JP7359632B2

JP7359632B2 - 細菌叢捕集装置及び細菌叢捕集方法

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Publication number: JP7359632B2
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Inventors: 崇秀横井
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Description

本開示は、細菌叢捕集デバイス、細菌叢捕集装置及び細菌叢捕集方法に関する。

近年、新たなバイオマーカーや治療の標的として、ヒトに常在する細菌群である常在細菌叢が注目されている。従来の細菌叢研究には培養による細菌の増殖が必要であったために、培養不能の細菌は検出困難であり、細菌叢の全体像の把握は不可能であった。一方、近年発達した次世代シーケンサを用いた細菌叢遺伝子解析技術では、培養を行うことなく細菌叢に由来する遺伝子を増幅して網羅的に解析することができるため、細菌叢の全体像やその多様性の比較が可能となった。

しかしながら、非特許文献１にみられるように、細菌叢から遺伝子を取り出すＤＮＡ調製技術は未成熟であり、用いる試薬やキットによって計測結果に違いが発生することや、同一キットであっても操作する技術者による差異が発生することが細菌叢研究の大きな妨げとなっている。相互比較可能な細菌叢データの蓄積は腸内細菌研究の推進に大きく貢献すると想定されており、細菌叢遺伝子解析技術の前処理工程であるＤＮＡ調製技術の自動化が望まれている。

細菌叢からＤＮＡを調製する技術は、直接抽出法と間接抽出法に大別される。直接抽出法は、細菌叢を含む検体に対しビーズ破砕等の物理的な破壊を直接実施した後に、試料溶液中のＤＮＡを抽出し精製する技術である。直接抽出法は操作の簡便性が利点である。しかし、検体に含まれる細菌以外の構成物（ヒト細胞や食物残渣）に由来するＤＮＡが混入することや、物理処理のためＤＮＡが数ｋｂ以下に断片化してしまうことが課題である。

間接抽出法は、一旦検体から菌体を分離した後に、菌体からＤＮＡを抽出する技術である。間接抽出法は分離した細菌叢から穏やかな処理でＤＮＡを抽出するため、他生物が混入しない２０ｋｂを超える長鎖ＤＮＡを回収可能である（非特許文献２）が、直接抽出法に比べて操作に手間がかかることが課題である。

現在の腸内細菌研究は細菌叢構成の比較が主であるが、今後は腸内細菌叢の機能解析へと研究が進展すると想定される。菌種の同定に要求されるＤＮＡ鎖長は数百ｂｐであるため、現在のところ直接抽出法を用いる機関が多いが、機能の解析には遺伝子構造を把握できる長鎖ＤＮＡの調製が可能な間接抽出法が適している。

Costea et al., Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies nature biotechnology, 2017, 1-9 Kim et al., Robustness of Gut Microbiota of Healthy Adults in Response to Probiotic Intervention Revealed by High-Throughput Pyrosequencing, DNA RESEARCH 2013, 20, 241-253

非特許文献２において、検体から細菌叢を捕集するためにフィルタによる残渣除去後に遠心分離を行っているが、この工程は煩雑であり、特に、遠心処理は作業者の負担が大きい。

そこで、本開示は、試料からの細菌叢の捕集を簡便に行う技術を提供する。

上記課題を解決するために、本開示の細菌叢捕集デバイスは、試料中の残渣を捕捉する第１のフィルタを有する第１の溶液槽と、前記試料中の細菌を捕捉する第２のフィルタを有する第２の溶液槽と、を備え、前記第２の溶液槽は、前記第２のフィルタより上部に通気口を有することを特徴とする。

本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。

本開示の細菌叢捕集デバイスによれば、試料からの細菌叢の捕集を簡便に行うことができる。
上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

第１の実施形態に係る細菌叢捕集装置を示す概略図である。第１の実施形態に係る細菌叢捕集装置を用いた細菌叢捕集方法を示すフローチャートである。第２の実施形態に係る細菌叢捕集装置を示す概略図である。第３の実施形態に係る細菌叢捕集デバイスの一部の構成を示す概略図である。実施例１における抽出試験により細菌叢から抽出したＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。細菌叢由来ＤＮＡの定量ＰＣＲの結果を示す図である。

本実施の形態を説明するための全図において同一機能を有するものには同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。また、本開示は以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。本開示の思想ないし趣旨から逸脱しない範囲で、その具体的構成を変更し得ることは当業者であれば容易に理解される。

図面等において示す各構成の位置、大きさ、形状、範囲などは、発明の理解を容易にするため、実際の位置、大きさ、形状、範囲などを表していない場合がある。このため、本開示は、必ずしも、図面等に開示された位置、大きさ、形状、範囲などに限定されない。
本明細書で引用した刊行物は、そのまま本明細書の説明の一部を構成する。
本明細書において単数形で表される構成要素は、特段文脈で明らかに示されない限り、複数形を含むものとする。

