JP5030015B2

JP5030015B2 - 微生物計測システム

Info

Publication number: JP5030015B2
Application number: JP2007184545A
Authority: JP
Inventors: 野恵大里; 龍介後藤田; 松雄神谷
Original assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Current assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Priority date: 2007-07-13
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2027-07-13
Also published as: JP2009017852A

Description

本発明は微生物計測システムに係り、特にＡＴＰ法を用いた微生物計測システムに関する。

微生物数の計測は、食品衛生や医薬品環境などの分野で重要であり、高感度かつ迅速な方法を用いて、製品や環境中の微生物をオンラインで計測することが求められている。

従来の微生物数の計測法としては、寒天培地を用いたコロニーカウント法や液体培地を用いた濁度測法などがあるが、これらの方法では、培養に一日から数日の時間を要するという問題があり、さらに濁度計測法においては、死菌や塵埃と生菌との区別ができないという問題があった。

これに対して、近年では、迅速で感度の高い微生物計測方法として、発光試薬や蛍光試薬を用いて微生物細胞の構成物を特異的に標識し、発光強度を計測して微生物を求める方法が提案されている。このうち、ＡＴＰ法は、生きた細胞が必ず含有する化学物質ＡＴＰ（アデノリン−３−リン酸）を微生物数の指標とする方法であり、数〜数十分程度で計測が可能である。

ＡＴＰ法は、特許文献１に記載されるように、生物由来の酵素であるルシフェラーゼとその基質タンパク質であるルシフェリンによる生物発光を利用している。そして、微生物を含む試料からＡＴＰを抽出し、これをルシフェリン−ルシフェラーゼ混合液を添加して発光させることによって、発光強度からＡＴＰ量を求める。

微生物細胞が含有する１細胞あたりのＡＴＰ量は、微生物の種類によって異なるため、ＡＴＰ法は試料中の微生物の種類が明らかな場合に非常に有効である。この場合、既知量の微生物を含む試料を用いて作成した検量線を利用し、微生物細胞数へ換算することができる。

また、試料が複数微生物の混合である場合には、特許文献２に開示されるように、標的微生物特異的抗体を用いて微生物を分離した後にＡＴＰ法で定量することにより、標的とする微生物数を求めることができる。
特許第３０７０７８０号公報特開２００６−８１５０６号公報

しかしながら、前述の方法では、標的以外の微生物が含まれる際に、これを計測することができず、衛生管理や環境管理の分野では使用できないという問題があった。衛生管理や環境管理の分野では、不特定の微生物を含む試料を対象として単位容量あたりの微生物数を管理する必要があり、従来のＡＴＰ法で、不特定の微生物に対して微生物数への換算ができず、異常な増殖を検知できないため、適用できないという問題があった。

本発明はこのような事情に鑑みて成されたもので、ＡＴＰ法を用いて不特定の微生物を計測し、管理することのできる微生物計測システムを提供することを目的とする。

請求項１に記載の発明は前記目的を達成するために、試料を吸引口から吸引する吸引手段と、前記吸引された試料中の微生物を所定の担体に捕集する捕集手段と、前記捕集された微生物に所定の試薬を供給することによって前記微生物の細胞内のＡＴＰを発光反応させる発光反応手段と、前記発光反応させた微生物の発光強度を計測する光学計測手段と、前記光学計測手段で計測された発光強度の計測値を、ＡＴＰ量と任意の微生物の細胞数に換算し、これらの換算値に基づいて運転条件を変更する演算制御装置と、を備え、前記演算制御装置は、前記ＡＴＰ量の換算値が単位容積あたりに許容される微生物数を超えているか否かを判断する第１の判断と、前記ＡＴＰ量の換算値の平均値に対する増減幅が所定の範囲内であるか否かを判断する第２の判断と、を行うことを特徴とする。

請求項１の発明によれば、ＡＴＰ量換算値が単位容積あたりに許容される微生物数を超えているか否かを判断し、さらに、ＡＴＰ量換算値の平均値に対する増減幅が所定範囲内であるか否かを判断するようにしたので、不特定の微生物であっても、微生物の異常な増殖を検出することができる。

