FR2839458A1 - Procede d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques et dispositif pour la mise en oeuvre du procede - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'échantillons biologiques, ainsi qu'un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé.Le procédé d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'échantillons biologiques, mettant en oeuvre un dispositif comprenant une plaque de titration (1) présentant au moins un puits (10), ouvert en ses deux extrémités (11, 12), apte à contenir une phase solide d'extraction, est caractérisé en ce que :- on maintient la plaque sur un support (2) de manière étanche,- on réalise toutes les étapes du procédé d'extraction dans le puits (10), - on contrôle simultanément la fixation des molécules à extraire sur la phase solide d'extraction (13) et l'évacuation des solutions (16) nécessaires à l'extraction.
Description
l'une des face de l'anneau.
L'invention concerne un procede d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques, ainsi qu'un dispositif
pour la mise en osuvre de ce procede.
Bien que plus particulierement con,cu dans le cadre de I'analyse proteomique, et notamment la digestion de proteines d'interet et ['extraction des peptides obtenus, ce procede et le dispositif correspondent pourraient tout a fait etre utilises dans un autre domaine, ou une telle
extraction est souhaitee.
Ainsi, ce systeme est particulierement adapte aux procedes faisant intervenir des reactions chimiques ou enzymatiques sur des molecules
d'interet et requerant ['elimination sequentielle d'une phase liquide.
Un des principaux enjeux de la recherche pharmaceutique, veterinaire ou phytosanitaire reside dans la decouverte de nouvelles cibles dans le cadre d'un traitement therapeutique ou de tests diagnostics. En particulier, I'analyse de ['ensemble des proteines d'un organe ou d'une cellule, le proteome, permet d'identifier des proteines marqueurs d'un etat
physiologique donne.
L'analyse proteomique, complementaire de l'analyse genomique ou de l'analyse transcriptomique, necessite le developpement de
procedes a tres haut debit.
Un autre champ d'application de l'analyse proteomique se developpe dans le secteur agro-alimentaire, pour la detection de proteines alterees, telles que des enzymes non autorisees, des traces de proteine potentieliement immunogene, etc.
Une telle demarche comprend plusieurs etapes successives.
Tout d'abord, les proteines vent extraites du milieu biologique, solubilisees, puis separees generalement par electrophorese bidimentionnel dans un gel de polyacrylamide. Les proteines vent ensuite visualisees a ['aide d'un colorant. L'etape suivante consiste en ['identification des proteines d'interet, c'est-a-dire les proteines qui vent sur ou sous-exprimees dans les conditions physiologiques etudiees, par rapport a un temoin. Cette identification repose sur la comparaison du profil de masse de la proteine selection nee avec les informations extraites de bases de don nees. On obtient le profil de masse de la proteine selectionnee en analysant par spectrometrie de masse les peptides obtenus apres hydrolyse de ladite proteine. Dans une demarche d'analyse proteomique a haut debit, plusieurs etapes limitantes apparaissent. II s'agit, d'une part, de l'hydrolyse enzymatique des proteines d'interet, et d'autre part, du traitement des peptides obtenus pour les rendre compatibles avec l'analyse en spectrometrie de
1 0 masse.
L'hydrolyse enzymatique des proteines d'interet est realisee soit en tube a essai, soit dans des puits de micro-plaques de titration dans
lesquels vent deposes les morceaux de gel.
Malheureusement, les automates actuellement disponibles sur le marche vent tous bases sur des cycles d'alimentation et d'evacuation de liquide. Cela genere toute une serie d'inconvenients. Tout d'abord, d'importants volumes vent manipules, ce qui a pour consequence une forte dilution desdits peptides. D'autre part, la purete des solvents n'est jamais absolue et done plus on apporte de volumes importants, plus les contaminations vent importantes. Enfin, les solvents utilises peuvent etre
assez polluants.
Par ailleurs, I'extraction optimale des peptides peut requerir une ultime etape de ravage a ['aide d'un solvent organique incompatible avec le processus de purification, qui se fait en solution aqueuse. Ainsi, une etape de concentration de la solution de peptides est indispensable avant la purification des peptides pour l'analyse. Outre le temps necessaire a la realisation de cette concentration, d'eventuels contaminants provenant des solutions utilisees lors des etapes precedentes, se retrouvent done egalement concentre. Le but de ['invention est de proposer un procede d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques, et un
dispositif pour sa mise en osuvre qui pallient les inconvenients precites.
