JPWO2019097752A1 - 血液検体の前処理方法 - Google Patents
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Abstract
Description
現行の薬剤感受性試験は菌の濁度で判定するため、先ず起炎菌を分離培養し、次に薬剤感受性試験にて菌の十分な増殖を待たなければならず、通常、採血から2〜3日を要する。
それに対し、菌が産生するATPを測定することによって、細菌コロニーからスタートする薬剤感受性試験の迅速化が報告されている。(非特許文献1)
同報告によれば従来法が細菌コロニーのスタートから18〜24時間要するのに対して、ATP測定ではおよそ6時間で可能とされている。
しかし上記方法はコロニーからのスタートであり、このコロニーを得るまでの分離培養に1〜2日間は必要であるため、採血からの時間としては迅速であるとは言いがたい。
しかし、SDSの濃度が0.1%,0.2%のように高濃度であると、例えば敗血症の起炎菌として度々検出される[Streptococcus agalactiae]の場合に殆どが死滅して生菌として回収できなかった。
一方、SDSの濃度を0.05%まで下げると、上記菌の生菌回収率が向上したが、血液中の血小板は殆ど破壊されないため、ヒト由来のATPを最小化することができず生菌をATP測定できなかった。
(A)血小板の細胞膜蛋白をプロテアーゼ分解処理する。
(B)血小板を低張液にて膨化処理する。
(C)起炎菌への影響を抑えた条件下で、血小板の細胞膜を界面活性剤溶液にて破壊処理する。
本発明にて起炎菌への影響を抑えるとは、生菌としての回収率が敗血症起炎菌の主要19菌属の平均で50%以上であることをいう。
抗凝固剤としては、例えばEDTAなどが挙げられる。
具体的には、細菌のバシラス属起源のプロテアーゼ(例えば、アロアーゼの商品名で市販されているもの)、真菌のアスペルギルス属起源のプロテアーゼ(例えば、パンチダーゼの商品名で市販されているもの)などが挙げられる。
それらは、1種あるいは2種以上の使用が好ましい。
また、陰イオン性界面活性剤(D1)の全溶液中の濃度は、0.05重量%以下であることが好ましい。
界面活性剤(D2)は使用しなくてもよいが、1種あるいは2種以上の使用が好ましい。
また、界面活性剤溶液による処理においては、細菌へのダメージを抑えている。
これらにより、血小板及び極小量含まれている赤血球や白血球が、プロテアーゼによる細胞膜蛋白の分解、低張液による内圧の上昇と膨化、界面活性剤溶液によるリン脂質の乳化、の3つの作用の組み合わせにて細胞膜が破壊され、ヒト由来のATPが細胞外に放出され、洗浄工程などを経て、ヒト由来のATPを最小化し起炎菌のみのペレットを生菌の状態で回収することができる。
本発明においてヒト由来のATPを最小化するとは、起炎菌のATP測定に影響を与えない程度にヒト由来のATPを除去することをいう。
本発明においては、ヒト由来のATPを約1/2,500,000以下に抑えることができる。
また、起炎菌を生菌として回収できるので、検体中の生菌の有無判定や薬剤感受性試験に供することができる。
本発明により、採血から僅か約6時間程度の短時間で薬剤感受性試験の判定結果が得られるようになり、予後を大きく左右する敗血症早期の治療に役立つことが期待される。
なお、本発明に係る検体前処理方法をBAMB(Bacterial ATP Measurement in Blood)Procedureと表現した。
全体のステップの流れを図12に示す。
ここで、ステップ2〜4の順序は問わない。
血液検体は、富山大学病院と流杉老人病院において、敗血症が疑われる患者から採取した全血であり、以下の実施例のすべての手技は、富山大学倫理委員会および流杉老人病院倫理委員会の承認並びにすべての患者から文書による同意を得てられ行われ、また実施例の方法は、承認されたガイドラインに従って実施された。
<ステップ1:全血からの血小板および細菌のペレット化>
血液検体から赤血球・白血球を取り除き、「血小板(極少量の赤血球や白血球を含む)と起炎菌のペレット」を作る。
