KR20200088390A - 혈액 검체의 전처리 방법 - Google Patents

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이사오 키타지마
토모히로 우에노
아츠시 마츠이
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국립대학법인 도야마 다이가쿠
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Abstract

혈액 검체 중의 인간 유래의 ATP를 최소화하는 것을 가능하게 하고, 또한 기염균(起炎菌)을 생균인 상태로 혈액 검체로부터 직접 회수할 수 있는 전처리 방법의 제공을 목적으로 한다. 혈액 중의 기염균을 ATP 측정하기 위한 혈액 검체의 전처리 방법으로서, 혈액 검체로부터 혈소판과 기염균의 펠릿을 작성하는 단계와, 상기 혈소판과 기염균의 펠릿에 대해, 하기 (A)∼(C)의 단계를 임의의 순서로 혹은, 복수의 단계를 동시에 처리하는 단계를 갖는 것을 특징으로 한다. 단, 혈액 배양 검체의 전처리에 있어서는, 하기 (A)의 단계를 행하지 않고, (B)와 (C)의 단계만을 동시에 처리하는 간이 단계인 것을 특징으로 한다. (A) 혈소판의 세포막 단백질(蛋白)을 프로테아제 분해 처리한다. (B) 혈소판을 저장액(低張液)으로 팽화(膨化) 처리한다. (C) 기염균에 대한 영향을 억제한 조건하에서, 혈소판의 세포막을 계면활성제 용액으로 파괴 처리한다.

Description

혈액 검체의 전처리 방법
[0001] 본 발명은, 예컨대 패혈증 등의 감염증의 기염균(起炎菌)을 검체로부터 생균인 상태로 직접 회수하거나, 혈액 배양병(blood culture bottle)(혈액 배양 검체)으로부터 기염균을 직접 회수하거나 할 때에, 인간 유래의 ATP(아데노신3인산)를 최소화하여, 기염균의 ATP를 측정하기 위한 혈액 검체의 전처리 방법에 관한 것이다.
[0002] 모든 생물은 생명 활동을 하기 위해 ATP(아데노신3인산)를 에너지로서 사용하고 있고, 혈액 중의 인간 유래의 ATP를 제거하여 최소화하고, 패혈증 등의 기염균을 생균인 상태로 회수할 수 있으면, ATP 측정에 의해 생균(기염균)의 유무나 약제 감수성 시험을 행할 수 있다.
현행의 약제 감수성 시험은 균의 탁도로 판정하기 때문에, 우선 기염균을 분리 배양하고, 다음으로 약제 감수성 시험으로 균의 충분한 증식을 기다려야 하므로, 통상, 채혈로부터 2∼3일을 요한다.
이에 반해, 균이 생산하는 ATP를 측정함으로써, 세균 콜로니(colony)로부터 출발하는 약제 감수성 시험의 신속화가 보고된 바 있다(비특허문헌 1).
이 보고에 따르면, 종래법이 세균 콜로니의 출발로부터 18∼24시간을 요하는데 반해, ATP 측정으로는 대략 6시간에 가능하다고 되어 있다.
그러나, 상기 방법은 콜로니로부터의 출발이며, 이 콜로니를 얻을 때까지의 분리 배양에 1∼2일은 필요하기 때문에, 채혈로부터의 시간으로서는 신속하다고는 하기 어렵다.
[0003] 특허문헌 1에는 예컨대, 0.1, 0.2중량%의 SDS(황산 도데실 나트륨)(sodium dodecyl sulfate)과 2중량%의 사포닌으로 이루어진 계면활성제 처리액에 의해, 혈구가 파괴된 것이 기재되어 있다.
그러나, SDS의 농도가 0.1%, 0.2%와 같이 고농도이면, 예컨대 패혈증의 기염균으로서 자주 검출되는 [Streptococcus agalactiae]의 경우에 대부분이 사멸되어 생균으로서 회수할 수 없었다.
한편, SDS의 농도를 0.05%까지 떨어뜨리면, 상기 균의 생균 회수율이 향상되었지만, 혈액 중의 혈소판은 거의 파괴되지 않기 때문에, 인간 유래의 ATP를 최소화할 수 없어, 생균을 ATP 측정할 수 없었다.
일본 특허공개 2014-235076호 공보
Hattori N. et al. Novel antibiotic susceptibility tests by the ATP-bioluminescence method using filamentous cell treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy: 42, 1406-1411, 1998
[0006] 본 발명은, 혈액 검체 중(혈액 배양 검체를 포함함)의 인간 유래의 ATP를 최소화하는 것을 가능하게 하고, 또한 기염균을 생균인 상태로 혈액 검체로부터 직접 회수할 수 있는 전처리 방법의 제공을 목적으로 한다.