Un premier but est de proposer un procede plus rapide que les procedes deja connus, afin de repondre aux exigences des analyses a haut debit. Un autre but de ['invention est de proposer un procede dans lequel les differentes etapes vent optimisees, et notamment les etapes d'hydrolyse enzymatique des proteines d'interet et de traitement des peptides obtenus pour les rendre compatibles avec l'analyse en spectrometrie de masse. Un autre but de ['invention est d'obtenir, apres la mise en oeuvre du procede, des echantillons presentant le moins de contamination possible. Un autre but de ['invention est de proposer un procede moins
onereux et moins polluant.
D'autres buts et avantages de ['invention appara^'tront au cours
de la description qui va suivre, qui n'est donnee qu'a titre indicatif et qui n'a
pas pour but de la limiter.
L'invention concerne un procede d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques, mettant en ccuvre un dispositif comprenant une plaque de titration presentant au moins un puits,
ouvert en ses deux extremites, apte a contenir une phase solide d'extraction.
Selon le procede de ['invention, on maintient la plaque de titration sur un support de maniere etanche et on realise toutes les etapes du procede d'extraction dans le putts. De plus, on controle simultanement, d'une part la fixation des molecules a extraire sur la phase solide d'extraction, et
d'autre part, I'evacuation des solutions necessaires a ['extraction.
L'invention concerne egalement ['application d'un tel procede a ['extraction de peptides, en utilisant une phase inverse apte a fixer lesdits
peptides comme phase solide d'extraction.
Enfin, I'invention a trait a un dispositif pour realiser des extractions sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques. Le dispositif de ['invention comprend une plaque de titration presentant au moins un puits ouvert en ses deux extremites, apte a contenir une phase solide d'extraction. II comprend en outre un support pour la plaque de titration. Le fond et les parois audit support definissent une cavite obturee par la plaque, cette cavite communique avec les puits par leur extremite inferieure. Les parois de la cavite presentent en outre des premiers moyens de
communication entre la cavite et l'exterieur.
Enfin, le dispositif de ['invention comprend au moins des premiers moyens d'aspiration cooperant avec les premiers moyens de communication, le support et la plaque, pour maintenir la plaque sur le support sous l'effet d'une depression et pour controler simultanement, d'une part, la fixation des molecules a extraire sur la phase solide d'extraction, et d'autre
part, I'evacuation des solutions necessaires a ['extraction dans la cavite.
L'invention sera mieux comprise a la lecture de la description,
accompagnee des dessins en annexe, parmi lesquels: - la figure 1 est une vue en coupe d'une variante du dispositif selon ['invention, - la figure 2 est une vue en coupe de la meme variante du dispositif en cours d'utilisation, - la figure 3 est une vue en perspective de la face inferieure de la plaque de titration,
- la figure 4 est une vue en perspective du dessus du support.
La figure 1 donne un exemple de realisation du dispositif selon ['invention. Ce dispositif, pour realiser des extractions sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques, comprend une plaque de titration 1 presentant au moins un puits 10 ouvert en ses deux extremites 11,
12, apte a contenir une phase solide d'extraction 13.
Ledit dispositif comprend en outre un support 2 pour la plaque 1, ledit support presentant des parois 3 et un fond 4 definissant une cavite 5 obturee par la plaque, ladite cavite communiquant avec les puits 10 par leur
extremite inferieure 12.
Ledit dispositif est egalement remarquable en ce que les parois 3 du support 2 presentent des premiers moyens de communication 20
entre la cavite 5 et l'exterieur 6.
En outre, led it d ispositif de ['invention comprend au moins des premiers moyens d'asiration non representes, cooperant avec lesdits premiers moyens de communication 20, le support 2 et la plaque 1 pour maintenir la plaque sur le support sous l'effet d'une depression et pour contr61er simultanement la fixation des molecules a extraire sur la phase solide d'extraction 13 et ['evacuation des solutions necessaires a ['extraction dans la
cavite 5.
