CN101819200A - 微生物检测装置、检测方法、以及用于该装置的试样容器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以高精度、高灵敏度、迅速、简便地检测和定量含在大量样品中的少数微生物的方法。该方法使用在底部具有二层结构膜过滤器(101)的试样容器(102)，该二层结构膜过滤器(101)的上层第一层(116)为亲水性膜过滤器，其下有作为第二层的、不使用润湿剂且可以通过产生负压而过滤水溶液的膜过滤器(117)，通过抽气部(105)产生的负压，过滤大量的样品水溶液，用亲水性膜过滤器捕捉样品水溶液中的微生物。并且，由负压回到常压后，加入微生物溶解液，使微生物溶解液在疏水性膜过滤器上保持一定时间。然后，分注到放入发光试剂(115)的反应容器(113)中，通过检测发光而检测微生物。

Description

微生物检测装置、检测方法、以及用于该装置的试样容器
技术领域
本发明涉及微生物检测装置、检测方法、以及用于其的试样容器。
背景技术
微生物的检测或者微生物数量的定量，在制药厂或者食品厂、再生医疗设施等方面，作为将制品的微生物污染防范于未然的安全卫生管理来实施。尤其是微生物数量的定量，根据日本药局方面的规定，在制药厂中，不仅对制品和原料实施，还对制药厂内的空气和墙壁表面、作业人员手套表面等实施。并且，关于微生物数量的定量，在食品厂也随着HACCP(危害分析和关键控制点，Hazard Analysis and Critical Control Point)的导入，作为食品厂自身和作业行程的检查，与食品一起对墙壁表面和地板面、切菜板表面和菜刀表面等烹调工具也实施。
微生物数量的定量方法一般为培养法。培养法是，当样品为液体时，直接将样品涂在琼脂平板培养基上，并且当样品不是液体时，将洗出微生物的液体涂在培养基上，在培养基上培养微生物，利用1个微生物形成1个菌落的特点，对形成的菌落数进行计数的微生物数量的定量方法。
并且，使用膜过滤器定量微生物的膜过滤器(Membrane filter，MF)法也比较常用。MF法是用膜过滤器过滤样品而捕捉微生物，将捕捉了微生物的膜过滤器放在平板琼脂培养基上培养，并对菌落进行计数而定量的方法。并且，不进行培养的情况下，还有在捕捉了微生物的膜过滤器上，将从微生物中提取三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)的ATP提取试剂、含有荧光素酶和荧光素的发光试剂进行雾状喷雾，用CCD(电荷耦合元件，Charge Coupled Device)照相机拍摄由ATP与荧光素酶及荧光素反应而产生的荧光亮点来定量微生物的方法(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献1：日本特愿平9-317792号公报
发明内容
发明要解决的问题
以往的培养法由于是将含有微生物的样品涂在琼脂平板培养基上，所以存在样品量的上限约为1ml的问题。从而，在样品量多而微生物数量少的情况下，就难以进行定量。并且，还存在需要24～72小时的培养以至获得定量结果的问题。其结果，不得不在制药、食品或者生物细胞等的装运阶段等待定量结果，在安全性、效率性或者经济性方面造成很大的损失，因此，需要缩短微生物定量所需要的时间。
并且，就以往的MF法而言，捕捉了微生物的膜过滤器和培养基之间进入空气等而未完全密合的话，培养基的营养成分就难以移向微生物，使得微生物的增殖速度达不到一定程度，导致菌落的大小不均，所以存在定量精度降低的问题。并且，MF法中，向被捕捉在膜过滤器上的微生物喷雾ATP提取试剂，但是喷出的提取试剂被渗入到膜过滤器中的样品或者缓冲溶液所稀释，或者相对所使用的提取液用量微生物的细胞壁坚固的话，提取效率就减少，定量灵敏度降低。
本发明是以迅速、高精度、高灵敏度、简便地检测和定量含在大量样品中的少数微生物的方法。
解决问题的手段
本发明人为了提供迅速、高精度、高灵敏度、简便地检测并定量含在大量样品中的少数微生物的装置和方法，尝试了开发如下的装置和方法：用膜过滤器过滤含有微生物的样品，用足量的微生物溶解液溶解微生物，以源自微生物的生物物质为指标，用发光反应或者荧光反应来检测。在此过程中首先发现以下问题。
如果用多孔性亲水性膜过滤器过滤含微生物的样品，微生物的直径明显大于膜过滤器的孔径时，微生物会被捕捉在膜过滤器的表面，但是微生物的直径与膜过滤器的孔径相近时，由于微生物会进入膜过滤器中而被捕捉。以微生物被捕捉在膜过滤器内的状态，在膜过滤器上加入微生物溶解试剂(例如ATP提取试剂)的话，微生物就会在膜过滤器内溶解，很多提取出的生物物质(例如ATP)就会留在膜过滤器内。如果以这样的状态，将提取的ATP与ATP提取试剂一起从膜过滤器上移入装有生物发光试剂(例如荧光素酶、荧光素)的容器中尝试发光测试，留在膜过滤器内的ATP就会损失而减少发光量，所以定量性就会降低。
于是，还尝试了通过在亲水性膜过滤器上加入提取试剂静置一定时间或者搅拌，使ATP从膜过滤器内游离的方法。但是，这种情况下，在ATP从膜过滤器内游离之前，ATP就会与提取试剂一起渗漏到膜过滤器下面，而使游离困难。
并且，为了使ATP提取试剂不从膜过滤器渗漏，尝试代替亲水性膜过滤器而使用对水溶液非浸透的疏水性膜过滤器的方法。首先，用疏水性膜过滤器过滤含微生物的样品水溶液时，必须使润湿剂(例如甲醇或者乙醇等醇类或者二乙醚等醚类)渗入疏水性膜过滤器。但是，润湿剂可能会使微生物溶解或者受损伤，并且，如果在过滤过程中润湿剂从膜过滤器中溶出，过滤性能就会变差。从而，使润湿剂渗入疏水性膜过滤器中进行过滤的方法，在微生物的检测、定量以及判断微生物的生死上存在困难。
