WO2021002105A1 - 生体試料分析装置及び生体試料分析方法 - Google Patents

生体試料分析装置及び生体試料分析方法 Download PDF

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sample
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biological sample
light intensity
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秀喜 中山
嘉希 深尾
成典 木戸
中井　陽子
要平 岡
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株式会社堀場アドバンスドテクノ
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Definitions

  • the present invention relates to a biological sample analyzer and a biological sample analysis method for analyzing light generated by a biological substance contained in a sample.
  • microbial monitoring has been carried out for environmental management of pharmaceutical manufacturing plants and food plants.
  • a luminescent reagent is added to ATP (adenosine triphosphate) contained in the microorganism, the bioluminescence thereof is measured, and the obtained luminescence intensity is converted into the amount of ATP. Can be correlated.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Patent Document 1 As a device for analyzing light generated by a substance derived from a living body such as ATP, the device shown in Patent Document 1 is considered.
  • a luminescent reagent is added to a sample containing a substance derived from a living body, and the luminescence intensity of the luminescence peak and the luminescence after a lapse of a predetermined time (for example, about 10 minutes) from the luminescence peak have subsided. It is detected as the emission intensity of.
  • the number of bacteria is converted by using the luminescence intensity obtained by subtracting the "light emission intensity in the state where the luminescence is suppressed" from the "emission intensity of the luminescence peak".
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and a sample containing a substance derived from a living body and a luminescent reagent are stored in a container, and the luminescence generated by reacting them is detected to detect the substance derived from the living body.
  • the main task is to shorten the measurement time of the sample and improve the measurement accuracy.
  • the biological sample analyzer holds a sample containing a biological substance and a luminescent reagent in a container, detects luminescence generated by reacting them, and analyzes the biological sample. It ’s a device, The photodetector that detects the light emission and outputs a light intensity signal, and the light intensity signal obtained after the reaction of the light emitting reagent with the sample, obtained before the sample and the light emitting reagent react with each other. It is characterized by including a calculation unit that removes the phosphorescence of the container by subtracting a light intensity signal and calculates a value related to the amount of a substance derived from a living body.
  • the light intensity signal obtained before the reaction of the sample and the luminescent reagent is subtracted from the light intensity signal obtained after the reaction of the sample and the luminescent reagent to obtain the substance derived from the living body. Since the value related to the amount is calculated, it is not necessary to detect the "emission intensity in the state where the emission is suppressed" as in the conventional case. As a result, the measurement time of the sample can be shortened. Further, since the phosphorescence of the container is removed by subtracting the light intensity signal obtained before the reaction of the sample and the luminescent reagent from the light intensity signal obtained after the reaction of the sample and the luminescent reagent, the phosphorescence of the container is removed.
  • the phosphorescence of the container is light other than bioluminescence generated by the reaction of the sample and the luminescent reagent, and includes phosphorescence and fluorescence emitted from the container.
  • the biological sample analyzer sequentially measures the emission of the samples contained in the plurality of the containers.
  • the amount of phosphorescence in the plurality of containers is different. Therefore, the amount of phosphorescence to be deducted differs for each container. Therefore, in each of the plurality of containers, the calculation unit obtains the light intensity before the reagent and the light emitting reagent react from the light intensity signal obtained after the sample and the light emitting reagent react with each other. It is desirable to subtract the signal. With this configuration, the measurement accuracy in each of the plurality of containers can be improved.
  • the substance derived from the living body is adenosine triphosphate (hereinafter referred to as ATP), which detects the luminescence derived from ATP generated by the reaction between the sample and the ATP luminescent reagent. Can be considered.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the biological sample analyzer of the present invention uses the reagent in the sample, a standard solution having a known ATP amount, and a zero solution having an ATP amount of zero. It is desirable to further provide a dispensing mechanism for dispensing. Specifically, the dispensing mechanism dispenses ATP scavenging solution, spore reaction solution, ATP extract, luminescent reagent, etc. into the sample, the standard solution, and the zero solution. Conventionally, the liquid volume of each reagent is different between the standard liquid, the zero liquid, and the sample.
  • the dispensing mechanism uses the mixing ratio of the ATP scavenging solution, the spore reaction solution, and the ATP extract solution to be added to the sample, and the standard solution. It is desirable to control their mixing ratio to be the same as their mixing ratio in the zero liquid.
  • the ATP extract has the effect of inactivating the ATP scavenger. Therefore, it is desirable that the dispensing mechanism is controlled so as to dispense the ATP extract after adding the ATP scavenging solution and the spore reaction solution to the standard solution. By dispensing each reagent in this order, a standard solution containing an ATP scavenging solution can be prepared.
  • the biological sample analyzer of the present invention houses a measurement system device for biological sample analysis inside, and has a housing body having an opening, a door for opening and closing the opening of the housing body, and the housing. It is desirable to provide a concavo-convex structure that is provided at each contact portion between the opening of the main body and the door and that fits with each other in a state where the door closes the opening. With this configuration, the light entering the inside of the device from between the housing body and the door can be blocked by the uneven structure, and the measurement accuracy can be improved.
  • the biological sample analyzer of the present invention may further include a waste box for discarding the pipette tip for injecting the reagent into the sample.
  • the disposal box in order to reliably dispose of each pipette tip in the disposal box, the disposal box is divided into a disposal space for each of the pipette tips to be discarded, and the discarded pipette tip is placed in each disposal space. It is desirable to have an inclined portion that is inclined in a predetermined direction. In the configuration without the inclined portion, the orientation of the discarded pipette tip varies in the disposal space, which may interfere with the discarded pipette tip.
  • a biological sample containing a biological substance and a luminescent reagent are stored in a container, and the luminescence generated by reacting them is detected to analyze the biological substance. It is an analysis method, and the phosphorescence of the container is obtained by subtracting the light intensity signal obtained before the sample and the luminescent reagent react from the light intensity signal obtained after the reaction of the sample and the luminescent reagent. Is removed, and the value related to the amount of the substance derived from the living body is calculated.
  • a biological sample analyzer for storing a sample containing a biological substance and a luminescent reagent in a container, detecting luminescence generated by reacting them, and analyzing the biological substance.
  • the measurement time of the sample can be shortened and the measurement accuracy can be improved.
  • the biological sample analyzer 100 of the present embodiment measures the amount of the biological substance by analyzing the light generated by the biological substance contained in the sample.
  • the biological sample analyzer 100 moves a holder 3 that holds a plurality of containers 2 for accommodating samples, a photodetector 4 fixed at a predetermined position, and a holder 3.
  • a holder drive mechanism 5 and a dispensing mechanism 6 for dispensing a luminescent reagent that reacts with ATP to generate light in a container 2 held in the holder 3 are provided.
  • the biological sample analyzer 100 of the present embodiment includes a housing C having a door C2 for inserting and removing the holder 3.
  • the housing C includes a housing main body C1 that houses measurement equipment necessary for ATP measurement such as a holder 3, a holder drive mechanism 5, and a dispensing mechanism 6, and a door C2 provided in the housing main body C1. I have.
  • the housing body C1 has an opening C1h on the front surface.
  • the door C2 is provided so as to be openable and closable with respect to the opening C1h of the housing body C1. Specifically, the upper portion of the opening C1h can be opened and closed by a horizontal connecting shaft (not shown), and the user can access the inside of the housing body C1 by lifting the door C2 upward. It will be possible.
  • each of the contact portions between the housing body C1 and the door C2 is provided with concave-convex structures 15 and 16 that are fitted to each other with the door C2 closing the opening C1h. ..
  • the uneven structures 15 and 16 are omitted in FIGS. 2 and 3.
  • the uneven structures 15 and 16 are provided so as to surround substantially the entire circumference of the opening C1h.
  • the concave-convex structure 15 provided at the contact portion of the housing main body C1 has an opening inside the main body outer ridge portion 151 provided so as to surround the opening C1h and the inside of the main body outer ridge portion 151. It is composed of a ridge portion 152 on the inside of the main body provided so as to surround the portion C1h.
  • the concave-convex structure 16 provided at the contact portion of the door C2 includes a door outer convex portion 161 provided so as to surround the opening C1h outside the main body outer convex portion 151 of the housing main body C1 and a housing.
  • the inside of the housing C may be in a dark room state by sealing between the door C2 and the opening C1h with a sealing member (not shown).
  • the housing body C1 has a temperature control mechanism 7 that holds and controls a plurality of sample tube FCs containing samples, and a reagent set unit 8 in which reagent containers RC1 and RC2 containing each reagent are set. And a pipette tip set portion 9 in which the pipette tip PT used in the dispensing mechanism 6 is provided.
  • the temperature control mechanism 7 accommodates and holds a plurality of sample tube FCs in, for example, a matrix.