請求項２に記載の発明は請求項１の発明において、前記演算制御装置が前記第１の判断で前記ＡＴＰ量の換算値が単位容積あたりに許容される微生物数を超えたと判断した際、又は、前記第２の判断で前記ＡＴＰ量の換算値の平均値に対する増減幅が所定の範囲内を超えたと判断した際、映像又は音によって警告を発する警告手段を備えたことを特徴とする。

請求項２の発明によれば、微生物の異常な増殖を警告手段によって作業者に確実に知らせることができる。

請求項３に記載の発明は請求項１の発明において、前記演算制御装置は、前記ＡＴＰ量の換算値が増加傾向にあるか否かを判断する第３の判断を行い、該第３の判断の結果に基づいて前記運転条件を変更することを特徴とする。

請求項３の発明によれば、ＡＴＰ量の換算値が増加傾向にある際に、運転条件を変更するので、不特定微生物がゆっくりと大きく増加した場合であっても異常を検出することができる。

請求項４に記載の発明は請求項１の発明において、前記吸引口の近傍に人感センサを設け、該センサの測定値に基づいて前記第１、第２の判断の基準を変えることを特徴とする。

請求項４の発明によれば、人の有無に応じて判断基準を変更するようにしたので、より高精度な管理を行うことができる。

本発明によれば、ＡＴＰ量の換算値が単位容積あたりに許容される微生物数を超えているか否かを判断し、さらに、ＡＴＰ量の換算値の平均値に対する増減幅が所定の範囲内であるか否かを判断するようにしたので、不特定な微生物であっても、微生物の異常な増殖を検出することができる。

以下添付図面に従って本発明に係る微生物計測システムの好ましい実施形態について説明する。

図１は微生物計測システムの構成を模式的に示している。同図に示す微生物計測システム１０は、対象室１２内に浮遊する浮遊微生物を測定対象とするシステムであり、対象室１２の内部には、測定口１４及びセンサ１６が設けられる。

センサ１６は、対象室１２内の人の存在を感知するセンサであり、後述の計測ユニット２０の演算・制御機構３０に電気的に接続される。測定口１４は、浮遊微生物をエアともに吸引するための開口であり、搬送路１８を介して計測ユニット２０の捕集機構２２に接続される。

計測ユニット２０は、捕集機構２２、反応機構２４、試薬供給機構２６、光学計測機構２８、及び、演算・制御機構３０を備えており、前述した搬送路１８は捕集機構２２に接続される。捕集機構２２は、エア中に浮遊する微生物を所定の担体に捕集する装置であり、捕集された微生物はポンプ３２によって供給管３４に送られる。供給管３４は、反応機構２４の反応容器３６に接続されており、この反応容器３６に微生物が供給されてＡＴＰが抽出される。

反応容器３６には、試薬供給機構２６が接続されており、この試薬供給機構２６によって、ルシフェリン−ルシフェラーゼ混合液が反応容器３６に添加される。これにより、反応機構２４では、微生物からＡＴＰが抽出されるとともに、ルシフェリン−ルシフェラーゼ混合液の添加によって生物発光反応が行われる。

反応機構２４の反応容器３６には、光学計測機構２８が接続されており、この光学計測機構２８によって、反応容器３６内での生物発光反応の発光量が計測される。光学計測機構２８は、演算・制御機構３０に電気的に接続されており、光学計測機構２８の計測値のデータ（以下、発光強度Ｌという）が演算・制御機構３０に出力される。

演算・制御機構３０には、入力機構３８が接続されており、この入力機構３８によって、演算に必要な基準値等が測定に先立って入力される。演算・制御機構３０は、入力機構３８で入力されたデータ、前述のセンサ１６の測定値、光学計測機構２８で測定した発光強度Ｌに基づいて以下のように制御を行う。

図２は、演算・制御機構３０の制御フローを示している。

まず、制御を行うにあたり、各種の設定を行っておく（ステップＳ１）。すなわち、許容清浄度Ａ（ＣＦＵ／ｍ^３）、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂ（ｍｏｌ／ＣＦＵ）、変化係数Ｃを設定する。ここで、許容清浄度Ａとは、対象室１２の清浄度の許容値（微生物濃度規格）であり、たとえば無菌医薬品製造施設の場合には、グレードＢである５ＣＦＵ／ｍ^３に設定される。

