WO2022239867A1 - 微生物検出装置及び微生物検出方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an apparatus and method for detecting contaminant microorganisms contained in a sample.
- ATP adenosine triphosphate
- Patent Document 1 Since it is difficult to directly measure ATP derived from contaminant microorganisms contained in a small amount in a sample, in Patent Document 1, microorganisms are cultured and the amount of ATP that increases during this culture is measured. Further, in Patent Document 2, only microorganisms are separated from a sample using an antibody that specifically recognizes only microorganisms, and then ATP extracted from the separated microorganisms is amplified by an enzymatic reaction and then measured. However, these methods require a step of amplifying the microorganism itself or ATP derived from the microorganism, so there is a problem that it takes time to detect the microorganism.
- the present invention was made to solve the above-mentioned problems, and its main purpose is to detect microorganisms in samples more quickly than before.
- the microorganism detection device includes a pretreatment unit that selects and concentrates contaminant microorganisms from a sample, and a measurement unit that measures the amount of ATP contained in the concentrated liquid concentrated by the pretreatment unit.
- the pretreatment unit is characterized in that the contaminant microorganisms are sorted out from the sample by removing cells other than the contaminant microorganisms in the sample by physical disruption, chemical disruption and/or filtering.
- the amount of ATP in a concentrated liquid obtained by removing cells other than contaminating microorganisms in the sample by physical disruption, chemical disruption, and/or filtering and then measuring the amount of ATP in the concentrated liquid is measured. or the step of amplifying ATP is unnecessary. As a result, contaminant microorganisms can be detected more quickly than before.
- Examples of the physical disruption include those caused by adjusting the pressure or osmotic pressure of the sample, applying ultrasonic waves or electric shocks to the sample, or contacting with cell disruption beads or nanopillars. .
- one or more selected from predetermined medium components, surfactants, enzymes, apoptosis inducers, and cytolysins that can selectively kill target cells in the sample. or by adjusting the temperature or pH of the sample to a temperature that selectively kills the cells of interest.
- a filter that allows only the contaminant microorganisms to pass can be used.
- the measuring unit measures the amount of ATP extracted from the contaminant microorganisms contained in the concentrated liquid.
- the measurement unit measures the amount of ATP extracted from the contaminant microorganisms contained in the concentrated solution after the addition of the ATP elimination solution for removing free ATP, only ATP derived from living contaminant microorganisms can be measured. In addition, by comparing this measurement result with the measurement result when no ATP-scavenging solution is added, the amount of free ATP and the amount of ATP derived from dead contaminant microorganisms in the concentrate can also be known.
- ATP may not be extracted with the ATP extract. Therefore, if the measurement unit measures the amount of ATP extracted from the contaminant microorganisms contained in the concentrated liquid after adding the germination liquid for germinating the contaminant microorganisms in the spore state, ATP can be extracted from all contaminating microorganisms, including contaminating microorganisms.
- the amount of contaminant microorganisms in the form of spores present in the concentrated liquid can be known by comparing the measurement results with those obtained when no germination liquid is added.
- the effect of the present invention is particularly pronounced when the sample contains cultured cells.
- biofilm decomposing unit that decomposes biofilms.
- the microorganism detection method selects the contaminant microorganisms from the sample by removing cells other than the contaminant microorganisms in the sample by physical destruction, chemical destruction and/or filtering. It is characterized by concentrating and measuring the amount of ATP in the concentrate obtained by concentrating.
- a step of identifying the types of contaminant microorganisms contained in the concentrate it is possible to identify not only the presence of contaminant microorganisms but also the types of contaminant microorganisms.
- cells other than contaminating microorganisms in the sample are removed by physical disruption, chemical disruption and/or filtering, and the amount of ATP in the concentrated solution is measured. No steps for amplifying microorganisms or ATP are required. As a result, contaminant microorganisms can be detected more quickly than before.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing the overall configuration of a microorganism detection device according to an embodiment of the present invention
- FIG. FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of a measurement unit included in the microorganism detection device of the present embodiment
- FIG. 2 is a perspective view showing the external appearance of a measurement unit included in the microorganism detection device of the present embodiment
- It is a schematic diagram which shows the measurement procedure in the measurement part of this embodiment.
- It is a schematic diagram which shows the structure of the pre-processing part of this embodiment.
- 4 is an enlarged cross-sectional view of the pretreatment section of the embodiment;
- the microorganism detection device 100 of the present embodiment measures the amount of the biological substance by analyzing the light generated by the contaminant microorganism-derived substance contained in the sample.
- this microorganism detection apparatus 100 includes a pretreatment unit 1 for pretreatment of a sample and a measurement unit for measuring the amount of ATP in the treated liquid treated by the pretreatment unit 1. 2, a control unit 3 that controls the preprocessing unit 1 and the measurement unit 2, a calculation unit 4 that calculates the ATP amount based on the output signal from the measurement unit 2, and the ATP amount calculated by the calculation unit 4 and a display unit 6 for displaying the .
- the preprocessing control unit 31 that controls the preprocessing unit and the measurement control unit 32 that controls the measurement unit are provided, but the present invention is not limited to this.
- control unit 3 The functions of the control unit 3, the calculation unit 4, and the like are exhibited by a computer COM including, for example, a CPU, a memory, an input/output interface, an AD converter, and the like.
- display unit 6 one provided in the computer COM described above may be used, or a separately provided display or the like may be used.
- COM 1 functioning as a preprocessing control unit 31, COM 2 functioning as a measurement control unit 32, a calculation unit 4, etc. are provided, and only one display unit 6 is provided, but the present invention is not limited to this.
- the preprocessing unit 1 is a characteristic configuration of the present invention, and will be described in detail later.
- the measurement unit 2 is a so-called ATP meter, and for example, as shown in FIG.
- a holder driving mechanism 25 for moving and a dispensing mechanism 26 for dispensing a luminescent reagent that reacts with ATP to generate light into the container 22 held by the holder 23 are provided.
- the measurement unit 2 includes a housing C having a door C2 for inserting and removing the holder 23, as shown in FIGS.
- the housing C includes a housing main body C1 that accommodates measurement system equipment necessary for ATP measurement such as the holder 23, the holder driving mechanism 25, and the dispensing mechanism 26, and an openable and closable door provided in the housing main body C1. C2.
- a user can access the inside of the housing body C1 by, for example, lifting the door C2 upward to open it. Further, by closing the door C2, the inside of the apparatus is made to be in a darkroom state.
- the housing main body C1 includes a temperature control mechanism 27 for holding and controlling the temperature of a plurality of sample tubes FC containing the treated liquid processed by the pretreatment unit 1, and a reagent container RC1 containing each reagent. , RC2 are set, and a pipette tip setting portion 29 is provided with pipette tips PT used in the pipetting mechanism 26 .
- reaction reagents include an ATP removal solution that removes ATP (free ATP) other than viable cells (viable bacteria) contained in the treated liquid, a spore reaction solution that germinates spores, and extracts ATP from viable cells. ATP extract or the like.
- the holder 23 holds, for example, a plurality of containers 22 in an annular shape. Specifically, it holds them on the same circle about a predetermined center of rotation.
- the container 22 is made of resin and has a cylindrical shape with a bottom. In this embodiment, the container 22 is made of resin and has a cylindrical shape with a bottom.
- the photodetector 24, as shown in FIG. 2, detects light emitted from the sample in the container 22 held by the holder 23, and is, for example, a photomultiplier tube (PMT).
- the photodetector 24 is provided below the container 22 held by the holder 23 .
- An optical system having a reflector 211 is provided above the photodetector 24 to guide the light emitted from the sample in the container 22 to the photodetector 24 .
- the holder drive mechanism 25 moves the holder 23 to sequentially position each container 22 held by the holder 23 at the detection position X det by the photodetector 24 . Specifically, the holder driving mechanism 25 rotates the holder 23 around the predetermined rotation center. As shown in FIG. A rotation shaft 252 for rotating the holder 23 and an actuator 253 for rotating the rotation shaft 252 are provided. In addition, the holder drive mechanism 25 is provided with a rotational position sensor (not shown) for detecting the rotational position of the holder 23 . Based on the detection signal of this rotational position sensor, the actuator 253 is rotationally controlled by the controller 3 so as to position the container 22 to be measured at the detection position X det .
- a rotation position sensor may be used to detect a position that serves as a mark such as a predetermined origin, and other positions may be managed by the number of pulses of the motor, which is the actuator 253 . By configuring in this manner, the configuration of the rotational position sensor can be made simpler, which is preferable.
- the dispensing mechanism 26 drives the suction or discharge of the nozzle 261 through a nozzle 261 for sucking or discharging a sample or each reagent and a flow path connected to the nozzle 261. and a nozzle moving mechanism 263 for moving the nozzle 261 in a predetermined direction.
- the nozzle 261 is provided with a tip holder 261H that detachably holds a pipette tip PT for contacting and holding the sample and each reagent.
- the tip holder 261H is formed with an internal channel, the channel is connected to the base end thereof, and the pipette tip PT is connected to the tip opening.
- the nozzle moving mechanism 263 linearly moves the nozzle 261 in the horizontal direction (X-axis direction and Y-axis direction) and linearly moves the nozzle 261 in the vertical direction (Z-axis direction).
- This nozzle moving mechanism 263 is controlled by the control section 3 described above.
- the disposal box 210 is provided, for example, integrally with the holder 23 , and is provided inside the plurality of containers 22 that are dead spaces in the holder 23 in this embodiment.
