CN108473935B

CN108473935B - 细胞分选培养增殖容器及细胞分选培养增殖方法

Info

Publication number: CN108473935B
Application number: CN201680075849.2A
Authority: CN
Inventors: 岛垣昌明; 铃木孝尚; 渥美优介; 中岛美砂子
Original assignee: Meinong Wheel Ascend; National Center for Geriatrics and Gerontology; NEPA GENE CO Ltd
Current assignee: National Research and Development Corporation National longevity Medical Research Center; NEPA GENE CO Ltd
Priority date: 2015-12-26
Filing date: 2016-12-24
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2036-12-24
Also published as: JPWO2017111148A1; EP3395939A4; WO2017111148A1; US20190309245A1; EP3395939A1; CN108473935A; JP6851598B2; EP3395939B1

Abstract

本发明提供一种用于从组织、细胞群体将所期望的细胞高效地分选并培养增殖的技术，其操作简便且廉价，可稳定地实施。本发明涉及一种能密闭的细胞分选培养增殖容器，其包含如下单元而构成：细胞分选单元，其为：具备具有能分选细胞的微细孔的细胞分选膜而成的结构体；第一次培养用单元，其为：具有能培养通过了所述细胞分选膜的细胞的第一次培养用培养面，具有能将保持于该单元内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构的容器状结构体；以及，主体容器单元，其为：具备能培养从上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽，具有能收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构的容器状结构体。

Description

细胞分选培养增殖容器及细胞分选培养增殖方法

技术领域

本发明涉及一种能密闭的细胞分选培养增殖容器，详细而言，涉及一种用于从组织、细胞群体将所期望的细胞高效地分选并增殖的技术，其是一种操作简便且廉价，可稳定地实施的细胞分选培养增殖技术。

背景技术

在生命科学领域中，用于将从组织等的细胞群体的任意细胞分选并增殖的技术为重要技术，特别是可高效地达成干细胞的分选培养的技术，在医疗领域中所瞩目的技术。

其中，现有技术中的细胞分选法，可列举使用流式细胞术的方法或使用磁抗体珠的方法。但是，在利用流式细胞术或磁抗体珠的方法中，从装置、设备、原理等观点考虑，该方法在从廉价利用的观点考虑仍存在课题。另外，作为根本课题指出了如下课题：从安全性的观点考虑，如何符合临床上使用基准，即医药品及医药部外品的制造管理及质量管理的基准的相关省令(GMP)。

作为使用流式细胞术分选对象的目标细胞的方法，例如为干细胞时，可列举如下方法：以DNA结合性色素标记SP细胞(源自齿髓的CD31-SP细胞)，分选出强烈排出该色素的部分。但是，在使用流式细胞术的方法中，被指出本身在细胞的安全性存在问题。

另外，作为利用磁抗体珠的方法，例如，列举使用与骨髓干细胞用CD34或CD133膜表面抗原对应的抗体珠来分选目标细胞的方法，则具有由于分选用组织所含的干细胞的含有率不高而使得分选率低的问题。另外，由于抗体珠根据种类进行定制化，因此不认为是可廉价地实现的操作。

因此，发明人等的研究团队以不使用流式细胞术或磁抗体珠而分选肝细胞的技术为目标，构思了一种利用趋化因子及膜分选器的技术(专利文献1)。其中，作为专利文献1所述的膜分选器，也可作为上部结构插入细胞培养内件(cell culture insert，法尔康(Falcon)公司制)等市售制品而使用。

但是，若仅使用专利文献1所述的膜分选器，则在移植到用于进行增殖培养的其他容器时所导致的对细胞的刺激、损伤等的损失大，特别在对刺激敏感性强而容易丧失多能性的贵重的干细胞的分选增殖中，会成为细胞的品质及回收效率大幅降低的主要原因。另外，由于必须分别进行分选及增殖，因此在处理细胞的操作技术上必须熟练，分选效率会因操作者的熟练度而产生极大差异。

另外，由于专利文献1所述的膜分选器是假定为开放形状构件的装置，因此有引起霉浆菌、病毒等感染以及来自其他细胞源的污染等风险的担忧。因此，有难以达成稳定的生产效率、难以得到实验结果的课题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际专利申请WO2012/133803号公报