微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂは、一般に空中浮遊菌として存在する微生物の値であり、たとえば一般的な室内環境菌である Bacillus subtilis (Bacillus spizizenii) ATCC 9372 の値として7.13が適用される。なお、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂは、N.hattori et al./Analytical Biochemistry 319 287-295(2003)に示されているように、微生物の種類によって異なっている。図４の表は、一般的な室内環境菌１細胞あたりのＡＴＰ量の一例を示しており、本実施の形態では、この表１の微生物なかから対象となる微生物を選択することによって、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂを決定する。なお、微生物の選択は、対象室１２の浮遊菌を別装置で測定し、測定された微生物を選択するとよい。また、入力機構３８等によって、測定毎に微生物を選択するようにしてもよい。ただし、微生物（試料の中身）が全く未知である場合には、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂを示す一般的な値として、１ mol (1×10^-18mol)が入力される。一方、変化係数Ｃは、後述の換算値Ｘと、その平均値Ｙによって、｜Ｘ−Ｙ｜／Ｙで表されるＸの変化量の係数であり、たとえば０．５に設定される。

次いで、発光強度Ｌを用いて、ＡＴＰ量換算値Ｘ（mol/m³）を演算する（ステップＳ２）。そして、求めた換算値Ｘを用いて、菌数換算値Ｐ(＝Ｘ／Ｂ)を求め（ステップＳ９）、さらにその菌数換算値Ｐを表示機構４０に表示する（ステップＳ１０）。

一方で、ステップＳ２で求めた換算値Ｘを用いて第１の判断を行う（ステップＳ３）。第１の判断とは、換算値Ｘが第１の判断式（Ｘ＜Ａ×Ｂ）を満たすか否かの判断であり、この第１の判断式を満たした場合に、対象室１２の清浄度基準を満足したことを確認できる。第１の判断式を満たした場合（すなわちＸがＡ×Ｂよりも小さい場合）には次のステップＳ４に進む一方で、第１の判断式を満たさない場合には、エラーメッセージの表示を行う（ステップＳ８）。

ステップＳ４では、換算値Ｘと同条件下で測定された前回までの平均値Ｙを演算する。そして、求めた平均値Ｙと換算値Ｘとを用いて第２の判断を行う（ステップＳ５）。第２の判断とは、平均値Ｙ、換算値Ｘ、変化定数Ｃが第２の判断式（｜Ｘ−Ｙ｜／Ｙ＜Ｃ）を満たすか否かの判断であり、この第２の判断式を満たす場合には、ＡＴＰ量換算値Ｘの増減幅が一定範囲内であること、すなわち微生物量の増減が小さいことを確認できる。第２の判断式を満たす場合には、ステップＳ６に進み、第２の判断式を満たさない場合には、ステップＳ８でエラーメッセージの表示を行う。

ステップＳ６では、第３の判断を行う。第３の判断では、所定時間（たとえば３０分）ごとに換算値Ｘを比較する。そして、ｎ回目の換算値Ｘの値をＹ_ｎ、（ｎ−１）回目の換算値Ｘの値をＹ_ｎ−１とした際に第３の判断式（Ｙ_ｎ＞Ｙ_ｎ−１）を満たす回数（頻度）によって判断を行い、たとえば、第３の判断式を満たす回数が全体の半数以内の場合を許容範囲として判断する。これにより、換算値Ｘが小さく連続的に増加する場合に、これを検出することができる。たとえば、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂが小さい Staphylococcus epidermidis などの微生物が混入して徐々に増加している場合であっても、これを検出することができる。

ステップＳ６において、許容範囲であると判断した場合にはステップＳ７に進み、換算値Ｘと平均値Ｙを表示する。一方、ステップＳ７において許容範囲外と判断した場合には、ステップＳ８に進み、エラーメッセージを表示する。このステップ８のエラーメッセージにおいても、換算値Ｘや平均値Ｙも同時に表示することが好ましい。

以上の制御により、微生物数が基準を超えた場合だけでなく、微生物数が短時間に大きく増加した場合や、長期間にわたって微生物数が増加した場合を検出することができ、微生物の異常な増加を検出することができる。

次に上記の如く構成された微生物計測システム１０の作用について説明する。

まず、ポンプ３２を駆動することによって試料を測定口１４から吸引する。吸引された試料は、搬送路１８を介して捕集機構２２に搬送され、この捕集機構２２によって、含有する微生物が捕集回収される。捕集回収された微生物は、供給管３４を通って反応機構２４に供給される。反応機構２４では、微生物からＡＴＰが抽出され、必要な試薬が試薬供給機構２６から供給されることによって、ルシフェリン−ルシフェラーゼ混合液添加による生物発光反応が行われる。光学計測機構２８は、その発光を計測し、その情報を演算・制御機構３０に送信する。

