FR3101884A1 - Dispositif de piégeage de microbiote, appareil de piégeage de microbiote, et procédé de piégeage de microbiote - Google Patents

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Abstract

Dispositif de piégeage de microbiote, appareil de piégeage de microbiote, et procédé de piégeage de microbiote Dispositif de piégeage de microbiote comprenant :- un premier réservoir de solution comportant un premier filtre conçu pour piéger un résidu dans un échantillon ; et- un deuxième réservoir de solution comportant un deuxième filtre conçu pour piéger des bactéries dans l’échantillon, le deuxième réservoir de solution possédant un évent au-dessus du deuxième filtre. Figure pour l’abrégé : Fig. 1

Description

Dispositif de piégeage de microbiote, appareil de piégeage de microbiote, et procédé de piégeage de microbiote
La présente invention concerne un dispositif de piégeage de microbiote, un appareil de piégeage de microbiote, et un procédé de piégeage de microbiote.
Ces dernières années, le microbiote indigène, qui est un groupe bactérien résidant dans le corps humain, a attiré l’attention en tant que biomarqueur nouveau ou en tant que cible en thérapie. La recherche conventionnelle sur le microbiote implique inévitablement la croissance de bactéries par culture. Ainsi, il a été difficile de détecter des bactéries non cultivables et ainsi impossible d’analyser complètement le microbiote. Entre-temps, avec une technique d’analyse de gènes du microbiote à l’aide du séquenceur de nouvelle génération développé ces dernières années, il est devenu possible d’analyser complètement des gènes issus de microbiote par amplification sans culture. Ainsi, il est devenu possible d’identifier complètement le microbiote et de faire une comparaison parmi une diversité d’espèces bactériennes dans le microbiote.
Cependant, tel que divulgué dans la Littérature Non-Brevet 1 (Costea et al., Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies nature biotechnology, 2017, 1-9), une technique d’extraction d’ADN de microbiote est encore immature. Par exemple, des variations dans les résultats de mesure dues aux différents réactifs et/ou kits utilisés, et des variations dans des opérations dues aux différents ingénieurs impliqués dans l’opération, même avec le même kit, sont des obstacles majeurs au développement de la recherche sur le microbiote. Il est supposé que l’accumulation d’éléments de données sur le microbiote qui peuvent être mutuellement comparés les uns avec les autres contribuera grandement à la promotion de la recherche sur le microbiote intestinal, et il est souhaité d’automatiser une technique d’extraction d’ADN qui est une étape de prétraitement d’une technique d’analyse génétique du microbiote.
Une technique d’extraction d’ADN de microbiote est globalement divisée en un procédé d’extraction directe et un procédé d’extraction indirecte. Le procédé d’extraction directe est une technique de perturbation physique et directe d’un échantillon contenant un microbiote à l’aide d’une agitation avec des billes, par exemple, et ensuite d’extraction d’ADN de la solution d’échantillon et de purification de celui-ci. Le procédé d’extraction directe est avantageux pour sa facilité d’opération. Cependant, le procédé est problématique en ce que l’ADN issu de composants (par ex., des cellules humaines ou des résidus d’aliments) autres que les bactéries contenues dans l’échantillon serait mélangé ou l’ADN souhaité serait fragmenté en une taille de plusieurs kb ou moins en raison du processus physique réalisé.
Le procédé d’extraction indirecte est une technique consistant à séparer d’abord des cellules bactériennes d’un échantillon et à extraire ensuite l’ADN des cellules bactériennes séparées. Puisque l’ADN est extrait du microbiote séparé par l’intermédiaire d’un procédé doux dans le procédé d’extraction indirecte, il peut récupérer de grands fragments d’ADN présentant une grosseur supérieure à 20 kb et ne possédant pas d’autres organismes mélangés avec ceux-ci (Littérature Non-Brevet 2 : Kim et al., Robustness of Gut Microbiota of Healthy Adults in Response to Probiotic Intervention Revealed by High-Throughput Pyrosequencing, DNA RESEARCH 2013, 20, 241-253). Cependant le procédé d’extraction indirecte est problématique en ce qu’il implique une opération contraignante par comparaison avec le procédé d’extraction directe.
La recherche dominante actuelle sur le microbiote intestinal est conduite par comparaison des composants du microbiote intestinal. Dans le futur, il est supposé que la recherche fera davantage de progrès dans l’analyse de la fonction du microbiote intestinal. La longueur de fragment d’ADN qui est requise pour l’identification d’une espèce bactérienne est de plusieurs centaines de pb. Par conséquent, bien que de nombreuses institutions utilisent actuellement le procédé d’extraction directe, le procédé d’extraction indirecte est plus approprié pour l’analyse de la fonction du microbiote puisqu’il peut préparer des grands fragments d’ADN avec lesquels l’analyse d’une structure génétique est possible.
Dans la Littérature Non-Brevet 2, une centrifugation est réalisée pour piéger le microbiote d’un échantillon après qu’un résidu a été éliminé de l’échantillon à travers un filtre. Cependant, une telle étape est complexe, et en particulier, la réalisation d’un processus de centrifugation est contraignante pour l’opérateur.
En conséquence, la présente divulgation fournit une technique pour piéger facilement le microbiote à partir d’un échantillon.
Au vu de ce qui précède, un dispositif de piégeage de microbiote de la présente divulgation comporte un premier réservoir de solution possédant un premier filtre conçu pour piéger un résidu dans un échantillon, et un deuxième réservoir de solution possédant un deuxième filtre conçu pour piéger des bactéries dans l’échantillon, et le deuxième réservoir de solution possède un évent au-dessus du deuxième filtre.
D’autres caractéristiques de la présente divulgation deviendront évidentes par la description de cette spécification et des dessins annexés. De plus, des modes de réalisation de la présente divulgation peuvent être implémentés par éléments, par une combinaison d’une variété d’éléments, par la description détaillée suivante, et par les revendications jointes.
La description de cette spécification ne contient que des exemples illustratifs typiques. Par conséquent, des revendications ou des exemples de la demande de la présente divulgation ne devraient en aucun sens être limités.
Selon le dispositif de piégeage de microbiote de la présente divulgation, le microbiote peut être facilement piégé à partir d’un échantillon.
Des problèmes, des configurations, et des effets avantageux autres que ceux décrits ci-dessus deviendront évidents par la description suivante de modes de réalisation.
Dans un de ses aspects, l’invention est liée à au moins l’un des objets suivants.
Objet 1 : un dispositif de piégeage de microbiote comprenant :
- un premier réservoir de solution comportant un premier filtre conçu pour piéger un résidu dans un échantillon ; et
- un deuxième réservoir de solution comportant un deuxième filtre conçu pour piéger des bactéries dans l’échantillon,
le deuxième réservoir de solution possédant un évent au-dessus du deuxième filtre.
Objet 2 : le dispositif de piégeage de microbiote selon l’objet 1, une grosseur de pores du premier filtre étant supérieure ou égale à 70 µm, et une grosseur de pores du deuxième filtre étant inférieure ou égale à 1 µm.
Objet 3 : le dispositif de piégeage de microbiote selon l’objet 1, comprenant en outre un support qui soutient le premier réservoir de solution au-dessus du deuxième réservoir de solution, le support étant conçu pour soutenir le premier réservoir de solution de sorte qu’un espacement est formé entre le premier réservoir de solution est le deuxième réservoir de solution et qu’une ouverture du deuxième réservoir de solution sert d’évent.