  • the temperature control mechanism 7 detects the temperature of a metal (for example, aluminum) holder block 71 that holds the sample tube FC, a heat source portion 72 such as a heater provided on the holder block 71, and the holder block 71. It is equipped with an equal temperature sensor 73. Based on the temperature detected by the temperature sensor 73, the heater 72, which is a heat source unit, is controlled by the control device COM so that the temperature of the holder block 71 becomes a predetermined temperature.
  • the reagent setting unit 8 is set with a reagent container RC1 containing a pretreatment reagent for pretreating a sample and a reagent container RC2 containing a luminescent reagent.
  • pretreatment reagents ATP scavenging solution that eliminates ATP (free ATP) other than living cells (live bacteria) contained in the sample, spore reaction solution that germinates spore-like bacteria, and ATP is extracted from living cells. ATP extract or the like.
  • the holder 3 holds a plurality of containers 2 in an annular shape, and specifically, holds the holder 3 on the same circle with respect to a predetermined rotation center.
  • the holder 3 of the present embodiment holds a container 2b for blank measurement and a container 2s for standard solution measurement in addition to the plurality of containers 2 for sample measurement.
  • the holder 3 is configured to be removable from the main body of the device, and a plurality of (here, two) holding holes 3h for holding are formed in order to facilitate the attachment / detachment operation.
  • the container 2 is made of a resin having a bottomed tubular shape, and in the present embodiment, it is made of a resin having a bottomed circular tubular shape.
  • the photodetector 4 detects the light emitted from the sample in the container 2 held in the holder 3, and is, for example, a photomultiplier tube (PMT).
  • the photodetector 4 is provided below the container 2 held in the holder 3.
  • An optical system 12 having a reflector 11 for guiding the light emitted from the sample in the container 2 to the photodetector 4 is provided above the photodetector 4.
  • the reflector 11 is configured to be movable back and forth with respect to the container 2 located above them.
  • the other optical system 12 including the reflector 11 or the photodetector 4 may also be configured to be movable back and forth with respect to the container 2.
  • the holder drive mechanism 5 moves the holder 3 and sequentially positions each container 2 held by the holder 3 at the detection position X det by the photodetector 4. Specifically, the holder drive mechanism 5 rotates the holder 3 around the predetermined rotation center, and is installed on the installation table 51 on which the holder 3 is installed and the installation table 51 as shown in FIG. A rotating shaft 52 for rotating the holder 3 and an actuator 53 for rotating the rotating shaft 52 are provided. In addition, the holder drive mechanism 5 is provided with a rotation position sensor (not shown) for detecting the rotation position of the holder 3. Based on the detection signal of the rotation position sensor, the actuator 53 is rotationally controlled so as to position the container 2 to be measured by the control device COM at the detection position X date .
  • the dispensing mechanism 6 drives suction or discharge of the nozzle 61 via a nozzle 61 for sucking or discharging a sample or each reagent and a flow path connected to the nozzle 61.
  • a pump mechanism 62 such as a syringe and a nozzle moving mechanism 63 for moving the nozzle 61 in a predetermined direction are provided.
  • the nozzle 61 includes a tip holder 611 that detachably holds the pipette tip PT for contacting and holding the sample and each reagent.
  • the tip holder 611 has an internal flow path formed therein, a flow path is connected to the base end portion thereof, and a pipette tip PT is connected to the tip opening portion.
  • the nozzle moving mechanism 63 linearly moves the nozzle 61 in the horizontal direction (X-axis direction and Y-axis direction) and linearly moves the nozzle 61 in the vertical direction (Z-axis direction).
  • the nozzle moving mechanism 63 includes a movable member 631 that holds the nozzle 61, a slide mechanism 632 provided in the X-axis direction, the Y-axis direction, and the Z-axis direction, respectively, and the movable member along the slide mechanism 632. It is provided with an actuator 633 for moving 631 in each direction.
  • Each operation in the ATP measurement is executed by controlling the actuator 633 and the pump mechanism 62 by the control device COM. It should be noted that each operation in the ATP measurement naturally includes attachment / detachment of the pipette tip PT to / from the tip holder 611.
  • the biological sample analyzer 100 guides the light emitted from the sample in the container 2 at the detection position X det to the photodetector 4, while the other container 2 (specifically, measurement).
  • the container 2) is provided with a light-shielding mechanism 13 for preventing the light emitted from the sample in the container 2) from being guided to the photodetector 4.
  • the light-shielding mechanism 13 includes a container-side light-shielding portion 131 provided in each container 2 and a movable-side light-shielding portion 132 that moves forward and backward with respect to the container 2 at the detection position X det .
  • the container-side light-shielding portion 131 is made of a member that does not have light transmission, and covers the entire circumference of the upper portion of each container 2.
  • a cylindrical container-side light-shielding portion 131 is provided in the container-holding portion of the holder 3, and the container 2 is housed in the container-side light-shielding portion 131 to accommodate the container 2 above the container 2 held by the holder 3. The entire circumference of the portion is covered by the light-shielding portion 131 on the container side.
  • the movable side light-shielding portion 132 is made of a member having no light transmission, and covers the entire circumference of the lower portion excluding the upper portion covered by the container-side light-shielding portion 131 in the container 2 at the detection position X det. Is.
  • the movable side light-shielding portion 132 is separated from the light-shielding position covering the lower portion of the container 2 at the detection position X det and the lower portion of the container 2 downward so as not to interfere with the movement of the holder 3.
  • the movable side light-shielding portion 132 is moved up and down by, for example, an elevating device 14 using an actuator.
  • the elevating device 14 is controlled by the control device COM in conjunction with the operations of the holder drive mechanism 5 and the dispensing mechanism 6.
  • a waste box 10 which is a waste tip accommodating portion for discarding the pipette tip PT of the dispensing mechanism 6 is integrally provided in the holder 3.
  • the waste box 10 is provided inside a plurality of containers 2 that serve as dead spaces in the holder 3.
  • the waste box 10 has an arcuate opening 10x along the arrangement direction of the plurality of containers 2 in a plan view.
  • the shape of the waste box 10 in a plan view is a substantially octagonal ring shape shown in FIG. 5, but other shapes such as an annular shape may be used. Since the waste box 10 is provided in the holder 3, the waste box 10 is taken in and out together with the holder 3 through the door C2.
  • the dead space other than the container holding portion in the holder 3 can be effectively used, so that the device 100 can be made compact.
  • a holding hole 3h for inserting and holding a finger inside the arc-shaped opening 10x is formed.
  • the pipette tip PT used for dispensing is removed above the waste box 10 of the holder 3.
  • the nozzle 61 may be moved to a tip removing member (not shown) arranged above the waste box 10, or a tip removing member may be provided on the movable member 631 to provide the movable member 631. May be carried out using the tip removing member after moving the waste box 10 upward.
  • the control device COM controls the holder drive mechanism 5 and the dispensing mechanism 6 so that the pipette tip PT is not unevenly distributed in one place of the disposal box 10.
  • the holder 3 is rotated by a predetermined angle each time each pipette tip PT is removed to change the disposal position with respect to the disposal box 10, and (2) the disposal position of a predetermined number of pipette tip PTs is changed. While keeping the same, it is conceivable to rotate the pipette tips PT by a predetermined angle each time a predetermined number of pipette tips PTs are removed to change the disposal position with respect to the disposal box 10.
  • the pipette tip PT to be discarded in the waste box 10 can be scattered as a whole, and it can be prevented that the pipette tip PT is unevenly distributed in one place and protrudes from the waste box 10.
  • a large volume (for example, 50 ml to 200 ml) of a sample is concentrated to a predetermined amount (for example, 1 ⁇ l to 1000 ⁇ l) to generate a sample.
  • the sample is concentrated on the filter FC1 of the sample tube FC by inserting the portion and sucking from the lower end of the sample tube FC with a pump.
  • an air layer may be formed at the lower end opening of the bottle BT and the connection portion of the sample tube FC, and suction may not be successful. Therefore, as shown in FIG. 7B, it is conceivable that the sample container 200 composed of the bottle BT and the sample tube FC is subjected to the vibration stirrer 300 to remove the air layer.
  • the container holder 400 accommodates the sample tube FC and is in contact with the lower surface and the side surface of the bottle BT to hold the sample container 200.
  • the tube accommodating portion 401 accommodating the sample tube FC forms a space 400s with the accommodating sample tube FC so that the sample tube FC does not come into contact with the container holder 400 and contaminate the sample tube FC. It is configured in.
  • the sample tube FC containing the concentrated sample is set in the temperature control mechanism 7. With a predetermined number of sample tubes FC set, the door C2 is closed and measurement is started. Although each container 2 held in the holder 3 in this state is empty, the container 2 for measuring the standard solution contains a standard solution having a known ATP amount.