- the pipette tip PT may be removed by moving the nozzle 261 to a tip removal member (not shown) arranged above the disposal box 210, or by moving the tip removal member to the movable member 631. After the movable member 631 is moved above the disposal box 210, the chip removing member may be used.
- the measurement unit 2 guides the light emitted from the sample in the container 22 at the detection position X det to the photodetector 24, while the other containers 22 (specifically, A light shielding mechanism 213 may be provided to prevent light from the sample in the finished container 22 ) from being directed to the photodetector 24 .
- the sample tube FC containing the treated liquid pretreated by the pretreatment unit is set in the temperature control mechanism 27 .
- the door C2 With a predetermined number of sample tubes FC set, the door C2 is closed and measurement is started. In this state, each container 22 held by the holder 23 is empty, but the container 22 for standard solution measurement contains a standard solution with a known ATP amount.
- control unit 3 controls the dispensing mechanism 26 to dispense each reaction reagent into each sample tube FC held by the temperature control mechanism 27 according to a predetermined sequence, as shown in FIG. note.
- the sample in the sample tube FC is subjected to a predetermined process (ATP extraction).
- ATP extraction a predetermined process
- the pipette tip PT is replaced for each reaction reagent, and the used pipette tip PT is disposed of in the disposal box 210 .
- a mixture of the ATP elimination solution and the spore reaction solution is dispensed into the sample in the sample tube FC, and the sample is kept at a predetermined temperature until the reaction of each reagent is completed.
- the ATP extraction liquid is dispensed into the sample in the sample tube FC, and the sample is kept at a predetermined temperature until the extraction of ATP is completed.
- the ATP-removing solution and the spore reaction solution may be separately dispensed instead of the mixed solution of the ATP-removing solution and the spore reaction solution. For example, as shown in FIG. 4, ATP solution and spore reaction solution are added to the treated solution, then ATP is extracted with the ATP extraction solution, and a luminescence reagent is added for measurement.
- each reaction reagent is dispensed according to a predetermined sequence into a standard solution with a known ATP amount and a zero solution with a zero ATP amount during the waiting time after the reagent is dispensed to the sample. do. Specifically, after dispensing the ATP elimination solution and the spore reaction solution into the standard solution measurement container and the blank measurement container, respectively, the ATP extraction solution is dispensed, and then the standard solution or zero solution is dispensed. do. Note that the order of dispensing each reaction reagent into the zero liquid is not limited to the above.
- the mixing ratio of the sample, the ATP-removed solution, the spore reaction solution, and the ATP extract the mixing ratio of the standard solution, the ATP-removed solution, the spore reaction solution, and the ATP extract, the zero solution, the ATP-removed solution, and the spores
- the mixing ratio of the reaction liquid and the ATP extraction liquid is made to be the same. Specifically, their mixing ratio is set to a predetermined value.
- the dispensing mechanism 26 dispenses the pretreated sample in each sample tube FC into each container 22 held by the holder 23 .
- the controller 3 controls the holder drive mechanism 25 to move the container 22 to be measured to the detection position Xdet .
- the controller 3 controls the dispensing mechanism 26 to introduce the luminescent reagent into the container 22 at the detection position X det .
- the light emitted from the sample in the container 22 at the detection position X det is detected by the photodetector 24 to perform luminescence measurement.
- blank measurement and standard solution measurement are performed, and zero point calibration and span calibration are performed.
- the light intensity signal obtained by the photodetector 24 is subjected to arithmetic processing by the calculator 4 to calculate the amount of ATP (amol).
- the calculator 4 subtracts the "light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent" from the "light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the sample" to Luminescence is removed to calculate a value related to the amount of biogenic material.
- the light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the sample is an integrated average signal that is the average value of the integrated signals for a predetermined time (for example, several seconds to several tens of seconds) from the time of introducing the luminescent reagent
- the “light intensity signal obtained before the addition of the luminescent reagent” is an integrated average signal, which is the average value of integrated signals for a predetermined time (for example, several seconds to several tens of seconds) before the introduction of the luminescent reagent.
- the “light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent” is based on the light stored in the container 22 .
- the calculation unit 4 converts the "second light intensity signal, which is the light intensity signal derived only from the container 22", into the "first light intensity signal including the light intensity signal derived from the container 22 and the light intensity signal derived from the living body”. Subtract.
- the microorganism detection device 100 can accurately calculate only the light intensity signal derived from contaminant microorganisms. The same applies to signal processing in blank measurement and standard solution measurement.
- the light intensity signal is not limited to an integrated average signal, and may be simply an integrated signal for a predetermined time (for example, several seconds to several tens of seconds) from the time of introduction of the luminescent reagent, or may be a signal that has been subjected to other arithmetic processing. It may be a signal.
- the calculation unit 4 calculates the ATP amount (amol) for each container 22 using the following formula (Equation 1).
- Sample signal is the signal obtained by sample measurement, and the "light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent to the sample” is subtracted from the "light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the sample”. is a signal.
- the STD signal is the signal obtained in the standard solution measurement, ranging from "the light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the standard solution” to "the light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent to the standard solution”. is the signal minus
- the zero signal is the signal obtained in the blank measurement, and the light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the zero solution is changed to the ⁇ light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent to the zero solution.” This is the subtracted signal. In the blank measurement, when the luminescence reagent was added, a luminescence peak occurred, but it may not occur in some cases.
- the user determines whether contaminating microorganisms are present in the sample based on the amount of ATP calculated as described above. Specifically, for example, a predetermined threshold is set for the ATP concentration in the sample obtained from the concentration ratio of the sample in the pretreatment section and the calculated ATP amount, and the ATP concentration in the sample exceeds this threshold. If it exceeds, it may be determined that contaminant microorganisms are present.
- the controller 3 controls the holder drive mechanism 25 to move the next container 22 to be measured to the detection position X det .
- the luminescence measurement of the samples in each container 22 is sequentially performed.
- the pipette tip PT is replaced each time the luminescence measurement of the sample in each container 22 is performed, and the used pipette tip PT is disposed of in the disposal box 210 .
- the pipette tip PT may be used as it is without replacing it once.
- the door C2 is opened to replace the sample tube FC held by the temperature control mechanism 27 and the container 22 held by the holder 23.
- the holder 23 is removed from the main body of the apparatus by holding the holding hole 3h of the holder 23.
- the discarded pipette tips PT can be taken out from the device main body at the same time by removing the holder 23 from the device main body. can be done.
- the pretreatment unit 1 functions as a selection unit that selects contaminant microorganisms to be detected from a sample obtained by sampling a part of a product such as cultured cells, and a concentration that obtains a concentrated liquid in which the selected contaminant microorganisms are concentrated. function as a department.
- the pretreatment unit 1 removes, for example, cultured cells and/or the like by crushing and/or filtering, and selects only contaminating microorganisms. Crushing may be performed in a bottle BT containing a large volume of sample, as shown in FIG. Filtering may be performed using a filter (not shown) or the like that allows passage of contaminant microbial cells but not cultured cells.
- the pretreatment unit 1 concentrates the contaminant microorganisms selected as described above using a filter FC1 that does not allow the contaminant microorganisms to permeate.
- a filter FC1 that does not allow the contaminant microorganisms to permeate.
- the pretreatment unit 1 is detachably attached to a bottle BT in which a large volume of sample is stored and the lower end opening of the bottle BT, and does not allow contaminant microorganisms to permeate inside. It is provided with a cartridge (specimen tube FC) having a filter FC1 formed with small holes of a certain size, and a pump (not shown) for sucking the internal liquid from the lower end of the specimen tube.
- the liquid inside is aspirated from the lower end of the sample tube FC by a pump or the like, thereby transferring the sample onto the filter FC1 of the sample tube FC. It is configured so that it can be concentrated.
- the operation of the pump and the like may be controlled by the pretreatment control section 31 described above.
- the pretreatment unit 1 may wash the concentrate by adding distilled water or an appropriate buffer onto the filter FC1. This cleaning process may be performed by the preprocessing section 1 or may be manually performed by the user himself/herself.
- the specimen tube FC described above is arranged so as to be in contact with a cylindrical tube main body FC2 with both ends open, and the inner peripheral surface of the tube main body FC2. and a filter cassette FC3 in which the above-described filter FC1 is arranged in a direction perpendicular to the axial direction of the tube main body FC2.
- a slight gap S may be formed between the filter cassette FC3 and the inner peripheral surface of the tube main body FC2. If a sample is supplied into the sample tube FC with this gap S formed, and a part of the sample enters this gap S, accurate measurement will not be possible if the sample contains a component that affects luminescence measurement. will hinder.
- a buffer solution, distilled water, or the like that does not affect the ATP measurement is circulated to fill the gap S formed between the filter cassette FC3 and the tube main body FC2. It is preferable to introduce a buffer solution, distilled water, or the like in advance. In order to make it easier for these liquids to enter the gaps described above, a chemical such as a surfactant may be added to the buffer solution or distilled water.
- ⁇ Pretreatment method> As a means for the preprocessing unit 1 configured in this way to select contaminant microorganisms to be detected from a sample, cells other than contaminant microorganisms in the sample are crushed by a physical or chemical method, or filtered. You can mention how to do it.
- Examples of physical disruption include cell disruption beads and nanopillars that adjust the pressure or osmotic pressure of a sample, apply ultrasonic waves or electric shocks to the sample, or selectively destroy cells according to their size. Those caused by contact can be mentioned.
- Adjusting the pressure or osmotic pressure of a sample means for example, a method of crushing cells other than contaminant microorganisms by adjusting the water pressure or osmotic pressure at which contaminant microorganisms to be detected can survive but other cells cannot survive. etc. can be mentioned.