[0007] 본 발명은, 혈액 중의 기염균을 ATP 측정하기 위한 혈액 검체의 전처리 방법으로서, 혈액 검체로부터 혈소판과 기염균의 펠릿을 작성하는 단계와, 상기 혈소판과 기염균의 펠릿에 대해, 하기 (A)∼(C)의 단계를 임의의 순서로 혹은, 복수의 단계를 동시에 처리하는 단계를 갖는 것을 특징으로 한다.
(A) 혈소판의 세포막 단백질(蛋白)을 프로테아제 분해 처리한다.
(B) 혈소판을 저장액(低張液)으로 팽화(膨化) 처리한다.
(C) 기염균에 대한 영향을 억제한 조건하에서, 혈소판의 세포막을 계면활성제 용액으로 파괴 처리한다.
본 발명에서 기염균에 대한 영향을 억제한다는 것은, 생균으로서의 회수율이 패혈증 기염균의 주요 19균속(菌屬)의 평균으로 50% 이상인 것을 말한다.
[0008] 여기서, 상기 혈소판과 기염균의 펠릿은, 항응고제가 들어 있는 채혈관(採血管)으로 채혈한 혈액 검체로부터 원심 조작 또는 분리제에 의해, 적혈구 및 백혈구를 제외한 상청액(上淸, supernatant)을 원심 조작으로 펠릿화한 것이다.
항응고제로서는, 예컨대 EDTA 등을 들 수 있다.
[0009] 본 발명에 있어서, 상기 단계 (A)의 프로테아제 분해 처리에 사용하는 프로테아제는, 동물성 단백질의 분해에 사용되는 세균, 진균 등의 미생물 기원의 프로테아제(최적 pH(optimum pH)에 의해 산성 프로테아제, 중성 프로테아제, 알칼리성 프로테아제로 구분됨)이다.　
구체적으로는, 세균인 바실루스속(bacillus屬) 기원의 프로테아제(예컨대, 아로아제(AROASE)라는 상품명으로 시판되고 있는 것), 진균인 아스페르길루스속(aspergillus屬) 기원의 프로테아제(예컨대, 판치다제(PANCIDASE)라는 상품명으로 시판되고 있는 것) 등을 들 수 있다.
[0010] 본 발명에 있어서, 상기 단계 (B)의 팽화 처리에 사용하는 저장액은, 삼투압이, 혈액 삼투압보다 낮은 액(液)이며, 세균에는 무독·무해하고 인간 혈액 세포만을 팽화·파괴하는 것이면, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 4-(2-HydroxyEthyl)-1-Piperazine Ethane Sulfonic acid(HEPES), 염화 칼륨 및 염화 마그네슘을 구성 성분으로 하는 저장완충액(低張緩衝液) 등을 들 수 있다.
[0011] 본 발명에 있어서, 상기 단계 (C)에 사용하는 계면활성제 용액은, 소수성(疏水性) 부분에 장쇄(長鎖) 알킬기 등의 사슬형(鎖狀) 탄화수소를 갖는 음이온성 계면활성제(D1), 소수성 부분에 구조 중에 스테로이드핵(核) 등의 고리형(環狀) 탄화수소를 갖는 계면활성제(D2) 중 1종 이상을 함유하는 용액이다.
[0012] 장쇄 알킬기 등의 사슬형 탄화수소를 갖는 음이온성 계면활성제(D1)로서는, 카복실산형(型), 설폰산형(型) 및 황산 에스테르형(型) 중 어느 계면활성제여도 되고, 구체적으로는, 황산 도데실 나트륨(sodium dodecyl sulfate)(SDS), 라우릴 황산 나트륨(sodium lauryl sulfate), 황산 도데실 리튬(lithium dodecyl sulfate)(LDS), N-소듐 라우로일 사코시네이트(sodium lauroyl sarcosinate) 등을 들 수 있다.
이들은, 1종 또는 2종 이상의 사용이 바람직하다.
또한, 음이온성 계면활성제(D1)의 전체 용액 중의 농도는, 0.05중량% 이하인 것이 바람직하다.
[0013] 상기 계면활성제(D2)는 구조 중에 스테로이드핵 등의 고리형 탄화수소를 갖는 화합물이며, 구체적으로는, 사포닌, 콜산 나트륨(sodium cholate), 디옥시콜산 나트륨(sodium deoxycholate), 3-[(3-콜라미도프로필(cholamidopropyl))디메틸암모니오(dimethylammonio)]-1-프로판설포네이트(propanesulfonate)(CHAPS), 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트(CHAPSO) 등을 들 수 있다.
계면활성제(D2)는 사용하지 않아도 되지만, 1종 또는 2종 이상의 사용이 바람직하다.
[0014] 본 발명에 따른 혈액 검체의 전처리 방법에 있어서는, 세균이 펩티도글리칸(peptidoglycan) 벽을 갖고 있으므로, 프로테아제로 분해되지 않고, 저장액으로는 팽화되지 않는다.