  • the control device COM controls the dispensing mechanism 6 to dispense each pretreatment reagent to each of the sample tubes FC held in the temperature control mechanism 7 according to a predetermined sequence.
  • a predetermined pretreatment ATP extraction
  • the pipette tip PT is replaced for each pretreatment reagent, and the used pipette tip PT is discarded in the disposal box 10.
  • a mixed solution of ATP scavenging solution and spore reaction solution is dispensed into the sample in the sample tube FC, and the mixture is kept warm at a predetermined temperature until the reaction of each reagent is completed.
  • the ATP extract is dispensed into the sample in the sample tube FC, and the sample is kept warm at a predetermined temperature until the extraction of ATP is completed.
  • the ATP scavenging solution and the spore reaction solution may be dispensed separately instead of the mixed solution of the ATP scavenging solution and the spore reaction solution.
  • each pretreatment reagent is divided into a standard solution having a known ATP amount and a zero solution having an ATP amount according to a predetermined sequence.
  • the ATP scavenging solution and the spore reaction solution are dispensed into the standard solution and the zero solution, and then the ATP extract is dispensed. Since the standard solution is contained in the container 2s for measuring the standard solution and the zero solution is contained in the container 2b for measuring the blank, the dispensing mechanism 6 puts each pretreatment reagent in the container 2s. And dispense into container 2b.
  • the order of dispensing each pretreatment reagent into the zero solution is not limited to the above.
  • the mixing ratio of the sample, the ATP scavenging solution, the spore reaction solution and the ATP extract, the mixing ratio of the standard solution, the ATP scavenging solution, the spore reaction solution and the ATP extract, and the zero solution is set to be the same. Specifically, the mixing ratio thereof is set to a predetermined value.
  • the dispensing mechanism 6 sorts the pretreated sample in each sample tube FC into each container 2 held in the holder 3.
  • the control device COM controls the holder drive mechanism 5 to move the container 2 to be measured to the detection position X det .
  • the control device COM controls the elevating device 14 to move the movable side light-shielding portion 132 of the light-shielding mechanism 13 to the light-shielding position.
  • the control device COM controls the dispensing mechanism 6 to introduce the luminescent reagent into the container 2 at the detection position X det .
  • the light emitted from the sample in the container 2 at the detection position X det is detected by the photodetector 4.
  • the light intensity signal obtained by the photodetector 4 is subjected to arithmetic processing by the calculation unit of the control device COM to calculate the ATP amount (amol).
  • the calculation unit COM1 of the control device COM subtracts the "light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent" from the "light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the sample".
  • the phosphorescence of the container 2 is removed, and the value related to the amount of the substance derived from the living body is calculated.
  • the "light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the sample” is an integrated average signal which is an average value of the integrated signals from the time when the luminescent reagent is introduced to a predetermined time (for example, several seconds to several tens of seconds).
  • the "light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent” is an integrated average signal which is an average value of the integrated signals up to a predetermined time (for example, several seconds to several tens of seconds) before the introduction of the luminescent reagent.
  • the "light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent” is based on the light stored in the container 2.
  • the calculation unit COM1 selects the "second light intensity signal which is the light intensity signal only from the container 2" from the "first light intensity signal including the light intensity signal derived from the container 2 and the light intensity signal derived from the living body". Subtract.
  • the biological sample analyzer 100 can accurately calculate only the light intensity signal derived from the biological body. The same applies to signal processing in blank measurement and standard solution measurement.
  • the light intensity signal is not limited to the integrated average signal, and may be a simple integrated signal from the time when the luminescent reagent is introduced to a predetermined time (for example, several seconds to several tens of seconds), or other arithmetic processing is performed. It may be a signal.
  • the calculation unit COM1 of the control device COM calculates ATP [amol] for each of the containers 2 by the following formula (see FIG. 9).
  • the Sample signal is a signal obtained in the sample measurement, and is obtained by subtracting the "light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent to the sample” from the "light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the sample". It is a signal.
  • the STD signal is a signal obtained by measuring the standard solution, and is obtained from the "light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the standard solution” to the "light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent to the standard solution”. It is a signal obtained by subtracting.
  • the Zero signal is a signal obtained by blank measurement, and is obtained from "a light intensity signal obtained after adding a luminescent reagent to zero solution” to "a light intensity signal obtained before adding a luminescent reagent to zero solution".
  • the control device COM controls the elevating device 14 to move the movable side light-shielding portion 132 of the light-shielding mechanism 13 to the retracted position, and then controls the holder drive mechanism 5.
  • the next container 2 to be measured is moved to the detection position X date .
  • the luminescence measurement of the sample in each container 2 is sequentially performed.
  • the pipette tip PT is replaced every time the luminescence of the sample in each container 2 is measured, and the used pipette tip PT is discarded in the disposal box 10.
  • the door C2 is opened to replace the sample tube FC held by the temperature control mechanism 7, and the container 2 held by the holder 3 is replaced.
  • the holder 3 is removed from the main body of the apparatus by holding the holding hole 3h of the holder 3. Since the used and discarded pipette tip PT is contained in the waste box 10 of the holder 3, the discarded pipette tip PT is also taken out from the device body at the same time by removing the holder 3 from the device body. Can be done.
  • an ATP solution adjusted to 0, 1, 2, 4, 10, 20 amol / ⁇ L was measured using a biological sample analyzer 100.
  • the amount of light emitted in each container is shown in FIG. It can be seen that the light emission amount (light intensity signal obtained before adding the light emitting reagent) in the dark measurement under the influence of phosphorescence is larger in the container irradiated with ultraviolet rays. It can also be seen that the amount of light emitted from the peak measurement under the influence of phosphorescence (the light intensity signal obtained after adding the light emitting reagent) is also larger in the container irradiated with ultraviolet rays.
  • the light emission amount of the dark measurement is substantially the same, and the above calculation method is used. It can be seen that the amount of ATP can be calculated by removing the amount of phosphorescence in the container.
  • the light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent is subtracted from the light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the sample. Since the value related to the amount of the substance derived from the living body is calculated, it is not necessary to detect the "emission intensity in the state where the luminescence is suppressed" as in the conventional case. As a result, the measurement time of the sample can be shortened. Further, since the phosphorescence of the container 2 is removed by subtracting the light intensity signal obtained before adding the luminescent reagent from the light intensity signal obtained after adding the luminescent reagent to the sample, the container for accommodating the sample. It is not necessary to consider the phosphorescence of 2, and the measurement accuracy can be improved.
  • the holder 3 holds a plurality of containers 2 in an annular shape, but the holder 3 may hold the plurality of containers 2 in an annular shape so that the arrangement of the plurality of containers 2 is, for example, a rectangular shape, a polygonal shape, or an elliptical shape. Good.
  • the waste box 10 has two openings 10x, but it may have one or three or more openings 10x.
  • the waste space 10s is divided for each pipette tip PT to be discarded.
  • the waste space 10s has an opening 10s1 that opens on the upper surface of the waste box 10 and a throttle portion 10s2 that is formed vertically below the opening 10s1 and has an opening area smaller than the opening 10s1.
  • the opening 10s1 of each waste space 10s is configured by forming a through hole 101h in the upper surface plate 101 of the waste box 10, and the narrowing portion 10s2 of each waste space 10s is provided inside the waste box 10. It is configured by forming a through hole 102h in the intermediate plate 102.
  • the disposal space 10s is divided for each pipette tip PT in this way, the pipette tip PT that has already been discarded does not get in the way, and the pipette tip PT can be smoothly disposed of. Further, since the pipette tip PTs discarded in the disposal box 10 are separated from each other, the work of removing the discarded pipette tip PT from the disposal box 10 becomes easy, and further, for example, the waste liquid remaining in the pipette tip PT can be removed. The work of removing from the pipette tip PT also becomes easier.
  • the disposal box 10 may have an inclined portion 10y in which the discarded pipette tip PT is inclined in a predetermined direction in each disposal space 10s.
  • the inclined portion 10y is inclined so that the upper ends of the pipette tips PT discarded in each disposal space 10s do not interfere with each other.
  • the inclined portion 10y is a tapered surface formed on the bottom surface or the inner surface of the waste box 10, and the pipette tip PT is moved toward the rotation center axis side of the holder 3.
  • the upper end of the pipette is positioned outward in the radial direction.
  • the pipette tip PT discarded in the disposal box 10 becomes radial in a plan view.
  • the inclined portion 10y may be formed of a member different from the waste box 10. With such an inclined portion 10y, the orientation of the discarded pipette tip PT can be aligned in each disposal space 10s, and it is possible to prevent the pipette tip PT from being obstructed.
  • the holder 3 and the waste box 10 are integrally formed, but each may be provided separately.