本開示において、「長鎖ＤＮＡ」は、一般的なアガロース電気泳動法において分離観察が可能な上限である２０ｋｂ以上のものを指す。

［第１の実施形態］
＜細菌叢捕集装置の構成＞
図１は、第１の実施形態に係る細菌叢捕集装置を示す概略図である。図１に示すように、細菌叢捕集装置は、細菌叢捕集デバイス１、制御装置１００、圧力ポンプ１０７及びチューブ１０８を備える。なお、図１において細菌叢捕集デバイス１はその断面が図示されている。細菌叢捕集デバイス１は、第１の溶液槽１０１、第２の溶液槽１０３、廃液容器１０５、圧力容器１０６及び支持体１０９を備える。

第１の溶液槽１０１は、少なくとも底面の一部が残渣除去フィルタ１０２（第１のフィルタ）から構成され、開口部から試料溶液（検体）が導入される。なお、第１の溶液槽１０１として、上部及び底部に開口部を有するフィルタホルダを用いて、該フィルタホルダの底部に残渣除去フィルタ１０２を設置してもよい。

残渣除去フィルタ１０２は試料中の残渣を捕捉可能であり、残渣除去フィルタ１０２の孔径は、例えば７０μｍ以上とすることができる。残渣除去フィルタ１０２の材質として、疎水性材料及び親水性材料のいずれも使用できる。疎水性材料としては、例えばポリアミド、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリカーボネート又はガラスなどが挙げられる。親水性材料としては、例えばポリエーテルスルホン樹脂、セルロースアセテート、ニトロセルロースなどが挙げられる。

第２の溶液槽１０３は、第１の溶液槽１０１の下方に配置され、残渣除去フィルタ１０２を通過したろ液が導入される。第２の溶液槽１０３の底部には、細菌捕捉フィルタ１０４（第２のフィルタ）が配置されている。細菌捕捉フィルタ１０４は、例えば上述の親水性材料からなるメンブレンフィルタである。細菌捕捉フィルタ１０４の孔径は、細菌（一般的には直径が約１～１０μｍ）を捕捉可能な孔径であり、例えば１μｍ以下とすることができ、場合に応じて０．４５μｍ以下とすることができる。このように、残渣除去フィルタ１０２の孔径よりも、下段に位置する細菌捕捉フィルタ１０４の孔径の方が小さいことにより、試料溶液中の残渣を除去したろ液から細菌を捕捉することができる。

第１の溶液槽１０１の内径と第２の溶液槽１０３の内径は、例えば略同一とすることができる。第２の溶液槽１０３の内径を第１の溶液槽１０１の内径以上とすることで、残渣除去フィルタ１０２によりろ過された試料溶液をより確実に第２の溶液槽１０３に導入することができる。

廃液容器１０５は、第２の溶液槽１０３の下方に配置され、細菌捕捉フィルタ１０４を通過したろ液が導入される。廃液容器１０５は、細菌捕捉フィルタ１０４からのろ液が飛散しないような構造や位置であれば良く、例えば送液チューブ等により第２の溶液槽１０３と接続されていてもよい。

支持体１０９は、第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３との間に間隙１１０が形成されるように、第１の溶液槽１０１を支持する。間隙１１０の大きさは特に限定されないが、外部からのコンタミネーションを防止するという観点からは、間隙１１０は小さいほどよい。このように、第２の溶液槽１０３の上方に間隙１１０を有することにより、第２の溶液槽１０３の開口部が通気口となるので、第１の溶液槽１０１への圧力を印加しても、第２の溶液槽１０３の内部の圧力は大気圧に維持される。このように、第１の溶液槽１０１への圧力の印加と第２の溶液槽１０３への圧力の印加とをそれぞれ独立して行うことができる。

支持体１０９は、例えば支持体アクチュエータ（不図示）により三軸方向に移動可能に構成されていてもよく、これにより第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３との位置関係を変更することができる。なお、第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３との位置関係は、ユーザにより変更してもよい。また、図１において、支持体１０９は、第１の溶液槽１０１を把持することにより支持しているが、これに限定されず、第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３との間に間隙１１０が形成される構造を有していればよい。例えば、第２の溶液槽１０３の上縁部に第１の溶液槽１０１の底面を支持する支柱を設け、該支柱を支持体１０９としてもよい。

