値Ｐが表示機構４０に表示される。

演算・制御機構３０は、上述したように、光学計測機構２８から受け取る発光強度の他に入力機構３８から入力される管理基準値や測定条件、センサ１６から入力される測定条件の情報を記録し、発光強度をＡＴＰ量及び任意の微生物の細胞数に換算するとともに、これを統計処理した数値に対応して運転条件を（たとえば測定頻度をあげるように）変更し、さらに、微生物が異常に増殖した場合にはエラーメッセージを表示する。すなわち、微生物数が基準を超えた場合や、微生物数が短時間に大きく増加した場合、さらには、長期間にわたって微生物数が増加した場合に、これを検出してエラーメッセージを表示することができる。

次に、ゼロ校正用のブランク測定時には、気密弁５１，５６を閉じ、気密弁５２、給気口５３を開口する。また、送風機構５４と殺菌ユニット５５は稼動する。空気は給気口５３からＨＥＰＡフィルタを通過して殺菌機構５０に入り、殺菌ユニット５５によって殺菌処理されて清浄空気となった後、搬送路１８に供給され捕集機構２２に到達する。以降の送風機構以降の捕集、ＡＴＰ抽出、発光測定は前述と同様である。これらの測定結果に基づいて計測ユニット２０に対しゼロ校正が行なわれる。

混入汚染がないことを保証するゼロ校正用の清浄空気を提供することにより、精度の高い微生物計測を行なうことができる。

ゼロ校正用のブランク測定は殺菌ユニット５５により、殺菌処理した清浄空気を基準に自動又は手動で行なわれる。

また、殺菌処理時には、気密弁５１、給気口５３を閉じ、気密弁５２，５６は開口する。また、送風機構５４と殺菌ユニット５５は稼動する。このとき、ダクト５７，５８と搬送路１８と供給管３４で構成される循環ダクトは閉鎖系となる。循環ダクト内の空気は、送風機構５４により循環しながら殺菌ユニット５５によって繰り返し殺菌処理される。

また、殺菌処理は自動又は手動で行なわれる。

本発明は、ＡＴＰ法において、試料中の微生物を担体に捕集してから発光計測するまでの一連の処理における混入汚染の可能性を低減し、また、混入汚染が起きていないことを確実に保証するものであり、特に、高清浄度の空気をサンプルとして、微量の微生物を検出あるいは計測する場合に、精度よくこれを検出あるいは計測することを可能にする。

そのため、医薬品工場、医工学研究施設、病院、食品工場など幅広い分野で微生物計測・管理方法として期待される。

本発明に係る微生物計測システムを模式的に示す構成図本発明に係る殺菌機構の構成を示す図各動作状態における殺菌機構の各部の状態を示す図微生物の種類とＡＴＰ量を示す表図

符号の説明

１０…微生物計測システム、１２…対象室、１４…測定口、１６…センサ、１８…搬送路、２０…計測ユニット、２２…捕集機構、２４…反応機構、２６…試薬供給機構、２８…光学計測機構、３０…演算・制御機構、３２…ポンプ、３４…供給管、３６…反応容器、３８…入力機構、４０…表示機構、５０…殺菌機構、５１，５２，５６…気密弁、５３…給気口、５４…送風機構、５５…殺菌ユニット、５７，５８…ダクト

Claims

試料を吸引口から吸引する吸引手段と、
計測ユニットと、
該計測ユニットは前記吸引された試料中の微生物を所定の担体に捕集する捕集手段と、前記捕集された微生物に所定の試薬を供給することによって前記微生物の細胞内のＡＴＰを発光反応させる発光反応手段と、前記発光反応させた微生物の発光強度を計測する光学計測手段と、前記光学計測手段で計測された発光強度の計測値を、ＡＴＰ量と任意の微生物の細胞数に換算し、これらの換算値に基づいて運転条件を変更する演算制御手段を有し、
前記計測ユニットの内部を殺菌処理し、かつゼロ校正に適用可能な清浄空気を前記計測ユニットに提供する殺菌機構と、
を備えていることを特徴とする微生物計測システム。
試料中の微生物の細胞数を換算処理、殺菌処理、及びゼロ校正処理の各処理が切り替え可能であるよう構成されることを特徴とする請求項１記載の微生物計測システム。
前記殺菌機構は、殺菌性の化学物質、ラジカル、イオン、又は電界を発生する殺菌ユニットを備えたことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物計測システム。