发明内容

发明所要解决的问题

本发明是鉴于上述现有技术的情况而完成的，作为其课题的目的在于提供一种用于从组织、细胞群体将所期望的细胞高效地分选并培养增殖的技术，其操作简便且廉价，可稳定地实施。

用于解决问题的方案

在上述现有技术的状况中，发明人等重复地进行了深入研究，其结果是构思出一种涉及含有细胞分选单元、第一次培养用单元及主体容器单元而构成的能密闭的细胞分选培养增殖容器的技术，从而想到本发明。

详细而言，所述细胞分选单元构思为如下构件构成：具备具有能分选细胞的微细孔的细胞分选膜而成的结构体。

另外，所述第一次培养用单元构思为如下构件构成：具有能培养通过了所述细胞分选膜的细胞的第一次培养用培养面，具有能将保持于该单元内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构的容器状结构体。

另外，主体容器单元构思为如下构件构成：具备能培养从上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽，具有能收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构的容器状结构体。

本发明人等制造了具有上述结构的能密闭的细胞分选培养增殖容器。而且，使用该容器进行用于将对象细胞选择性分选的细胞分选工序，进行第一次培养工序、细胞剥离工序及增殖培养工序等一系列的操作，此时发现能在同一容器内通过简便的操作来实施所期望的对象细胞的分选与增殖培养。需要说明的是，该一系列的工序不需要用于在其他容器增殖培养的细胞移送操作等操作就可实施，且可在显著降低霉浆菌、病毒等感染、来自其他细胞源的污染等风险的状态下实施。

该容器所具有的优异作用效果为：通过各构件单元所具有的特殊的结构及性质相互作用而首次被发挥的作用效果。

进而，本发明人等想到了如下情况：作为上述结构的容器构成构件，通过使特定位置的构件采用透光性构件，不开封主体容器单位也可使用显微镜等实施容器内培养状态的实时观察。

进而，本发明人等想到了如下情况：作为上述结构的容器构成构件，通过在主体容器配设可插入/插出中空管状构件的结构，不开封主体容器单位也能从细胞分选工序转移至第一次培养工序。

进而，本发明人等想到了如下情况：作为上述结构的容器构成构件，通过能与主体容器单元的主体盖状部的操作连动而对细胞分选单元的细胞分选膜的位置进行调整，不开封主体容器单元也能从细胞分选工序转移至第一次培养工序。

进而，本发明人等想到了如下情况：作为上述结构的容器构成构件，通过能与来自主体容器单元的外部的操作连动而使第一次培养用单元的释放结构调整为释放状态，不开封主体容器单元也能从第一次培养工序转移至增殖培养工序。

本发明人等发现了：通过实施其中1种以上的上述方案的避免主体容器单元开封的方法，可进一步降低感染及污染的风险。

另外，本发明人等进一步发现了：在具有上述结构的能密闭的细胞分选培养增殖容器中，作为培养用单元的培养面，在使用以具有刺激应答性细胞剥离作用的分子进行了表面修饰的所述基材时，从培养面细胞剥离将变得容易，能更简便地进行细胞移送。

另外，本发明人等进一步发现了：作为细胞分选单元的细胞分选膜，在使用以亲水性聚合物进行了表面分子修饰的基材时，可大幅降低对象细胞于细胞分选膜的附着损失，可提升回收效率。

本发明具体涉及以下所述的发明。

[第一项]

一种能密闭的细胞分选培养增殖容器，其为能将所期望的对象细胞分选并培养增殖的容器状结构体，其特征在于，

(A)含有细胞分选单元、第一次培养用单元及主体容器单元而构成；

(B)所述细胞分选单元为：具备具有能分选细胞的微细孔的细胞分选膜而成的结构体；

(C)所述第一次培养用单元为如下容器状结构体：具有能培养通过了所述细胞分选膜的细胞的第一次培养用培养面，具有能将保持于该单元内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构；

(D)所述主体容器单元为如下容器状结构体：具备能培养从上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽，具有能收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构。

[第二项]