圧力容器１０６（圧力印加部）は、図１においては第１の溶液槽１０１の開口部を覆い、密閉するように取り付けられているが、第１の溶液槽１０１及び第２の溶液槽１０３のそれぞれに対して着脱可能である。圧力容器１０６は、第１の溶液槽１０１及び第２の溶液槽１０３の開口部を覆う蓋であってもよい。圧力容器１０６は、チューブ１０８の取り付け口（不図示）を有し、チューブ１０８により圧力ポンプ１０７（圧力印加部）と接続される。圧力ポンプ１０７により生成された圧力は、チューブ１０８を経由して圧力容器１０６に供給される。なお、２つ以上の圧力容器１０６を圧力ポンプ１０７に接続して、第１の溶液槽１０１及び第２の溶液槽１０３のそれぞれに異なる圧力容器１０６を使用してもよい。

このように、圧力容器１０６が取り付けられた溶液槽１０１又は１０３に対し、圧力ポンプ１０７により生成された圧力を印加することができる。これにより、当該溶液槽に設けられたフィルタ（残渣除去フィルタ１０２又は細菌捕捉フィルタ１０４）に圧力が印加されるため、試料溶液をろ過することができる。

図示は省略しているが、細菌叢捕集装置は、試料溶液を収容する検体容器を移動させるための検体容器アクチュエータを有していてもよい。検体容器アクチュエータを駆動することにより、試料溶液を第１の溶液槽１０１に導入することができる。また、細菌叢捕集装置は、圧力容器１０６の移動、並びに第１の溶液槽１０１又は第２の溶液槽１０３に対する着脱を制御する圧力容器アクチュエータを有していてもよい。

さらに、細菌叢捕集装置は、第１の溶液槽１０１及び第２の溶液槽１０３に洗浄液を分注するための第１の分注ノズル、第２の溶液槽１０３に細菌を回収するための回収溶液を分注するための第２の分注ノズル（分注部、回収部）、第１の分注ノズル及び第２の分注ノズルを駆動するための分注ノズルアクチュエータを有していてもよい。洗浄液及び回収溶液として、例えばＰＢＳ溶液やＴＥ溶液などの緩衝液を用いることができる。第２の分注ノズルにより、細菌と回収溶液との混合液をピペッティングして、細菌叢懸濁液を得ることもできる。細菌叢懸濁液の回収は、第２の分注ノズルにより行ってもよいし、他の分注ノズル（回収部）を用いてもよい。

制御装置１００（制御部）は、圧力ポンプ１０７による圧力の生成、各種アクチュエータの駆動、各種分注ノズルの駆動を制御する。また、本実施形態の細菌叢捕集装置は、複数の細菌叢捕集デバイス１を有していてもよく、複数の細菌叢捕集デバイス１の動作を１つの制御装置１００で制御することもできる。

＜細菌叢捕集方法＞
図２は、細菌叢捕集装置を用いた細菌叢捕集方法を示すフローチャートである。以下において、上述の各種分注ノズル及び各種アクチュエータが細菌叢捕集装置に設けられ、制御装置１００が細菌叢捕集装置の各構成要素の駆動を制御することにより細菌叢捕集動作が自動で行われることとする。

ステップＳ１において、制御装置１００は、検体容器アクチュエータを駆動して検体容器を移動させ、第１の溶液槽１０１に試料溶液を導入する。

ステップＳ２において、制御装置１００は、圧力容器アクチュエータを駆動して圧力容器１０６を第１の溶液槽１０１に取り付ける。制御装置１００は、圧力ポンプ１０７を駆動して陽圧を生成させ、第１の溶液槽１０１の残渣除去フィルタ１０２に陽圧（第１の圧力）を印加する。これにより、試料溶液が残渣除去フィルタ１０２によりろ過され、残渣が除去されたろ液が第２の溶液槽１０３に導入される。このとき、捕集対象である細菌はろ液とともに第２の溶液槽１０３に導入される。

上述のように、第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３との間には間隙１１０が存在するため、第１の溶液槽１０１に圧力を印加しても、第２の溶液槽１０３は大気圧条件に維持される。換言すれば、第１の溶液槽１０１及び第２の溶液槽１０３に対しそれぞれ独立して圧力を印加することが可能である。したがって、第１の溶液槽１０１に圧力を印加して試料溶液の残渣を除去している間において、第２の溶液槽１０３に導入された溶液はろ過されずに保持される。

ステップＳ３において、制御装置１００は、第１の分注ノズルアクチュエータを駆動して、第１の分注ノズルにより洗浄液を第１の溶液槽１０１に添加する。このとき、圧力容器１０６を外してから洗浄液を添加してもよいし、第１の分注ノズルが貫通可能な材質で圧力容器１０６が形成されていてもよい。

ステップＳ４において、制御装置１００は、圧力ポンプ１０７を駆動して、第１の溶液槽１０１の残渣除去フィルタ１０２に圧力を印加する。これにより、第１の溶液槽１０１内部や残渣除去フィルタ１０２に付着した細菌を洗浄して第２の溶液槽１０３に捕集することができるため、細菌叢の回収効率が向上する。なお、ステップＳ３及びＳ４は複数回実施されてもよいし、実施されなくてもよく、ステップＳ３及びＳ４の実施回数は任意に設定することができる。