Objet 4 : le dispositif de piégeage de microbiote selon l’objet 1, le deuxième réservoir de solution possédant l’évent à travers une paroi latérale du deuxième réservoir de solution.
Objet 5 : un appareil de piégeage de microbiote comprenant :
- le dispositif de piégeage de microbiote selon l’objet 1 ;
- un applicateur de pression configuré pour appliquer une première pression au premier réservoir de solution et appliquer une deuxième pression au deuxième réservoir de solution ; et
- un dispositif de commande configuré pour commander le pilotage de l’applicateur de pression.
Objet 6 : l’appareil de piégeage de microbiote selon l’objet 5, le dispositif de commande étant configuré pour :
- faire en sorte que l’applicateur de pression applique la première pression au premier réservoir de solution, de sorte qu’ainsi le premier filtre piège le résidu dans l’échantillon, et un filtrat contenant les bactéries est introduit dans le deuxième réservoir de solution, et
- faire en sorte que l’applicateur de pression applique la deuxième pression au deuxième réservoir de solution, de sorte qu’ainsi le deuxième filtre piège les bactéries dans le filtrat.
Objet 7 : l’appareil de piégeage de microbiote selon l’objet 5, chacune parmi la première pression et la deuxième pression étant une pression positive.
Objet 8 : l’appareil de piégeage de microbiote selon l’objet 5, l’applicateur de pression comportant :
- un générateur de pression positive configuré pour générer une pression positive, et
- un générateur de pression négative configuré pour générer une pression négative,
la première pression étant la pression positive générée par le générateur de pression positive, et la deuxième pression étant la pression négative générée par le générateur de pression négative.
Objet 9 : l’appareil de piégeage de microbiote selon l’objet 6, comprenant en outre :
- un distributeur conçu pour distribuer une solution de récupération dans le deuxième réservoir de solution ; et
- un récupérateur conçu pour récupérer une solution dans le deuxième réservoir de solution,
le dispositif de commande étant configuré pour :
- faire en sorte que le deuxième filtre piège les bactéries dans le filtrat et qu’ensuite le distributeur ajoute la solution de récupération dans le deuxième réservoir de solution pour mettre en suspension les bactéries dans la solution de récupération, obtenant ainsi une suspension de microbiote, et
- faire en sorte que le récupérateur récupère la suspension de microbiote.
Objet 10 : un procédé de piégeage de microbiote utilisant un dispositif de piégeage de microbiote, le dispositif comportant un premier réservoir de solution possédant un premier filtre conçu pour piéger un résidu dans un échantillon, et un deuxième réservoir de solution possédant un deuxième filtre conçu pour piéger des bactéries dans l’échantillon, le deuxième réservoir de solution possédant également un évent au-dessus du deuxième filtre, le procédé comprenant :
- l’introduction de l’échantillon dans le premier réservoir de solution ;
- l’application d’une première pression au premier réservoir de solution, de sorte qu’ainsi le premier filtre piège le résidu dans l’échantillon et un filtrat contenant les bactéries est introduit dans le deuxième réservoir de solution ; et
- l’application d’une deuxième pression au deuxième réservoir de solution, de sorte qu’ainsi le deuxième filtre piège les bactéries dans le filtrat.
Objet 11 : le procédé de piégeage de microbiote selon l’objet 10, une grosseur de pores du premier filtre étant supérieure ou égale à 70 µm, et une grosseur de pores du deuxième filtre étant inférieure ou égale à 1 µm.
Objet 12 : le procédé de piégeage de microbiote selon l’objet 10, chacune parmi la première pression et la deuxième pression étant une pression positive.
Objet 13 : le procédé de piégeage de microbiote selon l’objet 10, la première pression étant une pression positive et la deuxième pression étant une pression négative.
Objet 14 : le procédé de piégeage de microbiote selon l’objet 10, comprenant en outre l’ajout d’une solution de récupération dans le deuxième réservoir de solution pour mettre en suspension les bactéries dans la solution de récupération, obtenant ainsi une suspension de microbiote.
La représente une vue schématique d'un appareil de piégeage de microbiote selon un premier mode de réalisation,
la représente un diagramme de flux illustrant un procédé de piégeage de microbiote qui utilise l’appareil de piégeage de microbiote selon le premier mode de réalisation,
la représente une vue schématique d’un appareil de piégeage de microbiote selon un deuxième mode de réalisation,
la représente une vue schématique d’une partie de la configuration d’un dispositif de piégeage de microbiote selon un troisième mode de réalisation,
la représente une vue schématique d’une partie de la configuration d’un dispositif de piégeage de microbiote selon un troisième mode de réalisation,
la représente une vue illustrant les résultats d’électrophorèse d’ADN qui a été extrait d’un microbiote dans un test d’extraction d’exemple 1,
la représente un graphique illustrant les résultats de PCR quantitatives réalisées sur de l’ADN issu du microbiote, et,
la représente un graphique illustrant les résultats de PCR quantitatives réalisées sur de l’ADN issu du microbiote.
Description détaillée
Dans tous les dessins pour l’illustration des modes de réalisation suivants, des éléments possédant la même fonction sont désignés par le même numéro de référence. Ainsi, la description répétée de ceux-ci sera omise autant que possible. De plus, la présente divulgation ne devrait pas être interprétée comme étant limitée à la description des modes de réalisation suivants. L’homme du métier comprendra facilement que la configuration spécifique de la présente divulgation peut être changée sans s’écarter de l’esprit et de la portée de celle-ci.
Il peut y avoir des cas où la position, la grosseur, la forme, l’amplitude, et autres, de chaque structure illustrée dans les dessins ne représentent pas la position, la grosseur, la forme, l’amplitude, et autres, réelles de la structure afin d’aider à comprendre facilement l’invention. Par conséquent la présente divulgation n’est pas nécessairement limitée à la position, la grosseur, la forme, l’amplitude, et autres, de chaque structure divulguée dans les dessins.
De plus, les publications citées dans cette spécification constituent partiellement la description de cette spécification.
Chaque élément constituant représenté sous une forme au singulier dans cette spécification inclut une forme au pluriel sauf mention explicite du contraire dans le contexte.
Dans la présente divulgation, « grand fragment d’ADN » fait référence à un ADN doté d’une grosseur supérieure ou égale à 20 kb qui est la limite supérieure permettant une observation par séparation par électrophorèse habituelle sur gel d’agarose.
[Premier mode de réalisation]
<Configuration de l’appareil de piégeage de microbiote>
La est une vue schématique d’un appareil de piégeage de microbiote selon un premier mode de réalisation. Comme illustré dans la , l’appareil de piégeage de microbiote comporte un dispositif 1 de piégeage de microbiote, un dispositif de commande 100, une pompe de pression 107, et un tube 108. La illustre une section transversale du dispositif 1 de piégeage de microbiote. Le dispositif 1 de piégeage de microbiote comporte un premier réservoir de solution 101, un deuxième réservoir de solution 103, un récipient pour déchets liquides 105, un récipient sous pression 106, et un support 109.