図1に示すように、例えば分離剤入りEDTA採血管で採血し、軽度の遠心操作にて上清を得る。
この上清をチューブに移し、強い遠心操作を行うことで血小板と起炎菌のペレットを得る。
具体的には、血漿分離EDTAチューブ(Vacutainer(登録商標)PPTTM Plasma Preparation Tube、BD Biosciences、CA、USA)に合計5mLの静脈血を採取した。
その後、血液サンプルを1100×gで10分間遠心分離して血球を遠心分離し、得られた血漿および細菌である上清画分(2mL)を使用した。
上清を等分して2つの部分(それぞれ1mL)に分け、2000×gで10分間再度遠心分離し、次いで上清画分900μLを慎重に取り出してペレットを乱さないようにした。
血小板(および極少量の赤血球や白血球)の細胞膜蛋白の分解を行う。
細菌はプロテオグリカン壁を持つため、プロテアーゼでは分解されない。
図2に示すように例えば、プロテアーゼを加え、インキュベートする。
具体的には、分子生物学研究グレードの蒸留水(UltraPureTM DNase / RNase-Free蒸留水、Thermo Fisher Scientific、Massachusetts、USA、以下、蒸留水)で溶解したプロテアーゼ(Aroase NP-10:ヤクルト製薬工業、東京、日本)1mL(10%w/v)をペレットに添加し、10回ピペッティングした後、37℃で10分間インキュベートした。
インキュベーション後、混合物を2000×gで5分間遠心分離し、次いでペレットを乱さないように上清画分1mLを注意深く除去した。
血小板(および極少量の赤血球や白血球)の内圧を高め、膨化させ壊れ易くする。
細菌はペプチドグリカン壁を持つため、膨化されない。
図3に示すように低浸透圧の低張液にて処理する。
具体的には、10mM HEPES(pH7.9.DOJINDO Molecular Technologies、Tokyo、Japan)、1.5mM KCl(和光純薬工業(株)、東京)および10mM MgCl2・6H2Oとなるように蒸留水で溶解した後、オートクレーブしてpH7.9の低張液を作成する。
そして、低張液800μLをペレットに加えて10回ピペッティングした後、室温で5分間インキュベートした。
血小板(および極少量の赤血球や白血球)の細胞膜を破壊する。
低張液処理後、菌をペレット化するために遠心操作を行うが、遠心前に低張液にDetergent(界面活性剤)溶液を加える工程が細菌の回収にとって必要である。
例えば、緑膿菌はチューブ内壁に付着しやすいため、Detergent無しで遠心すると、内壁に付着したままで殆ど回収できない。
但し、他の殆どの菌種ではそのような問題は生じない。
疎水性部分に環状炭化水素を有する界面活性剤の1種であるサポニンはヒト細胞膜のコレステロールに作用して楔を打つように入り込み、細胞膜の構造を緩める(破壊する)。
一方、細菌の細胞壁はペプチドグリカン層であるため、サポニンは作用しない。
疎水性部分に鎖状炭化水素を有する陰イオン性界面活性剤の1種であるSDSは脂質二重層であるヒト細胞膜のリン脂質を乳化して細胞膜を破壊する。
SDSは細菌の細胞壁をも障害するが、例えばSDS濃度を0.05%まで薄めれば、Detergent処理で死滅し易いStreptococcus agalactiaeでさえ殆ど死滅しない。
0.05%の低濃度で処理することで、細菌への影響を最小化してヒト細胞膜の破壊を主とした作用をもたらす。
その操作の流れを図4に示す。
具体的には、ステップ3のインキュベーション後、2%サポニン(SERVA Electrophoresis GmbH、Heidelberg、Germany)および0.05%SDS(和光純薬工業(株)製)をpH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS:Thermo Fisher Scientific)で溶解したDetergent A 200μLを低張液・ペレット混合液に加え、混合物を10回ピペッティングした後、2,000×gで5分間遠心分離し、ペレットを乱さないように注意深く1mLの上清画分を除去した。