本发明就是解决本发明人发现的这些问题和以往的问题。本发明人发现，即使是疏水性膜过滤器，根据孔径的大小，通过在膜过滤器下面产生负压，不使用润湿剂就可以过滤样品水溶液，并且疏水性膜滤器下方为常压时，提取试剂不会渗漏到膜过滤器下面。依靠疏水性膜过滤器进行的水溶液的过滤，孔径可以在某一定大小以上，如果某微生物的大小比该孔径小，则该微生物的捕捉就会变得困难。于是，通过在疏水性膜过滤器上设置用于捕捉微生物的、微小孔径且多孔性的亲水性膜过滤器，开发出了可以过滤大量的水溶液，并且可以捕捉微生物，再加上能够保持微生物溶解液的二层结构膜过滤器。
本发明的微生物检测装置，使用在底部设有二层结构膜过滤器的试样容器，并具有在试样容器的二层结构膜过滤器的下面设置抽气部的结构；所述二层结构膜过滤器上层第一层为亲水性膜过滤器，其下有作为第二层的、不使用润湿剂且可以通过产生负压而过滤水溶液的疏水性膜过滤器。二层结构膜过滤器的第一层亲水性膜过滤器起到捕捉微生物的作用，第二层疏水性膜过滤器起到保持试剂的作用。
而且根据本发明，依靠由抽气部产生的负压，就可以过滤通过第一层亲水性膜过滤器和第二层疏水性膜过滤器的大量样品水溶液，在不会溶解或损伤样品水溶液中的微生物的前提下，用第一层亲水性膜过滤器将其捕捉。并且从负压变回常压后，加入微生物溶解液，在一定时间内能够不使微生物溶解液从膜过滤器下面渗漏而保持在第二层疏水性膜过滤器上。而且根据本发明，可以将被捕捉在第一层亲水性膜过滤器上的微生物溶解，且可以使第一层亲水性膜过滤器内的源自微生物的生物物质游离到第一层亲水性膜过滤器上。
第一层亲水性膜过滤器的孔径优选0.05μm～0.65μm，第二层疏水性膜过滤器的孔径优选0.8μm～80μm。通过使第一层亲水性膜过滤器的孔径达到0.05μm～0.65μm，就可以在第一层亲水性膜过滤器上可靠地捕捉微生物，通过使第二层疏水性膜过滤器的孔径为0.8μm～80μm，就可以不使用润湿剂且通过产生负压而过滤样品水溶液，并且通过从负压回到常压，可以使微生物溶解液保持在疏水性膜过滤器上。
本发明的微生物检测方法是在样品水溶液中加入分解微生物外的生物物质的第一试剂来分解微生物外的生物物质，通过用二层结构膜过滤器抽滤样品水溶液，将微生物捕捉在第一层亲水性膜过滤器上的同时，除去样品水溶液中含有的第一试剂或者异物。然后，加入提取微生物内生物物质的第二试剂，通过保持在第二层疏水性膜过滤器上，从微生物中提取生物物质，并且，从第一层亲水性膜过滤器内游离生物物质，通过使游离的生物物质和与其反应的第三试剂发生反应，定量测定微生物。在这里，作为第二试剂使用不会润湿疏水性膜过滤器的试剂。
发明效果
本发明提供微生物检测装置和微生物检测方法，通过本发明容易过滤大量的样品水溶液，能可靠地溶解微生物，能容易地将从微生物中提取的生物物质从膜过滤器上洗脱。并且，提供无需培养，不需要熟练就能高灵敏度、高精度、迅速、简便地进行微生物的生死判断和生物细胞的定量的微生物检测装置和微生物检测方法。
附图说明
图1为本发明的微生物检测装置的一例的一部截面示意图；
图2为表示微生物检测的处理步骤的流程图；
图3为本发明的微生物检测装置的一例的一部截面示意图；
图4为本发明的微生物检测装置的一例的一部截面示意图；
图5为本发明的微生物检测装置的一例的一部截面示意图；
图6为本发明的微生物检测装置的一例的一部截面示意图；
图7为表示在容器底部安装二层结构膜过滤器的方法的例子的图；
图8为表示在容器底部安装二层结构膜过滤器的方法的例子的图；
图9为表示使用本发明的二层结构膜过滤器的检测方法的过程工序的示意图；
图10为表示使用单层亲水性膜过滤器的检测方法的过程工序的示意图；
图11为抽滤的说明图；
图12为表示使用二层结构膜过滤器时的横轴大肠杆菌数量和ATP数量的关系的图；
图13为表示在各种条件下检测到的ATP数量的图；
图14A为二层结构膜过滤器的微生物溶解液保持能力测定实验的说明图；
图14B为单层亲水性膜过滤器的微生物溶解液保持能力测定实验的说明图；
图15为二层结构膜过滤器内的ATP分子的洗脱实验的说明图；
图16为单层亲水性膜过滤器内的ATP分子的洗脱实验的说明图；
图17为表示残留在单层亲水性膜过滤器上的微生物溶解液和渗漏的微生物溶解液的发光量的经时变化的图；
图18为表示二层结构膜过滤器上的微生物溶解液的发光量的经时变化的图。
符号说明
101为二层结构膜过滤器；102为容器；103为试剂供给部；105为抽气部；106为洗涤液供给部；108为加热部；109为杆；110为分注部；112为检测部；113为反应容器；114为输入与控制部；115为发光试剂；116为亲水性膜过滤器；117为疏水性膜过滤器；118为废液部；301为试剂；302为试剂槽；601为激发光照射部；701为大肠杆菌；702为大肠杆菌悬浮液；703为微生物溶解液；704为源于大肠杆菌的ATP分子；801为容器的底部；802为环状的盖；803为螺丝；901为容器的具有螺丝样沟槽的底部；902为具有螺丝样沟槽的环状的盖；1001为单层亲水性膜过滤器；1002为容器；1003为渗漏的微生物溶解液；1004为渗漏的来源于大肠杆菌的ATP分子；1101为抽气口；1501为ATP分子；1601为渗漏的ATP分子。
具体实施方式
以下，结合附图说明本发明的实施方式。只是，以下的说明不对本发明作任何限定。
实施例1
微生物的检测装置和方法