第一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，

所述(B)所述的细胞分选单元为：(b-1)容器状结构体，且(b-2)在构成所述容器状结构体的面的至少一部分具备具有能分选细胞的微细孔的细胞分选膜而成的结构体；

所述(C)所述的第一次培养用单元为：(c-1)容器状结构体，且(c-2)具有在将液体填充于该容器状结构体内时，能以细胞分选膜面与填充的液面接触的状态配设所述细胞分选单元的结构，(c-3)在构成该容器状结构体的面的至少一部分具有能培养通过了细胞分选膜的细胞的第一次培养用培养面，(c-4)在构成该容器状结构体的面具有能将保持于该容器内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构；

所述(D)所述的主体容器单元为：(d-1)主要由主体容器及主体盖状部构成的容器状结构体，(d-2)具备能培养从上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽，(d-3)在该容器状结构体的内部具有能收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构，(d-4)所述主体盖状部为能使容器整体处于密闭状态的盖状结构体。

[第三项]

第一项或第二项的任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选单元为用于经由细胞分选膜在第一次培养用单元的容器状结构体侧将所期望的对象细胞分选的单元。

[第四项]

第一项～第三项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，以将上一阶段的培养用单元的培养面的面积设为1的情况下的面积比计，所述增殖培养用培养面的面积在大于1且20以下的范围。

[第五项]

第一项～第四项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选培养容器：

(E)(e-1)所述细胞分选培养容器所具备的所有培养面的至少一部分以及主体容器单元的增殖培养用培养面的对置方向或大致对置方向的容器结构的至少一部分由具有透光性的材质构成；(e-2)不开封主体容器单元也能经由所述具有透光性的部分观察容器内部的培养面。

[第六项]

第一项～第五项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述第一次培养用单元为由两个以上的构件构成的容器状结构体，且具有能通过构成该容器状结构体的构件的分离或转置而将所述能释放的结构调整为释放状态的结构。

[第七项]

第一项～第六项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述第一次培养用单元具有能与来自主体容器单元的外部的操作连动而将所述能释放的结构调整为释放状态的结构。

[第八项]

第一项～第七项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述第一次培养用单元能与主体盖状部的操作连动而将所述能释放的结构调整为释放状态。

[第九项]

第一项～第八项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选培养容器为：

(F)(f-1)在主体容器单元的主体容器壁面或主体盖状部具备不开封主体容器单元也能将中空管状构件朝容器内部插入或从容器内部插出的结构，(f-2)该结构为配设于经由插入的中空管状构件而能将填充于第一次培养用单元内的液体吸出的位置的结构，(f-3)该结构为主要由能保持中空管状构件的未插入状态下的气密性及中空管状构件的插入状态下的气密性的弹性构件构成的结构。

[第十项]

第一项～第九项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选单元具有能与主体盖状部的操作连动而调整细胞分选膜的位置的结构。

[第十一项]

第一项～第十项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述主体容器单元具备气体交换口而成。

[第十二项]

第一项～第十一项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述主体容器单元具备能朝主体容器注入培养基及从主体容器排出培养基的培养基交换口。

[第十三项]

第一项～第十二项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选单元为主要由细胞分选膜及膜保持结构体构成的容器状结构体，且所述膜保持结构体的被细胞分选膜覆盖的开口部的周边底面部为具备朝向所述开口部且朝上方的倾斜的形状。

[第十四项]

第一项～第十三项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选培养增殖容器为：

(G)具备一个以上能多阶段地进行第一次培养后的增殖培养的增殖培养用单元而成的细胞分选培养增殖容器，且

(g-1)所述增殖培养用单元为容器状结构体，(g-2)具备能培养由上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽，(g-3)在该容器状结构体的内部具有能装载或收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构；(g-4)在构成该容器状结构体的面具有能将保持于该容器内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构。

[第十五项]

第一项～第十四项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，形成于所述细胞分选膜的微细孔的平均尺寸为1～20μm，该细胞分选膜的开孔率为5～50％。

[第十六项]

第一项～第十五项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，形成于所述细胞分选膜的微细孔在垂直于和/或大致垂直于膜表面的方向开孔。

[第十七项]

第一项～第十六项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，形成于所述细胞分选膜的微细孔的一部分或全部排列为格子状、大致格子状、交错状、大致交错状、漩涡状、大致漩涡状、同心圆状、大致同心圆状、或将它们组合的形状。

[第十八项]

第一项～第十七项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选膜在由疏水性聚合物构成的基材层的表面具有共价键结有亲水性聚合物的结构。