  • the luminescent reagent is added to the container containing the biological sample, but the biological sample may be added to the container containing the luminescent reagent.
  • the bacterial species contained in the sample whose ATP is measured by the biological sample analyzer of the above embodiment may be identified.
  • the residual liquid after adding the luminescent reagent (sample after ATP measurement) or the residual liquid in the sample tube FC (sample before ATP measurement) is used. It is conceivable to identify the bacterial species from the DNA or RNA contained therein. More specifically, a DNA sequencer is used to identify the bacterial species from the residual liquid. In the case of RNA, a DNA sequencer can be used after synthesizing DNA by reverse transcription.
  • amplification by a DNA amplification method can be considered.
  • the residual liquid is collected using, for example, DNA collection beads, and the collected DNA is amplified by PCR.
  • the residual liquid contains an ATP extract.
  • a surfactant for example, a mixed solution of ethanol and ammonia, methanol, ethanol, trichloroacetic acid, perchloric acid, Tris buffer and the like can be preferably used.
  • surfactants are sodium dodecyl sulfate, potassium lauryl sulfate, sodium monolauroyl phosphate, sodium alkylbenzene sulfonate, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, cetylpyridinium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, myristyldimethylbenzylammonium chloride. And so on.
  • Some ATP extracts inhibit the action of enzymes that break down DNA.
  • a pretreatment for removing the ATP extract may be performed.
  • the ATP amount of the spore-forming bacterium can be measured by the biological sample analyzer of the above embodiment. That is, the ATP amount of the spore-forming bacterium can be measured by subtracting the ATP amount before the spore-forming bacterium germinates from the ATP amount after the spore-forming bacterium is germinated.
  • the ATP measurement is performed before the spore reaction solution germinates, so that the normal state before the spore bacteria germinate.
  • the amount of ATP (Y [amol]) of only the bacteria (live bacteria) can be measured.
  • the amount of ATP (X [amol]) of both the spore-forming bacterium and the viable bacterium can be measured by adding the spore-reacting solution of the sample to germinate the spore-forming bacterium and then performing the ATP measurement. Then, the amount of ATP of the spore-forming bacterium can be calculated by XY [amol].
  • spore-forming bacteria When the value of XY is large, it is known that spore-forming bacteria are generated, and the user can take measures such as cleaning with a spore-killing agent or the like. In addition, a certain method (for example, heat shock method) is used to kill live bacteria in the sample. Then, the amount of ATP of the spore-forming bacterium can be measured by germinating the spore-forming bacterium by heating or by adding nutrients to germinate the spore-forming bacterium.
  • a certain method for example, heat shock method
  • the measurement time of the sample can be shortened and the measurement accuracy can be improved.

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Abstract

本発明は、試料の測定時間を短縮するとともに測定精度を向上するものであり、生体由来の物質を含む試料及び発光試薬を容器２に収容し、それらを反応させることにより生じる発光を検出して生体由来の物質を分析する生体試料分析装置であって、発光を検出して光強度信号を出力する光検出器４と、試料に発光試薬が反応した後に得られた光強度信号から試料及び発光試薬が反応する前に得られた光強度信号を差し引くことにより容器２の蓄光を除去して、生体由来の物質の量に関連する値を算出する算出部ＣＯＭ１とを備える。

Description

生体試料分析装置及び生体試料分析方法
　本発明は、試料に含まれる生体由来の物質により生じる光を分析する生体試料分析装置及び生体試料分析方法に関するものである。
　従来、医薬品製造プラントや食品プラント等の環境管理のために微生物モニタリングが行われている。この微生物モニタリングの一例として、微生物に含まれるＡＴＰ（アデノシン三リン酸）に、発光試薬を添加し、その生物発光を測定して、得られた発光強度をＡＴＰの量に換算することで菌との相関を取ることができる。
　そしてこのＡＴＰ等の生体由来の物質により生じる光を分析する装置として、特許文献１に示すものが考えられている。この生体試料分析装置は、生体由来の物質を含む試料に発光試薬を添加し、その発光ピークの発光強度と、当該発光ピーク時から所定時間（例えば１０分程度）経過後の発光が収まった状態の発光強度と検出している。そしてこの装置では、「発光ピークの発光強度」から「発光が収まった状態の発光強度」を差し引いた発光強度を用いて、菌数に換算している。
　しかしながら、上記の方式では、「発光が収まった状態の発光強度」を検出するために発光ピーク時から所定時間（例えば１０分程度）経過するのを待つ必要があり、１つの試料の測定時間が長くなってしまう。この問題は、複数の試料を測定する構成とした場合に特に顕著となる。
　また、試料を収容する容器が樹脂製の場合には、外部における紫外線や蛍光灯などの光を蓄光してしまい、或いは、生体発光を蓄光してしまい、「発光が収まった状態の発光強度」には容器の蓄光が含まれてしまうことから、測定精度が悪くなってしまう。