图1是本发明的微生物检测装置的一例的一部截面示意图。微生物检测装置具有在底部设有二层结构膜过滤器101的容器102、试剂供给部103、试剂供给用配管104、抽气部105、洗涤液供给部106、洗涤液供给用配管107、加热部108、杆109、分注部110、分注用配管111、检测部112、反应容器113、以及输入与控制部114。输入与控制部114整体控制装置各部分的动作。容器102相对于装置可以拆装自如。并且，反应容器113中装有发光试剂115。
二层结构膜过滤器101为，上层第一层为亲水性膜过滤器116，下层第二层为疏水性膜过滤器117。为了可靠地捕捉微生物，第一层亲水性膜过滤器116的孔径为0.05μm～0.65μm。并且，厚度为7μm～200μm，当然比该厚度薄或者厚都没有关系，但是，如果比该厚度薄，膜过滤器的机械强度就会变差，在过滤中膜过滤器可能会破裂，如果比该厚度厚，膜过滤器中就会残留较多溶液，可能会使其后追加的各种试剂稀释。从而厚度优选7μm～200μm。为了可靠地过滤水溶液，第二层疏水性膜过滤器117的孔径为0.8μm～180μm。并且，厚度为7μm～800μm，虽然无论比该厚度薄或者厚都没有关系，但是，如果比该厚度薄，则膜过滤器的机械强度就会变差，在过滤中膜过滤器可能会破裂，如果比该厚度厚，则在抽滤上可能会耗费时间。从而厚度优选7μm～800μm。
图2是表示根据图1所示的微生物检测装置的微生物检测的处理步骤的流程图。另外，图3～6为本发明的微生物检测装置的另外形态，在此一起说明。
在装置上设置底部设有二层结构膜过滤器101的容器102，一开始在输入与控制部114输入样品的粘性高低、可否测定枯草杆菌芽孢的初始值等，开始微生物检测(S201)。在容器102中装入含有待测微生物的样品水溶液(S202)。在步骤203的判断中，被判断为样品水溶液的粘性高时，为了促进快速过滤，输入与控制部114就会驱动加热部108来加热样品水溶液(S204)。在步骤201中输入的样品的粘性低时，就省略加热工序而进入步骤205。
接着，从试剂供给部103通过试剂供给部用配管104，将微生物外生物物质分解试剂供给到容器201内的样品水溶液中(S205)。作为微生物外生物物质分解试剂，可以使用例如ATP分解酶、DNA(DeoxyriboNucleic Acid)分解酶或RNA(RiboNucleic Acid)分解酶。
另外，如图3所示，微生物检测装置代替试剂供给部设有容纳各种试剂301的试剂槽302时，还可以设置成为：分注部110通过分注用配管111，将试剂槽302内的微生物外生物物质分解试剂分注到样品水溶液中。具有图1所示的试剂供给部103的装置，适合1日测定许多样品的用途，具备图3所示的试剂槽的装置则适合较少样品的用途。
然后，由抽气部105产生负压，通过二层结构膜过滤器101过滤容器102内的样品水溶液。此时，水溶液中的微生物被第一层亲水性膜过滤器捕捉，生物物质分解试剂、残存生物物质等就流入废液部118而被除去。然后，以洗涤二层结构膜过滤器101为目的，由洗涤液供给部106供给洗涤液(S206)。并且，样品水溶液的粘性高时，以降低粘性为目的，还可以从洗涤液供给部106通过洗涤液供给用配管107加入洗涤液。同样以降低粘性为目的，也可以由加热部108加热洗涤液后加入到样品水溶液中。
接着，在步骤207的判断中，当判断为待测微生物形成了芽孢或者孢子时，过滤后，由试剂供给部103加入营养细胞转换试剂(S208)。作为营养细胞转换试剂使用的是例如丙氨酸或葡萄糖、磷酸的组合，也可以使用液体培养基。另外，如图3所示，微生物检测装置具备各种试剂槽302时，通过分注部110，将试剂槽302内的营养细胞转换试剂分注到样品水溶液中。并且，为了促进营养细胞转换，也可以通过加热部108加热营养细胞转换试剂(S209)。并且，以除去营养细胞转换试剂为目的，还可以进行过滤(S210)。步骤207的判断为No时，省略由步骤208到步骤210的处理而进入步骤211。
然后，从试剂供给部103加入微生物溶解液，将微生物溶解液保持在二层结构膜过滤器101上(S211)。作为微生物溶解液可以使用例如苯扎氯铵、三氯乙酸或Tris缓冲液。如图3所示，微生物检测装置具备各种试剂槽302时，通过分注部110，将试剂槽302内的微生物溶解液分注到样品水溶液中。
接着，通过分注部110的分注用配管111吸引容器102的二层结构膜过滤器101上的微生物溶解液，并驱动杆109，将分注用配管111移动到检测部112的反应容器113上，将微生物溶解液移至反应容器113中(S212)。反应容器113内装有发光试剂115，发光试剂115与微生物溶解液中含有的生物物质(例如ATP、鲁米诺、碱性磷酸酶)反应产生发光。发光试剂115是例如荧光素酶、荧光素。另外，还可以使用过氧化物酶或者碱性磷酸酶的基质。这种情况下，还可以检测动物细胞。
另外，如图4或图5所示的例子，微生物检测装置在容器102的侧面或者下部设有检测部112时，可以通过试剂供给部103，将发光试剂直接供给到容器102的二层结构膜过滤器101上，产生发光。图5所示的微生物检测装置的例子是，使用这样的容器：二层结构膜过滤器101安装在底部的一部分区域而不是整个底部，并且在底部设有透明区域。检测部112与其容器底部的透明区域相对配置，检测由容器内的溶液中的发光反应产生的发光。并且，如图6的装置例子所示，当微生物检测装置具有激发光照射部601时，不需要使用发光试剂，即可由激发光照射部601将激发光照射到生物物质(例如DNA、RNA或者NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，Nicotinamide Adenine Dinucleotide))上而产生荧光。