次に、1mLのDetergent Aをペレットに再度加え、混合物を20回ピペッティングし、続いて室温で15分間インキュベートした。
血小板(および極少量の赤血球や白血球)由来のATPや細胞小器官をDetergent成分と共に洗い流し、起炎菌のみを生菌の状態で回収する。
その操作の流れを図5に示す。
具体的には、ステップ4のインキュベーション後、混合物を2000×gで5分間遠心分離し、ペレットを乱さないように上清画分1mLを注意深く除去した。
次に、ペレットにMuller−Hinton培地(Muller-Hinton IIブロス、Cation-adjusted、BD Biosciences)1mLを加え、数回穏やかに転倒混和した後、再び2000×gで5分間遠心分離した。
遠心分離後、ペレットを乱さないように、1mLの上清画分を注意深く除去した。
その後、このペレット洗浄工程を再度繰り返した。
すなわち、ペレットに1mLのMuller−Hinton培地を加え、穏やかに転倒混和した後、再び2,000×gで5分間遠心分離した。
遠心分離後、ペレットを乱さないように、1mLの上清画分を注意深く除去した。
これらは、ヒト由来のATPバックグラウンドを最小化した敗血症起炎菌の細菌ペレットである。
血液検体より回収された起炎菌(生菌)を抗菌薬存在下、および非存在下で振盪培養する。
その操作例を図6に示す。
具体的には、BAMB procedureの後、1mLのMuller−Hinton培地をペレットに添加した。
これら2チューブの混合物を1つに戻し、再び2等分に分割して菌数を揃えた。
その後、Levofloxacin(LVFX)(Sigma-Aldrich、USA)2.0μg/ml存在下、非存在下の各々の条件で、37℃、0,2,4,6,12,24時間の振盪培養を行った。
培養後の各タイムポイントで生菌ATPを測定し、薬剤感受性を判定する。
通常、培養後4時間程度、すなわち採血後6時間程度(前処理工程の2時間含む)の迅速さで薬剤感受性が判定可能。
その操作例を図7に示す。
具体的には、ATPバイオルミネッセンスによる生菌のATP測定を以下の手順で行った。
なお、ATPの測定にはATPバイオルミノメーター自動測定装置を使用した。
ATPバイオルミノメーター自動測定装置は日立製作所が開発したプロトタイプモデルであり、単菌を検出するためのattomoleレベルでのATP測定を可能とする。
CheckLiteTM HSセットには、ATP除去試薬、ATP抽出試薬、および生物発光試薬が含まれている。
洗浄液と希釈用緩衝液として、蒸留水(UltraPureTM DNase / RNase-Free蒸留水、Thermo Fisher Scientific)を用いて、それぞれ細菌試料とATP標準サンプルの希釈系列を作成した。
高濃度測定用には100〜2×109amol/mLのATP標準サンプルを滅菌水で希釈することによって調製した。
低濃度測定用には100〜500amol/mLのATP標準サンプルを滅菌水またはATP抽出試薬で希釈することにより調製した。
ブランクサンプルとして滅菌水またはATP抽出試薬を使用した。
ATP生物発光は以下のステップで測定した。
まず、反応チューブ内に滅菌水またはATP抽出試薬で希釈したATP標準サンプル10μLを、試薬チューブ内に生物発光試薬1mLを、それぞれATPバイオルミノメーター自動測定装置にセットした。
そして、ATPバイオルミノメーター自動測定装置により50μLの生物発光試薬をサンプルに添加した。
まずATP除去試薬をPBSで20%(v/v)に希釈した。
次に振盪培養後の細菌試料12.5μLに20%(v/v)ATP除去試薬12.5μLを添加した。
そして細胞外ATPおよび死菌ATPを除去するために30分間インキュベートした。
インキュベーション後、25μLのATP抽出試薬を細菌試料またはブランク試料に添加した。
生菌の細胞内ATPを抽出するために、試料を1分間インキュベートした。
細胞内ATP抽出後の試料10μLを反応チューブに加え、ATPバイオルミノメーター自動測定装置にセットした。
試料中の生菌細胞内ATPを生物発光試薬と混合し、30秒間測定した。