또한, 계면활성제 용액에 의한 처리에 있어서는, 세균에 대한 데미지를 억제하고 있다.
이들에 의해, 혈소판 및 극소량 포함되어 있는 적혈구나 백혈구가, 프로테아제에 의한 세포막 단백질의 분해, 저장액에 의한 내압의 상승과 팽화, 계면활성제 용액에 의한 인지질의 유화(乳化)의 3가지 작용의 조합에 의해 세포막이 파괴되고, 인간 유래의 ATP가 세포 밖으로 방출되고, 세정 공정 등을 거쳐, 인간 유래의 ATP를 최소화하고 기염균만의 펠릿을 생균인 상태로 회수할 수 있다.
[0015] 상기 처리에 의해 상법(常法)에 근거하여, 예컨대, 루시페라아제(luciferase) 발광법 등에 의한 ATP 측정이 가능해진다.
본 발명에 있어서 인간 유래의 ATP를 최소화한다는 것은, 기염균의 ATP 측정에 영향을 주지 않을 정도로 인간 유래의 ATP를 제거하는 것을 말한다.
본 발명에 있어서는, 인간 유래의 ATP를 약 1/2,500,000 이하로 억제할 수 있다.
또한, 기염균을 생균으로서 회수할 수 있으므로, 검체 중의 생균의 유무 판정이나 약제 감수성 시험에 이용할 수 있다.
본 발명에 의해, 채혈로부터 불과 약 6시간 정도의 단시간에 약제 감수성 시험의 판정 결과를 얻을 수 있게 되어, 예후를 크게 좌우하는 패혈증 조기의 치료에 도움이 될 것으로 기대된다.
도 1은, 혈액 검체로부터 혈소판과 기염균의 펠릿을 만드는 조작을 나타낸다.
도 2는, 프로테아제 처리의 조작 및 작용의 설명도를 나타낸다.
도 3은, 저장액 처리 조작 및 세포 팽화 사진을 나타낸다.
도 4는, 계면활성제(Detergent) 처리 조작 및 그 작용의 설명도를 나타낸다.
도 5는, 펠릿의 세정 조작을 나타낸다.
도 6은, 회수한 기염균의 배양 조작을 나타낸다.
도 7은, ATP 측정 및 약제 감수성의 판정예를 나타낸다.
도 8은, 인간 유래 ATP의 제거 결과를 나타낸다. (a)는 현미경 사진, (b)는 ATP 측정 결과를 나타낸다.
도 9는, 균 회수능(回收能)의 평가 결과를 나타낸다.
도 10의 (a), (b)는, 임상 검체의 생균의 유무의 판정예를 나타낸다.
도 11의 (c), (d), (e)는, 임상 검체의 약제 감수성의 판정예를 나타낸다.
도 12는, 검체 전처리 방법(BAMB Procedure)과 ATP 측정의 순서를 나타낸다.
도 13은, 혈액 배양 검체에서의 간이 전처리 프로토콜의 혈구 파괴 단계의 차이에 따른, ATP 백그라운드의 측정 결과를 나타낸다.
도 14는, 혈액 배양 검체의 약제 감수성의 판정예를 나타낸다.
도 15는, 혈액 배양 검체의 약제 감수성의 판정예를 나타낸다.
도 16은, 혈액 배양 검체의 약제 감수성의 판정예를 나타낸다.
[0017] 다음으로, 채혈부터 ATP 측정 및 약제 감수성의 판정까지를 실시예에서 설명한다.
덧붙여, 본 발명에 따른 검체 전처리 방법을 BAMB(Bacterial ATP Measurement in Blood) Procedure라고 표현하였다.
전체적인 단계의 흐름을 도 12에 나타낸다.
여기서, 단계 2∼4의 순서는 상관없다.　
혈액 검체는, 토야마(富山) 대학병원과 나가레스기(流杉) 노인병원에 있어서, 패혈증이 의심되는 환자로부터 채취한 전혈(全血)이고, 이하의 실시예의 모든 절차는, 토야마 대학 윤리위원회 및 나가레스기 노인병원　윤리위원회의 승인 및 모든 환자로부터 문서에 의한 동의를 얻어 행해졌으며, 또한 실시예의 방법은, 승인된 가이드 라인에 따라 실시되었다.
실시예 1
[0018] 혈액 검체의 전처리를 (A), (B), (C)의 순서로 행한 경우.
＜단계 1: 전혈로부터의 혈소판 및 세균의 펠릿화＞
혈액 검체로부터 적혈구·백혈구를 제거하고, 「혈소판(극소량의 적혈구나 백혈구를 포함함)과 기염균의 펠릿」을 만든다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 예컨대 분리제가 들어 있는 EDTA 채혈관으로 채혈하고, 경도(輕度)의 원심 조작으로 상청액을 얻는다.