Pour realiser le dispositif conforme a ['invention, c'est-a-dire ['ensemble plaque de titration et support, on pourra utiliser tout type de materiau compatible avec les reactions que l'on souhaite mener dans le puits
et compatibles avec les diverges solutions necessaires a ['extraction.
Le materiau utilise pour la fabrication du support doit egalement etre compatible avec les solutions utilisees lors des differentes reactions. En particulier, cela pourra etre les materiaux plastiques, comme des polyethylenes ou des polypropylenes, du verre ou de l'acier inoxydable. La plaque de titration 1 pourra presenter au moins un, voire plusieurs, puits 10 ouverts en leurs deux extremites 11, 12, la taille de l'ouverture de l'extremite superieure 11, denommee ouverture d'alimentation, etant plus grande que celle de l'ouverture de l'extremite inferieure 12, denommee ouverture d'evacuation. La plaque 1 utilisee pourrait etre, par exemple, une micro-plaque de titration, ou plaque multi-puits de 96 puits, 384 puits ou plus. Bien que ['invention puisse etre mise en oeuvre avec un seul puits, I'utilisation d'une plaque multi- puits permet d'augmenter la vitesse des analyses, puisqu'un grand nombre de reactions chimiques ou enzymatiques
vent realisees en parallele.
La taille de l'ouverture d'evacuation 12 est telle que, du fait des forces de capillarite, un liquide place dans un puits 10 ne peut pas s'ecouler,
sauf a etre aspire.
De plus, la falble porosite de la phase solide d'extraction 13, associee a la tension de surface assurent egalement le maintien de la phase
liquide lorsqu'aucune depression n'est appliquee au niveau de la cavite 5.
Les puits 10 peuvent presenter une forme conique, au moins dans la zone ou ont lieu les reactions. Dans ce cas, le sommet du cone
correspond a l'extremite d'evacuation 12 du putts.
Bien entendu, les puits pourraient avoir une autre forme. Par exemple, ils pourraient d'abord etre de forme cylindrique au niveau de I'extremite d'alimentation 11 du puits puis devenir de forme conique ou tronconique, auquel cas il disposerait d'une derriere zone cylindrique, au
niveau de l'extremite d'evacuation 12.
L' utilisation de puits con iq ues permet de d im i n uer notablement
les volumes de solvent utilises, au moins d'un facteur 10.
Les solutions 16 necessaires a ['extraction vent apportees au niveau de l'ouverture d'alimentation 11, circulent dans le puits 10 puis vent
evacuees au niveau de l'ouverture d'evacuation 12 dans la cavite 5.
Les solutions 16 peuvent etre apportees manuellement a ['aide d'une micropipette ou automatiquement par un robot manipulateur par
exemple.
La phase solide d'extraction 13 peut etre constituee de billes greffees sur une resine ou d'un materiau polymerise in situ. Le materiau de la phase solide d'extraction est choisi en fonction du type de molecules a
extraire, et des solvents utilises au cours de ['extraction.
Dans le cas d'applications en analyse proteomique, la phase solide d'extraction est constituee d'une phase chromatographique a polarite inverse, par exemple de la silice greffee C18. Pour d'autres types d'extraction, la phase solide d'extraction pourra etre une resine echangeuse d'ion, des billes d'agarose, ou d'autres milieux connus de l'homme du metier specialise dans la
chimie d'affinite.
Le dispositif selon ['invention comprend en outre un support 2
pour la plaque. Les parois 3 et le fond 4 du support definissent une cavite 5.
L'extremite inferieure 12 des puits 10 debouche dans cette cavite.
Les parois du support presentent des premiers moyens de communication 20 entre la cavite 5 et l'exterieur 6. Le dispositif comprenant des moyens d 'aspiration cooperant avec lesd its premiers moyens de communication 20, le support et la plaque, les parois et le fond du support dolvent pouvoir resister a une depression appliquee au niveau de la cavite 5,
voire a un vice pousse.
Les premiers moyens de communication 20 pourront se presenter sous la forme d'au moins un orifice traversant, prevu dans la paroi 3
du support 2 eVou de la plaque 1.
Selon une variante particuliere de ['invention, les premiers moyens de communication 20 debouchent dans la cavite 5 au niveau de leur ouverture 21. Cette ouverture 21 se trouve a une hauteur h au-dessus du fond
4 de la cavite 5.