- cultured cells obtained by culturing cells of multicellular organisms are less resistant to pressure changes and osmotic pressure than cells of unicellular organisms such as microorganisms, so this method can easily screen out only contaminating microorganisms.
- Beads for cell disruption are commercially available that are suitable for the size and type of cells to be disrupted, and the size and material of beads used for cell disruption are completely different between microorganisms and other cells. Therefore, by selecting beads of the optimal size and material for crushing cells other than contaminant microorganisms, for example, cultured cells of multicellular animals, it is possible to crush contaminant microorganisms without crushing them. It is possible to crush only the cells of In addition, when disrupting cells with beads, the shaking speed and shaking time differ depending on the target cells. It is also possible to disrupt only cells other than the cells.
- the sample by bringing the sample into contact with the nanopillars, which are fine needle-like structures, only relatively large-sized cells may be crushed by the needle-like structures of the nanopillars.
- one or more selected from predetermined medium components, surfactants, enzymes, apoptosis inducers, and cytolysins are added to the sample, or the temperature or pH of the sample can be induced by adjusting the
- the contaminant cells to be detected can survive as in the physical disruption method described above, but the conditions may be such that other cells cannot survive.
- a predetermined medium component is added to the sample.
- a proteolytic enzyme capable of specifically disrupting other cells or a toxin such as cytolysin may be added to the sample.
- surfactants after adjusting the surfactant concentration in the sample to be at or above the critical micelle concentration, we examined the conditions for cell disruption with various types of surfactants. It was confirmed that the concentration of surfactant required for disruption varied depending on the size of the cells, such as that the cells were disrupted with a concentration of surfactant. Among them, compared to polar anionic surfactants, cationic surfactants, and amphoteric surfactants, the action on cells is gentle, and the conditions for selectively disrupting cells can be easily set. , it is considered preferable to use a nonionic surfactant, which is a nonpolar surfactant, as the surfactant.
- the temperature and pH of the sample are set to a range in which contaminant microorganisms can survive but other cells are killed, or the cells are killed by an apoptosis-inducing agent or the like, thereby causing autolysis and indirect crushing. You can do it.
- cells other than contaminant microorganisms present in a sample are cells of multicellular animals
- cells of multicellular animals since cells of multicellular animals generally have a narrower temperature range and pH range than microorganisms, Cells other than contaminant microorganisms can be made dead by setting the conditions (temperature and/or pH) in which only contaminant microorganisms can survive.
- the pH is adjusted by titration instead of adjusting the pH.
- a buffer solution that can easily change the pH within a desired pH range, particularly within a range of pH 5.5 or more and pH 8.5 or less.
- Such buffers include, for example, 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (Tris), phosphate-buffered saline (PBS), 2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate (MES), Bis(2-hydroxyethyl) iminotris(hydroxymethyl)methane (Bis ⁇ Tris), N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid (ADA), Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N-(2-Acetamido)-2 -aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPSC), N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N-Tris(hydroxymethyl)methyl- 2-aminoethanesulf
- an agent that induces apoptosis by acting only on cells other than the contaminating microorganisms without acting on the contaminating microorganisms to be detected can be selected and used from known apoptosis-inducing agents.
- a wide variety of apoptosis-inducing agents that cause apoptosis are known, for example, chemically synthesized substances, naturally occurring substances, biologically derived substances, etc., and research on their mechanisms of action is progressing. Therefore, it is not difficult to select a substance that acts only on cells other than contaminating organisms without acting on contaminating microorganisms. Either one of the physical crushing method and the chemical crushing method described above may be selected and used, or a combination thereof may be used.
- a filter that allows only contaminant microorganisms to pass.
- cells other than the contaminant microorganisms such as cultured cells larger than the contaminant microorganisms, are not allowed to pass through, and only contaminant microorganisms smaller in size than the cultured cells are filtered.
- a size exclusion filter which allows passage. This method is particularly effective when separating cells having completely different cell sizes such as cultured cells and contaminant microorganisms.
- the process of sorting out contaminant microorganisms as described above may be performed inside a tank or the like that is separate from the bottle BT described above. Further, this preprocessing step may be partially performed manually by the user, or may be performed automatically by the preprocessing section 1 .
- the amount of ATP in the concentrated liquid obtained by concentrating after selecting the contaminating microorganisms to be detected from the sample is measured. Even when the population of contaminating microorganisms is very low, the amount of ATP derived from microorganisms can be measured by conventional ATP meters.
- the measurement unit subtracts the light intensity signal obtained before the reaction of the sample and the luminescent reagent from the light intensity signal obtained after the reaction of the sample and the luminescent reagent, and obtains the amount of ATP. Therefore, it is not necessary to detect the "luminescence intensity when the light emission is stopped" as in the conventional art. As a result, the sample measurement time can be shortened. As a result, it is possible to further shorten the time required to detect contaminating microorganisms.
- a method for selecting contaminating microorganisms from a sample is physical disruption caused by adjusting the temperature or osmotic pressure of the sample, or applying ultrasonic waves or electric shocks to the sample, and adding a surfactant to the sample. , enzymes, and cytolysins, which are caused by adding one or more selected from chemical disruption, filtering, etc. Only microorganisms can be concentrated.
- the luminescent reagent is added to the container containing the biological sample, but the biological sample may be added to the container containing the luminescent reagent.
- RNA contained in the residual liquid. It is conceivable to identify the bacterial species from More specifically, a DNA sequencer is used to identify bacterial strains from the remaining liquid. In the case of RNA, a DNA sequencer can be used after synthesizing DNA by reverse transcription.
- Amplification by DNA amplification method can be considered as a process for analysis with a DNA sequencer.
- the residual liquid is collected using, for example, DNA collection beads, and the collected DNA is amplified by PCR.
- the residual liquid contains the ATP extract.
- a surfactant for the ATP extract, for example, a surfactant, a mixed solution of ethanol and ammonia, methanol, ethanol, trichloroacetic acid, perchloric acid, Tris buffer, etc.
- surfactants include sodium dodecyl sulfate, potassium lauryl sulfate, sodium monolauroyl phosphate, sodium alkylbenzene sulfonate, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, cetylpyridinium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, myristyldimethylbenzylammonium chloride. etc.
- ATP extracts inhibit the action of enzymes that degrade DNA, and there is a risk that the ATP extracts will deactivate the PCR enzymes when PCR is performed on samples after ATP measurement. Therefore, the ATP extract may be removed or diluted, neutralized, or masked prior to PCR.
- the microorganism detection device may further include a biofilm decomposing unit that decomposes the biofilm in the sample, for example, before the pretreatment unit 1 .
- a biofilm decomposing unit that decomposes the biofilm in the sample, for example, before the pretreatment unit 1 .
- Specific configurations of the biofilm decomposing unit include, for example, filtration devices using track-etched membranes, nylon meshes, and the like.
- a biofilm decomposing enzyme or the like may be added to chemically decompose the biofilm.
- the biofilm may be decomposed by shear stress or the like by reciprocating the sample in the capillary. This biofilm decomposition process may be performed by the decomposition unit provided in the microorganism detection device, or may be manually performed by the user.
- the microorganism detection device of the above embodiment it is also possible to measure the amount of ATP in bacteria in a spore state (spore-forming bacteria).
- the ATP amount of the spore-forming bacteria can be measured by subtracting the ATP amount before the spore-forming bacteria germinate from the ATP amount after the spore-forming bacteria germinate.
- ATP measurement is performed before the spores germinate.
- the ATP amount (Y [amol]) of only bacteria in a normal state before germination (viable bacteria) can be measured.
- the ATP amount (X [amol]) of both the spore-forming bacteria and the viable bacteria can be measured by measuring ATP after germinating the spore-forming bacteria by adding the spore reaction solution of the sample. Then, the ATP amount of the spore-forming bacteria can be calculated from XY [amol].
- spore-forming bacteria When the value of XY is large, it is known that spore-forming bacteria are generated, and the user can take countermeasures such as cleaning with a sporicidal agent or the like. In addition, after killing the viable bacteria in the sample using a certain method (e.g., heat shock method), the spore-forming bacteria are germinated by heating, or by adding nutrients to germinate the spore-forming bacteria. ATP levels can also be measured.
- a certain method e.g., heat shock method
- the ATP-removing solution when the ATP-removing solution is added to the treated solution and when the ATP-removing solution is not added, if ATP is extracted from these with the ATP extraction solution and a luminescence reagent is added and measured, Since ATP derived from dead cells of microorganisms and free ATP not derived from microorganisms in the treated liquid can be eliminated, the amount of ATP derived only from living microorganisms can be calculated. Furthermore, it is also possible to estimate the existence ratio of dead microorganisms and live microorganisms by comparing with the case where no ATP elimination solution is added.
- the determination of whether or not microorganisms are present in the sample may be made by the user as described above, or the apparatus further includes a determination unit that determines the presence or absence of microorganisms based on the amount of ATP calculated by the calculation unit. It is good as In addition, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and it goes without saying that various modifications are possible without departing from the spirit of the present invention.
- microorganisms in samples can be detected more quickly than before.