이 상청액을 튜브로 옮기고, 강한 원심 조작을 행함으로써 혈소판과 기염균의 펠릿을 얻는다.
구체적으로는, 혈장 분리 EDTA 튜브(Vacutainer(등록 상표) PPTTM Plasma Preparation Tube, BD Biosciences, CA, USA)에 합계 5mL의 정맥혈을 채취하였다.
그 후, 혈액 샘플을 1100×g로 10분간 원심 분리하여 혈구를 원심 분리하고, 얻어진 혈장 및 세균인 상청액 분획(上淸劃分, supernatant fraction)(2mL)을 사용하였다.
상청액을 등분하여 2개의 부분(각각 1mL)으로 나누고, 2000×g로 10분간 다시 원심 분리하고, 이어서 상청액 분획 900μL를 신중하게 꺼내어 펠릿을 흐트러뜨리지 않게 하였다.
[0019] ＜단계 2: 프로테아제 처리(혈소판 세포막의 단백질 분해)＞
혈소판(및 극소량의 적혈구나 백혈구)의 세포막 단백질의 분해를 행한다.
세균은 프로테오글리칸(proteoglycan) 벽을 갖기 때문에, 프로테아제로는 분해되지 않는다.
도 2에 나타내는 바와 같이 예컨대, 프로테아제를 첨가하고, 인큐베이트한다.
구체적으로는, 분자생물학 연구 그레이드의 증류수(UltraPureTM DNase / RNase-Free 증류수, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA, 이하, 증류수)로 용해한 프로테아제(Aroase NP-10: 야쿠르트 제약 공업, 도쿄, 일본) 1mL(10% w/v)를 펠릿에 첨가하고, 10회 피펫팅(pipetting)한 후, 37℃에서 10분간 인큐베이트하였다.
인큐베이션 후, 혼합물을 2000×g로 5분간 원심 분리하고, 이어서 펠릿을 흐트러뜨리지 않도록 상청액 분획 1mL를 주의 깊게 제거하였다.
[0020] ＜단계 3: 저장액에 의한 처리(혈소판의 팽화)＞
혈소판(및 극소량의 적혈구나 백혈구)의 내압을 높여서, 팽화시켜 파괴되기 쉽게 한다.
세균은 펩티도글리칸 벽을 갖기 때문에, 팽화되지 않는다.
도 3에 나타내는 바와 같이 저삼투압의 저장액으로 처리한다.
구체적으로는, 10mM HEPES(pH7.9. DOJINDO Molecular Technologies, Tokyo, Japan), 1.5mM KCl(와코 순약(和光純藥) 공업(주), 도쿄) 및 10mM MgCl2·6H2O가 되도록 증류수로 용해한 후, 오토클레이브(autoclave)하여 pH7.9의 저장액을 작성한다.
그리고, 저장액 800μL를 펠릿에 첨가하여 10회 피펫팅한 후, 실온에서 5분간 인큐베이트하였다.
[0021] ＜단계 4: Detergent 처리＞
혈소판(및 극소량의 적혈구나 백혈구)의 세포막을 파괴한다.
저장액 처리 후, 균을 펠릿화하기 위해 원심 조작을 행하는데, 원심 전에 저장액에 Detergent(계면활성제) 용액을 첨가하는 공정이 세균의 회수에 있어 필요하다.
예컨대, 녹농균은 튜브 내벽에 부착되기 쉽기 때문에, Detergent 없이 원심하면, 내벽에 부착된 채로 거의 회수할 수 없다.
단, 다른 대부분의 균종에서는 그와 같은 문제는 생기지 않는다.
소수성 부분에 고리형 탄화수소를 갖는 계면활성제의 1종인 사포닌은 인간 세포막의 콜레스테롤에 작용하여 쐐기를 박듯이 파고 들어가, 세포막의 구조를 느슨하게 한다(파괴한다).
한편, 세균의 세포벽은 펩티도글리칸　층이기　때문에, 사포닌은 작용하지 않는다.
소수성 부분에 사슬형 탄화수소를 갖는 음이온성 계면활성제의 1종인 SDS는 지질(脂質) 이중층인 인간 세포막의 인지질을 유화하여 세포막을 파괴한다.
SDS는 세균의 세포벽도 손상시키지만, 예컨대 SDS 농도를 0.05%까지 묽게 하면, Detergent 처리로 사멸되기 쉬운 Streptococcus agalactiae조차 거의 사멸되지 않는다.
0.05%의 저농도로 처리함으로써, 세균에 대한 영향을 최소화하여 인간 세포막의 파괴를 주로 한 작용을 가져온다.
그 조작의 흐름을 도 4에 나타낸다.