[第十九项]

第一项～第十八项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选膜：

在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有共价键结有选自羟基、羧基及包含这些官能团的化合物结构中的一种以上的结构；和/或

在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有对应于该疏水性聚合物的良溶剂的不溶层。

[第二十项]

第一项～第十九项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，通过在培养时表现细胞粘接性且因刺激应答而表现细胞剥离作用的分子，在所述第一次培养用培养面的表面和/或所述增殖培养用培养面的表面进行了表面修饰。

[第二十一项]

根据第二十项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述表现细胞剥离作用的分子是作为下限临界温度的相转移温度为15℃～35℃的温度应答性聚合物分子。

[第二十二项]

第一项～第二十一项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述第一次培养用培养面和/或所述增殖培养用培养面：

[第二十三项]

第一项～第二十二项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，构成所述细胞分选培养增殖容器的结构体：

[第二十四项]

第一项～第二十三项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选培养增殖容器为用于主动分选干细胞并使其增殖的容器。

[第二十五项]

一种细胞分选培养增殖方法，其特征在于，使用第一项～第二十四项中任一项所述的细胞分选培养增殖容器。

[第二十六项]

根据第二十五项所述的细胞分选培养增殖方法，其中，作为分选增殖对象的细胞而包含干细胞。

发明效果

本发明可提供一种用于从组织、细胞群体将所期望的细胞高效地分选并培养增殖的技术，其操作简便且廉价，可稳定地实施。例如，可提供一种将干细胞高效地分选并增殖培养的技术。

附图说明

图1为实施例1所制造的细胞分选培养增殖容器的分解立体图。

图2为表示对于实施例1所制造的细胞分选培养增殖容器组装了所有单元后的容器整体的立体图。

图3为对于实施例1所制造的细胞分选培养增殖容器除去了主体盖状部的状态下的纵剖面图。

图4为表示对于实施例1所制造的细胞分选培养增殖容器进行了实施例2的细胞分选工序后的操作概略的立体图。

图5为表示对于实施例1所制造的细胞分选培养增殖容器进行了实施例2的第一次培养工序后及细胞剥离工序的操作概略的立体图。

图6为表示对于实施例1所制造的细胞分选培养增殖容器进行了实施例2的增殖培养工序前的操作概略的立体图。

图7为表示本发明的细胞分选工序的一方案的模式图。

图8为表示本发明的第一次培养工序的一方案的模式图。

图9为表示本发明的细胞剥离工序的一方案的模式图。

图10为表示本发明增殖培养工序的一方案的模式图。

图11为在进行了实施例2的细胞分选增殖培养后的各工序中拍摄细胞的显微镜照片的照片图像。图11A：在细胞分选工序后立即拍摄第一次培养用培养面上的细胞的照片图像。图11B：在第一次培养工序后，拍摄第一次培养用培养面上增殖的细胞的照片图像。图11C：在细胞剥离工序后，拍摄第一次培养用培养面上浮游的细胞的照片图像。图11D：在增殖培养工序后，拍摄增殖培养用培养面上增殖的细胞的照片图像。

图12为在实施例3(1)的细胞分选膜的结构评价中用扫描型电子显微镜(SEM)拍摄本实施例细胞分选膜的表面微细结构的照片图像。左图的照片左下的标尺(bar)表示50μm。右图的照片左下的(bar)表示10μm。

图13为在实施例3(1)的细胞分选膜的结构评价中用扫描型电子显微镜(SEM)拍摄以往方法制造的PE膜的表面微细结构的照片图像。照片下的标尺(bar)表示200μm。

图14为在表示实施例3(2)的细胞分选膜的功能评价中培养后的对于细胞分选膜的细胞未粘接面积率的图。

图15为在实施例3(2)的细胞分选膜的功能评价中将培养后的细胞分选膜表面吉姆萨(Giemsa)染色并拍摄的显微镜照片图像。各照片的右下标尺(bar)表示200μm。