产生的发光或者荧光由检测部112检测(S213)，根据检测的发光量或者荧光量算出微生物数量(S214)，完成微生物检测。
另外，在图2所示的处理工序中，省略了从步骤207到步骤210的处理，从步骤206进入到步骤211，在步骤213中进行发光测定，就可以检测出样品中含有的营养细胞数量。并且，在步骤206之后，经过步骤208到步骤214的处理就可以检测出非营养细胞数量。像这样，进行省略了步骤208到步骤210的处理而检测营养细胞数量后，返回到步骤208，重复到步骤214的处理，就可以区分检测出样品中含有的营养细胞数量和非营养细胞数量。
实施例2
微生物检测实验1：大肠杆菌
依靠设有根据本发明的二层结构膜过滤器的容器和设有以前的亲水性膜过滤器的容器，比较大肠杆菌的检测灵敏度。
准备带有两种膜过滤器的容器。一个是在底部设有二层结构膜过滤器101的容器102，另一个是在底部只设有亲水性膜过滤器的容器。
根据图7，说明在容器底部安装二层结构膜过滤器的方法的例子。二层结构膜过滤器101包括上层第一层亲水性膜过滤器116、下层第二层疏水性膜过滤器117。亲水性膜过滤器116使用孔径0.45μm、厚度150μm、空隙率79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。另外，亲水性膜过滤器可以是Durapore膜过滤器或者Isopre膜过滤器(日本密理博公司)。疏水性膜过滤器117使用孔径为10μm的Mitex膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。另外，疏水性膜过滤器可以是孔径为30μm的聚丙烯预滤器(日本密理博公司)，并且，还可以是材料为尼龙、聚四氟乙烯、疏水性的聚偏氟乙烯、聚乙烯、聚硅氧烷、聚碳酸酯、聚砜、聚酰胺、玻璃纤维，孔径为0.8μm～80μm的膜过滤器，或者是具有筛孔结构且间距大小为1μm～59μm的过滤器。
如图7(a)所示，重叠加工后的亲水性膜过滤器116和疏水性膜过滤器117，并安装在设于容器102的底部801的安装部，用环状的盖802压住过滤器的边缘部，如图7(b)所示，拧上螺丝803，完成组装。另外，过滤器的固定还可以通过螺丝式的盖子来进行。例如，如图8(a)所示，重叠加工后的亲水性膜过滤器116和疏水性膜过滤器117，并夹在容器102的具有螺丝结构的底部901和具有螺丝结构的环状的盖902之间，如图8(b)所示，通过拧上底部901和盖902来完成组装。另外，在第一层亲水性膜过滤器和第二层疏水性膜过滤器之间可以有空隙。
只设有亲水性膜过滤器的容器，虽然容器的结构相同，但如图10(a)所略示，该容器是代替二层结构膜过滤器安装有单层亲水性膜过滤器1001的容器1002。单层亲水性膜过滤器1001使用孔径0.45μm、厚度150μm、空隙率79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。
图9为表示使用本发明的具备二层结构膜过滤器的容器的检测方法的过程工序的示意图，图10为表示使用具备单层亲水性膜过滤器的容器的检测方法的过程工序的示意图。
作为待测微生物使用大肠杆菌。将大肠杆菌701悬浮于pH7.4的磷酸缓冲液(美国英杰生命技术有限公司)中，使大肠杆菌数达到20～2000个/10ml，制备大肠杆菌悬浮液702。
如图9(a)和图10(a)所示，首先在二层结构膜过滤器101和单层亲水性膜过滤器1001上分别加入10ml的大肠杆菌悬浮液702。然后，加入作为微生物外生物物质去除试剂的露西菲路(ルシフエ一ル)HS试剂盒附属的ATP消去液10μl。接着，如图11(a)所示，将抽气部105的抽气口1101连接在二层结构膜过滤器下面，如图11(b)所示产生负压，过滤大肠杆菌悬浮液和ATP消去液。另外，对单层亲水性膜过滤器也同样过滤大肠杆菌悬浮液和ATP消去液。图9(b)和图10(b)是表示过滤后的状态。过滤后，加入作为微生物溶解液703的露西菲路HS试剂盒附属的ATP提取液200μl，如图9(c)和图10(c)所示，从大肠杆菌701提取ATP分子704。
静置期间，如图10(d)所示，从单层亲水性膜过滤器1001下部渗漏微生物溶解液1003。一方面，如图9(d)所示，在二层结构膜过滤器101中则没有观察到变化。
将残留在二层结构膜过滤器101和单层亲水性膜过滤器1001上的微生物溶解液703，用分注部110分注10μl到设于检测部112上的反应容器113内的露西菲路HS试剂盒附属的发光试剂115中。将发光量换算成ATP数量。另外，对于二层结构膜过滤器101，如图12所示，以ATP数量为纵轴，大肠杆菌数量为横轴，作图。
使用具备二层结构膜过滤器的容器时，ATP数量和大肠杆菌数量显示出定量的线性关系(y＝1.4315x-7.9823)，相对于1个大肠杆菌的ATP分子数量为平均1.4amol，但是使用具备单层亲水性膜过滤器的容器时，如果大肠杆菌不足100个就检测不出ATP分子，相对于100个大肠杆菌的ATP分子数量为平均1amol，二层结构膜过滤器101与单层亲水性膜过滤器1001相比较，显示约100倍的值。
该结果可能是因为在设有单层亲水性膜过滤器的容器中，无法将微生物溶解液保持在单层亲水性膜过滤器上，所以微生物溶解液1003渗漏到单层亲水性膜过滤器下面，同时来源于大肠杆菌的ATP分子1004也落了下去，其结果，来源于大肠杆菌的ATP分子1004没有被洗脱到单层亲水性膜过滤器1001上的微生物溶解液中(图10(d))。