残渣除去工程が終了した段階で第１の溶液槽１０１及び残渣除去フィルタ１０２は不要となる。したがって、ステップＳ５において、制御装置１００は、支持体１０９を駆動して、第２の溶液槽１０３の上方から第１の溶液槽１０１を退避させる。これにより、後に続く工程において第１の溶液槽１０１が物理的な障害になることがない。また、制御装置１００は、圧力容器１０６を第１の溶液槽１０１から取り外す。

ステップＳ６において、制御装置１００は、圧力容器アクチュエータを駆動して圧力容器１０６を第２の溶液槽１０３に取り付ける。制御装置１００は、圧力ポンプ１０７を駆動して、第２の溶液槽１０３の細菌捕捉フィルタ１０４に陽圧（第２の圧力）を印加する。これにより、細菌を含む溶液が細菌捕捉フィルタ１０４によりろ過され、細菌が細菌捕捉フィルタ１０４に捕捉されるとともに、ろ液が廃液容器１０５に導入される。

ステップＳ７において、制御装置１００は、第１の分注ノズルアクチュエータを駆動して、第１の分注ノズルにより洗浄液を第２の溶液槽１０３に添加する。

ステップＳ８において、制御装置１００は、圧力ポンプ１０７を駆動して、第２の溶液槽１０３の細菌捕捉フィルタ１０４に圧力を印加する。これにより、第２の溶液槽１０３内部や細菌捕捉フィルタ１０４に付着した細菌以外の物質を洗浄してろ液として排出することができるため、細菌叢の回収効率が向上する。なお、ステップＳ７及びＳ８は複数回実施されてもよいし、実施されなくてもよく、ステップＳ７及びＳ８の実施回数は任意に設定することができる。

ステップＳ９において、制御装置１００は、第２の分注ノズルアクチュエータを駆動して、第２の分注ノズルにより回収溶液を第２の溶液槽１０３に添加する。

ステップＳ１０において、制御装置１００は、第２の分注ノズルアクチュエータを駆動して、第２の分注ノズルにより、第２の溶液槽１０３内の液体の吸引及び吐出を第２の溶液槽１０３において繰り返す。これにより、第２の溶液槽１０３内に細菌叢懸濁液を得る。次に、制御装置１００は、第２の分注ノズルアクチュエータを駆動して、第２の分注ノズルにより細菌叢懸濁液を回収容器に分注して回収する。

以上、制御装置１００が細菌叢捕集装置の各構成要素を駆動して自動で細菌叢の捕集を行う例について説明したが、これに限定されず、ユーザがマニュアルで上記の動作を実行してもよい。この場合、例えば圧力容器１０６の着脱、圧力ポンプ１０７の操作、第１の溶液槽１０１の移動、第１の分注ノズル及び第２の分注ノズルの操作をユーザにより行うことができる。

＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の細菌叢捕集デバイス１は、遠心分離を行うことなく、試料溶液中の細菌を捕集できるため、ユーザの作業の負担を削減することができる。また、細菌叢捕集デバイス１を用いた細菌叢捕集装置により、細菌叢の捕集のための操作を自動化することで、ユーザの作業の負担をさらに削減することができる。

試料溶液に含まれる細菌の量が多い場合に、細菌捕捉フィルタ１０４上へ細菌叢を捕捉する際に目詰まりが発生し、ろ過速度が大きく低下することがある。このような場合に、第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３が密封連結された構造であると、細菌捕捉フィルタ１０４でのろ過流量の低下が残渣除去フィルタ１０２への印加圧力への抵抗圧力となり、残渣除去フィルタ１０２におけるろ過洗浄の妨げとなってしまう。これに対し、本実施形態の細菌叢捕集デバイス１は、第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３との間に間隙１１０が設けられており、残渣除去フィルタ１０２への圧力の印加と細菌捕捉フィルタ１０４への圧力の印加とをそれぞれ独立して行うことができるため、残渣除去フィルタ１０２におけるろ過速度の低下を抑制することができる。したがって、試料溶液からの残渣の除去が効率化される。

また、間隙１１０は、第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３との位置関係を変更する際にも有利である。第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３との間に間隙１１０がなく密封連結された構造であると、第１の溶液槽１０１に圧力を印加する際に第２の溶液槽１０３にも圧力が生じるため、第１の溶液槽１０１を第２の溶液槽１０３から退避させるために、より大きな力が必要となる。また、第１の溶液槽１０１及び第２の溶液槽１０３に圧力が印加された状態でこれらの溶液槽を分離しようとすると、圧力開放に付随して試料の飛散が発生してしまう。このように、飛散により貴重な試料を損失したり、飛散した試料によって周囲を汚染したりしてしまう。これに対し、本実施形態の細菌叢捕集デバイス１は、間隙１１０の存在により、第２の溶液槽１０３が大気圧条件に保たれているため、第１の溶液槽１０１を退避させた際の圧力開放による試料の飛散が生じることがない。