Au moins une partie de la face inférieure du premier réservoir de solution 101 est formée d’un filtre d’élimination de résidu 102 (c’est-à-dire, un premier filtre), et une solution d’échantillon (c’est-à-dire, un échantillon) est introduite dans le premier réservoir de solution 101 par l’intermédiaire d’une ouverture de celui-ci. Il est également possible d’utiliser un support de filtre possédant des ouvertures au niveau de sa partie supérieure et de sa partie inférieure en tant que premier réservoir de solution 101 et de disposer le filtre d’élimination de résidu 102 au niveau de la partie inférieure du support de filtre.
Le filtre d’élimination de résidu 102 peut piéger un résidu dans un échantillon. La grosseur de pores du filtre d’élimination de résidu 102 peut être fixée à une valeur supérieure ou égale à 70 µm, par exemple. Comme matériau du filtre d’élimination de résidu 102, soit un matériau hydrophobe, soit un matériau hydrophile peut être utilisé. Des exemples du matériau hydrophobe comprennent un polyamide, une résine fluorée telle qu’un polytétrafluoroéthylène, une polyoléfine telle qu’un polypropylène, un polycarbonate, et un verre. Des exemples du matériau hydrophile comprennent une résine de polyéther sulfone, un acétate de cellulose, et une nitrocellulose.
Le deuxième réservoir de solution 103 est disposé en dessous du premier réservoir de solution 101 et reçoit un filtrat qui est passé à travers le filtre d’élimination de résidu 102. Le deuxième réservoir de solution 103 possède un filtre de piégeage de bactéries 104 (c’est-à-dire, un deuxième filtre) disposé au niveau de sa partie inférieure. Le filtre de piégeage de bactéries 104 est un filtre à membrane formé du matériau hydrophile mentionné précédemment, par exemple. Le filtre de piégeage de bactéries 104 présente une grosseur de pores capable de piéger des bactéries (typiquement, d’un diamètre d’environ 1à 10 µm), qui peut ainsi être fixée à une valeur inférieure ou égale à 1 µm, par exemple, ou inférieure ou égale à 0,45 µm selon les circonstances. De cette manière, puisque la grosseur de pores du filtre de piégeage de bactéries 104 situé en dessous est plus petite que celle du filtre d’élimination de résidu 102, des bactéries peuvent être piégées à partir du filtrat qui a été obtenu par élimination de résidu de la solution d’échantillon.
Le diamètre intérieur du premier réservoir de solution 101 et celui du deuxième réservoir de solution 103 peuvent être fixés de manière approximativement égale, par exemple. En variante, le fait de fixer le diamètre intérieur du deuxième réservoir de solution 103 à une valeur supérieure ou égale à celle du premier réservoir de solution 101 permettra à une solution d’échantillon filtrée à travers le filtre d’élimination de résidu 102 d’être introduit dans le deuxième réservoir de solution 103 de manière plus fiable.
Le récipient pour déchets liquides 105 est disposé en dessous du deuxième réservoir de solution 103 et reçoit un filtrat qui est passé à travers le filtre de piégeage de bactéries 104. Le récipient pour déchets liquides 105 peut posséder une quelconque structure et être disposé au niveau d’une quelconque position qui peut empêcher une diffusion du filtrat à partir du filtre de piégeage de bactéries 104, et peut également être couplé au deuxième réservoir de solution 103 via un tube d’alimentation de liquide, par exemple.
Le support 109 soutient le premier réservoir de solution 101 de telle sorte qu’un espacement 110 est formé entre le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103. La taille de l’espacement 110 n’est pas limitée à une valeur particulière, mais est préférablement aussi petite que possible du point de vue de l’empêchement d’une contamination provenant de l’extérieur. De cette manière, le placement de l’espacement 110 au-dessus du deuxième réservoir de solution 103 permet à l’ouverture du deuxième réservoir de solution 103 de servir d’évent. Ainsi, même lorsque le premier réservoir de solution 101 est pressurisé, une pression à l’intérieur du deuxième réservoir de solution 103 peut être maintenue à une pression atmosphérique. De cette manière, une pressurisation du premier réservoir de solution 101 et une pressurisation du deuxième réservoir de solution 103 peuvent être réalisées indépendamment.
Le support 109 peut être configuré pour être mobile dans trois directions axiales au moyen d’un actionneur de support (non illustré), par exemple. En conséquence, la relation de position entre le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103 peut être modifiée. En variante, la relation de position entre le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103 peut être modifiée par un utilisateur. Bien que la illustre un exemple dans lequel le support 109 soutient le premier réservoir de solution 101 en le saisissant, la présente divulgation n’est pas limitée à ceci et une quelconque structure peut être placée qui permet à l’espacement 110 d’être formé entre le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103. Par exemple, des barres pour le soutien de la face inférieure du premier réservoir de solution 101 peuvent être placées au niveau du bord supérieur du deuxième réservoir de solution 103, et de telles barres peuvent être utilisées en tant que support 109.
Bien que le récipient sous pression 106 (c’est-à-dire, un applicateur de pression) dans la soit fixé au premier réservoir de solution 101 de sorte à le sceller hermétiquement en recouvrant son ouverture, le récipient sous pression 106 peut être fixé à, et être détachable de chacun parmi le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103. Le récipient sous pression 106 peut être un couvercle qui recouvre l’ouverture du premier réservoir de solution 101 ou du deuxième réservoir de solution 103. Le récipient sous pression 106 possède un orifice (non illustré) pour la fixation au tube 108, et est couplé à la pompe de pression 107 (c’est-à-dire, un applicateur de pression) via le tube 108. Une pression générée par la pompe de pression 107 est alimentée au récipient sous pression 106 via le tube 108. Il est également possible de coupler deux récipients sous pression 106 ou plus à la pompe de pression 107, et d’utiliser les récipients sous pression 106 respectifs pour le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103.
De cette manière, une pression générée par la pompe de pression 107 peut être appliquée au réservoir de solution 101 ou 103 possédant le récipient sous pression 106 fixé à celui-ci. Ceci permet à la pression d’agir sur le filtre (c’est-à-dire, le filtre d’élimination de résidu 102 ou le filtre de piégeage de bactéries 104) placé sur le réservoir de solution, et permet ainsi à une solution d’échantillon d’être filtrée à travers le filtre.
Même s’il n’est pas illustré, l’appareil de piégeage de microbiote peut également comporter un actionneur de récipient d’échantillon pour le déplacement d’un récipient d’échantillon contenant une solution d’échantillon. Dans un tel cas, le pilotage de l’actionneur de récipient d’échantillon peut introduire une solution d’échantillon dans le premier réservoir de solution 101. De plus, l’appareil de piégeage de microbiote peut également comporter un actionneur de récipient sous pression pour la commande du mouvement du récipient sous pression 106 ainsi que de la fixation/du détachement du récipient sous pression 106 au/du premier réservoir de solution 101 ou au/du deuxième réservoir de solution 103.
En outre, l’appareil de piégeage de microbiote peut également comporter une première buse de distribution pour la distribution d’une solution de nettoyage dans le premier réservoir de solution 101 ou le deuxième réservoir de solution 103, une deuxième buse de distribution (c’est-à-dire, un distributeur ou un récupérateur) pour la distribution d’une solution de récupération pour la récupération de bactéries dans le deuxième réservoir de solution 103, et un actionneur de buse de distribution pour le pilotage de la première buse de distribution ou de la deuxième buse de distribution. En tant que solution de nettoyage et solution de récupération, une solution tampon, telle qu’une solution de PBS ou une solution de TE, peut être utilisée, par exemple. Avec la deuxième buse de distribution, il est également possible d’obtenir une suspension de microbiote en pipetant une solution mélangée de bactéries et une solution de récupération vers le haut et vers le bas. La suspension de microbiote peut être récupérée à l’aide de la deuxième buse de distribution ou d’une autre buse de distribution (c’est-à-dire, un récupérateur).
