JP2008516632A - 血液製剤、尿、および他の液体中の迅速かつ高感度な細菌の検出 - Google Patents
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Abstract
本発明は、輸血用の血液、血小板、および他の血液製剤、ならびに尿を含む、液体中の細菌を検出する方法を提供する。本方法は、細菌を溶解させてATPを放出し、そのATPを検出することに基づくものである。真核細胞が大量のATPを含むことから、真核細胞の汚染が解決すべき問題である。したがって、本方法の一部は、細菌細胞を溶解させてATPを放出する前に、無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞(例えば血小板)を分離、そのATPを、反応を触媒するATP消費酵素と接触させて、酵素触媒反応をモニタリングすることを伴う。一般に、この酵素はルシフェリンであり、反応はルシフェリンが発する検出光によってモニタリングする。本発明の他の方法では、液体試料を、細菌細胞を結合する担持表面と接触させ、細菌細胞を溶解させてATPを放出させ、ATPをATP消費酵素と接触させて、酵素触媒反応をモニタリングするステップ、ことを伴う。また、本方法を実行するための装置も開示する。
Description
(a)細菌細胞を溶解させて細菌ATPを液体中に放出し、細菌溶解液を生成し、(b)細菌溶解液中の細菌ATPをATP消費酵素と接触させて、酵素が反応を触媒するATP測定液を生成し、(c)ATP測定液における酵素触媒反応をモニタリングするステップで構成されるステップを実行する装置を提供する。
本明細書において使用される「真核細胞」という用語は、液体中に含有されることが疑われる有核細胞および、自然発生的な膜に囲まれた真核細胞由来の、例えば血小板などのような、核を持たないATP含有体を含むものとする。
本発明の実施形態の一部は、細菌細胞を溶解してATPを放出するのに先立って無傷の真核細胞(例えば血小板)を無傷の細菌細胞から分離し、反応を触媒するATP消費酵素にATPを接触させ、および酵素触媒反応をモニタリングすることを含む。
E+LH2+ATP+Mg2+→E−LH2−AMP+Mg2++PPi
E−LH2−AMP+O2→E+CO2+AMP+oxyluciferin+photon
該方法の特定の実施形態は、細菌細胞を結合する担持表面と液体試料を接触させるステップの前に、液体試料に存在する可能性のある細菌細胞を実質的に溶解することなく、液体試料に存在する可能性のある真核細胞を選択的に溶解することを含む。例えば、室温、中性pH、および適度な濃度のTRITON−X−100は、細菌を溶解することなく血小板と他の体細胞を溶解する。
細菌結合ビーズを使用した細菌汚染に関する濃厚血小板の測定
真核細胞を細菌から分離し細菌を濃縮する器具
コンピュータ制御細菌検出器具
実施例3の器具を使用した細菌汚染の測定
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Claims (82)
- 細菌を含有する疑いのある液体試料中の細菌を検出する方法であって、
(a)前記液体試料中に存在する可能性のある無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するステップと、
(b)前記細菌細胞を溶解して液体中に細菌ATPを放出し、細菌溶解液を生成するステップと、
(c)前記細菌溶解液中の前記細菌ATPをATP消費酵素と接触させて、前記酵素が反応を触媒するATP測定液を生成するステップと、
(d)前記ATP測定液中の酵素触媒反応をモニタリングするステップと、を含む方法。 - 前記無傷の真核細胞は、血小板を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するステップは、前記真核細胞を阻止して細菌細胞が通過できるようにするフィルターを使用して、前記真核細胞をろ過し、前記細菌細胞を含むろ過された液体試料を生成するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記フィルターは、1〜10ミクロンの細孔サイズである、請求項3に記載の方法。
- 前記フィルターは、2〜10ミクロンの細孔サイズである、請求項4に記載の方法。
- 前記フィルターは、4〜10ミクロンの細孔サイズである、請求項5に記載の方法。
- 前記真核細胞をろ過する前記ステップの後に、
前記ろ過した液体試料を、前記細菌を結合する担持表面と接触させるステップをさらに含む、請求項3に記載の方法。 - 前記担持表面は、ガラス、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、Arg−Gly−Aspオリゴペプチド、またはPhe−His−Arg−Arg−Ile−Lys−Ala(SEQ ID No.1)オリゴペプチドを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記担持表面は、真核細胞を結合しない、請求項7に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、前記担持表面に結合しながら溶解され、液体中に細菌ATPを放出して細菌溶解液を生成する、請求項7に記載の方法。
- 前記細菌細胞を溶解させるステップの前に、前記担持表面からの前記細胞を溶出液に溶出させるステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記真核細胞をろ過するステップの後に、1ミクロン未満の細孔サイズのフィルターを通して前記ろ過した液体試料をろ過するステップを含むプロセスによって、前記ろ過した液体試料中の前記細菌細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するステップは、