特開２００８－２６８０１９号公報
　そこで本発明は、上述した課題を解決すべくなされたものであり、生体由来の物質を含む試料及び発光試薬を容器に収容し、それらを反応させることにより生じる発光を検出して生体由来の物質を分析する生体試料分析装置において、試料の測定時間を短縮するとともに測定精度を向上することをその主たる課題とするものである。
　すなわち本発明に係る生体試料分析装置は、生体由来の物質を含む試料及び発光試薬を容器に収容し、それらを反応させることにより生じる発光を検出して前記生体由来の物質を分析する生体試料分析装置であって、
　前記発光を検出して光強度信号を出力する光検出器と、前記試料に前記発光試薬が反応した後に得られた前記光強度信号から前記試料及び前記発光試薬が反応する前に得られた前記光強度信号を差し引くことにより前記容器の蓄光を除去して、生体由来の物質の量に関連する値を算出する算出部とを備えることを特徴とする。
　このような生体試料分析装置であれば、試料及び発光試薬が反応した後に得られた光強度信号から試料及び発光試薬が反応する前に得られた光強度信号を差し引いて、生体由来の物質の量に関連する値を算出するので、従来のように「発光が収まった状態の発光強度」を検出する必要がない。その結果、試料の測定時間を短縮することができる。また、試料及び発光試薬が反応した後に得られた光強度信号から試料及び発光試薬が反応する前に得られた光強度信号を差し引くことによって容器の蓄光を除去しているので、容器の蓄光を考慮する必要がなく、測定精度を向上することができる。ここで、容器の蓄光は、試料及び発光試薬が反応して生じる生物発光以外の光であり、容器から出る燐光や蛍光を含む。
　ここで、生体試料の分析効率化を図るためには、生体試料分析装置は、複数の前記容器に収容された前記試料を順次発光測定するものであることが考えられる。
　この場合、複数の容器における蓄光量はそれぞれ異なる。このため、差し引くべき蓄光量は容器毎に異なる。このため、前記算出部は、前記複数の容器それぞれにおいて、前記試料及び前記発光試薬が反応した後に得られた前記光強度信号から前記試薬及び前記発光試薬が反応する前に得られた前記光強度信号を差し引くものであることが望ましい。この構成であれば、複数の容器それぞれにおける測定精度を向上することができる。
　本発明の生体試料分析装置において、前記生体由来の物質は、アデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰ）であり、前記試料及びＡＴＰ発光試薬が反応して生じるＡＴＰ由来の発光を検出するものであることが考えられる。
　試料に試薬を自動で導入することによって分析効率を向上させるためには、本発明の生体試料分析装置は、前記試料、ＡＴＰ量が既知のスタンダード液、及びＡＴＰ量がゼロのゼロ液に試薬を分注する分注機構をさらに備えることが望ましい。具体的に分注機構は、前記試料、前記スタンダード液及び前記ゼロ液にＡＴＰ消去液、芽胞反応液、ＡＴＰ抽出液、発光試薬などを分注する。
　従来は、スタンダード液と、ゼロ液と、試料とで各試薬の液量が異なっている。このようにスタンダード液とゼロ液と試料とで各試薬の液量が異なることで、液中のｐＨが異なり、発光強度が変化してしまい、正確な光強度を検出することができない。
　この問題を好適に解決して正確な光強度を検出するためには、前記分注機構は、前記試料に添加するＡＴＰ消去液、芽胞反応液、ＡＴＰ抽出液の混合比と、前記スタンダード液におけるそれらの混合比と、前記ゼロ液におけるそれらの混合比とを同じにするように制御されることが望ましい。
　ＡＴＰ抽出液は、ＡＴＰ消去液を失活させる効果を有する。
　このため、前記分注機構は、前記スタンダード液に前記ＡＴＰ消去液及び前記芽胞反応液を添加した後に、前記ＡＴＰ抽出液を分注するように制御されることが望ましい。
　この順番で各試薬を分注することによって、ＡＴＰ消去液を含むスタンダード液を作成することができる。
　さらに、本発明の生体試料分析装置は、内部に生体試料分析用の測定系機器を収容し、開口部を有する筐体本体と、前記筐体本体の開口部を開閉する扉と、前記筐体本体の開口部と前記扉との接触部それぞれに設けられ、前記扉が前記開口部を閉塞した状態で、互いに嵌り合う凹凸構造とを備えることが望ましい。
　この構成であれば、筐体本体と扉との間から装置内部に入る光を凹凸構造で遮断することができ、測定精度を向上させることができる。
　加えて、本発明の生体試料分析装置は、前記試薬を前記試料に注入するためのピペットチップを廃棄する廃棄箱を更に備えることが考えられる。
　この構成において、廃棄箱に各ピペットチップを確実に廃棄するためには、前記廃棄箱は、廃棄される前記ピペットチップ毎に廃棄空間が区切られており、各廃棄空間に廃棄されたピペットチップを所定方向に傾斜させる傾斜部を有することが望ましい。なお、前記傾斜部を設けない構成では、廃棄空間に廃棄されたピペットチップの向きがばらついてしまい、廃棄されるピペットチップの邪魔となる恐れがある。
　また、本発明に係る生体試料分析方法は、生体由来の物質を含む試料及び発光試薬を容器に収容し、それらを反応させることにより生じる発光を検出して前記生体由来の物質を分析する生体試料分析方法であって、前記試料及び前記発光試薬が反応した後に得られた前記光強度信号から前記試料及び前記発光試薬が反応する前に得られた前記光強度信号を差し引くことにより前記容器の蓄光を除去して、生体由来の物質の量に関連する値を算出することを特徴とする。
　このように構成した本発明によれば、生体由来の物質を含む試料及び発光試薬を容器に収容し、それらを反応させることにより生じる発光を検出して生体由来の物質を分析する生体試料分析装置において、試料の測定時間を短縮するとともに測定精度を向上することができる。
本実施形態に係る生体試料分析装置の構成を示す模式図である。 同実施形態の生体試料分析装置の外観を示す斜視図である。 同実施形態の装置本体の各部の配置を示す平面図である。 同実施形態の筐体本体及び扉の凹凸構造を示す部分断面図である。 同実施形態の複数の容器を保持したホルダを示す斜視図である。 同実施形態の複数の容器を保持したホルダを示す平面図である。 同実施形態の試料の濃縮工程を示す模式図である。 試料、スタンダード液、ゼロ液における各試薬の注入量を示す表である。 同実施形態の各容器における演算方法を説明するための模式図である。 容器の蓄光影響下でのＡＴＰ量と発光量の直線性評価を行った結果を示す図である。 変形実施形態の複数の容器を保持したホルダを示す平面図である。 変形実施形態の廃棄空間を模式的に示す断面図である。 変形実施形態のＤＮＡ同定方法を示すフローチャートである。
１００・・・生体試料分析装置
２・・・容器
４・・・光検出器
ＣＯＭ１・・・算出部
６・・・分注機構
Ｃ１ｈ・・・開口部
Ｃ１・・・筐体本体
Ｃ２・・・扉
１５、１６・・・凹凸構造
ＰＴ・・・ピペットチップ
１０・・・廃棄箱
１０ｓ・・・廃棄空間
１０ｙ・・・傾斜部
　以下、本発明に係る生体試料分析装置の一実施形態について図面を参照して説明する。
＜装置構成＞
　本実施形態の生体試料分析装置１００は、試料に含まれる生体由来の物質により生じる光を分析することによって、その生体由来の物質の量を測定するものである。なお、以下では、生体由来の物質としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の量（ａｍｏｌ（＝１０－１８ｍｏｌ））を測定するＡＴＰ量測定装置について説明する。
　具体的にこの生体試料分析装置１００は、図１に示すように、試料を収容する複数の容器２を保持するホルダ３と、所定位置に固定された光検出器４と、ホルダ３を移動させるホルダ駆動機構５と、ホルダ３に保持された容器２内にＡＴＰと反応して光を生じさせる発光試薬を分注などする分注機構６とを備えている。
　なお、本実施形態の生体試料分析装置１００は、図２及び図３に示すように、ホルダ３を出し入れするための扉Ｃ２を有する筐体Ｃを備えている。筐体Ｃは、ホルダ３、ホルダ駆動機構５及び分注機構６等のＡＴＰ測定に必要な測定系機器類を収容する筐体本体Ｃ１と、当該筐体本体Ｃ１に設けられた扉Ｃ２とを備えている。また、筐体本体Ｃ１は、前面に開口部Ｃ１ｈを有している。そして、扉Ｃ２は、筐体本体Ｃ１の開口部Ｃ１ｈに対して開閉可能に設けられている。具体的には、開口部Ｃ１ｈの上側部分において水平方向の連結軸（不図示）により開閉可能とされており、扉Ｃ２を上方向に持ち上げることによって、筐体本体Ｃ１の内部に利用者がアクセス可能となる。
　ここで、筐体本体Ｃ１と扉Ｃ２との接触部それぞれには、図４に示すように、扉Ｃ２が開口部Ｃ１ｈを閉塞した状態で、互いに嵌り合う凹凸構造１５、１６が設けられている。なお、図２及び図３において凹凸構造１５、１６は省略している。
　この凹凸構造１５、１６は、開口部Ｃ１ｈの略全周を取り囲むように設けられている。本実施形態では、筐体本体Ｃ１の接触部に設けられた凹凸構造１５は、開口部Ｃ１ｈを取り囲むように設けられた本体外側凸条部１５１と、当該本体外側凸条部１５１の内側において開口部Ｃ１ｈを取り囲むように設けられた本体内側凸条部１５２とから構成される。また、扉Ｃ２の接触部に設けられた凹凸構造１６は、筐体本体Ｃ１の本体外側凸条部１５１の外側において開口部Ｃ１ｈを取り囲むように設けられた扉外側凸条部１６１と、筐体本体Ｃ１の本体外側凸条部１５１及び本体内側凸条部１５２の間に挿入される扉内側凸条部１６２とから構成される。この凹凸構造１５、１６により外部からの光の経路は蛇行状となり、装置内部に到達する前に遮断され、装置内部が暗室状態となる。これにより、迷光を低減して、測定精度を向上させることができる。その他、扉Ｃ２と開口部Ｃ１ｈとの間をシール部材（不図示）によりシールすることにより筐体Ｃ内部を暗室状態としても良い。