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Abstract
従来よりも迅速に夾雑微生物を検出するために、試料中の夾雑微生物を検出する微生物検出装置であって、試料から夾雑微生物を選別して濃縮する前処理部と、前記前処理部によって濃縮された濃縮液中のＡＴＰ量を測定する測定部とを備え、前記前処理部が、前記試料中の前記夾雑微生物以外の細胞を物理的破砕、化学的破砕及び／又はフィルタリングによって除去することによって前記試料から前記夾雑微生物を選別するものである、微生物検出装置とした。
Description
本発明は、試料に含まれる夾雑微生物を検出する装置及方法に関するものである。
例えば、培養細胞等を含む製品においては、出荷時にその一部を試料として採取して微生物汚染が起こっていないかどうかを検査している。
このような検査において試料中に汚染源となる夾雑微生物が含まれているか否かを検出する方法としては、特許文献１や特許文献２に挙げるように微生物に含まれるＡＴＰ（アデノシン三リン酸）に、発光試薬を添加し、その生物発光を測定する方法が考えられている。
試料中にわずかに含まれている夾雑微生物に由来するＡＴＰをそのまま測定することは難しいため、特許文献１では、微生物を培養し、この培養時に増加するＡＴＰ量を測定している。また特許文献２では、微生物のみを特異的に認識する抗体を用いて試料から微生物のみを分離してから、分離した微生物から取り出したＡＴＰを酵素反応によって増幅させてから測定している。
しかしながら、これらの方法では、微生物自体や微生物由来のＡＴＰを増幅させる工程を経る必要があるために、微生物の検出に時間がかかってしまうという問題がある。
しかしながら、これらの方法では、微生物自体や微生物由来のＡＴＰを増幅させる工程を経る必要があるために、微生物の検出に時間がかかってしまうという問題がある。
そこで本発明は、上述した課題を解決すべくなされたものであり、試料中の微生物を従来よりもさらに迅速に検出することを主な目的とするものである。
すなわち本発明に係る微生物検出装置は、試料から夾雑微生物を選別して濃縮する前処理部と、前記前処理部によって濃縮された濃縮液に含まれるＡＴＰ量を測定する測定部とを備え、前記前処理部が、前記試料中の前記夾雑微生物以外の細胞を物理的破砕、化学的破砕及び／又はフィルタリングによって除去することによって前記試料から前記夾雑微生物を選別することを特徴とする。
このような微生物検出装置であれば、前記試料中の夾雑微生物以外の細胞を物理的破砕、化学的破砕及び／又はフィルタリングによって除去して濃縮した濃縮液中のＡＴＰ量を測定するので、夾雑微生物やＡＴＰを増幅させる工程が不要である。その結果、従来よりもさらに迅速に夾雑微生物を検出することができる。
前記物理的破砕としては、前記試料の圧力や浸透圧を調節する、前記試料に対して超音波若しくは電気ショックを与える、又は細胞破砕用ビーズ若しくはナノピラーとの接触によって引き起こされるものを挙げることができる。
前記化学的破砕としては、前記試料に対して、目的の細胞を選択的に死滅させることができる所定の培地成分、界面活性剤、酵素、アポトーシス誘導剤及び細胞融解素から選択される１種以上を添加する、又は前記試料の温度若しくはｐＨを目的の細胞を選択的に死滅させる温度に調節することによって引き起こされるものを挙げることができる。
前記フィルタリングとしては、前記夾雑微生物のみを通過させるフィルタを用いるものを挙げることができる。
本発明の具体的な実施態様としては、前記測定部が前記濃縮液中に含まれる前記夾雑微生物から抽出されたＡＴＰの量を測定するものを挙げることができる。
前記測定部が、遊離のＡＴＰを除去するＡＴＰ消去液添加後の前記濃縮液に含まれる前記夾雑微生物から抽出されたＡＴＰの量を測定するものであれば、生きている夾雑微生物由来のＡＴＰのみを測定することができる。また、この測定結果を、ＡＴＰ消去液を添加していない場合の測定結果と比較することによって、前記濃縮液中の遊離のＡＴＰ量及び死んだ夾雑微生物由来のＡＴＰ量についても知ることができる。
夾雑微生物が、耐久性の高い芽胞状態になっている場合には、ＡＴＰ抽出液によってＡＴＰが抽出できない場合がある。そこで、前記測定部が、芽胞状態の前記夾雑微生物を発芽させる発芽液添加後の前記濃縮液に含まれる前記夾雑微生物からＡＴＰを抽出されたＡＴＰの量を測定するものであれば、芽胞状態の夾雑微生物を含めたすべての夾雑微生物からＡＴＰを抽出することができる。また、発芽液を添加していない場合の測定結果と比較することによって、前記濃縮液中に存在する芽胞状態の夾雑微生物の量について知ることもできる。
前記試料が、培養細胞を含むものである場合に、本発明の効果が特に顕著に発揮される。
夾雑微生物がバイオフィルムを形成していることも考えられるので、バイオフィルムを分解するバイオフィルム分解部をさらに備えることが好ましい。
また、本発明に係る微生物検出方法は、前記試料中の前記夾雑微生物以外の細胞を、物理的破壊、化学的破壊及び／又はフィルタリングによって除去することによって、前記試料から前記夾雑微生物を選別して濃縮し、濃縮して得た濃縮液中のＡＴＰ量を測定することを特徴とする。
前記濃縮液中に含まれる夾雑微生物の種類を同定する工程をさらに備えるものとすれば、夾雑微生物の存在だけでなく、夾雑微生物の種類を同定することも可能である。
このように構成した本発明によれば、前記試料中の夾雑微生物以外の細胞を物理的破砕、化学的破砕及び／又はフィルタリングによって除去して濃縮した濃縮液中のＡＴＰ量を測定するので、夾雑微生物やＡＴＰを増幅させる工程が不要である。その結果、従来よりもさらに迅速に夾雑微生物を検出することができる。
以下、本発明に係る微生物検出装置の一実施形態について図面を参照して説明する。
＜装置構成＞
本実施形態の微生物検出装置１００は、試料に含まれる夾雑微生物由来の物質により生じる光を分析することによって、その生体由来の物質の量を測定するものである。なお、以下では、夾雑微生物由来の物質としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の量（ａｍｏｌ（＝１０－１８ｍｏｌ））を測定するＡＴＰ量測定装置について説明する。
本実施形態の微生物検出装置１００は、試料に含まれる夾雑微生物由来の物質により生じる光を分析することによって、その生体由来の物質の量を測定するものである。なお、以下では、夾雑微生物由来の物質としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の量（ａｍｏｌ（＝１０－１８ｍｏｌ））を測定するＡＴＰ量測定装置について説明する。
具体的にこの微生物検出装置１００は、例えば、図１に示すように、試料を前処理する前処理部１と、前処理部１によって処理された処理済み液中のＡＴＰ量を測定する測定部２と、これら前処理部１及び測定部２を制御する制御部３と、前記測定部２からの出力信号に基づいてＡＴＰ量を算出する算出部４と、算出部４によって算出されたＡＴＰ量を表示する表示部６等とを備えるものである。本実施形態では、制御部３の一例として、前処理部を制御する前処理制御部３１と、測定部を制御する測定制御部３２とを備えるようにしてあるが、これに限られない。
これら制御部３や算出部４等は、例えば、ＣＰＵ、メモリ、入出力インターフェイス、ＡＤ変換器などからなるコンピュータＣＯＭによりその機能が発揮されるものである。表示部６は、前述したコンピュータＣＯＭに設けられているものを用いても良いし、別途設けられたディスプレイ等を用いるようにしても良い。図１では、前処理制御部３１として機能するＣＯＭ１と測定制御部３２、算出部４等として機能するＣＯＭ２とを備え、表示部６を1台のみ備えるものとしているが、これに限られない。
これら制御部３や算出部４等は、例えば、ＣＰＵ、メモリ、入出力インターフェイス、ＡＤ変換器などからなるコンピュータＣＯＭによりその機能が発揮されるものである。表示部６は、前述したコンピュータＣＯＭに設けられているものを用いても良いし、別途設けられたディスプレイ等を用いるようにしても良い。図１では、前処理制御部３１として機能するＣＯＭ１と測定制御部３２、算出部４等として機能するＣＯＭ２とを備え、表示部６を1台のみ備えるものとしているが、これに限られない。
前処理部１は、本発明の特徴構成であるので、後で詳述することとする。
測定部２は、いわゆるＡＴＰ計であり、例えば、図２に示すように、試料を収容する複数の容器２２を保持するホルダ２３と、所定位置に固定された光検出器２４と、ホルダ２３を移動させるホルダ駆動機構２５と、ホルダ２３に保持された容器２２内にＡＴＰと反応して光を生じさせる発光試薬を分注などする分注機構２６とを備えている。
なお、本実施形態に係る測定部２は、図２及び図３に示すように、ホルダ２３を出し入れするための扉Ｃ２を有する筐体Ｃを備えている。筐体Ｃは、ホルダ２３、ホルダ駆動機構２５及び分注機構２６等のＡＴＰ測定に必要な測定系機器類を収容する筐体本体Ｃ１と、当該筐体本体Ｃ１に設けられた開閉可能な扉Ｃ２とを備えている。扉Ｃ２を、例えば、上方向に持ち上げて開けることによって、筐体本体Ｃ１の内部に利用者がアクセス可能となる。また扉Ｃ２を閉めることにより、装置内部が暗室状態となるようにしてある。
その他、筐体本体Ｃ１には、前処理部１によって処理された処理済み液が収容された複数の検体チューブＦＣを保持して温調する温調機構２７と、各試薬を収容した試薬容器ＲＣ１、ＲＣ２がセットされる試薬セット部２８と、分注機構２６に用いられるピペットチップＰＴが設けられるピペットチップセット部２９とが設けられている。
試薬セット部２８は、前処理部１によって前処理された処理済み液からＡＴＰを抽出するための反応試薬を収容した試薬容器ＲＣ１と、発光試薬を収容した試薬容器ＲＣ２とがセットされるものである。反応試薬としては、処理済み液に含まれる生細胞（生菌）以外のＡＴＰ（遊離ＡＴＰ）を消去するＡＴＰ消去液、芽胞状態の菌を発芽させる芽胞反応液、及び、生細胞からＡＴＰを抽出するＡＴＰ抽出液等である。
ホルダ２３は、例えば、複数の容器２２を円環状に保持するものであり、具体的には、所定の回転中心に対して同一円上に保持するものである。なお、容器２２は有底筒形状をなす樹脂製のものであり、本実施形態では有底円管状をなす樹脂製のものである。
光検出器２４は、図２に示すように、ホルダ２３に保持された容器２２内の試料から出る光を検出するものであり、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）である。光検出器２４は、ホルダ２３に保持された容器２２よりも下側に設けられている。そして、光検出器２４の上方には、容器２２内の試料から出る光を光検出器２４に導くためのリフレクタ２１１を有する光学系が設けられている。