［第２の実施形態］
上述の第１の実施形態においては、圧力容器１０６を第１の溶液槽１０１に取り付けて圧力を印加した後、圧力容器１０６を第２の溶液槽１０３に取り付けて圧力を印加することで、残渣除去フィルタ１０２により試料溶液から残渣を除去し、細菌捕捉フィルタ１０４によりろ過して細菌叢を捕集する例について説明した。しかし、第２の溶液槽１０３への圧力印加の方式が第１の溶液槽１０１への圧力印加の方式と同じである必要はなく、第１の溶液槽１０１には陽圧を印加し、第２の溶液槽１０３には陰圧を印加することにより、細菌捕捉フィルタ１０４によるろ過を実現することもできる。

そこで、第２の実施形態においては、第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３にそれぞれ異なる圧力印加機構を設ける例について説明する。

＜細菌叢捕集装置の構成＞
図３は、第２の実施形態に係る細菌叢捕集装置を示す概略図である。図３に示すように、第２の実施形態の細菌叢捕集装置は、細菌叢捕集デバイス２が排気口１１２を有する圧力容器１１１（圧力印加部）を備え、該圧力容器１１１の排気口１１２と減圧ポンプ１１３（圧力印加部（陰圧生成部））とがチューブ１１４により接続される点で、第１の実施形態の細菌叢捕集デバイス１と異なっている。

圧力容器１１１は、細菌捕捉フィルタ１０４及び廃液容器１０５が圧力容器１１１の内部空間に位置するように、第２の溶液槽１０３を覆う。排気口１１２と減圧ポンプ１１３とがチューブ１１４により接続され、圧力容器１１１の内部の空間が密閉される。減圧ポンプ１１３により生成された陰圧は、圧力容器１１１に印加される。圧力容器１１１としては、例えば吸引ろ過容器などを用いることができる。

なお、圧力ポンプ１０７（陽圧生成部）と減圧ポンプ１１３（陰圧生成部）とを別々に設ける代わりに、１つの加圧減圧両用型ポンプによりこれらを兼用して、加圧減圧両用型ポンプに圧力容器１０６及び圧力容器１１１を接続することができる。

＜細菌叢捕集方法＞
本実施形態の細菌叢捕集方法は、図２に示した第１の実施形態の細菌叢捕集方法とほぼ同様であるため、以下では相違点のみについて説明する。

ステップＳ６において、圧力容器１０６を第２の溶液槽１０３に付け替えて加圧する代わりに、本実施形態においては、減圧ポンプ１１３を駆動して圧力容器１１１内を減圧する。これにより、細菌捕捉フィルタ１０４に陰圧（第２の圧力）が印加されるため、第２の溶液槽１０３内の溶液を吸引ろ過して細菌叢を捕集することができる。また、本実施形態においては、図２に示したステップＳ５をステップＳ６の後に実施してもよい。

＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の細菌叢捕集装置は、圧力容器１１１及び減圧ポンプ１１３により第２の溶液槽１０３に陰圧を印加して、細菌を含む溶液を吸引ろ過する構成を有する。これにより、圧力容器１０６の付け替えが不要となるため、第１の実施形態と比較してより迅速かつ簡便に細菌叢の捕集の動作を実行することができる。

［第３の実施形態］
上述の第１の実施形態及び第２の実施形態においては、第１の溶液槽１０１の底面（残渣除去フィルタ１０２）と第２の溶液槽１０３の開口部との間に間隙１１０が設けられる例について説明した。しかし、間隙１１０の位置はこれに限定されず、第１の溶液槽１０１と第２の溶液槽１０３との圧力の印加をそれぞれ独立して行うことができれば、適宜変更することができる。

そこで、第３の実施形態においては、間隙１１０の位置を変更させた細菌叢捕集デバイスについて説明する。

＜細菌叢捕集デバイスの構成＞
図４（ａ）は、第３の実施形態に係る細菌叢捕集デバイス３の一部の構成を示す概略図である。図４（ａ）に示すように、細菌叢捕集デバイス３においては、第２の溶液槽１０３の内径が第１の溶液槽１０１の外径よりも大きく形成されている。第１の溶液槽１０１は、残渣除去フィルタ１０２が第２の溶液槽１０３の内部に位置し、外壁が第２の溶液槽１０３の内壁に接触しないように、支持体１０９により支持されている。これにより、間隙１１０は、第１の溶液槽１０１の残渣除去フィルタ１０２の側方と、第２の溶液槽１０３の内壁との間に形成される。