　その他、筐体本体Ｃ１には、検体が収容された複数の検体チューブＦＣを保持して温調する温調機構７と、各試薬を収容した試薬容器ＲＣ１、ＲＣ２がセットされる試薬セット部８と、分注機構６に用いられるピペットチップＰＴが設けられるピペットチップセット部９とが設けられている。
　温調機構７は、複数の検体チューブＦＣを例えばマトリックス状に収容して保持するものである。この温調機構７は、検体チューブＦＣを保持する金属製（例えばアルミ製）のホルダブロック７１と、ホルダブロック７１に設けられたヒータ等の熱源部７２と、ホルダブロック７１の温度を検出する熱電対等の温度センサ７３とを備えている。この温度センサ７３の検出温度に基づいて、熱源部であるヒータ７２は、制御装置ＣＯＭによってホルダブロック７１の温度が所定温度となるように制御される。
　試薬セット部８は、検体に前処理を施すための前処理用試薬を収容した試薬容器ＲＣ１と、発光試薬を収容した試薬容器ＲＣ２とがセットされるものである。前処理用試薬としては、検体に含まれる生細胞（生菌）以外のＡＴＰ（遊離ＡＴＰ）を消去するＡＴＰ消去液、芽胞状態の菌を発芽させる芽胞反応液、及び、生細胞からＡＴＰを抽出するＡＴＰ抽出液等である。
　ホルダ３は、図５及び図６に示すように、複数の容器２を円環状に保持するものであり、具体的には、所定の回転中心に対して同一円上に保持するものである。本実施形態のホルダ３は、サンプル測定用の複数の容器２の他に、ブランク測定用の容器２ｂ及び標準液測定用の容器２ｓも保持している。また、ホルダ３は、装置本体に対して着脱可能に構成されており、この着脱操作を容易にするために、保持用の複数（ここでは２つ）の保持孔３ｈが形成されている。なお、容器２は有底筒形状をなす樹脂製のものであり、本実施形態では有底円管状をなす樹脂製のものである。
　光検出器４は、図１に示すように、ホルダ３に保持された容器２内の試料から出る光を検出するものであり、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）である。光検出器４は、ホルダ３に保持された容器２よりも下側に設けられている。そして、光検出器４の上方には、容器２内の試料から出る光を光検出器４に導くためのリフレクタ１１を有する光学系１２が設けられている。このリフレクタ１１は、それらの上方に位置する容器２に対して進退移動可能に構成されている。リフレクタ１１を容器２に近接させることで容器２内に試料から出る光を効率良く光検出器４に導くことができるとともに、リフレクタ１１を容器２から退避させることで容器２の移動を邪魔しないようにできる。なお、リフレクタ１１を含むその他の光学系１２又は光検出器４も容器２に対して進退移動可能に構成しても良い。
　ホルダ駆動機構５は、ホルダ３を移動させ、ホルダ３に保持されている各容器２を、光検出器４による検出位置Ｘｄｅｔに順次位置づけるものである。具体的にホルダ駆動機構５は、ホルダ３を前記所定の回転中心周りに回転させるものであり、図１に示すように、ホルダ３が設置される設置台５１と、当該設置台５１に設置されたホルダ３を回転させるための回転軸５２と、当該回転軸５２を回転させるアクチュエータ５３とを備えている。その他、ホルダ駆動機構５には、ホルダ３の回転位置を検出するための回転位置センサ（不図示）が設けられている。この回転位置センサの検出信号に基づいて、アクチュエータ５３は、制御装置ＣＯＭによって測定すべき容器２を検出位置Ｘｄｅｔに位置付けるように回転制御される。
　分注機構６は、図１～図３に示すように、試料や各試薬を吸引又は吐出するためのノズル６１と、ノズル６１に接続された流路を介してノズル６１の吸引又は吐出を駆動する例えばシリンジ等のポンプ機構６２と、ノズル６１を所定方向に移動させるノズル移動機構６３とを備えている。
　ノズル６１は、試料や各試薬に接触してそれらを保持するためのピペットチップＰＴを着脱可能に保持するチップホルダ６１１を備えている。このチップホルダ６１１は内部流路が形成されたものであり、その基端部に流路が接続されており、先端開口部にピペットチップＰＴが接続される。
　また、ノズル移動機構６３は、ノズル６１を水平方向（Ｘ軸方向及びＹ軸方向）に直線移動させるとともに、ノズル６１を鉛直方向（Ｚ軸方向）に直線移動させるものである。具体的にノズル移動機構６３は、ノズル６１を保持する可動部材６３１と、Ｘ軸方向、Ｙ軸方向及びＺ軸方向にそれぞれ設けられたスライド機構６３２と、当該スライド機構６３２に沿って前記可動部材６３１を各方向に移動させるためのアクチュエータ６３３とを備えている。このアクチュエータ６３３及び前記ポンプ機構６２が制御装置ＣＯＭによって制御されることによってＡＴＰ測定における各動作が実行される。なお、ＡＴＰ測定における各動作には、当然、チップホルダ６１１へのピペットチップＰＴの装着及び取り外しが含まれる。
　さらに生体試料分析装置１００は、図１に示すように、検出位置Ｘｄｅｔにある容器２内の試料から出る光を光検出器４に導く一方で、それ以外の容器２（具体的には測定が終了した容器２）内の試料から出る光が光検出器４に導かれることを防止する遮光機構１３を備えている。
　この遮光機構１３は、各容器２に設けられ容器側遮光部１３１と、検出位置Ｘｄｅｔにある容器２に対して進退移動する可動側遮光部１３２とを備えている。
　容器側遮光部１３１は、光透過性を有さない部材からなり、各容器２の上側部分の全周を覆うものである。本実施形態では、ホルダ３の容器保持部に円筒状の容器側遮光部１３１を設けておき、当該容器側遮光部１３１に容器２を収容することによって、ホルダ３に保持された容器２の上側部分の全周を容器側遮光部１３１が覆う構成としている。
　可動側遮光部１３２は、光透過性を有さない部材からなり、検出位置Ｘｄｅｔにある容器２において容器側遮光部１３１により覆われた上側部分を除いた下側部分の全周を覆うものである。この可動側遮光部１３２は、検出位置Ｘｄｅｔにある容器２の下側部分を覆う遮光位置と、当該容器２の下側部分から下方に離間して、ホルダ３の移動時にその移動を邪魔しない退避位置との間で昇降移動する。なお、可動側遮光部１３２の昇降移動は例えばアクチュエータを用いた昇降装置１４により行われる。この昇降装置１４は、制御装置ＣＯＭによってホルダ駆動機構５及び分注機構６の動作と連動して制御される。
　そして、本実施形態の生体試料分析装置１００は、分注機構６のピペットチップＰＴを廃棄するための廃棄チップ収容部である廃棄箱１０がホルダ３に一体に設けられている。具体的に廃棄箱１０は、ホルダ３においてデッドスペースとなる複数の容器２の内側に設けられている。この廃棄箱１０は、平面視において複数の容器２の配置方向に沿った円弧状の開口１０ｘを有している。廃棄箱１０の平面視の形状は、図５に示す概略八角形の環状をなすものであるが、例えば円環状をなすものなどその他の形状であっても良い。廃棄箱１０がホルダ３に設けられているので、廃棄箱１０はホルダ３とともに扉Ｃ２を介して出し入れされることになる。その結果、装置本体に廃棄箱１０を引き出すための引き出し構造を設ける必要が無くなり、外光を確実に遮断することができる。また、引き出し構造が不要になることに加えて、ホルダ３における容器保持部分以外のデッドスペースを有効に利用することができるので、装置１００をコンパクト化することができる。
　このホルダ３において、円弧状の開口１０ｘよりも内側に指を挿入して保持するための保持孔３ｈが形成されている。この構成により、保持孔３ｈによりホルダ３を保持した状態で、保持した手よりも外側に廃棄箱１０及び容器２が位置する状態となり、廃棄されたピペットチップＰＴ及び測定済みの容器２への不用意な接触を防ぎやすくできる。
　そして、分注に使用したピペットチップＰＴの取り外しは、ホルダ３の廃棄箱１０の上方において行われる。具体的には、廃棄箱１０の上方に配置されたチップ外し部材（不図示）にノズル６１を移動させることによって行っても良いし、可動部材６３１にチップ外し部材を設けておき、可動部材６３１を廃棄箱１０の上方に移動させた後にチップ外し部材を用いて行っても良い。
　また、各ピペットチップＰＴの取り外す場合に、制御装置ＣＯＭは、ピペットチップＰＴが廃棄箱１０の一箇所に偏在しないように、ホルダ駆動機構５及び分注機構６を制御する。この制御態様としては、（１）各ピペットチップＰＴを取り外す毎にホルダ３を所定角度回転させて、廃棄箱１０に対する廃棄位置を変更すること、（２）所定数のピペットチップＰＴの廃棄位置を同じとしつつ、所定数のピペットチップＰＴを取り外す毎に所定角度回転させて、廃棄箱１０に対する廃棄位置を変更すること、等が考えられる。このように制御することによって、廃棄箱１０に廃棄されるピペットチップＰＴを全体的にばらけさせることができ、一箇所に偏在して廃棄箱１０からはみ出てしまうことを防ぐことができる。
＜分析方法＞
　次にこのように構成した生体試料分析装置１００の動作とともに分析方法について説明する。
　例えば大容量（例えば５０ｍｌから２００ｍｌ）の検体を所定量（例えば１μｌから１０００μｌ）に濃縮させて試料を生成する。