구체적으로는, 단계 3의 인큐베이션 후, 2% 사포닌(SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) 및 0.05% SDS(와코 순약 공업(주)제(製))을 pH7.4의 인산 완충 식염수(PBS: Thermo Fisher Scientific)로 용해한 Detergent A 200μL를 저장액·펠릿 혼합액에 첨가하고, 혼합물을 10회 피펫팅한 후, 2,000×g로 5분간 원심 분리하고, 펠릿을 흐트러뜨리지 않도록 주의 깊게 1mL의 상청액 분획을 제거하였다.
다음으로, 1mL의 Detergent A를 펠릿에 다시 첨가하고, 혼합물을 20회 피펫팅하고, 계속해서 실온에서 15분간 인큐베이트하였다.
[0022] ＜단계 5:　펠릿의 세정(인간 유래 ATP의 백그라운드를 최소화하여 생균을 펠릿화함)＞
혈소판(및 극소량의 적혈구나 백혈구) 유래의 ATP나 세포 소기관을 Detergent 성분과 함께 씻어 내어, 기염균만을 생균인 상태로 회수한다.
그 조작의 흐름을 도 5에 나타낸다.
구체적으로는, 단계 4의 인큐베이션 후, 혼합물을 2000×g로 5분간 원심 분리하고, 펠릿을 흐트러뜨리지 않도록 상청액 분획 1mL를 주의 깊게 제거하였다.
다음으로, 펠릿에 Muller-Hinton 배지(培地)(Muller-Hinton II 브로스, Cation-adjusted, BD Biosciences) 1mL를 첨가하고, 수회 부드럽게 뒤집어가며 골고루 섞은 후, 다시 2000×g로 5분간 원심 분리하였다.
원심 분리 후, 펠릿을 흐트러뜨리지 않도록, 1mL의 상청액 분획을 주의 깊게 제거하였다.
그 후, 이 펠릿 세정 공정을 다시 반복하였다.
즉, 펠릿에 1mL의 Muller-Hinton 배지를 첨가하고, 부드럽게 뒤집어가며 골고루 섞은 후, 다시 2,000×g로 5분간 원심 분리하였다.
원심 분리 후, 펠릿을 흐트러뜨리지 않도록, 1mL의 상청액 분획을 주의 깊게 제거하였다.
이들은, 인간 유래의 ATP 백그라운드를 최소화한 패혈증 기염균의 세균 펠릿이다.
[0023] ＜단계 6: 기염균의 배양(항균약±)＞
혈액 검체로부터 회수된 기염균(생균)을 항균약 존재하, 및 비존재하에서 진탕(振蕩, shaking) 배양한다.
그 조작예를 도 6에 나타낸다.
구체적으로는, BAMB procedure 후, 1mL의 Muller-Hinton 배지를 펠릿에 첨가하였다.
이들 2개의 튜브의 혼합물을 하나로 되돌리고, 다시 2등분으로 분할하여 균수를 맞추었다.
그 후, Levofloxacin(LVFX)(Sigma-Aldrich, USA) 2.0μg/ml 존재하, 비존재하의 각각의 조건에서, 37℃, 0, 2, 4, 6, 12, 24시간의 진탕 배양을 행하였다.
[0024] ＜단계 7: 기염균 배양 후의 생균 ATP의 측정과 약제 감수성의 판정＞
배양 후의 각 타임 포인트에서 생균 ATP를 측정하고, 약제 감수성을 판정한다.
통상, 배양 후 4시간 정도, 즉, 채혈 후 6시간 정도(전처리 공정의 2시간 포함)의 신속함으로 약제 감수성의 판정이 가능하다.
그 조작예를 도 7에 나타낸다.
구체적으로는, ATP 바이오루미네선스(bioluminescence)에 의한 생균의 ATP 측정을 이하의 순서로 행하였다.
덧붙여, ATP의 측정에는 ATP 바이오루미노미터(bioluminometer) 자동 측정 장치를 사용하였다.
ATP 바이오루미노미터 자동 측정 장치는 히타치(日立) 제작소가 개발한 프로토타입 모델이고, 단균(單菌)을 검출하기 위한 attomole 레벨에서의 ATP 측정을 가능하게 한다.
[0025] 생균 ATP의 측정 시약은, CheckLiteTM HS 세트(Kikkoman Biochemifa, Tokyo, Japan) 및 ATP 표준 샘플(Kikkoman Biochemifa)을 사용하였다.
CheckLiteTM HS 세트에는, ATP 제거 시약, ATP 추출 시약, 및 생물 발광 시약이 포함되어 있다.
세정액과 희석용 완충액으로서, 증류수(UltraPureTM DNase / RNase-Free 증류수, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여, 각각 세균 시료와 ATP 표준 샘플의 희석계열을 작성하였다.
[0026] ATP 검량선 작성은, ATP 표준 샘플(Kikkoman Biochemifa)을 사용하여, 고농도 측정용과 저농도 측정용의 2개의 희석계열을 조제하였다.
고농도 측정용으로는 100∼2×109amol/mL의 ATP 표준 샘플을 멸균수로 희석함으로써 조제하였다.