図４（ｂ）は、細菌叢捕集デバイス４の一部の構成を示す概略図である。図４（ｂ）に示すように、間隙１１０は、第２の溶液槽１０３の側壁に設けられた貫通孔の形態であってもよい。貫通孔（通気口）は、細菌捕捉フィルタ１０４より上方に設けられ、これにより第２の溶液槽１０３に圧力が印加されていない際に、第２の溶液槽１０３の内部を大気圧に維持することができる。図４（ｂ）の場合、第１の溶液槽１０１の外径と第２の溶液槽１０３の内径とをほぼ等しくして、第２の溶液槽１０３の開口部に第１の溶液槽１０１の端部を嵌合することができる。

図４（ｂ）の構成を採用することにより、第２の溶液槽１０３へ外部の物質がより侵入しにくくなり、コンタミネーションのリスクを低減することができる。

図４（ａ）の細菌叢捕集デバイス３及び図４（ｂ）の細菌叢捕集デバイス４において、第１の溶液槽１０１及び第２の溶液槽１０３への圧力印加機構としては、第１の実施形態及び第２の実施形態の圧力印加機構のいずれも採用することができる。

＜細菌叢捕集方法＞
本実施形態において、第１の実施形態又は第２の実施形態と同様の細菌叢捕集方法を採用することができるため、説明を省略する。

＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の細菌叢捕集デバイス３及び４は、第１の実施形態及び第２の実施形態と比較して、間隙１１０の空間を小さくすることができる。これにより、外部からの第２の溶液槽１０３への汚染（コンタミネーション）を抑制することができる。

以下、本開示の実施例を説明する。

［実施例１］
＜試料の調製＞
ＬＢ培地を用いた終夜の振盪培養によって大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、腸球菌（Enterococcus faecalis）の４種の純粋培養菌体を得た。

各菌体溶液の濁度を計測してＯ．Ｄ．＝１に調製した。Ｏ．Ｄ．＝１の菌体溶液１ｍＬ中の菌体数が１×１０^８ＣＦＵの値を指標とし、前記４種の菌体溶液を等量ずつ混合して、総菌数１×１０^９ＣＦＵ又は１×１０^１０ＣＦＵの混合菌体液を作製してモデル細菌叢とした。

作製したモデル細菌叢に対し、釣餌である浮子鯉（マルキュー株式会社製）２．５ｇ、カメリヤ（登録商標）強力粉（日清製粉株式会社製）１ｇ、滅菌水２．５ｇの比率で混合して、模擬的な便モデル試料として作製した。便モデル試料を－２０℃にて保管した後に後述する工程に使用した。

＜細菌叢捕集デバイスの準備＞
実施例１において、図３に示した第２の実施形態の細菌叢捕集デバイス２を６つ用意し、それぞれ１つの制御装置１００に接続して細菌叢捕集装置とした。細菌叢捕集装置の各構成要素として、具体的には以下のものを使用した。

第１の溶液槽１０１及び残渣除去フィルタ１０２：ファルコン社製のセルストレーナ（メッシュ径１００μｍ）
第２の溶液槽１０３：細菌捕捉フィルタ１０４を保持するホルダを３Ｄプリンタにより製作し、第２の溶液槽１０３とした。
細菌捕捉フィルタ１０４：メルク社製のミリポアエクスプレスプラス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓＰＬＵＳ）メンブレンフィルタ（孔径０．４５μｍ）
廃液容器１０５：ファルコン社製の５０ｍＬ容量のコニカルチューブ
圧力容器１０６：アルミ製の圧力容器を製作し、圧力容器１０６とした。
圧力容器１１１：吸引ろ過容器
圧力ポンプ１０７及び減圧ポンプ１１３：ＫＮＦ社製のダイアフラム型真空ポンプＮ８６ＫＮ．１８（加圧減圧両用型ポンプ）
チューブ１０８及び１１４：シリコンチューブ

＜試料からの残渣除去＞
便モデル試料からの残渣除去処理を以下の手順で実施した。なお、６つの細菌叢捕集デバイス２（試験Ｎｏ．１～６）について同一試料、同一条件で以下の工程及び試験を行った。
工程１：便モデル試料を２ｍＬのＰＢＳ溶液に溶解し、懸濁することにより試料溶液を得た。
工程２：第２の溶液槽にメンブレンフィルタ（細菌捕捉フィルタ）を設置し、第２の溶液槽の下部に廃液容器を接続した。また、第２の溶液槽の上方にセルストレーナ（第１の溶液槽及び残渣除去フィルタ）を配置した。第２の溶液槽とセルストレーナとの間の間隙の大きさは、約１ｍｍとした。その後、セルストレーナに試料溶液を添加した。
工程３：加圧減圧両用型ポンプを加圧条件に設定し、セルストレーナへ１分間加圧して試料溶液をろ過し、ろ液を第２の溶液槽に導入した。
工程４：セルストレーナに１ｍＬのＰＢＳ溶液を添加した。
工程５：工程３と同様に、セルストレーナへ１分間加圧してろ過し、ろ液を第２の溶液槽に導入した。
工程６：セルストレーナを第２の溶液槽の上部から除去した。