图16为表示在实施例4的第一次培养用培养面的细胞剥离作用评价中低温处理前后的细胞剥离率的图。

图17为在实施例4的细胞分选膜的功能评价中拍摄低温处理前后的第一次培养用培养面的状态的显微镜照片图像。

图18为表示在本发明的细胞分选培养增殖容器中可吸出/注入第一次培养用容器内的培养基的容器结构的一方案的模式图。

图19为表示对于实施例6所制造细胞分选培养增殖容器组装所有单元后的容器整体的立体图。

图20为表示对于实施例6所制造细胞分选培养增殖容器所配设的转动调节机构的结构的图。图20A：具备调节部的环状结构构件(扣锁环)的俯视立体图。图20B：表示环状结构体上的调节部与主体盖状部的扣突起部的嵌合状态的结构模式图。

图21为表示对于实施例6所制造细胞分选培养增殖容器进行了细胞分选增殖培养后的各工序中的容器状态的结构图。图21A：表示进行细胞分选工序及第一次培养工序时的容器状态的图。图21B：表示进行第一次培养工序及细胞剥离工序而使细胞悬浮液从主体容器侧流出时的容器状态的图。该图中的方向朝上的箭头表示第一次培养容器上部结构体(及释放结构闭塞构件)的朝上方的移动。另外，该图中的方向朝左右的箭头表示细胞悬浮液从第一次培养用容器到主体容器侧的移动。图21C：表示进行增殖培养工序时的容器状态的图。该图中的方向朝上的箭头表示第一次培养容器下部结构体(第一次培养容器的整体)的朝上方的移动。

图22为对于实施例8中对培养基材进行等离子处理而制造的培养用平板构件随时间推移拍摄干细胞的培养状态的显微镜照片图像。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式详细说明，但不限定本发明。以下的说明中的符号编号意指附图中使用的符号编号。

[用语等的说明]

在本说明书中，“上一阶段的培养用单元”是指前一阶段的培养用单元。例如由主体容器单元来看，在未使用增殖培养用单元的方案的情况下，第一次培养用单元为上一阶段的培养用单元。另外，在使用增殖培养用单元的方案的情况下，前一阶段的增殖培养用单元为上一阶段的培养用单元。

另外，在本说明书中，“具有下一阶段的培养面的单元”是指后一阶段的培养用单元。例如由第一次培养用单元来看，在未使用增殖培养用单元的方案的情况下，主体容器单元为具有下一阶段的培养面的单元。另外，在使用增殖培养用单元的方案的情况下，下一个增殖培养用单元为具有下一阶段的培养面的单元。

在本说明书中，附有“大致”的图形、形状、排列状态及角度等表述是指允许添加一些变化等的图形等。

例如，在本说明书中，附有“大致”的角度或方向的表述是指相对于对象角度或方向为±10°以内，优选±5°以内，进一步优选±2°以内的角度或方向。

另外，在本说明书中，若附有“大致”的图形、形状及排列等为圆等的情况是指允许圆周部分为稍微扭曲的形状、长圆或椭圆等变形图形。另外，若为角形等的情况是指可允许角相对于对象图形为带有圆的形状、外围为稍微扭曲的形状等变形图形。另外，为格子状等的排列状态的情况也同样允许排列构成要素所形成的图形等的变形。

1.细胞分选培养增殖容器

本发明涉及一种能密闭的细胞分选培养增殖容器(1)，其为能将所期望的对象细胞分选并培养增殖的容器状结构体，其含有细胞分选单元(2)、第一次培养用单元(3)及主体容器单元(4)而构成。此处，对构成本发明细胞分选培养增殖容器(1)的主要构件的构成构件的属性进行了整理的表如下所示。

需要说明的是，表1为对各构成构件的属性进行了整理的表，并非表示必须构件。根据此点，本发明的技术范围不限定于包含所有表1所述的构件的方案。

[表1]

[细胞分选单元]

本发明的细胞分选培养增殖容器(1)为具备细胞分选单元(2)而构成的容器状结构体。

本发明的细胞分选单元(2)为用于经由细胞分选膜(11)在第一次培养用单元(3)的容器状结构体侧将所期望的对象细胞(101)分选的单元。

细胞分选单元(2)为具备具有能分选细胞的微细孔的细胞分选膜(11)而成的结构体。详细而言，细胞分选单元(2)为容器状结构体，为在构成所述容器状结构体的面的至少一部分具备细胞分选膜而成的结构体。