另一方面，在设有二层结构膜过滤器的容器中，可以将微生物溶解液703保持在二层结构膜过滤器101上，所以微生物溶解液703和来源于大肠杆菌的ATP分子704没有渗漏到二层结构膜过滤器101下面。并且，第一层亲水性膜过滤器116内的由大肠杆菌提取的ATP分子704随着时间的推移被洗脱到二层结构膜过滤器101上的微生物溶解液中(图9(d))。
本发明的微生物检测装置能够高灵敏度、高精度、迅速、简便地测量一个大肠杆菌。另外，对大肠菌群或者葡萄球菌等细菌、酿酒酵母等酵母、黑曲霉等真菌也可以获得同样的效果。
实施例3
微生物检测实验2：枯草菌芽孢
根据本发明的具备二层结构膜过滤器的容器和以前的具备亲水性膜过滤器的容器，比较枯草菌芽孢的检测灵敏度。
准备两种带有膜过滤器的容器。一个是具备二层结构膜过滤器101的容器102，另一个是只具备亲水性膜过滤器的容器。容器的结构和在容器上安装二层结构膜过滤器和单层亲水性膜过滤器的结构，如图7和图8所示。
二层结构膜过滤器101包括上层第一层亲水性膜过滤器116、下层第二层疏水性膜过滤器117。亲水性膜过滤器116使用孔径0.45μm、厚度150μm、空隙率79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。另外，亲水性膜过滤器可以是Durapore膜过滤器或者Isopre膜过滤器(日本密理博公司)。疏水性膜过滤器117使用孔径10μm的Mitex膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。另外，疏水性膜过滤器可以是孔径为30μm(日本密理博公司)的聚丙烯预滤器，并且，还可以是材料为尼龙、聚四氟乙烯、疏水性的聚偏氟乙烯、聚乙烯、聚硅氧烷、聚碳酸酯、聚砜、聚酰胺、玻璃纤维，孔径为0.8μm～80μm的膜过滤器，或者是具有筛孔结构且间距大小为1μm～59μm的过滤器。
在只具备亲水性膜过滤器的容器上安装的单层亲水性膜过滤器，使用孔径为0.45μm、厚度为150μm、空隙率为79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。
作为待测微生物使用枯草杆菌芽孢。将枯草杆菌悬浮于10％w/v明胶溶液+磷酸缓冲液(pH7.4)(美国英杰生命技术有限公司)中，调制枯草杆菌数达到2000个/10ml的粘性高的枯草杆菌悬浮液。作为营养细胞转换试剂，使用100mM丙氨酸+100mM葡萄糖+磷酸缓冲液(pH7.4)。作为微生物外生物物质去除试剂，使用露西菲路HS试剂盒附属的ATP消去液。作为微生物溶解液，使用露西菲路HS试剂盒附属的ATP提取液。
测定时使用如图3所示的微生物检测装置。在本实施例中，将触摸屏用于输入与控制部114的输入。另外，输入与控制部114还可以使用膝上型计算机、台式计算机、或者输入用按钮和显示器、输入输出用(USB Universal Serial Bus)存储器的组合等。
首先，枯草杆菌悬浮液由于含有明胶所以粘性高。并且，由于枯草杆菌悬浮液含有形成芽孢的菌，所以使用输入与控制部114，将枯草杆菌悬浮液的粘性高和含有形成芽孢的菌的情况进行输入。接着指示开始微生物检测。装置按照图2所示的处理步骤进行检测处理。
在二层结构膜过滤器和单层亲水性膜过滤器上各加入枯草杆菌悬浮液10ml(S202)。输入与控制部114为，由输入的信息在步骤203的判断中判断枯草杆菌悬浮液粘性高，进而使用加热部108在40℃下加热枯草杆菌悬浮液，使其粘性降低(S204)。
在枯草杆菌悬浮液中加入ATP消去液10μl(S205)，通过抽气部105产生的负压，分别用二层结构膜过滤器101和单层亲水性膜过滤器过滤枯草杆菌悬浮液和ATP消去液(S206)。
过滤后，输入与控制部114为，由输入的信息在步骤207的判断中判断含有芽孢形成菌，为了由芽孢转变到营养细胞，将营养细胞转变试剂1ml分别加入到二层结构膜过滤器101和单层亲水性膜过滤器上(S208)。通过加热部108将营养细胞转换试剂在40℃或者45℃加热约1小时，以促进由芽孢转变为营养细胞(S209)。1小时后，在单层亲水性膜过滤器中，营养细胞转变试剂渗漏到单层亲水性膜过滤器下面，但是在二层结构膜过滤器101中，由于营养细胞转变试剂被保持，所以将其再次进行过滤(S210)。
接着，加入ATP提取试剂200μl，静置10分钟(S211)。静置期间，从单层亲水性膜过滤器下部渗漏ATP提取剂，但是，在二层结构膜过滤器101中，没有观察到变化。将残留在二层结构膜过滤器101和单层亲水性膜过滤器上的ATP提取液10μl，用分注部110分注到设于检测部112上的反应容器113内的发光试剂115中(S212)。检测部112检测产生的发光量(S213)，输入与控制部114根据发光量算出ATP数量(S214)。
ATP数量的检测结果如图13所示。在单层亲水性膜过滤器中，相对于100个枯草杆菌的ATP分子数量约为10amol，但是在二层结构膜过滤器101中，估计约有200amol，显示约20倍的值。该结果可能是因为在单层亲水性膜过滤器中，无法将ATP提取液保持在单层亲水性膜过滤器上，所以ATP提取液渗漏到单层亲水性膜过滤器下面，同时来源于枯草杆菌的ATP分子也落了下去，其结果，在单层亲水性膜过滤器上的来源于枯草杆菌的ATP分子没有被洗脱。另一方面，在二层结构膜过滤器101中，可以将ATP提取液保持在二层结构膜过滤器101上，所以ATP提取液和来源于枯草杆菌的ATP分子都没有渗漏到二层结构膜过滤器101下面。并且，第一层亲水性膜过滤器116内的来源于枯草杆菌的ATP分子，随着时间的推移在二层结构膜过滤器101上洗脱。