＜菌体の捕捉＞
菌体捕捉とメンブレンフィルタの洗浄を以下の手順で実施した。
工程７：第２の溶液槽及び廃液容器を吸引ろ過容器に設置し、吸引ろ過容器の排気口と加圧減圧両用型ポンプとをシリコンチューブにより接続した。次に、加圧減圧両用型ポンプにより吸引して吸引ろ過容器内の真空度を高める（減圧する）ことによってメンブレンフィルタ（細菌捕捉フィルタ）に陰圧を印加し、ろ液を分離した。
工程８：第２の溶液槽に３ｍＬのＰＢＳ溶液を添加した。
工程９：第２の溶液槽に３ｍＬのＰＢＳ溶液を添加した。
工程１０：第２の溶液槽に２ｍＬのＴＥ溶液を添加した。
工程１１：第２の溶液槽に２ｍＬのＴＥ溶液を添加した。
工程１２：第２の溶液槽に２ｍＬのＴＥ溶液を添加した。
工程１３：ろ液分離後に減圧を停止した。
なお、工程８～１２は加圧減圧両用型ポンプによる減圧を維持したまま実施した。

ここで、圧力印加時間は、用いる試料に存在する細菌及び懸濁物によって異なることが観察されている。純水に近い清浄な試料であれば、例えば３ｍＬの溶液が数１０秒でろ過されるが、糞便等の懸濁物を多く含む試料では、３ｍＬの溶液をろ過するのに２時間程度が要求される場合がある。したがって、ろ過処理を実施する時間（減圧時間）は添加する試料の状態や量によって適宜調整可能である。また、メンブレンフィルタ及び第２の溶液槽の洗浄を目的とすることから、第２の溶液槽に添加した溶液が十分に通過した際に次の工程の洗浄液を添加する。具体的には、１回の洗浄につき、メンブレンフィルタ上に残存する溶液量が２００μＬ未満となるまで洗浄を実施する。洗浄の回数や、メンブレンフィルタ上の溶液の残量についても、ユーザが任意に設定することができる。

＜菌体懸濁溶液の回収＞
菌体の回収を以下の手順で実施した。
工程１４：第２の溶液槽に８００μＬのＴＥ溶液を添加した。
工程１５：６００μＬ容量の設定にてマイクロピペットを使用し、第２の溶液槽内で１０回のピペッティングを行った。これにより、菌体懸濁溶液を得た。
工程１６：菌体懸濁溶液を回収容器に回収した。

＜ＤＮＡの抽出試験＞
得られた菌体懸濁溶液から、非特許文献２に記載の方法（酵素を用いた抽出）に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、０．８％アガロースゲルによる電気泳動を行った。

図５は、細菌叢から抽出したＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。レーンＭは塩基長の指標となるサイズマーカである。レーン１～６はそれぞれ試験Ｎｏ．１～６に対応する。

図５に示すように、各試験において、３０ｋｂｐを超える長鎖ＤＮＡを抽出できたことがわかる。

＜菌体懸濁液中の菌種の比率の測定＞
上記抽出試験により抽出した細菌叢由来ＤＮＡについて、サーモフィッシャー社製ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）を用いて定量ＰＣＲを行い、ＤＮＡ溶液を構成する菌種の比率を産出した。

また、参考例として、実施例１で作製した便モデル試料について、細菌叢捕集デバイスを用いる代わりに、非特許文献２に記載の方法に従って残渣の除去から細菌叢の回収までを実施した。その後、サーモフィッシャー社製ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）を用いて定量ＰＣＲを行った。

図６は、細菌叢由来ＤＮＡの定量ＰＣＲの結果を示す図である。図６（ａ）は本実施例１の細菌叢捕集デバイスを用いて細菌叢を回収し、ＤＮＡを抽出して定量ＰＣＲを行った結果である。図６（ｂ）は非特許文献２に記載の方法で細菌叢を回収し、ＤＮＡを抽出して定量ＰＣＲを行った結果である。図６（ａ）及び（ｂ）において、６つの試験（試験Ｎｏ．１～６）の結果が１つのグラフに示されている。

図６（ａ）に示すように、実施例１によれば、菌種のバイアス無く細菌叢を回収できたことが確認された。また、図６（ａ）及び（ｂ）を比較すると、定量ＰＣＲの結果が実施例１と参考例とで高い類似性を示したことがわかる。したがって、本実施例の細菌叢捕集デバイスを用いることにより、フィルタによる残渣の除去及び遠心分離により細菌叢を捕集する従来の方法と同程度に、細菌叢を回収できたといえる。