ホルダ駆動機構２５は、ホルダ２３を移動させ、ホルダ２３に保持されている各容器２２を、光検出器２４による検出位置Ｘｄｅｔに順次位置づけるものである。具体的にホルダ駆動機構２５は、ホルダ２３を前記所定の回転中心周りに回転させるものであり、図２に示すように、ホルダ２３が設置される設置台２５１と、当該設置台２５１に設置されたホルダ２３を回転させるための回転軸２５２と、当該回転軸２５２を回転させるアクチュエータ２５３とを備えている。その他、ホルダ駆動機構２５には、ホルダ２３の回転位置を検出するための回転位置センサ（不図示）が設けられている。この回転位置センサの検出信号に基づいて、アクチュエータ２５３は、制御部３によって測定すべき容器２２を検出位置Ｘｄｅｔに位置付けるように回転制御される。回転位置センサによって予め定められた原点などの目印となる位置を検知し、その他の位置についてはアクチュエータ２５３であるモータのパルス数で管理するようにしても良い。このように構成することによって、回転位置センサの構成をより簡単なものとすることができるので好ましい。
分注機構２６は、図２～図３に示すように、試料や各試薬を吸引又は吐出するためのノズル２６１と、ノズル２６１に接続された流路を介してノズル２６１の吸引又は吐出を駆動する例えばシリンジ等のポンプ機構２６２と、ノズル２６１を所定方向に移動させるノズル移動機構２６３とを備えている。
ノズル２６１は、試料や各試薬に接触してそれらを保持するためのピペットチップＰＴを着脱可能に保持するチップホルダ２６１Ｈを備えている。このチップホルダ２６１Ｈは内部流路が形成されたものであり、その基端部に流路が接続されており、先端開口部にピペットチップＰＴが接続される。
また、ノズル移動機構２６３は、ノズル２６１を水平方向（Ｘ軸方向及びＹ軸方向）に直線移動させるとともに、ノズル２６１を鉛直方向（Ｚ軸方向）に直線移動させるものである。このノズル移動機構２６３は前述した制御部３によって制御されるようにしてある。
そして、分注に使用したピペットチップＰＴの取り外しは、ホルダ２３の廃棄箱２１０の上方において行われる。廃棄箱２１０は、例えば、ホルダ２３に一体に設けられているものであり、本実施形態においては、ホルダ２３においてデッドスペースとなる複数の容器２２の内側に設けられている。ピペットチップＰＴの取り外しは、具体的には、廃棄箱２１０の上方に配置されたチップ外し部材（不図示）にノズル２６１を移動させることによって行っても良いし、可動部材６３１にチップ外し部材を設けておき、可動部材６３１を廃棄箱２１０の上方に移動させた後にチップ外し部材を用いて行っても良い。
また、測定部２は、図２に示すように、検出位置Ｘｄｅｔにある容器２２内の試料から出る光を光検出器２４に導く一方で、それ以外の容器２２（具体的には測定が終了した容器２２）内の試料から出る光が光検出器２４に導かれることを防止する遮光機構２１３をさらに備えるものとしても良い。
＜分析方法＞
次にこのように構成した微生物検出装置１００の動作とともに微生物の検出方法について説明する。
次にこのように構成した微生物検出装置１００の動作とともに微生物の検出方法について説明する。
前記前処理部によって前処理された処理済み液を収容した検体チューブＦＣを温調機構２７にセットする。所定数の検体チューブＦＣをセットした状態で扉Ｃ２を閉じ、測定を開始する。なお、この状態でホルダ２３に保持された各容器２２は空であるが、標準液測定用の容器２２にはＡＴＰ量が既知の標準液が収容されている。
測定が開始されると制御部３は、分注機構２６を制御して温調機構２７に保持された検体チューブＦＣそれぞれに、例えば図４に示すように、各反応試薬を所定のシーケンスに従って分注する。これにより検体チューブＦＣ内の試料に所定の処理（ＡＴＰ抽出）が行われる。なお、反応試薬毎にピペットチップＰＴは交換され、使用済みのピペットチップＰＴは廃棄箱２１０に廃棄される。
具体的には、検体チューブＦＣ内の試料に、ＡＴＰ消去液及び芽胞反応液の混合液を分注し、各試薬の反応が完了するまで、所定温度に保温しながら待機する。その後、検体チューブＦＣ内の試料にＡＴＰ抽出液を分注して、ＡＴＰの抽出が完了するまで、所定温度に保温しながら待機する。なお、ＡＴＰ消去液及び芽胞反応液の混合液ではなく、ＡＴＰ消去液及び芽胞反応液を別々に分注してもよい。
例えば、図４に示すように、処理済み液にＡＴＰ液及び芽胞反応液を添加し、その後ＡＴＰ抽出液でＡＴＰを抽出し、発光試薬を添加して測定すれば、芽胞状態の夾雑微生物をも含めた生きた状態の夾雑微生物全体に由来するＡＴＰ量を測定することが可能である。また、この時に芽胞反応液を添加しない対照サンプルから抽出されたＡＴＰ量についても測定しておけば、芽胞状態の微生物のみに由来するＡＴＰ量を算出することも可能である。
例えば、図４に示すように、処理済み液にＡＴＰ液及び芽胞反応液を添加し、その後ＡＴＰ抽出液でＡＴＰを抽出し、発光試薬を添加して測定すれば、芽胞状態の夾雑微生物をも含めた生きた状態の夾雑微生物全体に由来するＡＴＰ量を測定することが可能である。また、この時に芽胞反応液を添加しない対照サンプルから抽出されたＡＴＰ量についても測定しておけば、芽胞状態の微生物のみに由来するＡＴＰ量を算出することも可能である。
また、校正液については、上記の試料への試薬分注後の待ち時間の間に、ＡＴＰ量が既知のスタンダード液、及びＡＴＰ量がゼロのゼロ液に各反応試薬を所定のシーケンスに従って分注する。具体的には、標準液測定用の容器及びブランク測定用の容器に、それぞれＡＴＰ消去液及び芽胞反応液を分注した後に、ＡＴＰ抽出液を分注し、その後スタンダード液又はゼロ液を分注する。なお、ゼロ液への各反応試薬の分注順は上記に限られない。
このとき、例えば、試料、ＡＴＰ消去液、芽胞反応液及びＡＴＰ抽出液の混合比と、スタンダード液、ＡＴＰ消去液、芽胞反応液及びＡＴＰ抽出液の混合比と、ゼロ液、ＡＴＰ消去液、芽胞反応液及びＡＴＰ抽出液の混合比とが同じとなるようにされている。具体的には、それらの混合比が所定の値となるようにされている。このように試料とスタンダード液とゼロ液とで各試薬の液量を同じにすることで、液中のｐＨを同一にすることができる。その結果、発光試薬を分注する前の液の前提条件を同一にすることができ、正確な光強度を検出することができる。
その後、分注機構２６は、各検体チューブＦＣ内の前処理済み試料を、ホルダ２３に保持された各容器２２内にそれぞれ分取する。
そして、制御部３は、ホルダ駆動機構２５を制御して測定すべき容器２２を検出位置Ｘｄｅｔに移動させる。測定すべき容器２２を検出位置Ｘｄｅｔに移動させた後、制御部３は、分注機構２６を制御して発光試薬を検出位置Ｘｄｅｔにある容器２２内に導入する。これにより、検出位置Ｘｄｅｔにある容器２２内の試料から出る光が光検出器２４により検出されることにより発光測定が行われる。なお、各容器２２の発光測定前に、ブランク測定及び標準液測定が実施されて、ゼロ点校正及びスパン校正が行われる。
光検出器２４により得られた光強度信号は、算出部４により演算処理が施されてＡＴＰ量（ａｍｏｌ）が算出される。
具体的には、この算出部４は、「試料に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引くことにより容器２２の蓄光を除去して、生体由来の物質の量に関連する値を算出する。
「試料に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」は、発光試薬を導入した時点から所定時間（例えば数秒～数十秒間）までの積算信号の平均値である積算平均信号であり、「発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」は、発光試薬を導入する以前の所定時間（例えば数秒から数十秒）までの積算信号の平均値である積算平均信号である。ここで、「発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」は、容器２２に蓄光した光に基づくものである。例えば測定開始前に容器２２を微生物検出装置１００の外に置いておくと、紫外線や蛍光灯等の光が容器２２に蓄光することがある。したがって、算出部４は、「容器２２由来の光強度信号と生体由来の光強度信号とを含む第１光強度信号」から「容器２２由来のみの光強度信号である第２光強度信号」を差し引く。これにより、微生物検出装置１００は、夾雑微生物由来の光強度信号のみを正確に算出できる。なお、ブランク測定及び標準液測定における信号処理も同様である。また、光強度信号は、積算平均信号に限られず、発光試薬を導入した時点から所定時間（例えば数秒～数十秒間）までの単なる積算信号であっても良いし、その他の演算処理を施した信号であっても良い。
このようにして、算出部４は、各容器２２それぞれについて、以下の式（数１）により、ＡＴＰ量（ａｍｏｌ）を算出する。
Samplesignalは、サンプル測定で得られる信号であり、「試料に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「試料に発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引いた信号である。
STDsignalは、標準液測定で得られる信号であり、「スタンダード液に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「スタンダード液に発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引いた信号である。
Zerosignalは、ブランク測定で得られる信号であり、「ゼロ液に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「ゼロ液に発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引いた信号である。なお、ブランク測定において発光試薬を添加した際に発光ピークが生じているが、生じない場合もある。
STDsignalは、標準液測定で得られる信号であり、「スタンダード液に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「スタンダード液に発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引いた信号である。