En effet, au cours des differentes etapes du procede d'extraction, diverges solutions seront evacuees dans la cavite 5. On place done l'ouverture 21 des premiers moyens de communication 20 de fa,con a eviter que les solutions evacuees ne soient aspirees par lesdits premiers
moyens d'aspiration au cours du procede d'extraction.
Selon un autre mode de realisation de ['invention, des seconds moyens de communication 30 vent prevus. Ces seconds moyens de communication debouchent en leur ouverture 31 au niveau de la surface commune de contact 32, 33 du support 2 et de la plaque 1 et ils debouchent
en leur ouverture 34 a l'exterieur 6.
Selon une premiere variante, lesdits seconds moyens de communication 30 comprennent une gouttiere peripherique 35 au niveau de la surface commune de contact 32, 33 du support 2 et de la plaque 1 ainsi que des seconds orifices traversant prevus dans la paroi 3 du support eVou de la
plaque, entre ladite gouttiere 35 et i'exterieur 6.
On peut voir une illustration de cette variante aux figures 3 et 4. Toutefois, d'autres formes peuvent etre envisagees, I'important etant de creer, par la depression engendree, une force de plaquage de la plaque 1 sur le support 2 suffisante, cela independamment de la depression creee par
lesdits premiers moyens d'aspiration.
En effet, en presence de seconds moyens de communication, des seconds moyens d'aspiration, independamment des premiers moyens d'aspiration, cooperent avec lesdits seconds moyens de communication 30, la plaque 1 et le support 2 pour maintenir de maniere etanche la plaque sur le
support sous l'effet d'un vice pousse.
Enfin, selon ['invention, au moins un puits peut comprendre un filtre support plan 14, dispose perpendiculairement au sens de circulation des liquides dans les puits 10. Ainsi, on peut deposer l'echantillon a analyser 15
sur le filtre 14 afin d'eviter l'obturation du puits 10.
L'invention concerne egalement un procede d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques, mettant en
ceuvre un dispositif tel qu'illustre aux figures 1 et 4.
Le dispositif comprend une plaque de titration 1 presentant au moins un puits 10, ouvert en ses deux extremites 11 et 12, et apte a contenir une phase solide d'extraction 13. Selon le procede de ['invention, on maintient la plaque 1 sur un support 2 de maniere etanche, on realise toutes les etapes du procede dans le puits 10, et on controle simultanement la fixation des molecules a extraire sur la phase solide d'extraction 13 et ['evacuation des
solutions 16 necessaires a ['extraction.
Dans le cadre de l'analyse d'un echantillon biologique solide 15, il peut etre utile de prevoir un filtre support 14, dispose perpendiculairement au sens de circulation des liquides 16 dans le puits 10, sur lequel on peut deposer l'echantillon 15 a analyser afin d'eviter l'obturation
du putts.
Plusieurs methodes vent envisageabies pour maintenir la plaque 1 sur le support 2 de maniere etanche. En particulier, on peut relier une cavite 5 definie par les parois 3 et le fond 4 du support a l'exterieur par des moyens de communication 20. On applique alors auxdits moyens de communication 20 une depression qui permet de maintenir la plaque 1 sur le
support 2 de maniere etanche.
Dans ce cas, on peut egalement controler la fixation des molecules a extraire sur la phase solide d'extraction 13 ainsi que ['evacuation
des solutions 16 necessaires a ['extraction dans la cavite 5.
Un critere essentiel dans le processus de fixation et de relargage de molecules sur une phase solide est le temps de contact entre la
phase solide et la phase liquide.
L'application d'une depression precisement controlee, au niveau de la cavite 5, permet d'optimiser la vitesse de circulation des liquides 16 dans les puits 10, et done d'optimiser le temps de contact entre la phase
solide d'extraction 13 et la phase liquide 16.
Simultanement, Les solutions usageeS vent evacuees dans la
cavite 5.
Selon une variante du procede, on maintient la plaque 1 sur le support 2 de maniere etanche, par application d'une depression au niveau de la surface commune de contact 32, 33 entre le support 2 et la plaque 1, par
l'intermediaire de seconds moyens de communication 30.