［変形例］
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。

１～３…細菌叢捕集デバイス
１００…制御装置
１０１…第１の溶液槽
１０２…残渣除去フィルタ
１０３…第２の溶液槽
１０４…細菌捕捉フィルタ
１０５…廃液容器
１０６…圧力容器
１０７…圧力ポンプ
１０８…チューブ
１０９…支持体
１１０…間隙
１１１…圧力容器
１１２…排気口
１１３…減圧ポンプ
１１４…チューブ

Claims

試料中の残渣を捕捉する第１のフィルタを有する第１の溶液槽と、前記試料中の細菌を捕捉する第２のフィルタを有し、前記第２のフィルタより上部に通気口を有する第２の溶液槽と、を備える細菌叢捕集デバイスと、
前記第１の溶液槽に第１の圧力を印加し、前記第２の溶液槽に第２の圧力を印加する圧力印加部と、
前記圧力印加部の駆動を制御する制御部と、を備え、
前記制御部は、
前記圧力印加部により前記第１の溶液槽及び前記第２の溶液槽のそれぞれに独立して前記第１の圧力及び前記第２の圧力を印加する細菌叢捕集装置。
前記制御部は、
前記圧力印加部により前記第１の溶液槽に前記第１の圧力を印加して、これにより前記第１のフィルタに前記試料中の前記残渣を捕捉し、前記細菌を含むろ液を前記第２の溶液槽に導入し、
前記圧力印加部により前記第２の溶液槽に前記第２の圧力を印加して、これにより前記第２のフィルタに前記ろ液中の前記細菌を捕捉する請求項１記載の細菌叢捕集装置。
前記第１の圧力及び前記第２の圧力が陽圧である請求項１に記載の細菌叢捕集装置。
前記圧力印加部は、
陽圧を生成する陽圧生成部と、
陰圧を生成する陰圧生成部と、を有し、
前記第１の圧力が前記陽圧生成部により生成される前記陽圧であり、前記第２の圧力が前記陰圧生成部により生成される前記陰圧である請求項１に記載の細菌叢捕集装置。
前記第２の溶液槽に回収溶液を分注する分注部と、
前記第２の溶液槽内の溶液を回収する回収部と、をさらに備え、
前記制御部は、
前記第２のフィルタに前記細菌を含むろ液中の前記細菌を捕捉した後、前記分注部により前記第２の溶液槽に前記回収溶液を添加して懸濁させ、細菌叢懸濁溶液を取得し、
前記回収部により前記細菌叢懸濁溶液を回収する請求項１に記載の細菌叢捕集装置。
細菌叢捕集デバイスを用いた細菌叢捕集方法であって、
前記細菌叢捕集デバイスは、
試料中の残渣を捕捉する第１のフィルタを有する第１の溶液槽と、
前記試料中の細菌を捕捉する第２のフィルタを有する第２の溶液槽と、を備え、
前記第２の溶液槽は、前記第２のフィルタより上部に通気口を有し、
前記細菌叢捕集方法は、
前記第１の溶液槽に前記試料を導入することと、
前記第１の溶液槽にのみ第１の圧力を印加して、前記第１のフィルタに前記試料中の前記残渣を捕捉し、前記細菌を含むろ液を前記第２の溶液槽に導入することと、
前記第２の溶液槽にのみ第２の圧力を印加して、前記第２のフィルタに前記ろ液中の前記細菌を捕捉することと、を含む細菌叢捕集方法。
前記第１のフィルタの孔径が７０μｍ以上であり、前記第２のフィルタの孔径が１μｍ以下である請求項６に記載の細菌叢捕集方法。
前記第１の圧力及び前記第２の圧力が陽圧である請求項６に記載の細菌叢捕集方法。
前記第１の圧力が陽圧であり、前記第２の圧力が陰圧である請求項６に記載の細菌叢捕集方法。
前記第２の溶液槽に回収溶液を添加して懸濁させ、細菌叢懸濁溶液を取得することをさらに含む請求項６に記載の細菌叢捕集方法。
前記第１のフィルタの孔径が７０μｍ以上であり、前記第２のフィルタの孔径が１μｍ以下である請求項１に記載の細菌叢捕集装置。
前記第２の溶液槽の上方において前記第１の溶液槽を支持する支持体をさらに備え、
前記支持体は、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間に間隙を形成し、前記第２の溶液槽の開口部が前記通気口となるように前記第１の溶液槽を支持する請求項１に記載の細菌叢捕集装置。
前記第２の溶液槽は、側壁に前記通気口を有する請求項１に記載の細菌叢捕集装置。