Le dispositif de commande 100 (c’est-à-dire, un dispositif de commande) commande la génération d’une pression par la pompe de pression 107, le pilotage de chaque actionneur, et le pilotage de chaque buse de distribution. L’appareil de piégeage de microbiote du présent mode de réalisation peut comporter plus d’un dispositif 1 de piégeage de microbiote, et dans un tel cas, le fonctionnement du plus d’un dispositif 1 de piégeage de microbiote peut être commandé par un unique dispositif de commande 100.
<Procédé de piégeage de microbiote>
La est un diagramme de flux illustrant un procédé de piégeage de microbiote qui utilise l’appareil de piégeage de microbiote. Ci-après, il est supposé que chacun(e) des buses de distribution mentionnées précédemment et des actionneurs est présent(e) dans ou sur l’appareil de piégeage de microbiote, et le dispositif de commande 100 commande le pilotage de chaque élément constituant de l’appareil de piégeage de microbiote de sorte que l’opération de piégeage de microbiote est réalisée de manière automatique.
Dans l’étape S1, le dispositif de commande 100 pilote l’actionneur de récipient d’échantillon afin qu’il déplace le récipient d’échantillon, introduisant ainsi une solution d’échantillon dans le premier réservoir de solution 101.
Dans l’étape S2, le dispositif de commande 100 pilote l’actionneur de récipient sous pression afin qu’il fixe le récipient sous pression 106 au premier réservoir de solution 101. Ensuite, le dispositif de commande 100 pilote la pompe de pression 107 afin qu’elle génère une pression positive de sorte que la pression positive (c’est-à-dire, une première pression) est appliquée au filtre d’élimination de résidu 102 du premier réservoir de solution 101. Ceci permet à la solution d’échantillon d’être filtrée à travers le filtre d’élimination de résidu 102 et permet au filtrat résultant d’être introduit dans le deuxième réservoir de solution 103, un résidu ayant été éliminé. À ce moment, les bactéries cibles devant être piégées sont introduites dans le deuxième réservoir de solution 103 conjointement avec le filtrat.
Tel que décrit ci-dessus, puisque l’espacement 110 est placé entre le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103, le deuxième réservoir de solution 103 est maintenu sous les conditions de pression atmosphérique même lorsque le premier réservoir de solution 101 est pressurisé. C’est-à-dire que chacun parmi le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103 peut être pressurisé indépendamment. Ainsi, tandis que le premier réservoir de solution 101 est pressurisé pour qu’un résidu soit éliminé d’une solution d’échantillon, une solution qui a été introduite dans le deuxième réservoir d’échantillon 103 est maintenue dans celui-ci sans être filtrée.
Dans l’étape S3, le dispositif de commande 100 pilote l’actionneur de première buse de distribution de sorte que la première buse de distribution ajoute une solution de nettoyage dans le premier réservoir de solution 101. À ce moment, la solution de nettoyage peut être ajoutée après que le récipient sous pression 106 est détaché, ou le récipient sous pression 106 peut être formé d’un matériau qui permet à la première buse de distribution de pénétrer à travers celui-ci.
Dans l’étape S4, le dispositif de commande 100 commande à la pompe de pression 107 d’appliquer une pression au filtre d’élimination de résidu 102 du premier réservoir de solution 101. Ceci permet à des bactéries, qui ont adhéré à une paroi interne du premier réservoir de solution 101 ou au filtre d’élimination de résidu 102, d’être enlevées par nettoyage et piégées dans le deuxième réservoir de solution 103. Ainsi, l’efficacité de récupération du microbiote est améliorée. Il est à noter que chacune des étapes S3 et S4 peut être exécutée plus d’une fois ou peut ne pas être réalisée du tout. Le nombre de fois où chacune des étapes S3 et S4 doit être exécutée peut être fixé à une quelconque valeur.
Au stade où l’étape d’élimination de résidu est terminée, le premier réservoir de solution 101 et le filtre d’élimination de résidu 102 ne sont plus nécessaires. Ainsi, dans l’étape S5, le dispositif de commande 100 pilote le support 109 afin d’évacuer le premier réservoir de solution 101 d’au-dessus du deuxième réservoir de solution 103. Ceci peut empêcher le premier réservoir de solution 101 de devenir un obstacle physique dans les étapes suivantes. De plus, le dispositif de commande 100 détache le récipient sous pression 106 du premier réservoir de solution 101.
Dans l’étape S6, le dispositif de commande 100 pilote l’actionneur de récipient sous pression pour fixer le récipient sous pression 106 au deuxième réservoir de solution 103. Ensuite, le dispositif de commande 100 pilote la pompe de pression 107 pour appliquer une pression positive (c’est-à-dire, une deuxième pression) au filtre de piégeage de bactéries 104 du deuxième réservoir de solution 103. Ceci permet à la solution contenant les bactéries d’être filtrée à travers le filtre de piégeage de bactéries 104 et permet ainsi aux bactéries d’être piégées par le filtre de piégeage de bactéries 104, et permet également au filtrat résultant d’être introduit dans le récipient pour déchets liquides 105.
Dans l’étape S7, le dispositif de commande 100 pilote l’actionneur de première buse de distribution de sorte que la première buse de distribution ajoute une solution de nettoyage dans le deuxième réservoir de solution 103.
Dans l’étape S8, le dispositif de commande 100 pilote la pompe de pression 107 pour appliquer une pression au filtre de piégeage de bactéries 104 du deuxième réservoir de solution 103. Ceci permet à des substances autres que les bactéries, qui ont adhéré à la paroi interne du deuxième réservoir de solution 103 ou au filtre de piégeage de bactéries 104, d’être enlevées par nettoyage et déchargées en tant que filtrat. Ainsi, l’efficacité de récupération du microbiote est améliorée. Il est à noter que chacune des étapes S7 et S8 peut être exécutée plus d’une fois ou peut ne pas être réalisée du tout. Le nombre de fois où chacune des étapes S7 et S8 doit être exécutée peut être fixé à une quelconque valeur.
Dans l’étape S9, le dispositif de commande 100 pilote l’actionneur de deuxième buse de distribution de sorte que la deuxième buse de distribution ajoute une solution de récupération dans le deuxième réservoir de solution 103.
Dans l’étape S10, le dispositif de commande 100 pilote l’actionneur de deuxième buse de distribution de sorte que la deuxième buse de distribution aspire et décharge de manière répétée le liquide dans le deuxième réservoir de solution 103 à l’intérieur du deuxième réservoir de solution 103. En conséquence, une suspension de microbiote est obtenue dans le deuxième réservoir de solution 103. Après, le dispositif de commande 100 pilote l’actionneur de deuxième buse de distribution de sorte que la deuxième buse de distribution distribue la suspension de microbiote dans un récipient de récupération pour le récupérer.
Bien qu’un exemple ait été décrit dans lequel le dispositif de commande 100 pilote chaque élément constituant de l’appareil de piégeage de microbiote pour piéger automatiquement le microbiote, la présente demande ne se limite pas à ceci. Par exemple, un utilisateur peut exécuter manuellement les opérations mentionnées précédemment. Dans un tel cas, l’utilisateur peut fixer ou détacher le récipient sous pression 106, faire fonctionner la pompe de pression 107, déplacer le premier réservoir de solution 101, et faire fonctionner la première buse de distribution et la deuxième buse de distribution, par exemple.