作为细胞分选单元(2)的结构，更详细而言，为主要由具有能分选细胞的微细孔的细胞分选膜(11)及膜保持结构体(13)构成的容器状结构体，为具备可注入液体的开口部(14)及能经由细胞分选膜流出液体的开口部(15)的结构体。

通过该结构，细胞分选单元成为在细胞分选工序中发挥主要功能的构件。需要说明的是，作为构成细胞分选单元的构件，只要不损害本发明的细胞分选培养增殖容器的功能，允许包含细胞分选膜及膜保持结构体以外的构件。

另外，在本发明中，细胞分选单元优选为与第一次培养用单元等可自由地装卸的方案。

细胞分选膜

细胞分选膜(2)具备细胞分选膜(11)作为在细胞分选工序中发挥主要功能的构件。

细胞分选膜(11)为具有能分选细胞的微细孔的膜状结构体。该微细孔为用于使所期望对象的分选细胞透过而形成的孔(小孔)，作为细胞透过孔(12)发挥功能。

优选的是，在细胞分选膜的实施细胞分选的膜区域中，不存在尺寸比该微细孔大的孔。

在制造本发明的细胞分选膜(11)的情况下，为了使为细胞透过孔的微细孔(12)的尺寸、开孔率、规则排列性及开孔角度等在以下所述的优选范围下实施，优选的是，根据WO2014/171365公报的记载，通过制成微细模具的印刷中(imprinting)法进行。

需要说明的是，在通过现有技术的重粒子线等的照射进行随机开孔的情况下，无法制造这种结构的细胞分选膜。

作为细胞透过孔的微细孔(12)的尺寸，可根据作为对象的细胞的尺寸选择适合的尺寸。例如，作为形成于细胞分选膜的微细孔的平均尺寸(在横截面为圆形的情况下为平均内径)，可列举1～20μm，优选2～15μm，更优选3～10μm。特别优选的是，在干细胞的分选中为3～10μm的范围。

作为细胞透过孔的微细孔(12)的形状，虽可采用相对于膜面的水平截面为圆形、大致圆形、椭圆形、四角形、顶点数为5以上的多角形等任意形状的孔，但优选为圆形、大致圆形、六角形等。

作为细胞分选膜(11)的开孔率，可列举4～50％，优选5～40％，更优选5～20％。开孔率越高，则所期望的对象细胞可越高效地通过细胞分选膜，而使细胞分选所需时间缩短，因此优选。

作为细胞透过孔的微细孔(12)，优选处于在膜面具有规则性地排列的状态。具体而言，微细孔的一部分或全部优选排列为格子状、大致格子状、交错状、大致交错状、漩涡状、大致漩涡状、同心圆状、大致同心圆状、或将它们组合的形状。优选的是，微细孔的全部具有规则性地排列。

另外，作为细胞透过孔的微细孔(12)，优选的是，在垂直和/或大致垂直于膜表面的方向开孔。此处，大致垂直具体是指：相对于膜表面的垂直方向为±10°以内，优选±5°以内，更优选2°以内的角度。

需要说明的是，在不使用本发明的细胞分选膜的结构等而采用将微细孔随机配置的现有技术的膜的情况下，细胞的平均移动距离各不相同，分选时间容易产生不一致，因此不优选。另外，在作为分选对象的细胞的含有率低或细胞对损伤脆弱的情况下，可能使到达微细孔的细胞显著减少，因此不优选。

另外，在随机开口的微细孔彼此重叠的情况下，孔的尺寸也可使分选对象的细胞以外的物质通过，细胞种类的选择性降低，因此不优选。

作为细胞分选膜(11)，优选的是，膜厚度为0.05～100μm，优选0.5～50μm，更优选1～30μm。在该膜厚度过厚的情况下，对象细胞通过细胞透过孔将需要时间，有分选时间变长的倾向，因此不优选。另外，对象细胞通过细胞透过孔时的刺激等也有变多的倾向，因此不优选。特别是，在对于外在刺激敏感的干细胞的分选中，为了得到良好质量的细胞，膜厚度优选在适当的范围内。

细胞分选膜(11)的滤器外形只要是可充分确保细胞分选面的面积的尺寸及形状，就没有特别限制。例如，可采用外径为2～50mm，优选为3～20mm的圆形滤器。

作为细胞分选膜(11)，优选为基材层主要由疏水性聚合物构成的细胞分选膜。

作为构成基层材的材质的疏水性聚合物，优选的是，例如为PE(聚乙烯)、PET(聚对苯二甲酸乙二酯)、聚碳酸酯、聚砜、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚酰胺、PLA(聚乳酸)等。优选为PE、PET。