演算・制御機構３０は、上述したように、光学計測機構２８から受け取る発光強度Ｌの他に入力機構３８から入力される管理基準値や測定条件、センサ１６から入力される測定条件の情報を記録し、発光強度ＬをＡＴＰ量及び任意の微生物の細胞数に換算するとともに、これを統計処理した数値に対応して運転条件を（たとえば測定頻度をあげるように）変更し、さらに、微生物が異常に増殖した場合にはエラーメッセージを表示する。すなわち、微生物数が基準を超えた場合や、微生物数が短時間に大きく増加した場合、さらには、長期間にわたって微生物数が増加した場合に、これを検出してエラーメッセージを表示することができる。したがって、本実施の形態によれば、不特定の微生物であっても、その異常な増殖を検出することができ、衛生管理や環境管理の分野で好適に用いることができる。

次に第２の実施形態を図３に基づいて説明する。図３は、演算・制御機構３０における第２の実施形態の制御フローを示している。なお、図２のフローと同じステップは、同じ符号を付してその詳細な説明を省略する。

同図に示す実施形態では、まず、図２のフローと同様に、許容清浄度Ａ（ＣＦＵ／ｍ^３）、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂ（ｍｏｌ／ＣＦＵ）、変化係数Ｃを予め設定しておく（ステップＳ１）。

一方で、ステップＳ２で求めた換算値Ｘを、センサ１６の測定値に基づいてその演算値を分類する（ステップＳ１１〜Ｓ１４）。すなわち、センサ１６から測定値が入力されることによって（ステップＳ１１）、対象室１２に人が居る場合（作業時）と、対象室１２に人がいない場合（非作業時）とを判別し（ステップＳ１２）、人が居る場合の演算値をＸ１とし（ステップＳ１３）、人が居ない場合の演算値をＸ２とする（ステップＳ１４）。そして、それぞれの場合において、図２のフローにおけるステップＳ３〜ステップＳ７と同様の制御を行う。

人が居ると判断した場合（ステップＳ１３）には、換算値Ｘ１を用いて、第１の判断式（Ｘ１＜Ａ１×Ｂ）を満たすか否かを判断する（ステップＳ１５）。ここで、Ａ１は作業時における許容清浄度である。そして、第１の判断式を満たす場合は、作業時の対象室１２の清浄度基準を満足したことが確認されるので、次のステップＳ１５に進み、換算値Ｘ１の前回までの平均値Ｙ１を演算し、さらに、この平均値Ｙ１と換算値Ｘ１とを用いて、第２の判断式（｜Ｘ１−Ｙ１｜／Ｙ１＜Ｃ）を満たすか否かを判断する（ステップＳ１７）。第２の判断式を満たす場合には、ＡＴＰ量換算値Ｘ１の増減幅が一定範囲内であることが確認されるので、次のステップＳ１８に進み、第３の判断として増加傾向にあるか否かを判断する。そして、増加傾向でないことが確認できた場合には、正常な状態であるとして、表示機構４０に換算値Ｘ１と平均値Ｙ１を表示する（ステップＳ１９）。

なお、ステップＳ１５で微生物数が基準を満たさないと判断した場合や、ステップＳ１７で微生物の増減幅が一定の範囲を超えたと判断した場合、さらには、ステップＳ１８で微生物数が増加傾向であると判断した場合には、表示機構４０にエラーメッセージを表示するとともに、Ｘ１、Ｙ１の値を表示する（ステップＳ８）。