　ここで、上記の濃縮工程は、図７（Ａ）に示すように、大容量の検体を貯留したボトルＢＴの下端開口部に、内部にフィルタＦＣ１が形成されたカートリッジ（検体チューブＦＣ）の上端部を差し込み、当該検体チューブＦＣの下端部からポンプで吸引することにより、前記検体チューブＦＣのフィルタＦＣ１上に検体を濃縮する。ところが、ボトルＢＴの下端開口部と検体チューブＦＣの接続部に空気層ができてしまい、吸引がうまくいかないことがある。このため、図７（Ｂ）に示すように、ボトルＢＴ及び検体チューブＦＣからなる試料容器２００を振動式撹拌機３００にかけて空気層を除去することが考えられる。このとき、ボトルＢＴに対して検体チューブＦＣが細いことから、試料容器２００を振動式撹拌機３００にセットするための容器ホルダ４００を用いることが望ましい。この容器ホルダ４００は、検体チューブＦＣを収容するとともに、ボトルＢＴの下面及び側面に接触して、試料容器２００を保持するものである。ここで、容器ホルダ４００に検体チューブＦＣが接触して検体チューブＦＣが汚染されないように、検体チューブＦＣを収容するチューブ収容部４０１は、収容した検体チューブＦＣとの間に空間４００ｓを形成するように構成されている。
　上記の通り、濃縮された試料を収容した検体チューブＦＣを温調機構７にセットする。所定数の検体チューブＦＣをセットした状態で扉Ｃ２を閉じ、測定を開始する。なお、この状態でホルダ３に保持された各容器２は空であるが、標準液測定用の容器２にはＡＴＰ量が既知の標準液が収容されている。
　測定が開始されると制御装置ＣＯＭは、分注機構６を制御して温調機構７に保持された検体チューブＦＣそれぞれに各前処理試薬を所定のシーケンスに従って分注する。これにより検体チューブＦＣ内の試料に所定の前処理（ＡＴＰ抽出）が行われる。なお、前処理試薬毎にピペットチップＰＴは交換され、使用済みのピペットチップＰＴは廃棄箱１０に廃棄される。
　具体的には、検体チューブＦＣ内の試料に、ＡＴＰ消去液及び芽胞反応液の混合液を分注し、各試薬の反応が完了するまで、所定温度に保温しながら待機する。その後、検体チューブＦＣ内の試料にＡＴＰ抽出液を分注して、ＡＴＰの抽出が完了するまで、所定温度に保温しながら待機する。なお、ＡＴＰ消去液及び芽胞反応液の混合液ではなく、ＡＴＰ消去液及び芽胞反応液を別々に分注してもよい。
　また、校正液については、上記の試料への試薬分注後の待ち時間の間に、ＡＴＰ量が既知のスタンダード液、及びＡＴＰ量がゼロのゼロ液に各前処理試薬を所定のシーケンスに従って分注する。具体的には、スタンダード液及びゼロ液にＡＴＰ消去液及び芽胞反応液を分注した後に、ＡＴＰ抽出液を分注する。なお、スタンダード液は、標準液測定用の容器２ｓに収容されており、ゼロ液は、ブランク測定用の容器２ｂに収容されていることから、分注機構６は、各前処理試薬を容器２ｓ及び容器２ｂに分注する。なお、ゼロ液への各前処理試薬の分注順は上記に限られない。
　このとき、図８に示すように、試料、ＡＴＰ消去液、芽胞反応液及びＡＴＰ抽出液の混合比と、スタンダード液、ＡＴＰ消去液、芽胞反応液及びＡＴＰ抽出液の混合比と、ゼロ液、ＡＴＰ消去液、芽胞反応液及びＡＴＰ抽出液の混合比とが同じとなるようにされている。具体的には、それらの混合比が所定の値となるようにされている。このように試料とスタンダード液とゼロ液とで各試薬の液量を同じにすることで、液中のｐＨを同一にすることができる。その結果、発光試薬を分注する前の液の前提条件を同一にすることができ、正確な光強度を検出することができる。
　その後、分注機構６は、各検体チューブＦＣ内の前処理済み試料を、ホルダ３に保持された各容器２内にそれぞれ分取する。
　そして、制御装置ＣＯＭは、ホルダ駆動機構５を制御して測定すべき容器２を検出位置Ｘｄｅｔに移動させる。測定すべき容器２を検出位置Ｘｄｅｔに移動させた後、制御装置ＣＯＭは、昇降装置１４を制御して遮光機構１３の可動側遮光部１３２を遮光位置に移動させる。この状態とした後に、制御装置ＣＯＭは、分注機構６を制御して発光試薬を検出位置Ｘｄｅｔにある容器２内に導入する。これにより、検出位置Ｘｄｅｔにある容器２内の試料から出る光が光検出器４により検出される。なお、各容器２の発光測定前に、ブランク測定及び標準液測定が実施されて、ゼロ点校正及びスパン校正が行われる。
　光検出器４により得られた光強度信号は、制御装置ＣＯＭの算出部により演算処理が施されてＡＴＰ量（ａｍｏｌ）が算出される。
　具体的には、制御装置ＣＯＭの算出部ＣＯＭ１は、「試料に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引くことにより容器２の蓄光を除去して、生体由来の物質の量に関連する値を算出する。
　「試料に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」は、発光試薬を導入した時点から所定時間（例えば数秒～数十秒間）までの積算信号の平均値である積算平均信号であり、「発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」は、発光試薬を導入する以前の所定時間（例えば数秒から数十秒）までの積算信号の平均値である積算平均信号である。ここで、「発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」は、容器２に蓄光した光に基づくものである。例えば測定開始前に容器２を生体試料分析装置１００の外に置いておくと、紫外線や蛍光灯等の光が容器２に蓄光することがある。したがって、算出部ＣＯＭ１は、「容器２由来の光強度信号と生体由来の光強度信号とを含む第１光強度信号」から「容器２由来のみの光強度信号である第２光強度信号」を差し引く。これにより、生体試料分析装置１００は、生体由来の光強度信号のみを正確に算出できる。なお、ブランク測定及び標準液測定における信号処理も同様である。また、光強度信号は、積算平均信号に限られず、発光試薬を導入した時点から所定時間（例えば数秒～数十秒間）までの単なる積算信号であっても良いし、その他の演算処理を施した信号であっても良い。
　このようにして、制御装置ＣＯＭの算出部ＣＯＭ１は、各容器２それぞれについて、以下の式により、ＡＴＰ［ａｍｏｌ］を算出する（図９参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　Samplesignalは、サンプル測定で得られる信号であり、「試料に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「試料に発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引いた信号である。
　STDsignalは、標準液測定で得られる信号であり、「スタンダード液に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「スタンダード液に発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引いた信号である。
　Zerosignalは、ブランク測定で得られる信号であり、「ゼロ液に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号」から「ゼロ液に発光試薬を添加する前に得られた光強度信号」を差し引いた信号である。なお、図９においては、ブランク測定において発光試薬を添加した際に発光ピークが生じているが、生じない場合もある。
　上記の演算により、標準液測定用の容器２ｓ、ブランク測定用の容器２ｂ及びサンプル測定用の容器２それぞれの蓄光量のばらつきを除去して、精度良くＡＴＰ量を算出することができる。
　１つの容器２の発光測定が終了した後に、制御装置ＣＯＭは、昇降装置１４を制御して遮光機構１３の可動側遮光部１３２を退避位置に移動させ、その後、ホルダ駆動機構５を制御して次の測定すべき容器２を検出位置Ｘｄｅｔに移動させる。このようにして順次各容器２内の試料の発光測定が行われる。ここで、各容器２内の試料の発光測定毎にピペットチップＰＴは交換され、使用済みのピペットチップＰＴは廃棄箱１０に廃棄される。
　このようにして全ての試料について測定が終了した後に、扉Ｃ２を開けて温調機構７に保持された検体チューブＦＣを交換するとともに、ホルダ３に保持された容器２を交換する。ここで、ホルダ３の保持された容器２を交換する場合には、ホルダ３の保持孔３ｈを持ってホルダ３を装置本体から取り外す。このホルダ３には、使用済みの廃棄されたピペットチップＰＴがホルダ３の廃棄箱１０に入っているので、ホルダ３を装置本体から取り外すことによって廃棄されたピペットチップＰＴも同時に装置本体から取り出すことができる。
　次に、紫外線を照射した容器と紫外線を照射しない容器とを用いて、０，１，２，４，１０，２０ａｍｏｌ／μＬに調整したＡＴＰ液を生体試料分析装置１００を用いて測定した。各容器における発光量を図１０に示す。
　蓄光影響下におけるダーク測定の発光量（発光試薬を添加する前に得られた光強度信号）は、紫外線照射された容器の方が大きいことが分かる。また、蓄光影響下におけるピーク測定の発光量（発光試薬を添加した後に得られた光強度信号）においても、紫外線照射された容器の方が大きいことが分かる。
　一方で、ピーク測定の発光量からダーク測定の発光量を差し引くことにより、紫外線を照射した容器の発光量と紫外線を照射しない容器の発光量とで略一致しており、上記の演算方式により、容器の蓄光量を除去してＡＴＰ量を算出できることが分かる。
＜本実施形態の効果＞