저농도 측정용으로는 100∼500amol/mL의 ATP 표준 샘플을 멸균수 또는 ATP 추출 시약으로 희석함으로써 조제하였다.
블랭크 샘플(blank sample)로서 멸균수 또는 ATP 추출 시약을 사용하였다.
ATP 생물 발광은 이하의 단계로 측정하였다.
우선, 반응 튜브 내에 멸균수 또는 ATP 추출 시약으로 희석한 ATP 표준 샘플 10μL를, 시약 튜브 내에 생물 발광 시약 1mL를 첨가하고, 각각 ATP 바이오루미노미터 자동 측정 장치에 세트하였다.
그리고, ATP 바이오루미노미터 자동 측정 장치에 의해 50μL의 생물 발광 시약을 샘플에 첨가하였다.
[0027] ＜세균의 세포 내 ATP 측정의 순서＞
우선, ATP 제거 시약을 PBS로 20%(v/v)로 희석하였다.
다음으로, 진탕 배양 후의 세균 시료 12.5μL에 20%(v/v) ATP 제거 시약 12.5μL를 첨가하였다.
그리고, 세포 외 ATP 및 사균 ATP를 제거하기 위해 30분간 인큐베이트하였다.
인큐베이션 후, 25μL의 ATP 추출 시약을 세균 시료 또는 블랭크 시료에 첨가하였다.
생균의 세포 내 ATP를 추출하기 위해, 시료를 1분간 인큐베이트하였다.
세포 내 ATP 추출 후의 시료 10μL를 반응 튜브에 첨가하고, ATP 바이오루미노미터 자동 측정 장치에 세트하였다.
시료 중의 생균 세포 내 ATP를 생물 발광 시약과 혼합하고, 30초간 측정하였다.
상대 광강도(RLU)는, 시료와 생물 발광 시약을 혼합한 후 30초 이내에 그 최대 강도로부터 5초간의 평균치로서 계산하였다.
샘플의 ATP 생물 발광(RLU)을 ATP 검량선(RLU/amol)으로 비교 정량함으로써, 전(全) 세균 세포 내 ATP(amol)를 결정하였다.
[0028] 도 8에, 인간 유래 ATP 제거능(除去能)의 평가 결과를 나타낸다.
도 8의 (a)는, 본 발명에 따른 프로세스(BAMB procedure)의 처리 전과 처리 후의 혈장 펠릿의 현미경 사진을 나타낸다.
처리 후에는, 혈구 모두가 파괴되고, 제거되어 있음을 알 수 있다.
도 8의 (b)는, 건강인 5명으로부터 채혈한 혈액의 처리 전후에 있어서의 혈장 펠릿의 ATP 측정 결과를 나타낸다.
이 그래프로부터, 인간 유래의 ATP가 약 1/2,500,000로 저하되어 있음을 알 수 있다.
[0029] 도 9(표 1)에 패혈증 혈액의 혈액 배양으로부터 검출되는 빈도가 높은 19균속의 회수 결과를 나타낸다.
그 평균 회수율은 ATP 측정으로 93.6%, CFU 측정으로 71.9%였다.
[0030] 도 10, 도 11에 임상 검체에 본 발명에 따른 BAMB procedure를 이용한 예를 나타낸다.
검체 (a), (b): 패혈증 의심 환자의 혈액 검체로, 혈액 배양 음성인 예를 나타낸다.
BAMB procedure 후의 배양 시간 경과로 ATP의 상승은 인정되지 않고, 혈액 중에 생균이 없음을 알 수 있다.
검체 (c), (d): 패혈증 환자의 혈액 검체로, 혈액 배양 양성, 항균약인 LVFX(레보플록사신(levofloxacin))에 내성인 E. coli(c)와 MRSA(d)가 검출된 예를 나타낸다.
BAMB procedure 후의 배양 4시간 만에 LVFX±에 관계없이 ATP의 상승이 인정되었다.
즉, 배양 후 4시간(채혈 후 6시간) 만에 「혈액 중에 기염균(생균)이 존재하고, 그것이 LVFX 내성균이다」는 것이 ATP 측정으로 판정되었다.
검체 (e): 패혈증 환자의 혈액 검체로, 혈액 배양 양성, 항균약인 LVFX에 감수성이 있는 Proteus mirabilis와 Enterococcus faecalis의 2균이 검출된 예를 나타낸다.
BAMB procedure 후의 배양 4시간 만에 LVFX이 없는 경우에 ATP 상승, LVFX이 있는 경우에 ATP 억제가 인정되었다.
즉, 배양 후 4시간(채혈 후 6시간) 만에, 「혈액 중에 기염균(생균)이 존재하고, 그것이 LVFX 감수성균이다」는 것이 ATP 측정으로 판정되었다.