Zerosignalは、ブランク測定で得られる信号であり、「ゼロ液に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「ゼロ液に発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引いた信号である。なお、ブランク測定において発光試薬を添加した際に発光ピークが生じているが、生じない場合もある。
上記の演算により、標準液測定用の容器、ブランク測定用の容器及びサンプル測定用の容器２２それぞれの蓄光量のばらつきを除去して、精度良くＡＴＰ量を算出することができる。
利用者は、前述したようにして算出されたＡＴＰ量に基づいて、試料中に夾雑微生物が存在しているか否かを判断する。具体的には、例えば、前処理部における試料の濃縮率と算出されたＡＴＰ量から求められる試料中のＡＴＰ濃度について、所定の閾値を設定するようにして、試料中のＡＴＰ濃度がこの閾値を超えている場合には、夾雑微生物が存在していると判断するようにしても良い。
１つの容器２２の発光測定が終了した後に、制御部３は、ホルダ駆動機構２５を制御して次の測定すべき容器２２を検出位置Ｘｄｅｔに移動させる。このようにして順次各容器２２内の試料の発光測定が行われる。ここで、各容器２２内の試料の発光測定毎にピペットチップＰＴは交換され、使用済みのピペットチップＰＴは廃棄箱２１０に廃棄される。なお、同じ試薬を連続して分注する場合など、コンタミの危険が小さい場合には、ピペットチップＰＴを一回ずつ交換することなく、そのまま使うようにしても良い。
このようにして全ての試料について測定が終了した後に、扉Ｃ２を開けて温調機構２７に保持された検体チューブＦＣを交換するとともに、ホルダ２３に保持された容器２２を交換する。ここで、ホルダ２３の保持された容器２２を交換する場合には、ホルダ２３の保持孔３ｈを持ってホルダ２３を装置本体から取り外す。このホルダ２３には、使用済みの廃棄されたピペットチップＰＴがホルダ２３の廃棄箱２１０に入っているので、ホルダ２３を装置本体から取り外すことによって廃棄されたピペットチップＰＴも同時に装置本体から取り出すことができる。
＜特徴構成＞
前処理部１は、例えば、培養細胞等の製品の一部をサンプリングした試料から検出対象である夾雑微生物を選別する選別部としての機能と、選別された夾雑微生物を濃縮した濃縮液を得る濃縮部としての機能とを果たすものである。
前処理部１は、例えば、培養細胞等を破砕及び／又はフィルタリングによって除去して、夾雑微生物のみを選別するものである。破砕は、図５に示すような、大容量の試料を貯留したボトルＢＴ内で行われるものとしても良い。また、フィルタリングは、培養細胞を通過させず夾雑微生物細胞のみを通過させるフィルタ（不図示）等を用いて行われるものとしても良い。
また、前処理部１は、前述したようにして選別した夾雑微生物を、この夾雑微生物を透過させないフィルタＦＣ１を用いて濃縮するものである。前処理部１は、例えば、図５に示すように、大容量の試料を貯留したボトルＢＴと、該ボトルＢＴの下端開口部に着脱可能に取り付けられるものであり、内部に夾雑微生物を透過させないサイズの細穴が形成されたフィルタＦＣ１を備えたカートリッジ（検体チューブＦＣ）と、当該検体チューブの下端部から内部の液体を吸引するポンプ（不図示）とを備えるものである。前記カートリッジの上端部を、ボトルＢＴの下端開口部に差し込んだ状態で、当該検体チューブＦＣの下端部から内部の液体をポンプ等で吸引することにより、前記検体チューブＦＣのフィルタＦＣ１上に試料を濃縮することができるように構成されている。前記ポンプ等の動作については、前述した前処理制御部３１が制御するようにしても良い。
前処理部１は、例えば、培養細胞等の製品の一部をサンプリングした試料から検出対象である夾雑微生物を選別する選別部としての機能と、選別された夾雑微生物を濃縮した濃縮液を得る濃縮部としての機能とを果たすものである。
前処理部１は、例えば、培養細胞等を破砕及び／又はフィルタリングによって除去して、夾雑微生物のみを選別するものである。破砕は、図５に示すような、大容量の試料を貯留したボトルＢＴ内で行われるものとしても良い。また、フィルタリングは、培養細胞を通過させず夾雑微生物細胞のみを通過させるフィルタ（不図示）等を用いて行われるものとしても良い。
また、前処理部１は、前述したようにして選別した夾雑微生物を、この夾雑微生物を透過させないフィルタＦＣ１を用いて濃縮するものである。前処理部１は、例えば、図５に示すように、大容量の試料を貯留したボトルＢＴと、該ボトルＢＴの下端開口部に着脱可能に取り付けられるものであり、内部に夾雑微生物を透過させないサイズの細穴が形成されたフィルタＦＣ１を備えたカートリッジ（検体チューブＦＣ）と、当該検体チューブの下端部から内部の液体を吸引するポンプ（不図示）とを備えるものである。前記カートリッジの上端部を、ボトルＢＴの下端開口部に差し込んだ状態で、当該検体チューブＦＣの下端部から内部の液体をポンプ等で吸引することにより、前記検体チューブＦＣのフィルタＦＣ１上に試料を濃縮することができるように構成されている。前記ポンプ等の動作については、前述した前処理制御部３１が制御するようにしても良い。
前記フィルタＦＣ１は、夾雑微生物以外の細胞を破砕した場合に生じる細胞破砕物を通過させるものであるため、フィルタＦＣ１上には実質的に夾雑微生物の細胞のみが濃縮されることとなる。
夾雑微生物細胞以外の細胞破砕物などをできるだけ除去するために、前処理部１が、フィルタＦＣ１上に蒸留水や適切な緩衝液等を添加することによって、濃縮液を洗浄するものとしても良い。この洗浄工程は、前処理部１が行っても良いし、利用者自身が手作業で行うものとしても良い。
夾雑微生物細胞以外の細胞破砕物などをできるだけ除去するために、前処理部１が、フィルタＦＣ１上に蒸留水や適切な緩衝液等を添加することによって、濃縮液を洗浄するものとしても良い。この洗浄工程は、前処理部１が行っても良いし、利用者自身が手作業で行うものとしても良い。
前述した検体チューブＦＣは、例えば、図６に示すように、両端が開口した筒状のチューブ本体ＦＣ２と、該チューブ本体ＦＣ２の内側周面に接するように配置されて、チューブ本体ＦＣ２の中程に前述したフィルタＦＣ１をチューブ本体ＦＣ２の軸方向に対して垂直な方向に配置するフィルタカセットＦＣ３とを備えるものである。このフィルタカセットＦＣ３をチューブ本体ＦＣ２の内周面に取り付けた際に、フィルタカセットＦＣ３とチューブ本体ＦＣ２の内周面との間にわずかな隙間Ｓが形成されてしまう場合がある。この隙間Ｓが形成されている状態で検体チューブＦＣ内に試料を供給すると試料の一部がこの隙間Ｓに侵入すると、サンプルが発光計測に影響を与えるような成分を含む場合、正確な測定を阻害することになる。
そこで、検体チューブＦＣに試料を供給する前に、ATP測定に影響を与えない緩衝液や蒸留水等を流通させて、前述したフィルタカセットＦＣ３とチューブ本体ＦＣ２との間に形成された隙間Ｓに予め緩衝液や蒸留水等を入り込ませておくことが好ましい。前述した隙間にこれら液体をより入り込みやすくするために、緩衝液や蒸留水に界面活性剤等の薬剤を添加しても良い。
＜前処理方法＞
このように構成された前処理部１が、試料から検出対象である夾雑微生物を選別する手段としては、試料中の夾雑微生物以外の細胞を、物理的又は化学的な方法で破砕する方法やフィルタリングする方法を挙げることができる。
このように構成された前処理部１が、試料から検出対象である夾雑微生物を選別する手段としては、試料中の夾雑微生物以外の細胞を、物理的又は化学的な方法で破砕する方法やフィルタリングする方法を挙げることができる。
物理的な破砕としては、例えば、試料の圧力若しくは浸透圧を調節する、前記試料に対して超音波若しくは電気ショックを与える、又は細胞を大きさによって選択的に破壊する細胞破砕用ビーズやナノピラーに接触させることによって引き起こされるものを挙げることができる。
試料の圧力若しくは浸透圧を調節するとは、例えば、検出対象である夾雑微生物は生存できるが、他の細胞にとっては生存できない水圧や浸透圧に調節することによって、夾雑微生物以外の細胞を破砕する方法などを挙げることができる。特に多細胞生物の細胞を培養した培養細胞等は、微生物等の単細胞生物の細胞に比べて圧力変化や浸透圧に対する耐性が低いので、この方法によって簡単に夾雑微生物のみを選別することができる。
試料に対して超音波若しくは電気ショックを与える場合も同様に、検出対象である夾雑微生物は生存できるが、その他の細胞は破砕される範囲の超音波や電気ショックを与えることによって、夾雑微生物を選別するものである。特に、培養細胞等は、微生物の細胞に比べて細胞のサイズが大きいために、微生物に比べて超音波や電気ショックの影響を受けやすく、本発明者が行った実験によれば、例えば、電気ショックであれば、培養細胞は１ｋＶ／ｃｍ以下の電圧で破砕されるが、微生物は破砕されないことが確かめられている。
細胞破砕用のビーズは破砕対象の細胞の大きさや種類によって適切なものが市販されており、さらに微生物とその他の細胞とでは細胞破砕に用いられるビーズの大きさや素材が全く異なる。また、そのため、夾雑微生物以外の細胞である、例えば、多細胞動物の培養細胞等を破砕するのに最適な大きさや素材のビーズを選択することによって、夾雑微生物は破砕せずに、夾雑微生物以外の細胞のみを破砕することが可能である。また、ビーズによって細胞を破砕する場合には、対象の細胞によって振とう速度や振とう時間が異なるため、ビーズの大きさや材質だけでなく、振とう速度や振とう時間を調節することによって夾雑微生物以外の細胞のみを破砕することも可能である。
また、試料を微細な針状構造であるナノピラーに接触させることによって、比較的大きなサイズの細胞のみをナノピラーの針状構造で破砕するようにしても良い。
化学的な破砕としては、例えば、前記試料に対して所定の培地成分、界面活性剤、酵素、アポトーシス誘導剤及び細胞融解素から選択される１種以上を添加する、又は前記試料の温度若しくはｐＨを調節することによって引き起こされるものを挙げることができる。
化学的な破砕方法についても、前述した物理的破砕と同じく検出対象である夾雑細胞は生存できるが、他の細胞にとっては生存できない条件とすればよく、例えば、試料に所定の培地成分を添加することによって試料の組成を調整したり、試料に対して添加する界面活性剤の量を制御して試料中の界面活性剤の濃度を調節したり、検出対象の夾雑微生物の細胞は破壊せず、他の細胞を特異的に破砕することができるタンパク質分解酵素や、細胞融解素などの毒素を試料に添加したりするものとしても良い。