<Avantages techniques>
Tel que décrit ci-dessus, le dispositif 1 de piégeage de microbiote de la présente invention peut piéger des bactéries dans une solution d’échantillon sans réaliser de centrifugation, et peut ainsi réduire la contrainte sur l’utilisateur pour le fonctionnement du dispositif. De plus, l’automatisation de l’opération pour le piégeage de microbiote à l’aide de l’appareil de piégeage de microbiote avec le dispositif 1 de piégeage de microbiote peut en outre réduire la contrainte sur l’utilisateur pour le fonctionnement du dispositif.
Il peut y avoir des cas où le filtre de piégeage de bactéries 104 se bouche avec le microbiote alors que celui-ci est piégé par le filtre de piégeage de bactéries 104 si le nombre de bactéries contenues dans la solution d’échantillon est important, ce qui peut à son tour diminuer la vitesse de filtration. Dans un tel cas, si le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103 sont structurés de sorte qu’ils sont couplés ensemble hermétiquement, une diminution du débit d’écoulement de filtration à travers le filtre de piégeage de bactéries 104 provoquera l'action d’une pression résistive à l’encontre de la pression appliquée au filtre d’élimination de résidu 102, ce qui peut à son tour perturber le nettoyage par filtration réalisé à travers le filtre d’élimination de résidu 102. Au contraire, le dispositif 1 de piégeage de microbiote du présent mode de réalisation possède l’espacement 110 entre le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103. Ainsi, l’application d’une pression au filtre d’élimination de résidu 102 et l’application d’une pression au filtre de piégeage de bactéries 104 peuvent être réalisées indépendamment, ce qui peut supprimer une diminution de la vitesse de filtration à travers le filtre d’élimination de résidu 102. Par conséquent, un résidu peut être éliminé efficacement de la solution d’échantillon.
L’espacement 110 est également avantageux pour la modification de la relation de position entre le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103. Si le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103 sont structurés de sorte qu’ils sont couplés ensemble hermétiquement sans l’espacement 110 placé entre eux, tandis que le premier réservoir de solution 101 est pressurisé, le deuxième réservoir de solution 103 serait également pressurisé. Par conséquent, une force plus grande serait nécessaire pour évacuer le premier réservoir de solution 101 du deuxième réservoir de solution 103. En outre, si l’on essaie de séparer l’un de l’autre le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103 tandis qu’ils sont pressurisés, un échantillon diffuserait lors d'un relâchement de la pression. Alors, l’échantillon de valeur pourrait être perdu en raison de la diffusion ou l’échantillon diffusé pourrait contaminer l’environnement. Au contraire, dans le dispositif 1 de piégeage de microbiote du présent mode de réalisation, le deuxième réservoir de solution 103 est maintenu sous les conditions de pression atmosphérique en raison de la présence de l’espacement 110. Ainsi, il n’y a pas de possibilité qu’un échantillon puisse diffuser, ce qui pourrait sinon arriver lors d'un relâchement d’une pression quand le premier réservoir de solution 101 est évacué.
[Deuxième mode de réalisation]
Le premier mode de réalisation mentionné précédemment illustre un exemple dans lequel le récipient sous pression 106 est fixé au premier réservoir de solution 101 pour le pressuriser, et ensuite, le récipient sous pression 106 est fixé au deuxième réservoir de solution 103 pour le pressuriser de sorte qu’un résidu est éliminé d’une solution d’échantillon par le filtre d’élimination de résidu 102 et ensuite le microbiote est piégé par le filtre de piégeage de bactéries 104 lorsque la solution d’échantillon est filtrée à travers celui-ci. Cependant, le procédé de pressurisation pour le deuxième réservoir de solution 103 n’est pas nécessairement le même que pour le premier réservoir de solution 101. Par exemple, la filtration à travers le filtre de piégeage de bactéries 104 peut être implémentée par l’application d’une pression positive au premier réservoir de solution 101 et l’application d’une pression négative au deuxième réservoir de solution 103.
Ci-après, un deuxième mode de réalisation décrira un exemple dans lequel le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103 sont pourvus de différents mécanismes de pressurisation.
<Configuration de l’appareil de piégeage de microbiote>
La est une vue schématique d’un appareil de piégeage de microbiote selon le deuxième mode de réalisation. Comme illustré dans la , l’appareil de piégeage de microbiote du deuxième mode de réalisation diffère du dispositif 1 de piégeage de microbiote du premier mode de réalisation en ce qu’un dispositif 2 de piégeage de microbiote comporte un récipient sous pression 111 (c’est-à-dire, un applicateur de pression) doté d’un orifice d’évacuation 112, et l’orifice d’évacuation 112 du récipient sous pression 111 et une pompe de dépressurisation 113 (c’est-à-dire, un applicateur de pression (ou un générateur de pression négative)) sont couplés ensemble par un tube 114.
Le récipient sous pression 111 recouvre le deuxième réservoir de solution 103 de sorte que le filtre de piégeage de bactéries 104 et le récipient pour déchets liquides 105 sont situés dans l’espace interne du récipient sous pression 111. L’orifice d’évacuation 112 et la pompe de dépressurisation 113 sont couplés ensemble par le tube 114, et l’espace interne du récipient sous pression 111 est scellé hermétiquement. Une pression négative générée par la pompe de dépressurisation 113 est appliquée au récipient sous pression 111. Des exemples du récipient sous pression 111 comprennent un récipient de filtration par succion.
Au lieu de fournir séparément la pompe de pression 107 (c’est-à-dire, le générateur de pression positive) et la pompe de dépressurisation 113 (c’est-à-dire, le générateur de pression négative), il est également possible de fournir une unique pompe de pressurisation/dépressurisation possédant à la fois les fonctions de pressurisation et de dépressurisation et de coupler le récipient sous pression 106 et le récipient sous pression 111 à la pompe de pressurisation/dépressurisation.
<Procédé de piégeage de microbiote>
Le procédé de piégeage de microbiote du présent mode de réalisation est sensiblement le même que celui du premier mode de réalisation illustré dans la . Ainsi, uniquement les différences seront décrites ci-dessous.
Dans l’étape S6, au lieu de commuter la cible de fixation du récipient sous pression 106 au deuxième réservoir de solution 103 pour le pressuriser, la pompe de dépressurisation 113 est pilotée pour dépressuriser le récipient sous pression 111 dans le présent mode de réalisation. Ceci permet d’appliquer une pression négative (c’est-à-dire, une deuxième pression) au filtre de piégeage de bactéries 104 et permet ainsi à une solution dans le deuxième réservoir de solution 103 d’être filtrée par succion à travers le filtre de piégeage de bactéries 104, piégeant ainsi le microbiote. Dans le présent mode de réalisation, l’étape S5 illustrée dans la peut être réalisée après l’étape S6.
<Avantages Techniques>
Comme décrit ci-dessus, l’appareil de piégeage de microbiote du présent mode de réalisation est configuré de sorte qu’une pression négative est appliquée au deuxième réservoir de solution 103 par le récipient sous pression 111 et la pompe de dépressurisation 113 de sorte qu’une solution contenant des bactéries est filtrée par succion. Ceci peut éliminer le besoin de changer la cible de fixation du récipient sous pression 106 et peut ainsi exécuter l’opération de piégeage de microbiote plus rapidement et facilement par comparaison avec le premier mode de réalisation.