前記液体試料を、前記細菌細胞を結合して前記真核細胞を結合しない担持表面と接触させるステップを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記担持表面は、大部分の細菌種を結合する、請求項13に記載の方法。
- 前記担持表面は、ポリカチオンを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記液体試料中に存在する可能性のある無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するステップは、前記液体試料を、前記細菌を結合する担持表面と接触させるステップの前に、
前記真核細胞を阻止して前記細菌細胞が通過できるようにするフィルターを使用して、前記液体試料から前記真核細胞をろ過するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。 - 前記細菌細胞は、前記担持表面に結合しながら溶解され、液体中に細菌ATPを放出して細菌溶解液を生成する、請求項13に記載の方法。
- 前記細菌細胞を溶解させるステップの前に、前記担持表面から前記細菌細胞を溶出液に溶出させるステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記細菌細胞を溶解させるステップの前に、前記細菌細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ATP測定液の容量は、前記液体試料の容量の少なくとも10分の1である、請求項19に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、熱または洗浄剤、あるいはその両方によって溶解される、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、酸または塩基によって溶解される、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、音響エネルギーまたは粒子との接触、あるいはその両方によって溶解される、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、有機溶媒によって溶解される、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、酵素、凍結融解、フレンチプレスまたはその組み合わせによって溶解される、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素触媒反応をモニタリングするステップは、前記反応によって生成される生成物をモニタリングするステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生成物は、光である、請求項26に記載の方法。
- 前記酵素はルシフェラーゼであり、前記方法は、前記細菌ATPおよびルシフェラーゼをルシフェリンと接触させるステップをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 前記液体試料は、哺乳類の体液を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記体液は、血液製剤である、請求項29に記載の方法。
- 前記血液製剤は、濃厚血小板である、請求項30に記載の方法。
- 前記血液製剤は、全血、血清、血漿、濃厚骨髄幹細胞、または濃厚赤血球である、請求項30に記載の方法。
- 前記血液製剤は、哺乳類への輸血用である、請求項30に記載の方法。
- 前記体液は、尿である、請求項29に記載の方法。
- 前記体液は、髄液である、請求項29に記載の方法。
- 前記方法は、前記液体試料1mlにつき10,000の細菌コロニー形成単位レベルにおいて、少なくとも3つの細菌属を検出する、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、前記液体試料1mlにつき1000の細菌コロニー形成単位レベルにおいて、少なくとも3つの細菌属を検出する、請求項36に記載の方法。
- 前記方法は、前記液体試料1mlにつき100の細菌コロニー形成単位レベルにおいて、少なくとも3つの細菌属を検出する、請求項37に記載の方法。
- 前記方法は、セレウス菌、枯草菌、ウェルシュ菌、コリネバクテリウム種、大腸菌、エンテロバクタークロアカ、クレブシエラオキシトカ、挫瘡プロピオンバクテリウム、緑膿菌、豚コレラ菌、セラチアマルセッセンス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、化膿レンサ球菌、および緑色連鎖球菌の細菌種1mlにつき10,000またはそれ以下の細菌コロニー形成単位を検出する、請求項36に記載の方法。
- 前記液状試料は、5ml未満である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)、(c)、および(d)は、自動化される、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)および(c)は、前記細菌細胞を、溶解剤、ルシフェラーゼ、およびルシフェリンを含有する混合物と接触させるステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記自動化ステップは、2分未満で完了する、請求項41に記載の方法。
- 細菌を含有する疑いのある液体試料中の細菌を検出する方法であって、
前記液体試料を、前記細菌細胞を結合する担持表面と接触させて、前記細菌細胞を濃縮する、および/または前記液体試料中の他の成分から前記細菌細胞を分離するステップと、
前記細菌細胞を溶解して液体中に細菌ATPを放出し、細菌溶解液を生成するステップと、