　このように構成された本実施形態に生体試料分析装置１００によれば、試料に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号から発光試薬を添加する前に得られた光強度信号を差し引いて、生体由来の物質の量に関連する値を算出するので、従来のように「発光が収まった状態の発光強度」を検出する必要がない。その結果、試料の測定時間を短縮することができる。また、試料に発光試薬を添加した後に得られた光強度信号から発光試薬を添加する前に得られた光強度信号を差し引くことによって容器２の蓄光を除去しているので、試料を収容する容器２の蓄光を考慮する必要がなく、測定精度を向上することができる。
　＜その他の実施形態＞
　なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
　例えば、ホルダ３は複数の容器２を円環状に保持するものであったが、複数の容器２の配置が例えば矩形状、多角形状又は楕円形状となるように環状に保持するものであってもよい。
　また、前記実施形態では、廃棄箱１０は２つの開口１０ｘを有するものであったが、１つ又は３つ以上の開口１０ｘを有するものであってもよい。
　廃棄箱１０は、図１０に示すように、廃棄されるピペットチップＰＴ毎に廃棄空間１０ｓが区切られている。この廃棄空間１０ｓは、図１１に示すように、廃棄箱１０の上面に開口する開口部１０ｓ１と、当該開口部１０ｓ１よりも鉛直下方に形成され、開口部１０ｓ１よりも開口面積の小さい絞り部１０ｓ２とを有している。この例では、各廃棄空間１０ｓの開口部１０ｓ１は廃棄箱１０の上面板１０１に貫通孔１０１ｈを形成することにより構成され、各廃棄空間１０ｓの絞り部１０ｓ２は、廃棄箱１０の内部に設けられた中間板１０２に貫通孔１０２ｈを形成することにより構成されている。このようにピペットチップＰＴ毎に廃棄空間１０ｓが区切られているので、既に廃棄されたピペットチップＰＴが邪魔になることがなく、スムーズにピペットチップＰＴを廃棄することができる。また、廃棄箱１０に廃棄されたピペットチップＰＴは互いに分離された状態であるので、廃棄箱１０から廃棄されたピペットチップＰＴを取り外す作業も容易となり、さらに、例えばピペットチップＰＴに残留した廃液をピペットチップＰＴから除去する作業も行いやすくなる。
　さらに、廃棄箱１０は、各廃棄空間１０ｓに廃棄されたピペットチップＰＴを所定方向に傾斜させる傾斜部１０ｙを有してもよい。この傾斜部１０ｙは、各廃棄空間１０ｓに廃棄されたピペットチップＰＴの上端部が互いに干渉しないように傾斜させるものである。図１１の例では、傾斜部１０ｙは、廃棄箱１０の底面又は内側面に形成されたテーパ面であり、ピペットチップＰＴの先端をホルダ３の回転中心軸側に移動させることにより、ピペットチップＰＴの上端部を径方向外側に位置させるものである。これにより、廃棄箱１０に廃棄されたピペットチップＰＴは、平面視において放射状となる。なお、傾斜部１０ｙは、廃棄箱１０とは別の部材により構成してもよい。このような傾斜部１０ｙにより、各廃棄空間１０ｓに廃棄されたピペットチップＰＴの向きを揃えることができ、廃棄されるピペットチップＰＴの邪魔となることを防止することができる。
　前記実施形態では、ホルダ３と廃棄箱１０とを一体に形成しているが、それぞれが別体に設けられたものであってもよい。
　前記実施形態では、生体試料を収容した容器に発光試薬を添加する構成であったが、発光試薬を収容した容器に生体試料を添加する構成としても良い。
　その上、前記実施形態の生体試料分析装置でＡＴＰを測定した試料に含まれる菌種を同定するようにしてもよい。
　具体的には、図１２に示すように、発光試薬を添加した後の残液（ＡＴＰ測定後の試料）又は、検体チューブＦＣ内の残液（ＡＴＰ測定前の試料）を用いて、残液中に含まれるＤＮＡ又はＲＮＡから菌種を同定することが考えられる。より詳細には、ＤＮＡシーケンサを用いて、前記残液から菌種を同定する。なお、ＲＮＡの場合は、逆転写によりＤＮＡを合成した後に、ＤＮＡシーケンサを用いることができる。
　ＤＮＡシーケンサで分析する前処理としては、ＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ）により増幅することが考えられる。ここでは、残液から例えばＤＮＡ捕集ビーズを用いて捕集し、捕集したＤＮＡをＰＣＲにより増幅する。残液には、ＡＴＰ抽出液が含まれている。ＡＴＰ抽出液は、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、過塩素酸、トリス緩衝液等を好適に使用することができる。界面活性剤の例としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイルリン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等が挙げられる。ＡＴＰ抽出液は、ＤＮＡを分解する酵素の働きを阻害するものもある。その他、ＡＴＰ測定後の試料の場合には、ＡＴＰ抽出液がＰＣＲの酵素を失活させる恐れがあるため、ＡＴＰ抽出液を除去する前処理を行ってもよい。
　さらに、前記実施形態の生体試料分析装置により、芽胞状態の菌（芽胞菌）のＡＴＰ量を測定することもできる。つまり、芽胞菌を発芽させた後のＡＴＰ量から芽胞菌が発芽する前のＡＴＰ量を差し引くことによって、芽胞菌のＡＴＰ量を測定することができる。
　具体的には、試料に芽胞反応液を入れないで、或いは、芽胞反応液を入れた場合には芽胞菌が発芽する前に、ＡＴＰ測定を行うことにより、芽胞菌が発芽する前の通常状態の菌（生菌）のみのＡＴＰ量（Ｙ［ａｍｏｌ］）を測定することができる。また、試料の芽胞反応液を入れて芽胞菌を発芽させた後に、ＡＴＰ測定を行うことにより、芽胞菌及び生菌の両方のＡＴＰ量（Ｘ［ａｍｏｌ］）を測定することができる。そして、Ｘ－Ｙ［ａｍｏｌ］により、芽胞菌のＡＴＰ量を算出することができる。Ｘ－Ｙの値が大きい場合には、芽胞菌が生成されていることが分かり、ユーザは殺芽胞剤などを用いて清掃するなどの対策を取ることができる。また、ある手法（例えば、ヒートショック法）を用いて試料中の生菌を死滅させる。そして、加熱により芽胞菌を発芽させたり、栄養を添加することにより芽胞菌を発芽させることで芽胞菌のＡＴＰ量を測定することもできる。
　その他、本発明は前記実施形態に限られず、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。
　本発明によれば、試料の測定時間を短縮するとともに測定精度を向上することができる。

 

Claims (8)

  1. 　生体由来の物質を含む試料及び発光試薬を容器に収容し、それらを反応させることにより生じる発光を検出して前記生体由来の物質を分析する生体試料分析装置であって、
    　前記発光を検出して光強度信号を出力する光検出器と、
    　前記試料に前記発光試薬が反応した後に得られた前記光強度信号から前記試料及び前記発光試薬が反応する前に得られた前記光強度信号を差し引くことにより前記容器の蓄光を除去して、生体由来の物質の量に関連する値を算出する算出部とを備える生体試料分析装置。
  2. 　複数の前記容器に収容された前記試料を順次発光測定するものであり、
    　前記算出部は、前記複数の容器それぞれにおいて、前記試料及び前記発光試薬が反応した後に得られた前記光強度信号から前記試薬及び前記発光試薬が反応する前に得られた前記光強度信号を差し引くものである、請求項１記載の生体試料分析装置。
  3. 　前記生体由来の物質は、アデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰ）であり、
    　前記試料及びＡＴＰ発光試薬が反応して生じるＡＴＰ由来の発光を検出するものである、請求項１又は２記載の生体試料分析装置。
  4. 　前記試料、ＡＴＰ量が既知のスタンダード液、及びＡＴＰ量がゼロのゼロ液に試薬を分注する分注機構をさらに備え、
    　前記分注機構は、前記試料に添加するＡＴＰ消去液、芽胞反応液、ＡＴＰ抽出液の混合比と、前記スタンダード液におけるそれらの混合比と、前記ゼロ液におけるそれらの混合比とを同じにするように制御される、請求項３記載の生体試料分析装置。
  5. 　前記分注機構は、前記スタンダード液に前記ＡＴＰ消去液及び前記芽胞反応液を添加した後に、前記ＡＴＰ抽出液を添加するように制御される、請求項４記載の生体試料分析装置。
  6. 　内部に生体試料分析用の測定系機器を収容し、開口部を有する筐体本体と、
    　前記筐体本体の開口部を開閉する扉と、
    　前記筐体本体の開口部と前記扉との接触部それぞれに設けられ、前記扉が前記開口部を閉塞した状態で、互いに嵌り合う凹凸構造とを備える、請求項１乃至５の何れか一項に記載の生体試料分析装置。
  7. 　前記試薬を前記試料に注入するためのピペットチップを廃棄する廃棄箱を更に備え、
    　前記廃棄箱は、廃棄される前記ピペットチップ毎に廃棄空間が区切られており、各廃棄空間に廃棄されたピペットチップを所定方向に傾斜させる傾斜部を有する、請求項１乃至６の何れか一項に記載の生体試料分析装置。
  8. 　生体由来の物質を含む試料及び発光試薬を容器に収容し、それらを反応させることにより生じる発光を検出して前記生体由来の物質を分析する生体試料分析方法であって、
    　前記試料及び前記発光試薬が反応した後に得られた前記光強度信号から前記試料及び前記発光試薬が反応する前に得られた前記光強度信号を差し引くことにより前記容器の蓄光を除去して、生体由来の物質の量に関連する値を算出する生体試料分析方法。
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