[Troisième mode de réalisation]
Le premier mode de réalisation et le deuxième mode de réalisation mentionnés précédemment illustrent chacun un exemple dans lequel l’espacement 110 est placé entre la face inférieure (c’est-à-dire, le filtre d’élimination de résidu 102) du premier réservoir de solution 101 et l’ouverture du deuxième réservoir de solution 103. Cependant, la position de l’espacement 110 n’est pas limitée à ceci et peut être modifiée au besoin tant que chacun parmi le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103 peuvent être pressurisés indépendamment.
Ci-après, un troisième mode de réalisation décrira un dispositif de piégeage de microbiote dans lequel la position de l’espacement 110 est modifiée.
<Configuration du dispositif de piégeage de microbiote>
La est une vue schématique d’une partie de la configuration d’un dispositif 3 de piégeage de microbiote selon le troisième mode de réalisation. Comme illustré dans la , dans le dispositif 3 de piégeage de microbiote, le diamètre intérieur du deuxième réservoir de solution 103 est plus grand que le diamètre extérieur du premier réservoir de solution 101. Le premier réservoir de solution 101 est soutenu par le support 109 de sorte que le filtre d’élimination de résidu 102 est situé dans le deuxième réservoir de solution 103 et la paroi externe du premier réservoir de solution 101 n’est pas en contact avec la paroi interne du deuxième réservoir de solution 103. En conséquence, l’espacement 110 est formé entre le côté du filtre d’élimination de résidu 102 du premier réservoir de solution 101 et la paroi interne du deuxième réservoir de solution 103.
La est une vue schématique d’une partie de la configuration d’un dispositif 4 de piégeage de microbiote. Comme illustré dans la , l’espacement 110 peut être formé sous forme d’un trou traversant dans la paroi latérale du deuxième réservoir de solution 103. Le trou traversant (c’est-à-dire, un évent) est placé au-dessus du filtre de piégeage de bactéries 104, et peut ainsi maintenir l’intérieur du deuxième réservoir de solution 103 à une pression atmosphérique lorsque le deuxième réservoir de solution 103 n’est pas pressurisé. Dans la , le diamètre extérieur du premier réservoir de solution 101 est fixé de manière sensiblement égale au diamètre intérieur du deuxième réservoir de solution 103 de sorte qu’une extrémité du premier réservoir de solution 101 peut être ajustée dans l’ouverture du deuxième réservoir de solution 103.
Avec l’adoption de la configuration dans la , il devient moins probable qu’une matière externe puisse s’immiscer dans le deuxième réservoir de solution 103, ce qui peut réduire le risque de contamination.
Dans le dispositif 3 de piégeage microbiote de la et le dispositif 4 de piégeage de microbiote de la , soit le mécanisme de pressurisation du premier mode de réalisation, soit celui du deuxième mode de réalisation peut être adopté pour chacun parmi le premier réservoir de solution 101 et le deuxième réservoir de solution 103.
<Procédé de piégeage de microbiote>
Dans le présent mode de réalisation, le même procédé de piégeage de microbiote du premier mode de réalisation ou du deuxième mode de réalisation peut être adopté. Ainsi, la description de celui-ci est omise ici.
<Avantages techniques>
Comme décrit ci-dessus, l'écart de l’espacement 110 dans chacun des dispositifs de piégeage de microbiote 3 et 4 du présent mode de réalisation peut être réduit par rapport à ceux du premier mode de réalisation et du deuxième mode de réalisation. En conséquence, une contamination du deuxième réservoir de solution 103 de l’extérieur peut être supprimée.
Ci-après, des Exemples de la présente divulgation seront décrits.
[Exemple 1]
<Préparation d’échantillons>
Quatre types de cellules bactériennes de culture pure, y compris Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, et Enterococcus faecalis, ont été obtenus par la réalisation d’une culture sous agitation de nuit à l’aide d’un milieu de culture LB.
La densité optique de chaque solution de corps bactérien a été mesurée et a été ajustée pour atteindre D. O. = 1. Le nombre de cellules bactériennes, qui présente une valeur de 1 x 108UFC, dans 1 mL d’une solution de corps bactérien comportant un D. O. = 1 a été utilisé comme indice, et des quantités égales des quatre types de solutions de corps bactérien ont été mélangées pour produire une solution de corps bactérien mélangée dotée d’un nombre total de bactéries de 1 x 109UFC ou de 1 x 1010UFC en tant que microbiote modèle.
2,5 g de "Ukigoi" en tant que carpe flottante (fabriquée par MARUKYU CO., LTD.), qui est un appât de pêche, 1 g de farine de blé dur "Kameliya (marque déposée)" (fabriquée par Nisshin Seifun Group Inc.), et 2,5 g d’eau stérile ont été mélangés dans le microbiote modèle ainsi produit de sorte à produire un échantillon modèle fécal simulé. Ensuite, l’échantillon modèle fécal simulé a été stocké à -20oC pour une utilisation dans les étapes suivantes.
<Préparation du dispositif de piégeage de microbiote>
Dans l’Exemple 1, un appareil de piégeage de microbiote a été construit par la préparation de six dispositifs 2 de piégeage de microbiote du deuxième mode de réalisation illustré dans la et le couplage de ceux-ci à leurs dispositifs de commande 100 respectifs. En tant qu’éléments constituants de l’appareil de piégeage de microbiote, les éléments suivants ont été spécifiquement utilisés.
Le premier réservoir de solution 101 et le filtre d’élimination de résidu 102 : un tamis cellulaire Falcon (marque déposée) (possédant une maille dotée d’une grosseur de pores de 100 µm) fabriqué par Corning Incorporated a été utilisé.
Le deuxième réservoir de solution 103 : un support pour le soutien du filtre de piégeage de bactéries 104 a été produit avec une imprimante 3D et utilisé en tant que deuxième réservoir de solution 103.
Le filtre de piégeage de bactéries 104 : un filtre à membrane Millipore Express (marque déposée) PLUS (doté d’une grosseur de pores de 0,45 µm) fabriqué par Merck KGaA a été utilisé.
Le récipient pour déchets liquides 105 : un tube conique Falcon (marque déposée) de 50 mL fabriqué par Corning Incorporated a été utilisé.
Le récipient sous pression 106 : un récipient sous pression en aluminium a été produit et utilisé en tant que récipient sous pression 106.
Le récipient sous pression 111 : un récipient de succion–filtration a été utilisé.
La pompe de pression 107 et la pompe de dépressurisation 113 : une pompe à vide à diaphragme N86KN.18 (c’est-à-dire, une pompe de pressurisation/dépressurisation) fabriquée par KNF Group a été utilisée.
Les tubes 108 et 114 : des tubes de silicone ont été utilisés.
<Procédé d’élimination de résidu de l’échantillon>
Un processus d’élimination de résidu de l’échantillon modèle fécal a été réalisé avec les procédures suivantes. Les étapes et les tests suivants ont été conduits avec les six dispositifs 2 de piégeage de microbiote (test n° 1 à 6) à l’aide du même échantillon dans les mêmes conditions.
Étape 1 : l’échantillon modèle fécal a été dissous dans 2 mL d’une solution de PBS de sorte que l’échantillon était en suspension dans la solution et une solution d’échantillon a été ainsi obtenue.