另外，用加热部108加热营养细胞转变试剂时(图13，25℃、室温)，相对于枯草杆菌100个的ATP数量约为10amol。
如上所述，本发明的微生物检测装置能够高灵敏度、高精度、迅速、简便地进行测量。
本发明是通过进行各种实验而完成的。以下，对本发明的基础实验进行说明。
实验例1(对能够保持水溶液并能够通过负压过滤水溶液的疏水性膜过滤器的调查)
对能够保持水溶液、且能够通过负压过滤水溶液的疏水性膜过滤器的有无进行调查。
调查的疏水性膜过滤器的孔径、间距大小和材质如表1所示。用于实验的水溶液是超纯水、磷酸缓冲液和微生物溶解液。磷酸缓冲液是50mM磷酸/NaOH缓冲液pH7.4。微生物溶解液是0.2％苯扎氯铵+25mM Tris缓冲液pH 12。
表1
Figure GSA00000032814300141
在各疏水性膜过滤器上滴加各水溶液，调查保持水溶液的能力(表1)。其结果，在所有材质上均能保持水溶液，没有渗漏的情况。
并且，对是否可以通过各疏水性膜过滤器的负压过滤各水溶液进行调查(表1)。其结果，疏水性膜过滤器的孔径为0.8μm～80μm时，常压下对水溶液非浸透，且可以通过负压过滤水溶液。如果孔径在0.6μm以下，则通过负压的过滤就变得困难，孔径为0.45μm时无法过滤。另外，筛孔结构的疏水性膜过滤器为，当间距大小为1μm～59μm时能保持水溶液，并且在负压下能够过滤。
并且，制作在孔径为0.8μm～80μm或者间距大小为1μm～59μm的疏水性膜过滤器上加载孔径为0.05μm～0.65μm的亲水性膜过滤器的二层结构膜过滤器，并在二层结构膜过滤器上加入水溶液进行过滤的结果，在二层结构膜过滤器上也能够过滤水溶液。
实验例2(二层结构膜过滤器的微生物溶解液保持能力的测定实验)
为了比较二层结构膜过滤器和单层亲水性膜过滤器的微生物溶解液保持能力，准备两种在底部具备膜过滤器的容器。
一个是具备二层结构膜过滤器101的容器102(图14A(a))。二层结构膜过滤器101包括上层第一层亲水性膜过滤器116、下层第二层疏水性膜过滤器117。第一层亲水性膜过滤器116使用孔径为0.45μm、厚度为150μm、空隙率为79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。第二层疏水性膜过滤器117使用孔径为10μm的Mitex膜过滤器(日本密理博公司)。
另一个是具备仅由亲水性膜过滤器构成的单层亲水性膜过滤器1001的容器1002(图14B(a))。单层亲水性膜过滤器1001使用孔径为0.45μm、厚度为150μm、空隙率为79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。
在二层结构膜过滤器101和单层亲水性膜过滤器1001上，分别加入200μl作为微生物溶解液703的0.2％苯扎氯铵+25mM Tris缓冲液(pH12)，静置10分钟。静置5分钟、10分钟后，在二层结构膜过滤器101上没有观察到变化(图14A(b)(c))，在单层亲水性膜过滤器1001上，随着静置时间的推移，从单层亲水性膜过滤器1001下面渗漏微生物溶解液1003(图14B(b)(c))。
为了测定从单层亲水性膜过滤器1001渗漏的微生物溶解液1003的量，取渗漏的微生物溶解液1003测定重量。加入微生物溶解液703，4分钟后，渗漏了10mg的微生物溶解液1003。分别在6分钟后、8分钟后进行测定的结果，分别渗漏了15mg、20mg的微生物溶解液1003。合计渗漏了45mg量的微生物溶解液1003。
一方面，在二层结构膜过滤器101下面则没有渗漏微生物溶解液。在二层结构膜过滤器101上加入微生物溶解液703之后马上(图14A(a))、以及静置10分钟(图14A(c))后，分别测定具备二层结构膜过滤器101的容器102和微生物溶解液703的合计重量，并计算重量之差。结果差为1mg，由此可知几乎没有重量的变化。该结果表示微生物溶解液保持在具备二层结构膜过滤器的容器102中。
从该结果可知，在二层结构膜过滤器上可以保持微生物溶解液。
实验例3(膜过滤器内的ATP洗脱实验)
为了比较二层结构膜过滤器和单层亲水性膜过滤器内的ATP分子的洗脱量，准备两种具备膜过滤器的容器。一个是在底部具备二层结构膜过滤器101的容器102(图15(a))。二层结构膜过滤器101包括上层第一层亲水性膜过滤器116、下层第二层疏水性膜过滤器117。第一层亲水性膜过滤器116使用孔径为0.45μm、厚度为150μm、空隙率为79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。第二层疏水性膜过滤器117使用孔径为10μm的Mitex膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。
另一个是在底部具备仅由亲水性膜过滤器构成的单层亲水性膜过滤器1001的容器1002(图16(a))。单层亲水性膜过滤器1001使用孔径为0.45μm、厚度为150μm、空隙率为79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。
作为ATP溶液，使用露西菲路ATP标准试剂(龟甲万公司制)制备浓度为20000amol/10μl的ATP溶液。作为发光试剂115，使用能够产生ATP-荧光素酶-荧光素反应的露西菲路HS试剂盒(龟甲万)附属的发光试剂。