界面活性剤については、試料中の界面活性剤濃度が臨界ミセル濃度以上となるように調整した上で、様々な種類の界面活性剤による細胞破砕の条件を検討したところ、より大きい細胞はより低濃度の界面活性剤で破砕される等、細胞の大きさによって破砕に必要な界面活性剤の濃度が異なることが確認できた。中でも、極性を有するアニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤及び両性界面活性剤に比べて、細胞に対する作用が緩やかであり、細胞を選択的に破砕するための条件を設定しやすいという観点から、界面活性剤として非極性の界面活性剤である非イオン系界面活性剤を使用することが好ましいと考えられる。
他にも、試料の温度やｐＨを夾雑微生物は生存できるがそれ以外の細胞は死滅するような範囲とする、又はアポトーシス誘導剤などによって死細胞とすることによって自己消化させて間接的に破砕するようにしても良い。
例えば、試料中に存在する夾雑微生物以外の細胞が、多細胞動物の細胞である場合には、多細胞動物の細胞は微生物に比べて、生存できる温度範囲やｐＨ範囲が一般的に狭いため、夾雑微生物と生存できる条件（温度及び／又はｐＨ）を夾雑微生物のみが生存できる範囲に設定することによって、夾雑微生物以外の細胞を死細胞とさせることができる。試料溶液に触れる実験器具をできるだけ減らして実験器具などに由来する微生物汚染を防ぐために、例えば、試料溶液のｐＨを目的のｐＨ範囲に変化させる場合に、ｐＨを滴定法によって調整するのではなく、必要な試薬の量を予め算出してから一度に添加する等の工夫をすることが好ましい。
また、試料の主成分が緩衝液である場合には、緩衝液としてｐＨを所望のｐＨ範囲、特にｐＨ５．５以上ｐＨ８．５以下の範囲内で変化させやすいものを使用することが好ましい。このような緩衝液としては例えば、2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol(Tris)、phosphate-buffered saline (PBS)、2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate(MES)、Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane(Bis・Tris)、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid(ADA)、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)(PIPES)、N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid(ACES)、3-Morpholinopropanesulfonic acid(MOPSC)、N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES)、3-Morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)、N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid(TES)、2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid(HEPES)、3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid(DIPSO)、
2-Hydroxy-N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid(TAPSO)又はPiperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid),dehydrate(POPSO)等の緩衝液を挙げることができる。
また、試料の主成分が緩衝液である場合には、緩衝液としてｐＨを所望のｐＨ範囲、特にｐＨ５．５以上ｐＨ８．５以下の範囲内で変化させやすいものを使用することが好ましい。このような緩衝液としては例えば、2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol(Tris)、phosphate-buffered saline (PBS)、2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate(MES)、Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane(Bis・Tris)、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid(ADA)、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)(PIPES)、N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid(ACES)、3-Morpholinopropanesulfonic acid(MOPSC)、N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES)、3-Morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)、N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid(TES)、2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid(HEPES)、3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid(DIPSO)、
2-Hydroxy-N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid(TAPSO)又はPiperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid),dehydrate(POPSO)等の緩衝液を挙げることができる。
アポトーシス誘導剤としては、検出対象である夾雑微生物には作用せずに、夾雑微生物以外の細胞のみに作用してアポトーシスを引き起こすものを既知のアポトーシス誘導剤の中から選択して使用することができる。
アポトーシスを引き起こすアポトーシス誘導剤としては、例えば、化学的に合成されたものや天然に存在する物質や生体由来の物質等、多種多様なものが知られており、それぞれの作用機構について研究が進んでいるために、夾雑微生物には作用せずに、夾雑生物以外の細胞にのみ作用するものを選択することは難しいことではない。
前述した物理的破砕方法や化学的破砕方法のうちのいずれか１つのみを選択して用いても良いし、組み合わせて用いても良い。
アポトーシスを引き起こすアポトーシス誘導剤としては、例えば、化学的に合成されたものや天然に存在する物質や生体由来の物質等、多種多様なものが知られており、それぞれの作用機構について研究が進んでいるために、夾雑微生物には作用せずに、夾雑生物以外の細胞にのみ作用するものを選択することは難しいことではない。
前述した物理的破砕方法や化学的破砕方法のうちのいずれか１つのみを選択して用いても良いし、組み合わせて用いても良い。
フィルタリングとしては、例えば、夾雑微生物のみを通過させるフィルタを用いることが考えられる。この場合には、前述した夾雑微生物の濃縮に用いられるフィルタとは異なり、夾雑微生物以外の細胞、例えば夾雑微生物よりも大きい培養細胞などを通過させず、培養細胞よりもサイズが小さい夾雑微生物のみを通過させるサイズ排除フィルタを用いることが考えられる。この方法は、培養細胞と夾雑微生物など細胞の大きさが全く異なる細胞同士を分離する場合には、特に有効である。
以上に述べたような夾雑微生物の選別工程は、前述したボトルＢＴとは別のタンクなどを用意してその内部で行うものとしても良い。また、この前処理工程は、その一部を利用者自身が手作業で行うものとしても良いし、前処理部１が自動で行うものとしても良い。
＜本実施形態の効果＞
このように構成された本実施形態に微生物検出装置１００によれば、検出対象である夾雑微生物を試料中から選別した後に濃縮して得た濃縮液中のＡＴＰ量を測定するので、試料中の夾雑微生物の個体数が非常に少ない場合であっても、微生物に由来するＡＴＰの量を従来のＡＴＰ計によって測定することができる。
このように構成された本実施形態に微生物検出装置１００によれば、検出対象である夾雑微生物を試料中から選別した後に濃縮して得た濃縮液中のＡＴＰ量を測定するので、試料中の夾雑微生物の個体数が非常に少ない場合であっても、微生物に由来するＡＴＰの量を従来のＡＴＰ計によって測定することができる。
そのため、微生物を培養したり、微生物から抽出したＡＴＰを増幅させたりする等の工程が不要であり、従来よりもさらに迅速に夾雑微生物を検出することができる。
さらに、本実施形態では、測定部が、試料及び発光試薬が反応した後に得られた光強度信号から試料及び発光試薬が反応する前に得られた光強度信号を差し引いて、ＡＴＰの量に関連する値を算出するので、従来のように「発光が収まった状態の発光強度」を検出する必要がない。その結果、試料の測定時間を短縮することができる。その結果、夾雑微生物の検出に係る時間をさらに短縮することが可能である。
さらに、本実施形態では、測定部が、試料及び発光試薬が反応した後に得られた光強度信号から試料及び発光試薬が反応する前に得られた光強度信号を差し引いて、ＡＴＰの量に関連する値を算出するので、従来のように「発光が収まった状態の発光強度」を検出する必要がない。その結果、試料の測定時間を短縮することができる。その結果、夾雑微生物の検出に係る時間をさらに短縮することが可能である。
試料中から夾雑微生物を選別する方法が、試料の温度若しくは浸透圧を調節する又は前記試料に対して超音波若しくは電気ショックを与えることによって引き起こされる物理的な破砕、前記試料に対して界面活性剤、酵素及び細胞融解素から選択される１種以上を添加することによって引き起こされる化学的な破砕、又はフィルタリング等によるものであるので、特別な試薬や特殊な装置を準備することなく、簡単に夾雑微生物のみを濃縮することができる。
＜その他の実施形態＞
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