同様に、人が居ないと判断した場合（ステップＳ１４）には、換算値Ｘ２を用いて、第１の判断式（Ｘ２＜Ａ２×Ｂ）を満たすか否かを判断する（ステップＳ２０）。ここで、Ａ２は非作業時における許容清浄度であり、Ａ１よりも高い清浄度に設定される。そして、第１の判断式を満たす場合は、非作業時の対象室１２の清浄度基準を満足したことが確認されるので、次のステップＳ２１に進み、換算値Ｘ２の前回までの平均値Ｙ２を演算し、さらに、この平均値Ｙ２と換算値Ｘ２とを用いて、第２の判断式（｜Ｘ２−Ｙ２｜／Ｙ２＜Ｃ）を満たすか否かを判断する（ステップＳ２２）。第２の判断式を満たす場合には、ＡＴＰ量換算値Ｘ２の増減幅が一定範囲内であることが確認されるので、次のステップＳ２３に進み、第３の判断として増加傾向にあるか否かを判断する。そして、増加傾向でないことが確認できた場合には、正常な状態であるとして、表示機構４０に換算値Ｘ２と平均値Ｙ２を表示する（ステップＳ２４）。

なお、ステップＳ２０で微生物数が基準を満たさないと判断した場合や、ステップＳ２２で微生物の増減幅が一定の範囲を超えたと判断した場合、さらにはステップＳ２３で微生物数が増加傾向であると判断した場合は、表示機構４０にエラーメッセージを表示するとともに、Ｘ２、Ｙ２の値を表示する（ステップＳ８）。

以上説明したように、第２の実施形態では、作業時と非作業時とに分けて制御を行うので、それぞれの場合において微生物の異常な増殖を精度良く検出することができる。

なお、上述した実施形態では、空中に浮遊する微生物の測定、管理を対象としたが、測定・管理の対象は浮遊微生物に限定するものではなく、液中の微生物や付着微生物であってもよい。

また、上述した実施形態は、微生物１細胞あたりのＡＴＰ量Ｂを入力機構３８から入力するようにしたが、これに限定するものではなく、本発明の微生物計測システム１０を用いて任意の微生物のＢ値を求め、これを演算・制御機構３０に記憶させておくようにしてもよい。この場合、測定時には表示機構４０において微生物種を選択するだけで、微生物のＢ値を読み込むようにすればよい。

上述した実施形態では、第３の判断を３０分毎に行うようにしたが、これに限定するものではない。さらにその時間間隔を入力機構３８等によって任意に変更できるようにしてもよい。

また、上述した実施形態では、センサ１６によって人の有無を検知するようにしたが、装置の稼働状態を検知するようにしてもよい。

本発明に係る微生物計測システムを模式的に示す構成図演算・制御機構でのフローを示す図図２と異なるフローを示す図微生物の種類とＡＴＰ量を示す表図

符号の説明

１０…微生物計測システム、１２…対象室、１４…測定、１６…センサ、１８…搬送路、２０…計測ユニット、２２…捕集機構、２４…反応機構、２６…試薬供給機構、２８…光学計測機構、３０…演算・制御機構、３２…ポンプ、３４…供給管、３６…反応容器、３８…入力機構、４０…表示機構

Claims

試料を吸引口から吸引する吸引手段と、
前記吸引された試料中の微生物を所定の担体に捕集する捕集手段と、
前記捕集された微生物に所定の試薬を供給することによって前記微生物の細胞内のＡＴＰを発光反応させる発光反応手段と、
前記発光反応させた微生物の発光強度を計測する光学計測手段と、
前記光学計測手段で計測された発光強度の計測値を、ＡＴＰ量と任意の微生物の細胞数に換算し、これらの換算値に基づいて運転条件を変更する演算制御装置と、を備え、
前記演算制御装置は、
前記ＡＴＰ量の換算値が単位容積あたりに許容される微生物数を超えているか否かを判断する第１の判断と、
前記ＡＴＰ量の換算値の平均値に対する増減幅が所定の範囲内であるか否かを判断する第２の判断と、を行うことを特徴とする微生物計測システム。
前記演算制御装置が前記第１の判断で前記ＡＴＰ量の換算値が単位容積あたりに許容される微生物数を超えたと判断した際、又は、前記第２の判断で前記ＡＴＰ量の換算値の平均値に対する増減幅が所定の範囲内を超えたと判断した際、映像又は音によって警告を発する警告手段を備えたことを特徴とする請求項１に記載の微生物計測システム。
前記演算制御装置は、前記ＡＴＰ量の換算値が増加傾向にあるか否かを判断する第３の判断を行い、該第３の判断の結果に基づいて前記運転条件を変更することを特徴とする請求項１に記載の微生物計測システム。
前記吸引口の近傍に人感センサを設け、該センサの測定値に基づいて前記第１、第２の判断の基準を変えることを特徴とする請求項１に記載の微生物計測システム。