首先，在二层结构膜过滤器101和单层亲水性膜过滤器1001上分别加入10μl ATP溶液，使第一层亲水性膜过滤器116和单层亲水性膜过滤器1001内渗入ATP分子1501(图15(a)、图16(a))。接着，加入200μl作为微生物溶解液703的0.2％苯扎氯铵+25mM Tris缓冲液(pH12)后，静置(图15(b)、图16(b))。
静置期间，随着时间的推移，从单层亲水性膜过滤器1001下面渗漏微生物溶解液1003(图16(c)(d))。一方面，在二层结构膜过滤器101上则没有观察到变化(图15(c)(d))。
为了定量地评价从单层亲水性膜过滤器1001下渗漏的微生物溶解液1003中的ATP分子1601的数量、以及游离在单层亲水性膜过滤器1001上的微生物溶解液703中的ATP分子1501的数量(图16(c)(d))，分别取10μl的残留在单层亲水性膜过滤器1001上的微生物溶解液703和从单层亲水性膜过滤器1001下面渗漏的微生物溶解液1003，加入到反应容器113中的发光试剂115中，用检测部112检测产生的发光反应。
在单层亲水性膜过滤器1001上加入微生物溶解液703，4分钟后、6分钟后、8分钟后，渗漏的微生物溶解液1003的发光量分别显示为约20000CPS(每秒计数，Count per Second)、25000CPS、30000CPS(图17)。渗漏前，单层亲水性膜过滤器1001内存在20000amol的ATP分子，由于在单层亲水性膜过滤器1001上加入200μl的微生物溶解液703，所以在ATP分子1501理想地扩散到微生物溶解液703中的情况下，ATP浓度约为1000amol/10μl。另外，测定ATP浓度为1000amol/10μl的发光量的结果，发光量显示约为10000CPS。从而得知，从单层亲水性膜过滤器1001渗漏的微生物溶解液1003中的ATP分子1601的数量与ATP分子1501理想地扩散到微生物溶解液703中的情况相比，多出2～3倍。
一方面，对残留在单层亲水性膜过滤器1001上的微生物溶解液703中含有的ATP分子1501的数量进行发光测定的结果，即使过了10分钟，发光量最高也仅为5000CPS。与测定渗漏的微生物溶解液1003时相比，为1/4～1/6的发光量(图17)。由该结果可知，单层亲水性膜过滤器1001内的ATP分子1501(图16(a))仅有1/4～1/6左右游离在亲水性膜过滤器1001上(图16(d))。
另一方面，在二层结构膜过滤器101下面没有渗漏微生物溶解液703。在二层结构膜过滤器101上加入微生物溶解液703之后马上(图14A(a))和静置2～20分钟之后，每次取10μl二层结构膜过滤器101上的微生物溶解液703，进行发光测定。对各静置时间，发光量均显示为约9800CPS(图18)。该结果表示，通过将微生物溶解液703保持在具备二层结构膜过滤器101的容器102中，可以将渗入到第一层亲水性膜过滤器116内的ATP分子1501(图15(a))洗脱到二层结构膜过滤器101上(图15(d))。
由该结果可知，通过在二层结构膜过滤器101上保持微生物溶解液703，可以从第一层亲水性膜过滤器116内有效地洗脱ATP分子1501。并且，第一层亲水性膜过滤器的直径越小，且厚度越薄，洗脱效果越好。
实验例4(使用润湿剂时的微生物测定实验)
为了比较二层结构膜过滤器和通过渗入润湿剂才能过滤水溶液的疏水性膜过滤器的微生物检测灵敏度，准备四种具备膜过滤器的容器。
(1)具备二层结构膜过滤器的容器
二层结构膜过滤器包括上层第一层亲水性膜过滤器、下层第二层疏水性膜过滤器。第一层亲水性膜过滤器使用孔径0.45μm、厚度150μm、空隙率79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。第二层疏水性膜过滤器使用孔径10μm的Mitex膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。
(2)具备单层亲水性膜过滤器的容器
单层亲水性膜过滤器使用孔径0.45μm、厚度150μm、空隙率79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。
(3)具备需润湿剂二层结构膜过滤器的容器，所述需润湿剂二层结构膜过滤器由第一层亲水性膜过滤器和第二层疏水性膜过滤器构成，所述疏水性膜过滤器通过渗入润湿剂才能过滤水溶液。
二张重叠的膜过滤器的第一层亲水性膜过滤器使用孔径0.45μm、厚度150μm、空隙率79％的MF-微孔膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。作为第二层疏水性膜过滤器，使用孔径0.45μm的疏水性Durapore膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。
(4)具备需润湿剂单层疏水性膜过滤器的容器，所述需润湿剂单层疏水性膜过滤器由通过渗入润湿剂才能过滤水溶液的疏水性膜过滤器构成。
作为单层疏水性膜过滤器，使用孔径0.45μm的疏水性Durapore膜过滤器(日本密理博公司)，并将直径加工为0.5cm。
作为待测微生物使用大肠杆菌。使大肠杆菌悬浮在磷酸缓冲液(pH7.4)(美国英杰生命技术有限公司)中，并将大肠杆菌数量调制到100个/10ml。作为微生物外生物物质去除试剂，使用露西菲路HS试剂盒(龟甲万)附属的ATP消去液。微生物溶解液使用的是露西菲路HS试剂盒(龟甲万)附属的ATP提取液。
在二层结构膜过滤器、单层亲水性膜过滤器、需润湿剂二层结构膜过滤器、需润湿剂单层疏水性膜过滤器上分别加入大肠杆菌悬浮液10ml。并且作为第一试剂加入ATP消去液10μl。