相対光強度(RLU)は、試料と生物発光試薬を混合した後30秒以内にその最大強度から5秒間の平均値として計算した。
サンプルのATP生物発光(RLU)をATP検量線(RLU/amol)で比較定量することにより、全細菌細胞内ATP(amol)を決定した。
図8(a)は、本発明に係るプロセス(BAMB procedure)の処理前と処理後の血漿ペレットの顕微鏡写真を示す。
処理後には、血球のすべてが破壊され、除去されているのが分かる。
図8(b)は、健常人5人から採血した血液の処理前後における血漿ペレットのATP測定結果を示す。
このグラフから、ヒト由来のATPが約1/2,500,000に低下しているのが分かる。
その平均回収率はATP測定で93.6%,CFU測定にて71.9%であった。
検体(a),(b):敗血症疑い患者の血液検体で、血液培養陰性であった例を示す。
BAMB procedure後の培養時間経過でATPの上昇は認められず、血液中に生菌がいないことが分かる。
検体(c),(d):敗血症患者の血液検体で、血液培養陽性、抗菌薬のLVFX(レボフロキサシン)に耐性のE.coli(c)とMRSA(d)とが検出された例を示す。
BAMB procedure後の培養4時間でLVFX±に関わらずATPの上昇が認められた。
つまり、培養後4時間(採血後6時間)で「血液中に起炎菌(生菌)が存在し、それがLVFX耐性菌である」ことがATP測定で判定された。
検体(e):敗血症患者の血液検体で、血液培養陽性、抗菌薬のLVFXに感受性のあるProteus mirabilisとEnterococcus faecalisの2菌が検出された例を示す。
BAMB procedure後の培養4時間でLVFX無しでATP上昇、LVFXありでATP抑制が認められた。
つまり、培養後4時間(採血後6時間)で、「血液中に起炎菌(生菌)が存在し、それがLVFX感受性菌である」ことがATP測定で判定された。
その結果、バックグラウンド(図10において0時間のCPS値)の平均は476であった。
その結果、バックグラウンド(図10において0時間のCPS値)の平均は500であった。
その結果、バックグラウンド(図10において0時間のCPS値)の平均は479であった。
本実施例では、血液培養陽性となったボトルからATPバックグラウンドを最小化して起炎菌を生菌の状態で直接回収する方法を示す。
血液培養した後では血球の細胞膜が既に壊れ易くなっているため、実施例1のステップ2におけるプロテアーゼ処理を必要とせず、低張液とDetergent Aを混合した迅速・簡便な前処理方法のみで血球(血小板を含む)を破壊することができる。
その後、回収した生菌を培養してATP測定による迅速薬剤感受性試験を行う。
以下、本実施例のプロトコールを記載する。
1.培養検体(血液培養陽性化から1時間後)100μlを1.5mlのエッペンチューブに採る。
2.低張液800μl+Detergent A 200μlを添加し、20回ピペッティング。それから遠心(2000×G,10分間,室温)して菌のペレット化を行う。
3.上清1000μlを除去
4.ミューラーヒントン培地を用いて3000倍希釈
5.1.5mlのエッペンチューブ2本それぞれに希釈した産物を270μlずつ添加
6.エッペンチューブ2本それぞれにATP消去試薬30μlを添加
7.エッペンチューブの1本にはレボフロキサシン(LVFX 20μg/ml)を33.3μl添加、もう1本には超純水33.3μlを添加して、それぞれ35℃で培養
8.測定ポイントは2時間,4時間,6時間,(24時間)
9.培養後、1ポイントあたり10μlずつ3回サンプルを採取
10.ATP抽出試薬10μlを添加してボルテックス後にATP量をそれぞれ測定
本プロトコールにおいてもDetergent Aは必須である(図13)。
表2に示すように、健常人血液を4時間血液培養してヒト由来ATPバックグラウンドを測定した結果、低張液+0.05%SDS(サポニン無し)、或いは低張液のみでは血球を十分破壊することは出来ないことが分かる。
菌ATP量は抗菌薬有り・無しに関わらず培養時間が進むにつれて増加しており、抗菌薬(レボフロキサシン)耐性であることが培養4時間後には明らかである。