前記細菌溶解液中の前記細菌ATPをATP消費酵素と接触させて、前記酵素が反応を触媒するATP測定液を生成するステップと、
前記ATP測定液中の酵素触媒反応をモニタリングするステップと、を含む方法。 - 前記液体試料を、細菌細胞を結合する担持表面と接触させるステップの前に、
前記液体試料中に存在する可能性のある細菌細胞を実質上溶解せずに、前記液体試料中に存在する可能性のある真核細胞を選択的に溶解するステップをさらに含む、請求項44に記載の方法。 - 前記液体試料を、細菌細胞を結合する担持表面と接触させるステップの前に、
前記真核細胞を阻止して前記細菌細胞が通過できるようにするフィルターを使用して、前記液体試料から、前記液体試料中に存在する可能性のある無傷の真核細胞をろ過するステップをさらに含む、請求項44に記載の方法。 - 前記担持表面は、細菌細胞を結合して真核細胞を結合しない、請求項44に記載の方法。
- 液状試料中の細菌を検出するためのシステムであって、
(a)液体試料中の無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するための器具を受けるための保持手段と、
(b)液体試料中の無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するための前記器具からの流体を受けるように構成された測定容器を形成する流体密封材料と、
(c)前記測定容器に機能的に接続して前記測定容器内に放射される光を検出する光検出器と、を備えるシステム。 - 保持手段(a)内の無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するための器具をさらに備える、請求項48に記載のシステム。
- 無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するための器具は、細菌を結合して真核細胞を結合しない担持表面を備える、請求項49に記載のシステム。
- 無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するための器具は、真核細胞を阻止して細菌細胞が通過できるようにするフィルターを備える、請求項49に記載のシステム。
- 前記測定容器内にルシフェラーゼをさらに備える、請求項49に記載のシステム。
- (d)無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するための前記器具と流体連通する液体試料貯蔵器を受けるための保持手段と、
(e)前記液体試料貯蔵器と、無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するための前記器具(分離器具)と、前記測定容器とに機能的に連結して、液体を前記液体試料貯蔵器から前記分離器具に、および前記分離器具から前記測定容器に送り込むポンプとをさらに備える、請求項48に記載のシステム。 - 洗浄液受容器を受けるための保持手段と、
前記無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するための器具と、前記測定容器と、前記液体試料貯蔵器と、前記洗浄液受容器と流体連通するマルチポート選択弁であって、ある位置にある前記液体試料貯蔵器から、および別の位置にある前記洗浄液受容器から、液体を透過させるために構成される前記マルチポート選択弁とをさらに備える、請求項53に記載のシステム。 - 前記ポンプおよび前記マルチポート選択弁に操作可能に連結し、前記液体試料貯蔵器から前記分離器具に、前記分離器具から前記測定容器に、および前記洗浄液受容器から前記測定容器に、所定の量の液体を供給するようにプログラムしたプロセッサをさらに備える、請求項54に記載のシステム。
- 前記光検出器からの処理済または未加工のデータを表示するための、前記光検出器に機能的に連結するディスプレイをさらに備える、請求項48に記載のシステム。
- 前記光検出器によって得られた光検出データを、関連する光ユニットに、または前記ディスプレイ上に表示される細菌細胞数に変換するようにプログラムしたプロセッサをさらに備える、請求項56に記載のシステム。
- 無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するための器具と前記測定容器との間を流体連通する、無傷の細菌細胞を濃縮するための前記器具をさらに備える、請求項49に記載のシステム。
- 無傷の細菌細胞を濃縮するための前記器具は、細菌細胞の通過を阻止するフィルターを備える、請求項58に記載のシステム。
- 無傷の細菌細胞を濃縮するための前記器具は、細菌細胞を結合する担持表面を備える、請求項58に記載のシステム。
- 前記測定容器は、フロースルー細胞である、請求項48に記載のシステム。
- 液状試料中の細菌を検出するためのシステムであって、
(a)液体試料中の無傷の細菌細胞を結合する担持表面を受けるための保持手段と、
(b)液体試料中の無傷の細菌細胞を結合する前記担持表面からの流体を受けるように構成された測定容器を形成する流体密封材料と、
(c)前記測定容器に機能的に接続して前記測定容器内に放射される光を検出する光検出器と、を備えるシステム。 - 保持手段(a)内の無傷の細菌細胞を結合する前記担持表面をさらに備える、請求項62に記載のシステム。
- 前記担持表面は、ATPを結合しない、請求項63に記載のシステム。
- 前記担持表面は、前記液体試料中に存在する可能性のある無傷の真核細胞を結合しない、請求項63に記載のシステム。
- 細菌を検出するための、前記細菌を含有する疑いのある液体試料を調製するためのプロセスであって、
前記液体試料中に存在する可能性のある無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離し、その後の細菌検出試料中の細菌の検出のために、実質上真核細胞を含まない、前記細菌検出試料を生成するステップを含み、