Étape 2 : le filtre à membrane (c’est-à-dire, le filtre de piégeage de bactéries) a été placé sur le deuxième réservoir de solution et le récipient pour déchets liquides a été couplé à la partie inférieure du deuxième réservoir de solution. De plus, le tamis cellulaire (c’est-à-dire, le premier réservoir de solution et le filtre d’élimination de résidu) a été disposé au-dessus du deuxième réservoir de solution. L’espacement entre le deuxième réservoir de solution et le tamis cellulaire a été fixé à environ 1 mm. Ensuite, la solution d’échantillon a été ajoutée dans le tamis cellulaire.
Étape 3 : la pompe de pressurisation/dépressurisation a été fixée à une condition de pressurisation de sorte à pressuriser le tamis cellulaire pendant 1 minute de sorte que la solution d’échantillon a été filtrée et le filtrat résultant a été introduit dans le deuxième réservoir de solution.
Étape 4 : 1 mL d’une solution de PBS a été ajoutée dans le tamis cellulaire.
Étape 5 : le tamis cellulaire a été pressurisé pendant 1 minute comme dans l’étape 3 pour effectuer la filtration, et le filtrat résultant a été introduit dans le deuxième réservoir de solution.
Étape 6 : le tamis cellulaire a été retiré d’au-dessus du deuxième réservoir de solution.
<Piégeage de cellules bactériennes>
Le piégeage de cellules bactériennes et le nettoyage du filtre à membrane ont été réalisés avec les procédures suivantes.
Étape 7 : le deuxième réservoir de solution et le récipient pour déchets liquides ont été disposés dans le récipient de succion–filtration, et l’orifice d’évacuation du récipient de succion–filtration et la pompe de pressurisation/dépressurisation ont été couplés ensemble avec le tube de silicone. Après, la succion a été réalisée par la pompe de pressurisation/dépressurisation de sorte que le degré de vide dans le récipient de succion–filtration a été augmenté (c’est-à-dire, le récipient de succion–filtration a été dépressurisé) et ainsi, une pression négative a été appliquée au filtre à membrane (c’est-à-dire, au filtre de piégeage de bactéries) et le filtrat a été séparé.
Étape 8 : 3 mL d’une solution de PBS a été ajoutée dans le deuxième réservoir de solution.
Étape 9 : 3 mL d’une solution de PBS a été ajoutée dans le deuxième réservoir de solution.
Étape 10 : 2 mL d’une solution de TE a été ajoutée dans le deuxième réservoir de solution.
Étape 11 : 2 mL d’une solution de TE a été ajoutée dans le deuxième réservoir de solution.
Étape 12 : 2 mL d’une solution de TE a été ajoutée dans le deuxième réservoir de solution.
Étape 13 : la dépressurisation a été stoppée après que le filtrat a été séparé.
Il est à noter que les étapes 8 à 12 ont été réalisées alors que la dépressurisation par la pompe de pressurisation/dépressurisation était poursuivie.
Ici, il a été observé que le temps de pressurisation diffère en fonction des bactéries et de la matière en suspension contenue dans l’échantillon utilisé. Si l’échantillon utilisé est un échantillon propre proche de l’eau pure, cela prendra dix secondes pour filtrer 3 mL de la solution, par exemple. Alors que si l’échantillon utilisé contient une grande quantité de matière en suspension, telle que des matières fécales, cela peut prendre environ 2 heures pour filtrer 3 mL de la solution. Par conséquent, le temps (c’est-à-dire, le temps de dépressurisation) pour la réalisation d’un processus de filtration peut être ajusté de manière appropriée selon l’état et la quantité de l’échantillon ajouté. De plus, dans le but de nettoyer le filtre à membrane et le deuxième réservoir de solution, une solution de nettoyage est ajoutée dans le deuxième réservoir de solution dans l’étape suivante après que la solution ajoutée dans le deuxième réservoir de solution a suffisamment passé à travers celui-ci. Spécifiquement, le nettoyage est poursuivi jusqu’à ce que la quantité de la solution restante dans le filtre à membrane devienne inférieure à 200 µL par nettoyage. Le nombre de fois que le nettoyage doit être réalisé ainsi que la quantité de la solution devant rester dans le filtre à membrane peuvent être fixés de manière appropriée par l’utilisateur.
<Récupération de la suspension de corps bactérien>
Des cellules bactériennes ont été récupérées par les procédures suivantes.
Étape 14 : 800 µL d’une solution de TE ont été ajoutés dans le deuxième réservoir de solution.
Étape 15 : une micropipette a été utilisée, son volume fixé à 600 µL, et les cellules bactériennes et la solution de TE ont été pipetées vers le haut et vers le bas 10 fois dans le deuxième réservoir de solution. En conséquence, une suspension de corps bactérien a été obtenue.
Étape 16 : la suspension de corps bactérien a été récupérée dans le récipient de récupération.
<Test d’extraction d’ADN>
L’ADN génomique a été extrait de la suspension de corps bactérien ainsi obtenue conformément au procédé décrit dans la Littérature Non-Brevet 2 (c’est-à-dire, le procédé utilisant des enzymes), et a ensuite été soumis à une électrophorèse sur 0,8 % d’un gel d’agarose.
La illustre les résultats d’électrophorèse d’ADN extrait du microbiote. Une piste M est un marqueur de taille servant comme indice de la ligne de base. Les pistes 1 à 6 correspondent respectivement aux tests n° 1 à 6.
Comme illustré dans la , il a été trouvé que de l’ADN à chaîne longue doté d’une taille supérieure à 30 kpb pouvait être extrait dans chaque test.
<Mesure des proportions d’espèces bactériennes dans la suspension de corps bactérien>
L’ADN issu du microbiote extrait dans le test d’extraction mentionné précédemment a été soumis à une PCR quantitative à l’aide d’un QuantStudio (marque déposée) fabriqué par Thermo Fisher Scientific K.K. de sorte que les proportions d’espèces bactériennes contenues dans la solution d’ADN ont été calculées. Comme exemple de référence, les étapes d’élimination de résidu jusqu’à la récupération du microbiote ont été réalisées sur l’échantillon modèle fécal produit dans l’Exemple 1 conformément au procédé décrit dans la Littérature Non–Brevet 2 au lieu d’utiliser le dispositif de piégeage de microbiote. Ainsi, une PCR quantitative a été réalisée sur celui-ci à l’aide d’un QuantStudio (marque déposée) fabriqué par Thermo Fisher Scientific K.K.
Les FIGS. 6A et 6B illustrent les résultats de PCR quantitatives réalisées sur l’ADN issu du microbiote. La illustre les résultats de récupération du microbiote à l’aide du dispositif de piégeage de microbiote de l’Exemple 1 et d’extraction d’ADN du microbiote, et ensuite de la réalisation d’une PCR quantitative sur celui-ci. La illustre les résultats de récupération du microbiote conformément au procédé décrit dans la Littérature Non–Brevet 2 et d’extraction d’ADN du microbiote, et ensuite de la réalisation d’une PCR quantitative sur celui-ci. Dans chacune des et 6B, les résultats des six tests (test n° 1 à 6) sont illustrés dans un graphique.