実際、従来の検査法ではレボフロキサシン耐性のEscherichia coli(大腸菌)が検出され、薬剤感受性結果は一致した。
以上により、血液培養陽性時より僅か4時間で正確な感受性結果を得ることが出来た。
実施例5と同じプロトコール(但し血液培養陽性化から4時間後の培養検体を使用)で、実施例5とは別な敗血症患者の血培ボトルから迅速薬剤感受性試験を行った。
図15に本実施例の迅速薬剤感受性試験結果を示す。
培養時間が進むにつれ、抗菌薬無しでは菌ATP量は増加、抗菌薬(レボフロキサシン)有りでは菌ATP量は減少した。
つまり、抗菌薬(レボフロキサシン)感受性であることが培養4時間後には明らかである。
実際、従来の検査法ではレボフロキサシン感受性のStreptococcus anginosusが検出され、薬剤感受性結果は一致した。
以上により、血液培養陽性時より僅か4時間で正確な感受性結果を得ることが出来た。
実施例5と同じプロトコール(但し血液培養陽性化から5時間後の培養検体を使用)で、実施例5,6とは別な敗血症患者の血培ボトルから迅速薬剤感受性試験を行った。
図16に本実施例の迅速薬剤感受性試験結果を示す。
菌ATP量は抗菌薬有り・無しに関わらず培養時間が進むにつれて増加しており、抗菌薬(レボフロキサシン)耐性であることが培養4〜6時間後には明らかである。
但し抗菌薬有り・無しで菌ATP量の増加に差があるため、抗菌薬耐性菌と感受性菌とが混合していた可能性がある。従来の検査法ではレボフロキサシン耐性のStaphylococcus capitis or Staphylococcus capraeが検出され、薬剤感受性結果は一致した。
以上、血液培養陽性時より僅か4〜6時間で正確な感受性結果を得ることが出来た。
血液検体中の生菌の有無について、ATP測定により迅速判定(遺伝子検査の弱点を補える)の実施に利用できる。
血液培養ボトルからの血液培養検体における、ATP測定を用いた迅速薬剤感受性試験の実施に利用できる。
血液検体以外にも、脳脊髄液(細菌性髄膜炎)、心嚢水(心膜炎)、胸水(胸膜炎)、腹水(腹膜炎)、関節包液(整形外科の術後感染症)、眼房水(眼内炎)、肺胞洗浄液(肺炎)、尿(尿路感染症)、術後のドレーン排液(術後感染症)、CVカテーテル先端(長期臥床患者のカテ先バイオフィルムによる敗血症)などで、生菌の有無の迅速判定、および迅速薬剤感受性試験等の実施に利用できる。
Claims (6)
- 血液中の起炎菌をATP測定するための血液検体の前処理方法であって、
血液検体から血小板と起炎菌のペレットを作成するステップと、
前記血小板と起炎菌のペレットを、下記(A)〜(C)のステップを任意の順であるいは、
複数のステップを同時に処理するステップとを、
有することを特徴とする血液検体の前処理方法。
(A)血小板の細胞膜蛋白をプロテアーゼ分解処理する。
(B)血小板を低張液にて膨化処理する。
(C)起炎菌への影響を抑えた条件下で、血小板の細胞膜を界面活性剤溶液にて破壊処理する。 - 前記血小板と起炎菌のペレットは、抗凝固剤入り採血管で採血した血液検体から遠心操作又は分離剤により、赤血球及び白血球を除いた上清を遠心操作にてペレット化したものである請求項1記載の血液検体の前処理方法。
- 前記ステップ(A)のプロテアーゼ分解処理に用いるプロテアーゼは、微生物起源のプロテアーゼである請求項1又は2記載の血液検体の前処理方法。
- 前記ステップ(B)に用いる低張液は、浸透圧が、血液浸透圧より低い液である請求項1〜3のいずれかに記載の血液検体の前処理方法。
- 前記ステップ(C)に用いる界面活性剤溶液は、疎水性部分に鎖状炭化水素を有する陰イオン性界面活性剤(D1)、疎水性部分に環状炭化水素を有する界面活性剤(D2)のうち1種以上である請求項1〜4のいずれかに記載の血液検体の前処理方法。
- 血液培養検体の前処理においては、請求項1に記載の前処理において(A)のステップを行わず、(B)と(C)とのステップのみを同時に処理する簡易ステップであることを特徴とする血液培養検体の前処理方法。
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