前記細菌検出試料中の細菌の検出は、前記細菌を溶解するステップと、前記溶解細菌から放出されるATPをモニタリングするステップとを含むプロセス。 - 無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するステップは、前記真核細胞を阻止して前記細菌細胞が通過できるようにするフィルターを使用して、前記真核細胞をろ過するステップを含む、請求項66に記載のプロセス。
- 前記真核細胞をろ過するステップの後に、前記液体試料中の前記無傷の細菌細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項67に記載のプロセス。
- 無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離するステップは、前記液体試料を、前記細菌細胞を結合して前記真核細胞を結合しない担持表面と接触させるステップを含む、請求項66に記載のプロセス。
- 細菌細胞を含有する疑いのある試料を受けるように構成された装置であって、
(a)前記細菌細胞を溶解して液体中に細菌ATPを放出し、細菌溶解液を生成するステップと、
(b)前記細菌溶解液中の前記細菌ATPをATP消費酵素と接触させて、前記酵素が反応を触媒するATP測定液を生成するステップと、
(c)前記ATP測定液中の酵素触媒反応をモニタリングするステップと、を含むステップを実行するように構成された装置。 - 細菌細胞を含有する疑いのある前記試料は液体試料であり、前記装置は、前記細菌細胞を溶解するステップの前に、前記液体試料内に存在する可能性のある無傷の細菌細胞から無傷の真核細胞を分離する更なるステップを実行する、請求項70に記載の装置。
- 前記細菌溶解液および前記ATP測定液は、それぞれ1ml未満である、請求項70に記載の装置。
- 前記装置は、ステップ(a)、(b)、および(c)を2分未満で実行する、請求項70に記載の装置。
- 前記装置は、前記ステップを2分未満で実行する、請求項71に記載の装置。
- (a)細菌細胞を含有する疑いのある試料を保持する容器を受けるように構成されたポートであって、前記容器は、(i)液体通過可能フィルターおよび細菌細胞を結合する担持表面、または(ii)細孔サイズが1ミクロン未満であり、無傷の細菌細胞への通過が不可能である液体通過可能フィルターを備える容器である、ポートと、
(b)前記ポートと流体連通し、(c)と流体連通する通路と、
(c)測定容器と、
(d)前記測定容器に機能的に接続して、前記測定容器内で放射された光を検出する光検出器と、
(e)前記通路および測定容器に機能的に接続し、液体を、前記通路を通して前記測定容器にポンピングするように構成されたポンプと、を備える装置であって、
(I)前記容器を前記ポート上で受けたときに、前記通路からの溶解液を、前記ポートおよび前記容器の前記液体通過可能フィルターを通して送り込み、前記容器中の細菌を溶解することによって、前記容器中に細菌ATPを含有する細菌溶解物を生成し、(II)前記容器からの前記細菌溶解物を、前記容器の前記液体通過可能フィルターを通して前記通路に送り込み、(III)前記細菌溶解物中の前記細菌ATPを、ルシフェラーゼおよびルシフェリンと接触させて、ATP測定液を形成し、(IV)前記測定容器中の前記ATP測定液からの光の放射をモニタリングするように構成された装置。 - 前記装置は、前記ポート上で受ける前記容器をさらに備える、請求項75に記載の装置。
- 前記通路および前記測定容器と流体連通するマルチポート選択弁と、
前記マルチポート選択弁と流体連通する溶解液容器を受けるための保持手段と、
前記マルチポート選択弁と流体連通する廃液用容器を受けるための保持手段とをさら備える、請求項75に記載の装置。 - 液体試料中に存在する可能性のある無傷の細菌細胞から真核細胞を分離して、細菌細胞を検査するための検査試料を生成するように構成された器具であって、
(a)(b)に連結する液体容器と、
(b)細菌分離部であって、(i)細孔サイズが1ミクロン未満であり、無傷の細菌細胞を阻止する第2のフィルターに連結する、真核細胞を阻止して前記細菌細胞が通過できるようにする第1のフィルター、および(ii)前記細菌細胞を結合するが前記真核細胞を結合しない担持表面から選択される細菌分離部とを備え、
使用時に、前記液体試料は、前記液体容器から細菌分離部を通って流れ、前記液体試料中に存在した可能性のある細菌細胞を含有する検査試料を生成し、前記検査試料は、実質上真核細胞を含まない器具。 - 前記細菌分離部は(i)であり、前記第1のフィルターは1〜10ミクロンの細孔サイズであり、前記第2のフィルターは1ミクロン未満の細孔サイズである、請求項78に記載の器具。
- 前記細菌分離部は(i)であり、細菌細胞を結合する担持表面を有するビードが、前記第1および第2のフィルター間に保持される、請求項78に記載の器具。
- 細菌を含有する疑いのある試料中の細菌の有無を決定するための装置であって、
(a)(b)に接続される、細菌細胞を含有する疑いのある試料を受けるための受容手段と、
(b)(c)に接続される、前記細菌細胞を溶解して細菌ATPを液体に放出し、細菌溶解液を生成するための手段と、
(c)(d)に接続される、前記細菌溶解液中の前記細菌ATPをATP消費発光酵素と接触させて、前記酵素が発光反応を触媒するATP測定液を生成するための手段と、
(d)前記ATP測定液中の前記酵素によって生じる光を検出するための光検出手段と、を備える装置。 - 液体試料中の無傷の細菌細胞から前記液体試料中の無傷の真核細胞を分離して、実質上真核細胞を含まない検査試料を生成するための細菌分離手段であって、前記細菌分離手段は、前記受容手段に連結する細菌分離手段をさらに備える、請求項81に記載の装置。
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