二层结构膜过滤器和单层亲水性膜过滤器可以过滤大肠杆菌悬浮液。但是需润湿剂二层结构膜过滤器和需润湿剂单层疏水性膜过滤器则不能过滤大肠杆菌悬浮液，所以在各疏水性膜过滤器上渗入润湿剂甲醇，即可进行过滤。
过滤后，作为第二试剂，加入ATP提取液200μl。测定二层结构膜过滤器、单层亲水性膜过滤器、需润湿剂二层结构膜过滤器、需润湿剂单层疏水性膜过滤器上残留的ATP提取液10μl的发光。
在二层结构膜过滤器上，从100个大肠杆菌检测出140amol ATP。一方面，在单层亲水性膜过滤器上检测出10amol，在需润湿剂二层结构膜过滤器和需润湿剂单层疏水性膜过滤器上检测出12amol。在各膜过滤器上检测出的ATP数量与二层结构膜过滤器相比减少到约1/10以下。
该结果可能是因为渗入到疏水性膜过滤器的润湿剂，通过损伤大肠杆菌甚至将其溶解，使来源于大肠杆菌的ATP在过滤时流出而导致。
使用润湿剂用疏水性膜过滤器进行过滤的微生物检测方法，会减少微生物的检测灵敏度和精度。一方面，不使用润湿剂的二层结构膜过滤器提高了微生物的检测灵敏度和精度。

Claims (21)

1.一种微生物检测处理用试样容器，其特征在于，具有：
重叠了上层的亲水性膜过滤器和下层的疏水性膜过滤器的二层结构的膜过滤器，以及
将所述二层结构的膜过滤器的边缘部固定并保持在底部的容器。
2.根据权利要求1所述的微生物检测处理用试样容器，其特征在于，所述亲水性膜过滤器具有捕捉微生物的功能，所述疏水性膜过滤器具有保持试剂的功能。
3.根据权利要求1所述的微生物检测处理用试样容器，其特征在于，所述亲水性膜过滤器的孔径比所述疏水性膜过滤器的孔径小。
4.根据权利要求1所述的微生物检测处理用试样容器，其特征在于，所述疏水性膜过滤器是多孔性且孔径为0.8μm～80μm的膜过滤器，或者是筛孔结构且间距大小为1μm～59μm。
5.根据权利要求1所述的微生物检测处理用试样容器，其特征在于，所述疏水性膜过滤器是厚度为7μm～800μm的膜过滤器。
6.根据权利要求1所述的微生物检测处理用试样容器，其特征在于，所述亲水性膜过滤器是孔径为0.05μm～0.65μm的膜过滤器。
7.根据权利要求1所述的微生物检测处理用试样容器，其特征在于，所述亲水性膜过滤器是厚度为7μm～200μm的膜过滤器。
8.一种微生物检测装置，其特征在于，具有：
底部设有二层结构的膜过滤器的试样容器，所述二层结构的膜过滤器重叠了上层的亲水性膜过滤器和下层的疏水性膜过滤器，
在所述二层结构膜过滤器下面产生负压的抽气部，
将微生物外生物物质去除试剂和微生物溶解液分别添加到所述试样容器中的试剂供给部，
检测试样的发光的检测部，
对装置各部进行控制的控制部；
所述控制部进行如下控制：使所述试剂供给部工作而向所述试样容器中的试样添加微生物外生物物质去除试剂后，使所述抽气部工作而用所述二层结构膜过滤器过滤所述试样容器中的溶液，然后使所述试剂供给部工作而在所述试样容器中添加所述微生物溶解液。
9.根据权利要求8所述的微生物检测装置，其特征在于，所述亲水性膜过滤器的孔径比所述疏水性膜过滤器的孔径小。
10.根据权利要求8所述的微生物检测装置，其特征在于，所述亲水性膜过滤器的孔径为0.05μm～0.65μm，所述疏水性膜过滤器的孔径为0.8μm～80μm。
11.根据权利要求8所述的微生物检测装置，其特征在于，所述试剂供给部在所述试样容器中添加发光试剂，所述检测部检测由添加了所述发光试剂的试样容器中的溶液产生的发光。
12.根据权利要求8所述的微生物检测装置，其特征在于，具有分注部，所述检测部检测由试样溶液和发光试剂的反应产生的发光，所述试样溶液中添加了通过所述分注部分注到反应容器中的所述微生物溶解液。
13.根据权利要求8所述的微生物检测装置，其特征在于，具有激发光照射部，所述检测部检测通过来自所述激发光照射部的激发光照射，由试样产生的荧光。
14.一种微生物检测方法，其特征在于，具有以下工序：
在底部设有二层结构的膜过滤器的试样容器中添加含微生物的试样的工序，所述二层结构的膜过滤器重叠了上层的亲水性膜过滤器和下层的疏水性膜过滤器，
添加微生物外生物物质去除试剂的工序，
在所述二层膜过滤器下面产生负压，过滤所述试样容器内的溶液的工序，
添加溶解所述微生物的试剂，并由所述微生物提取生物物质的工序。
15.根据权利要求14所述的微生物检测方法，其特征在于，还具有：
使所述生物物质和发光试剂反应的工序，
检测在所述反应中产生的发光的工序。
16.根据权利要求14所述的微生物检测方法，其特征在于，还具有：
向所述生物物质照射激发光的工序，
检测通过所述激发光照射而产生的荧光的工序。
17.根据权利要求14所述的微生物检测方法，其特征在于，溶解所述微生物的试剂是不润湿所述疏水性膜过滤器的试剂。
18.根据权利要求14所述的微生物检测方法，其特征在于，所述亲水性膜过滤器的孔径比所述疏水性膜过滤器的孔径小。
19.根据权利要求14所述的微生物检测方法，其特征在于，所述亲水性膜过滤器的孔径为0.05μm～0.65μm，所述疏水性膜过滤器的孔径为0.8μm～80μm。
20.根据权利要求14所述的微生物检测方法，其特征在于，当试样的粘性高时，在添加所述微生物外生物物质去除试剂之前具有加热试样和/或供给洗涤液的工序。
21.根据权利要求14所述的微生物检测方法，其特征在于，当待测微生物形成非营养细胞时，在所述过滤之后具有添加营养细胞变换试剂的工序。
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