Dans ce cas, on dispose de deux etages de vice ou de depression: - un vice d'etancheite cree par les seconds moyens d'aspiration, permet de maintenir de maniere etanche, la plaque 1 sur le support 2, - un vice controle, cree au niveau de la cavite 5 par les premiers moyens d'aspiration cooperant avec les premiers moyens de communication 20, permet d'optimiser le temps de contact entre ia phase solide d'extraction 13 et
la phase liquide 16 dans les puits 10.
Pour creer un vice entre deux surfaces, il est necessaire que les deux surfaces soient tout a fait planes et pokes. Dans le cas contraire, des micro-fuites peuvent avoir lieu entre les deux surfaces, nuisant a la qualite du
vice. Cependant, obtenir un tel etat de surface peut etre onereux.
11 pourra done etre utile de prevoir au niveau de la surface commune de contact 32, 33 un joint en materiau elastique pourvu de moyens de communication en continuite avec les seconds moyens de communication
prevus dans la paroi 3 du support eVou de la plaque.
Enfin, I'invention concerne ['application du procede d'extraction sur phase solide a ['extraction de peptides. Dans ce cas, la phase solide
d 'extraction est u ne phase inverse apte a fixer lesd its peptides.
Pour l'analyse de proteines d'interet, on extrait tout d'abord les proteines du milieu biologique puis on les solubilise a ['aide d'un detergent avant de les separer par electrophorese bi-dimensionnel sur un gel polymerise
de polyacrylamide, selon des techniques connues par ailleurs.
Les proteines vent ensu ite visual isees a ['aide d' u n colorant tel que le bleu de Coomassie, par un phenomene d'absorption ou alors par une reaction d'oxydoreduction a ['aide du nitrate d'argent. On procede alors a une analyse par imagerie densitometrique. Les proteines d'interet vent celles qui
correspondent a des proteines sur ou sous-exprimees par rapport a un temoin.
On decoupe manuellement a l'emporte-piece ou automatiquement a ['aide diun robot les morceaux de gel contenant les
proteines d'interet.
Selon ['invention, le procede de digestion proteolytique pour l'analyse de proteines comprend les etapes suivantes: 1) On depose les morceaux de gel 15 contenant les proteines d'interet dans les puits 10, sur les filtres supports 14. L'echantillon proteique peut egalement etre contenu dans une phase liquide, auquel cas ledit echantillon est directement amene au-dessus de la phase solide, avec dilution en phase aqueuse ou precipitation pour assurer la fixation des proteines sur la
phase solide d'extraction.
2) On lave le morceau de gel et on elimine le colorant adsorbe sur les proteines. Ce colorant peut eventuellement se fixer sur la phase solide
d'extraction 13, qui est dans ce cas une phase inverse.
3) On seche le gel a ['aide d'un solvent organique. Cela permet de deshydrater le gel. De plus, un colorant a caractere hydrophobe eventuellement fixe sur la phase inverse 13 est elimine pendant la deshydratation du gel a ['aide d'acetonitrile. Les solvents vent elimines par aspiration. 4) On rehydrate le gel a ['aide de la solution d'enzymes. C'est
cette etape qui constitue la digestion proteolytique.
) Apres un certain temps de reaction, on applique un vice controle a la cavite 5, a ['aide des premiers moyens d'aspiration, par ie biais des premiers moyens de communication 20. Cette aspiration permet la fixation des peptides les plus hydrophiles a la phase inverse 13. Les contaminants et
la solution usagee vent evacuee dans la cavite 5.
6) On procede a un ravage du gel 15 a ['aide d'un tampon aqueux afin d'extraire les peptides restart sur le gel. L'application d'un vice controle a la cavite 5 permet le passage de la solution a travers la phase inverse 13, la fixation des peptides en solution a la phase inverse 13 et
['evacuation des contaminants et de la solution usagee.
7) On opere un dernier ravage a ['aide d'un solvent organique, qui permet de recuperer les peptides les plus hydrophobes restes dans le gel 15. L'ensemble des peptides est alors elue et pret a etre depose pour l'analyse
par spectrometrie de masse, selon u ne methode con n ue par ail leu rs.
Ce procede permet des economies de temps et de produit. II permet egalement d'obtenir des peptides presentant une moindre contamination. En effet, il n'y a plus besoin de concentrer les extraits apres avoir recupere ['ensemble des peptides digeres, puisque les peptides vent adsorbes et concentres au niveau de la phase inverse 13 tout au long du
procede d'extraction.