실시예 2
[0031] 실시예 1의 단계 2∼4의 순서를 단계 3, 2, 4로 변경하고, 그 외의 단계 등은 실시예 1과 마찬가지로 하여 3회 실험하였다.
그 결과, 백그라운드(도 10에 있어서 0시간의 CPS값)의 평균은 476이었다.
실시예 3
[0032] 실시예 1의 단계 2∼4의 순서를 단계 4, 2, 3으로 변경하고, 그 외의 단계 등은 실시예 1과 마찬가지로 하여 3회 실험하였다.
그 결과, 백그라운드(도 10에 있어서 0시간의 CPS값)의 평균은 500이었다.
실시예 4
[0033] 실시예 1의 단계 3에 있어서의 계면활성제를 SDS만으로 변경하고, 그 외의 단계 등은 실시예 1과 마찬가지로 하여 3회 실험하였다.
그 결과, 백그라운드(도 10에 있어서 0시간의 CPS값)의 평균은 479였다.
실시예 5
[0034] ＜혈액 배양병으로부터 생균을 회수하고, ATP 측정에 의한 신속 약제 감수성 시험을 행하는 순서＞
본 실시예에서는, 혈액 배양 양성이 된 병(bottle)으로부터 ATP 백그라운드를 최소화하고 기염균을 생균인 상태로 직접 회수하는 방법을 나타낸다.
혈액 배양한 후에는 혈구의 세포막이 이미 파괴되기 쉬워져 있기 때문에, 실시예 1의 단계 2에 있어서의 프로테아제 처리를 필요로 하지 않고, 저장액과 Detergent A를 혼합한 신속·간편한 전처리 방법만으로 혈구(혈소판을 포함함)를 파괴할 수 있다.
그 후, 회수한 생균을 배양하여 ATP 측정에 의한 신속 약제 감수성 시험을 행한다.
이하, 본 실시예의 프로토콜을 기재한다.
1. 배양 검체(혈액 배양 양성화(陽性化)로부터 1시간 후) 100μl를 1.5ml의 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 채취한다.
2. 저장액 800μl＋Detergent A 200μl를 첨가하고, 20회 피펫팅. 그 후 원심(2000×G, 10분간, 실온)하여 균의 펠릿화를 행한다.
3. 상청액 1000μl를 제거
4. 뮬러 힌트(Mueller Hinton) 배지를 사용하여 3000배 희석
5. 1.5ml의 에펜도르프 튜브 2개 각각에 희석한 산물(産物)을 270μl씩 첨가
6. 에펜도르프 튜브 2개 각각에 ATP 소거 시약 30μl를 첨가
7. 에펜도르프 튜브 중 1개에는 레보플록사신(LVFX 20μg/ml)을 33.3μl 첨가, 나머지 1개에는 초순수(超純水) 33.3μl를 첨가하고, 각각 35℃에서 배양
8. 측정 포인트는 2시간, 4시간, 6시간, (24시간)
9. 배양 후, 1포인트당 10μl씩 3회 샘플을 채취
10. ATP 추출 시약 10μl를 첨가하여 볼텍스(vortex) 후에 ATP량을 각각 측정
본 프로토콜에 있어서도 Detergent A는 필수이다(도 13).
표 2에 나타내는 바와 같이, 건강인 혈액을 4시간 혈액 배양하여 인간 유래 ATP 백그라운드를 측정한 결과, 저장액＋0.05% SDS(사포닌 없음), 혹은 저장액만으로는 혈구를 충분히 파괴할 수는 없음을 알 수 있다.
[0035] 도 14에 본 실시예의 신속 약제 감수성 시험 결과를 나타낸다.
균 ATP량은 항균약 유·무에 관계없이 배양 시간이 진행됨에 따라 증가하고 있어, 항균약(레보플록사신) 내성인 것이 배양 4시간 후에는 명백하다.
실제로, 종래의 검사법으로는 레보플록사신 내성인 Escherichia coli(대장균)가 검출되어, 약제 감수성 결과는 일치하였다.
이상에 의해, 혈액 배양 양성 시로부터 불과 4시간 만에 정확한 감수성 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 6
[0036] ＜혈액 배양병으로부터의 ATP 측정에 의한 신속 약제 감수성 시험의 증례(症例) 2＞
실시예 5와 동일한 프로토콜(단, 혈액 배양 양성화로부터 4시간 후의 배양 검체를 사용)로, 실시예 5와는 다른 패혈증 환자의 혈액 배양병으로부터 신속 약제 감수성 시험을 행하였다.
도 15에 본 실시예의 신속 약제 감수성 시험 결과를 나타낸다.
배양 시간이 진행됨에 따라, 항균약이 없는 경우에는 균 ATP량은 증가, 항균약(레보플록사신)이 있는 경우에는 균 ATP량은 감소하였다.
즉, 항균약(레보플록사신) 감수성인 것이 배양 4시간 후에는 명백하다.