例えば、前記実施形態では、生体試料を収容した容器に発光試薬を添加する構成であったが、発光試薬を収容した容器に生体試料を添加する構成としても良い。
その上、前記実施形態の測定部でＡＴＰを測定した試料に含まれる菌種を同定するようにしてもよい。
具体的には、発光試薬を添加した後の残液（ＡＴＰ測定後の試料）又は、検体チューブＦＣ内の残液（ＡＴＰ測定前の試料）を用いて、残液中に含まれるＤＮＡ又はＲＮＡから菌種を同定することが考えられる。より詳細には、ＤＮＡシーケンサを用いて、前記残液から菌種を同定する。なお、ＲＮＡの場合は、逆転写によりＤＮＡを合成した後に、ＤＮＡシーケンサを用いることができる。
ＤＮＡシーケンサで分析するための処理としては、ＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ）により増幅することが考えられる。ここでは、残液から例えばＤＮＡ捕集ビーズを用いて捕集し、捕集したＤＮＡをＰＣＲにより増幅する。残液には、ＡＴＰ抽出液が含まれている。
ＡＴＰ抽出液は、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、過塩素酸、トリス緩衝液等を好適に使用することができる。界面活性剤の例としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイルリン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等が挙げられる。ＡＴＰ抽出液は、ＤＮＡを分解する酵素の働きを阻害するものもあり、ＡＴＰ測定後の試料についてＰＣＲをする場合には、ＡＴＰ抽出液がＰＣＲの酵素を失活させる恐れがある。そのため、ＰＣＲの前にＡＴＰ抽出液を除去もしくは希釈、中和、マスクする処理を行ってもよい。
試料中に存在する夾雑微生物が、バイオフィルムを形成している場合も考えられる。このようなバイオフィルムで守られている夾雑微生物からはＡＴＰを効率よく抽出しにくい場合がある。そこで、微生物検出装置が、試料中のバイオフィルムを分解するバイオフィルム分解部を、例えば、前処理部１の前段に、さらに備えるものとしても良い。
バイオフィルム分解部の具体的な構成としては、例えば、トラックエッチドメンブレン、ナイロンメッシュ等を用いたろ過装置を挙げることができる。
また、前述したボトルＢＴ内において、バイオフィルムを分解する分解酵素などを添加して、バイオフィルムを化学的に分解するようにしても良い。また、試料を細管内で往復させてせん断応力などによって、バイオフィルムを分解するようにしても良い。このバイオフィルム分解工程については、微生物検出装置が備える分解部が行うようにしても良いし、利用者が手作業で行うようにしても良い。
バイオフィルム分解部の具体的な構成としては、例えば、トラックエッチドメンブレン、ナイロンメッシュ等を用いたろ過装置を挙げることができる。
また、前述したボトルＢＴ内において、バイオフィルムを分解する分解酵素などを添加して、バイオフィルムを化学的に分解するようにしても良い。また、試料を細管内で往復させてせん断応力などによって、バイオフィルムを分解するようにしても良い。このバイオフィルム分解工程については、微生物検出装置が備える分解部が行うようにしても良いし、利用者が手作業で行うようにしても良い。
さらに、前記実施形態の微生物検出装置により、芽胞状態の菌（芽胞菌）のＡＴＰ量を測定することもできる。つまり、芽胞菌を発芽させた後のＡＴＰ量から芽胞菌が発芽する前のＡＴＰ量を差し引くことによって、芽胞菌のＡＴＰ量を測定することができる。
具体的には、処理済み液（濃縮液）に芽胞反応液を入れないで、或いは、芽胞反応液を入れた場合には芽胞菌が発芽する前に、ＡＴＰ測定を行うことにより、芽胞菌が発芽する前の通常状態の菌（生菌）のみのＡＴＰ量（Ｙ［ａｍｏｌ］）を測定することができる。また、試料の芽胞反応液を入れて芽胞菌を発芽させた後に、ＡＴＰ測定を行うことにより、芽胞菌及び生菌の両方のＡＴＰ量（Ｘ［ａｍｏｌ］）を測定することができる。そして、Ｘ－Ｙ［ａｍｏｌ］により、芽胞菌のＡＴＰ量を算出することができる。Ｘ－Ｙの値が大きい場合には、芽胞菌が生成されていることが分かり、ユーザは殺芽胞剤などを用いて清掃するなどの対策を取ることができる。また、ある手法（例えば、ヒートショック法）を用いて試料中の生菌を死滅させた後に、加熱により芽胞菌を発芽させたり、栄養を添加することにより芽胞菌を発芽させることで芽胞菌のＡＴＰ量を測定することもできる。
さらに言えば、同様にして処理済み液にＡＴＰ消去液を添加した場合とＡＴＰ消去液を添加しない場合とにおいて、これらからＡＴＰ抽出液でＡＴＰを抽出し、発光試薬を添加して測定すれば、処理済み液中の微生物の死細胞由来のＡＴＰ及び微生物に由来しない遊離ＡＴＰを消去することができるので、生きている微生物のみに由来するＡＴＰ量を算出することができる。さらに、ＡＴＰ消去液を添加しない場合との比較により、死んだ微生物と生きた微生物との存在比を見積もること等も可能である。
試料中に微生物が存在するか否かの判断については、前述したように利用者が行うものとしても良いし、算出部によって算出されたＡＴＰ量から微生物が存否を判断する判断部をさらに備えるものとしても良い。
その他、本発明は前記実施形態に限られず、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。
その他、本発明は前記実施形態に限られず、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。
本発明によれば、試料中の微生物を従来よりもさらに迅速に検出することができる。
１００・・・微生物検出装置
１ ・・・前処理部
２ ・・・測定部
１ ・・・前処理部
２ ・・・測定部
Claims (11)
- 試料中の夾雑微生物を検出する微生物検出装置であって、
試料から夾雑微生物を選別して濃縮する前処理部と、
前記前処理部によって濃縮された濃縮液中のＡＴＰ量を測定する測定部とを備え、
前記前処理部が、前記試料中の前記夾雑微生物以外の細胞を物理的破砕、化学的破砕及び／又はフィルタリングによって除去することによって前記試料から前記夾雑微生物を選別するものである、微生物検出装置。 - 前記物理的破砕が、前記試料の圧力若しくは浸透圧を調節する、前記試料に対して超音波若しくは電気ショックを与える、又は、細胞破砕用ビーズ若しくはナノピラーに接触させることによって引き起こされるものである、請求項１に記載の微生物検出装置。
- 前記化学的破砕が、前記試料に対して所定の培地成分、界面活性剤、酵素、アポトーシス誘導剤及び細胞融解素から選択される１種以上を添加する、又は前記試料の温度又はｐＨを目的の細胞を選択的に死滅させる温度に調節することによって引き起こされるものである、請求項１に記載の微生物検出装置。
- 前記フィルタリングが、前記夾雑微生物のみを通過させるフィルタを用いるものである、請求項１に記載の微生物検出装置。
- 前記測定部が、前記濃縮液中の前記夾雑微生物から抽出されたＡＴＰの量を測定するものである、請求項１～４の何れか一項に記載の微生物検出装置。
- 前記測定部が、遊離のＡＴＰを除去するＡＴＰ消去液添加後の前記濃縮液中の前記夾雑微生物から抽出されたＡＴＰの量を測定するものである、請求項１～４の何れか一項に記載の微生物検出装置。
- 前記測定部が、芽胞状態の前記夾雑微生物を発芽させる芽胞反応液添加後の前記濃縮液中の前記夾雑微生物からＡＴＰを抽出されたＡＴＰの量を測定するものである、請求項１～４の何れか一項に記載の微生物検出装置。
- 前記試料が、前記夾雑微生物以外の細胞として培養細胞を含有するものである、請求項１～７の何れかに記載の微生物検出装置。
- バイオフィルムを分解するバイオフィルム分解部をさらに備え、
前記バイオフィルム分解部が、前記前処理部の前段に設けられている、請求項１～７の何れか一項に記載の微生物検出装置。 - 試料中の夾雑微生物を検出する方法であって、
前記試料中の前記夾雑微生物以外の細胞を、物理的破壊、化学的破壊及び／又はフィルタリングによって除去することによって、前記試料から前記夾雑微生物を選別して濃縮し、濃縮して得た濃縮液中のＡＴＰ量を測定することを特徴とする微生物検出方法。 - 前記濃縮液中に含まれる夾雑微生物の種類を同定する同定工程をさらに備える、請求項１０に記載の微生物検出方法。
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|---|---|---|---|
| EP22807565.1A EP4339273A1 (en) | 2021-05-14 | 2022-05-13 | Microorganism detection apparatus and microorganism detection method |
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|---|---|
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| JP2006081506A (ja) | 2004-09-17 | 2006-03-30 | Hiroshima Univ | 微生物の高感度迅速検出方法 |
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-
2022
- 2022-05-13 JP JP2023521268A patent/JPWO2022239867A1/ja active Pending
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Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NISHIKAWA, KEISUKE : "Case Study of Application and Utilization of Microorganism Rapid Test Method in Pharmaceutical Water", PHARM TECH JAPAN, vol. 37, no. 3, 1 March 2021 (2021-03-01), JP , pages 417 - 425, XP009541200, ISSN: 0910-4739 * |
Also Published As
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|---|---|
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