Ainsi, I'ensemble du procede d'extraction est realise dans les
memes puits, ce qui facilite l'automatisation audit procede.
Le dispositif et le procede selon ['invention ont ete testes a partir de morceaux de gel contenant 500 femtomoles d'une proteine temoin:
I'anhydrase carbonique, coloree au bleu de Coomassie de type collodal.
Precisement, le protocole experimental mis en ceuvre est le suivant: 1) Apres separation par electrophorese bi-dimensionnelle sur gel de polyacrylamide et coloration au bleu de Coomassie, un morceau de gel (1 a 2 mm2) contenant la proteine temoin est decoupe a l'emporte-piece puis
place sur un filtre support.
2) On lave le gel a ['aide de 50 pL de bicarbonate d'ammonium a 50 mM. L'incubation cure 30 min. Cette etape est repetee 3 fois avec une
aspiration intermediaire du liquide.
3) On deshydrate le gel a ['aide de 50,uL d'acetonitrite pendant min puis on aspire le liquide et on laisse secher pendant 20 min. 4) On rehydrate le gel a ['aide de 30 L d'une solution de trypsine a 10 ng/pL, a une temperature de 0 C, pendant 10 min puis on
aspire le surnageant.
On amene ensuite 50 pL d'un tampon de bicarbonate d'ammonium a 50 mM pour couvrir le gel. On laisse l'hydrolyse par la trypsine
se derouler pendant 8 heures.
) On procede a une aspiration lente, pendant 15 a 20
secondes, du contenu du putts.
6) On realise trots etapes d'extraction et de ravage a ['aide de
pL d'eau pure par etape.
7) On procede enfin a une extraction et elusion des peptides obtenues avec 1 5 uL d'un melange eau/acetronitrile (3: 7), puis a une
aspiration lente du contenu pendant 15 a 20 secondes.
Enfin, il est possible d'analyser les peptides obtenues par la methode de spectrometrie de masse en mode desorption laser assistee par matricetemps de vol. Pour cette analyse, 0,5 L de la solution de peptide est melange sur la cible avec 0,5,uL de matrice acide alphacyanohydroxycinnamique d'une concentration de 5 mg/mL dans un
melange d'eau/acetonitrile 3: 7, contenant 0,1 % d'acide trifluoroacetique.
Ce procede permet done un gain de temps puisque le protocole de digestion est realise plus rapidement que selon les procedes anciens notamment ceux qui necessitent de concentrer les extraits apres avoir
recupere ['ensemble des peptides digeres.
De plus, le nombre d'etapes de manipulation est nettement reduit ainsi que les volumes de produits apportes. Cela diminue done les
risques d'erreur, de contamination, ainsi que la quantite de produit consomme.
Enfin, etant donne que ['ensemble du procede a lieu dans les memes puits et que tous les flux de liquide se font dans le meme sees, la mise
en cauvre de procedes d'analyse proteomique a tres haut debit est facilitee.
Naturellement, d'autres modes de mise en ceuvre, a la portee de l'homme de ['art, auraient pu encore etre envisages sans pour autant sortir
du cadre de ['invention.
Claims (12)
1. Procede d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques, mettant en couvre un dispositif comprenant une plaque de titration (1) presentant au moins un puits (10), ouvert en ses deux extremites (11, 12), apte a contenir une phase solide d'extraction, caracterise en ce que: - on maintient la plaque sur un support (2) de maniere etanche, - on realise toutes les etapes du procede d'extraction dans le puits (10), - on controle simultanement la fixation des molecules a extraire sur la phase solide d'extraction (13) et ['evacuation des solutions (16)
necessaires a ['extraction.
2. Procede selon la revendication 1, dans lequel le fond (4) et les parois (3) du support (2) definissant une cavite (5), on relic ladite cavite (5) a l'exterieur (6) par des moyens de communication (20) et on applique une depression auxdits moyens de communication (20) pour controler la fixation des molecules a extraire sur la phase solide d'extraction (13) et pour controler simultanement ['evacuation des solutions (16) necessaires a ['extraction, dans
ladite cavite (5).