실제로, 종래의 검사법으로는 레보플록사신 감수성인 Streptococcus anginosus가 검출되어, 약제 감수성 결과는 일치하였다.
이상에 의해, 혈액 배양 양성 시로부터 불과 4시간 만에 정확한 감수성 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 7
[0037] ＜혈액 배양병으로부터의 ATP 측정에 의한 신속 약제 감수성 시험의 증례 3＞
실시예 5와 동일한 프로토콜(단, 혈액 배양 양성화로부터 5시간 후의 배양 검체를 사용)로, 실시예 5, 6과는 다른 패혈증 환자의 혈액 배양병으로부터 신속 약제 감수성 시험을 행하였다.
도 16에 본 실시예의 신속 약제 감수성 시험 결과를 나타낸다.
균 ATP량은 항균약 유·무에 관계없이 배양 시간이 진행됨에 따라 증가하고 있어, 항균약(레보플록사신) 내성인 것이 배양 4∼6시간 후에는 명백하다.
단, 항균약 유·무에 따라 균 ATP량의 증가에 차이가 있기 때문에, 항균약 내성균과 감수성균이 혼합되어 있었을 가능성이 있다. 종래의 검사법으로는 레보플록사신 내성인 Staphylococcus capitis or Staphylococcus caprae가 검출되어, 약제 감수성 결과는 일치하였다.
이상, 혈액 배양 양성 시로부터 불과 4∼6시간 만에 정확한 감수성 결과를 얻을 수 있었다.
[0038] 패혈증 의심 환자의 혈액 검체에 있어서의, ATP 측정을 이용한 신속 약제 감수성 시험의 실시에 이용할 수 있다.
혈액 검체 중의 생균의 유무에 관해, ATP 측정에 의해 신속 판정(유전자 검사의 약점을 보충할 수 있음)의 실시에 이용할 수 있다.
혈액 배양병으로부터의 혈액 배양 검체에 있어서의, ATP 측정을 이용한 신속 약제 감수성 시험의 실시에 이용할 수 있다.
혈액 검체 이외에도, 뇌척수액(세균성 수막염), 심낭수(心囊水)(심막염), 흉수(흉막염), 복수(腹水)(복막염), 관절포액(關節包液)(정형외과의 수술 후 감염증), 안방수(眼房水)(안내염(眼內炎)), 폐포 세정액(폐렴), 요(尿)(요로 감염증), 수술 후의 드레인 배액(수술 후 감염증), CV 카테터 팁(catheter tip)(장기 와상(臥牀) 환자의 카테터 팁 바이오 필름에 의한 패혈증) 등에서, 생균의 유무의 신속 판정, 및 신속 약제 감수성 시험 등의 실시에 이용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 혈액 중의 기염균(起炎菌)을 ATP 측정하기 위한 혈액 검체의 전처리 방법으로서,
    혈액 검체로부터 혈소판과 기염균의 펠릿을 작성하는 단계와,
    상기 혈소판과 기염균의 펠릿에 대해, 하기 (A)∼(C)의 단계를 임의의 순서로 혹은,
    복수의 단계를 동시에 처리하는 단계를
    갖는 것을 특징으로 하는 혈액 검체의 전처리 방법.
    (A) 혈소판의 세포막 단백질(蛋白)을 프로테아제 분해 처리한다.
    (B) 혈소판을 저장액(低張液)으로 팽화(膨化) 처리한다.
    (C) 기염균에 대한 영향을 억제한 조건하에서, 혈소판의 세포막을 계면활성제 용액으로 파괴 처리한다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈소판과 기염균의 펠릿은, 항응고제가 들어 있는 채혈관(採血管)으로 채혈한 혈액 검체로부터 원심 조작 또는 분리제에 의해, 적혈구 및 백혈구를 제외한 상청액(上淸, supernatant)을 원심 조작으로 펠릿화한 것인 혈액 검체의 전처리 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 (A)의 프로테아제 분해 처리에 사용하는 프로테아제는, 미생물 기원의 프로테아제인 혈액 검체의 전처리 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (B)에 사용하는 저장액은, 삼투압이, 혈액 삼투압보다 낮은 액(液)인 혈액 검체의 전처리 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (C)에 사용하는 계면활성제 용액은, 소수성(疏水性) 부분에 사슬형(鎖狀) 탄화수소를 갖는 음이온성 계면활성제(D1), 소수성 부분에 고리형(環狀) 탄화수소를 갖는 계면활성제(D2) 중 1종 이상인 혈액 검체의 전처리 방법.
  6. 혈액 배양 검체의 전처리에 있어서는, 제1항에 기재된 전처리에 있어서 (A)의 단계를 행하지 않고, (B)와 (C)의 단계만을 동시에 처리하는 간이 단계인 것을 특징으로 하는 혈액 배양 검체의 전처리 방법.
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