Comme illustré dans la , il est confirmé que conformément à l’Exemple 1, le microbiote pouvait être récupéré quel que soit l’espèce bactérienne incluse dedans. De plus, la comparaison des et 6B peut confirmer que le résultat de la PCR quantitative de l’Exemple 1 est très similaire à celle de l’exemple de référence. Ainsi, il est reconnu qu’à l’aide du dispositif de piégeage de microbiote de l’Exemple 1, on peut récupérer le microbiote environ dans la même mesure qu’avec le procédé conventionnel de piégeage de microbiote qui comporte l’élimination de résidu à travers un filtre et la réalisation d’une centrifugation.
[Variation]
La présente divulgation n’est pas limitée aux modes de réalisation mentionnés précédemment et comporte une variété de variations. Par exemple, bien que les modes de réalisation mentionnés précédemment ont été décrits en détails pour illustrer clairement la présente divulgation, la présente divulgation ne doit pas inclure toutes les configurations décrites dans les modes de réalisation. Il est possible de remplacer une partie d’une configuration d’un mode de réalisation par une configuration d’un autre mode de réalisation. De plus, il est également possible d’ajouter, à une configuration d’un mode de réalisation, une configuration d’un autre mode de réalisation. En outre, il est également possible, pour une partie d’une configuration de chaque mode de réalisation, d’ajouter, d’éliminer, ou de substituer une configuration d’un autre mode de réalisation.
1 à 3 Dispositif de piégeage de microbiote
100 Dispositif de commande
101 Premier réservoir de solution
102 Filtre d’élimination de résidu
103 Deuxième réservoir de solution
104 Filtre de piégeage de bactéries
105 Récipient pour déchets liquides
106 Récipient sous pression
107 Pompe de pression
108 Tube
109 Support
110 Espacement
111 Récipient sous pression
112 Orifice d’évacuation
113 Pompe de dépressurisation
114 Tube

Claims (14)

  1. Dispositif (1 ; 2 ; 3 ; 4) de piégeage de microbiote comprenant :
    - un premier réservoir (101) de solution comportant un premier filtre (102) conçu pour piéger un résidu dans un échantillon ; et
    - un deuxième réservoir (103) de solution comportant un deuxième filtre (104) conçu pour piéger des bactéries dans l’échantillon,
    le deuxième réservoir (103) de solution possédant un évent au-dessus du deuxième filtre (104).
  2. Dispositif (1 ; 2 ; 3 ; 4) de piégeage de microbiote selon la revendication 1, une grosseur de pores du premier filtre (102) étant supérieure ou égale à 70 µm, et une grosseur de pores du deuxième filtre (104) étant inférieure ou égale à 1 µm.
  3. Dispositif (1 ; 2 ; 3 ; 4) de piégeage de microbiote selon la revendication 1, comprenant en outre un support (109) qui soutient le premier réservoir (101) de solution au-dessus du deuxième réservoir (103) de solution, le support (109) étant conçu pour soutenir le premier réservoir (101) de solution de sorte qu’un espacement (110) est formé entre le premier réservoir (101) de solution et le deuxième réservoir (103) de solution et qu’une ouverture du deuxième réservoir (103) de solution sert d’évent.
  4. Dispositif (1 ; 2 ; 3 ; 4) de piégeage de microbiote selon la revendication 1, le deuxième réservoir (103) de solution possédant l’évent à travers une paroi latérale du deuxième réservoir (103) de solution.
  5. Appareil de piégeage de microbiote comprenant :
    - le dispositif (1 ; 2 ; 3 ; 4) de piégeage de microbiote selon la revendication 1 ;
    - un applicateur de pression (106 ; 111) configuré pour appliquer une première pression au premier réservoir (101) de solution et appliquer une deuxième pression au deuxième réservoir (103) de solution ; et
    - un dispositif (100) de commande configuré pour commander le pilotage de l’applicateur de pression (106 ; 111).
  6. Appareil de piégeage de microbiote selon la revendication 5, le dispositif (100) de commande étant configuré pour :
    - faire en sorte que l’applicateur de pression (106) applique la première pression au premier réservoir (101) de solution, de sorte qu’ainsi le premier filtre (102) piège le résidu dans l’échantillon et un filtrat contenant les bactéries est introduit dans le deuxième réservoir (103) de solution, et
    - faire en sorte que l’applicateur de pression (111) applique la deuxième pression au deuxième réservoir (103) de solution, de sorte qu’ainsi le deuxième filtre (104) piège les bactéries dans le filtrat.
  7. Appareil de piégeage de microbiote selon la revendication 5, chacune parmi la première pression et la deuxième pression étant une pression positive.
  8. Appareil de piégeage de microbiote selon la revendication 5, l’applicateur de pression (106 ; 111) comportant :
    - un générateur (107) de pression positive configuré pour générer une pression positive, et
    - un générateur (113) de pression négative configuré pour générer une pression négative,
    la première pression étant la pression positive générée par le générateur (107) de pression positive, et la deuxième pression étant la pression négative générée par le générateur (113) de pression négative.
  9. Appareil de piégeage de microbiote selon la revendication 6, comprenant en outre :
    - un distributeur conçu pour distribuer une solution de récupération dans le deuxième réservoir (103) de solution ; et
    - un récupérateur conçu pour récupérer une solution dans le deuxième réservoir (103) de solution,
    le dispositif (100) de commande étant configuré pour :
    - faire en sorte que le deuxième filtre (104) piège les bactéries dans le filtrat et qu’ensuite le distributeur ajoute la solution de récupération dans le deuxième réservoir (103) de solution pour mettre en suspension les bactéries dans la solution de récupération, obtenant ainsi une suspension de microbiote, et
    - faire en sorte que le récupérateur récupère la suspension de microbiote.
  10. Procédé de piégeage de microbiote utilisant un dispositif (1 ; 2 ; 3 ; 4) de piégeage de microbiote, le dispositif (1 ; 2 ; 3 ; 4) comportant un premier réservoir (101) de solution possédant un premier filtre (102) conçu pour piéger un résidu dans un échantillon, et un deuxième réservoir (103) de solution possédant un deuxième filtre (104) conçu pour piéger des bactéries dans l’échantillon, le deuxième réservoir (103) de solution possédant également un évent au-dessus du deuxième filtre (104), le procédé comprenant :
    - l’introduction de l’échantillon dans le premier réservoir (101) de solution ;
    - l’application d’une première pression au premier réservoir (101) de solution, de sorte qu’ainsi le premier filtre (102) piège le résidu dans l’échantillon et un filtrat contenant les bactéries est introduit dans le deuxième réservoir (103) de solution ; et
    - l’application d’une deuxième pression au deuxième réservoir (103) de solution, de sorte qu’ainsi le deuxième filtre (104) piège les bactéries dans le filtrat.
  11. Procédé de piégeage de microbiote selon la revendication 10, une grosseur de pores du premier filtre (102) étant supérieure ou égale à 70 µm, et une grosseur de pores du deuxième filtre (104) étant inférieure ou égale à 1 µm.
  12. Procédé de piégeage de microbiote selon la revendication 10, chacune parmi la première pression et la deuxième pression étant une pression positive.
  13. Procédé de piégeage de microbiote selon la revendication 10, la première pression étant une pression positive et la deuxième pression étant une pression négative.
  14. Procédé de piégeage de microbiote selon la revendication 10, comprenant en outre l’ajout d’une solution de récupération dans le deuxième réservoir (103) de solution pour mettre en suspension les bactéries dans la solution de récupération, obtenant ainsi une suspension de microbiote.
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