3. Procede selon la revendication 1, dans lequel on maintient la plaque (1) sur le support (2) de maniere etanche, par application d'une depression au niveau de la surface commune de contact (32, 33) entre le
support (2) et la plaque (1).
4. Application d'un procede selon l'une des revendications 1 a
3 pour ['extraction de peptides, dans laquelle la phase solide d'extraction (13)
est une phase inverse, apte a fixer lesdits peptides.
5. Application selon la revendication 4 dans laquelle: - apres avoir separe sur gel les proteines d'un echantillon et les avoir colorees, on place les morceaux de gel (15) contenant les proteines a analyser dans des puits (10), - on elimine le colorant absorbe sur les proteines a ['aide d'un
': - -:? G '' '
solvent, - on seche le gel (15) par un solvent organique, ledit solvent etant evacue avant de rehydrater le gel avec une solution enzymatique proteolytique, - on effectue au moins un ravage avec une solution aqueuse. pour entraner les peptides obtenus par proteolyse vers la phase inverse (13) et on evacue les solutions (16) utilisees par application d'une depression aux moyens de communication (20) entre la cavite (5) et l'exterieur (6), - on effectue un dernier ravage avec une solution organique pour Bluer lesdits peptides fixes sur la phase inverse (13) au cours des
precedentes etapes.
6. Dispositif pour realiser des extractions sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques, comprenant une plaque de titration (1) presentant au moins un puits (10) ouvert en ses deux extremites (11, 12), apte a contenir une phase solide d'extraction (13), caracterise en ce que: - le dispositif comprend en outre un support (2) pour la plaque (1), ledit support presentant un fond (4) et des parois (3) definissant une cavite (5) obturee par la plaque (1), ladite cavite (5) communiquant avec les puits (10) par leur extremite inferieure (12), - les parois (3) audit support (2) presentent en outre des premiers moyens de communication (20) entre ladite cavite (5) et l'exterieur (6), - le dispositif comprend au moins des premiers moyens d'aspiration cooperant avec lesdits premiers moyens de communication (20), le support (2) et la plaque (1), pour maintenir la plaque (1) sur le support (2) sous l'effet d'une depression et pour controler simultanement d'une part, la fixation des molecules a extraire sur la phase solide d'extraction (13) et d'autre part,
I'evacuation des solutions (16) necessaires a ['extraction dans ladite cavite (5).
7. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel au moins un puits (10) presente une forme conique, au moins dans la zone ou les operations d'extraction ont lieu, le sommet du cone correspondent a l'extremite
inferieure (12) audit puits (10).
8. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel lesdits premiers moyens de communication (20) se presentent sous la forme d'au moins un orifice traversant, prevu dans la paroi (3) du support (2) eVou de la
plaque (1).
9. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel des seconds moyens de communication (30) vent prevus entre la surface commune de
contact (32, 33) du support (2) et de la plaque (1) et l'exterieur (6).
10. Dispositif selon la revendication 9, dans lequel les seconds moyens d 'asp i ration cooperent avec lesd its seconds moyens de communication (30) , la plaque (1) et le support (2) pour maintenir de maniere
etanche la plaque (1) sur le support (2) sous l'effet d'un vice pousse.
11. Dispositif selon la revendication 9, dans lequel lesdits seconds moyens de communication (30) comprennent une gouttiere peripherique (35) moulee au niveau de la surface commune de contact (32, 33) du support (2) et de la plaque (1) ainsi que des seconds orifices traversants (30) prevus dans la paroi (3) du support (2) et/ou de la plaque (1),
entre ladite gouttiere (5) et l'exterieur (6).
12. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel au moins un puits (10) comprend un filtre support plan (14), dispose perpendiculairement au sens de circulation des liquides (16) dans le puits (10), sur lequel on peut
deposer l'echantillon (15) a analyser, afin d'eviter l'obturation du puits (10).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0205721A FR2839458A1 (fr) | 2002-05-07 | 2002-05-07 | Procede d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques et dispositif pour la mise en oeuvre du procede |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0205721A FR2839458A1 (fr) | 2002-05-07 | 2002-05-07 | Procede d'extraction sur phase solide, notamment pour l'analyse d'echantillons biologiques et dispositif pour la mise en oeuvre du procede |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2839458A1 (fr) |
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