作为本发明的细胞分选单元(2)，能将与细胞分选膜(11)不同的滤器状结构体以多层或积层配设于细胞分选膜。

此处，滤器状结构体只要由不损害细胞分选膜的功能的结构及材质构成，就可没有特别限制地使用滤膜或滤器等。另外，虽然材质、间隙尺寸以及厚度等可没有特别限制地使用，但优选使用对于所期望的对象细胞的移动效率或刺激应答等不造成较大影响的结构。

作为滤器状结构体的配设位置，在配设于细胞分选膜的分选前细胞悬浮液测的情况下，可作为预滤器使用。另外，在配设于第一次培养用单元侧的情况下，可作为细胞分选膜的支持构件使用。进而，也可为配设于细胞分选膜的两面的方案。

另外，该滤器状结构体也可为与细胞分选膜一体化的复合膜结构体的方案。

亲水性聚合物的膜表面修饰

作为细胞分选膜(11)，优选的是，所述基材层的表面具有共价键结有亲水聚合物的结构。

此处，在细胞分选膜的基材层表面经亲水性聚合物修饰的方案中，细胞分选膜作为发挥细胞非粘接性的作用的膜而成为表面特性经改性的膜构件。由此，可降低细胞分选工序中对象细胞于细胞分选膜的附着损失，大幅提升对象细胞回收率。

另外，由于细胞分选膜的基材层表面与亲水性聚合物的键结处于与以培养液等的水为主成分的液体接触的状态，因此优选为在不溶于水的状态下的键结。

作为用于本发明的细胞分选膜(11)的基材层的表面特性改性的亲水性聚合物，能使用选自乙烯吡咯烷酮系聚合物、乙二醇系聚合物及乙烯醇系聚合物构成的组中的一种以上。

作为乙烯吡咯烷酮系聚合物，可列举聚乙烯吡咯烷酮、乙烯吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物、乙烯吡咯烷酮-乙二醇共聚物、乙烯吡咯烷酮-苯乙烯共聚物、乙烯吡咯烷酮-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物、它们的改性聚合物等。乙二醇系聚合物可列举聚乙二醇等，也包含侧链含酯基的物质。乙烯醇系聚合物可列举聚乙烯醇等，依据皂化程度也可包含各种种类。

特别是，可优选列举聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮/聚醋酸乙烯酯共聚物等。

这些亲水性聚合物优选为水溶性倾向强的聚合物。因此，优选使用例如数均分子量为1万～100万的聚合物，但是只要有水溶性，就不受这样的分子量的限定。

就用于细胞分选膜(11)的基材层的表面改性的表面分子修饰处理而言，为了避免孔的闭塞或有机溶剂的残留等疑虑，可列举将基材层浸渍于含有水溶性单体、低聚物或聚合物的溶液中，照射高能量线照射的方法(WO2012/058637号公报)。另外，在对基材层照射高能量线，然后浸渍于含有水溶性单体、低聚物或聚合物的溶液的情况下，水溶性单体、低聚物或聚合物也能通过游离基进行共价键结。

在该共价键结法中，在疏水性单体、低聚物或聚合物构成的基材层表面，能使所述亲水性聚合物共价键结而实现表面分子修饰。

作为该共价键结法的表面分子修饰处理所使用溶液中的水溶性聚合物浓度，可列举10ppm以上，优选100ppm以上，更优选500ppm以上，进一步优选1000ppm以上。此处，在浓度过高的情况下，有微细孔闭塞的疑虑。因此，作为上限，优选为20000ppm以下，更优选为10000ppm以下。

在该表面分子修饰处理中，在构成基材层的疏水性聚合物的吸水率为2％的情况下，优选的是，在该表面分子修饰处理所用溶液中添加醇类。

在此，作为醇类的浓度，可列举：相对于溶液为0.05～5wt％，优选为0.1～1wt％。另外，作为醇类，从安全性的观点考虑，优选使用乙醇。

作为照射的高能量线，能使用紫外线、电子束、γ射线等。从反应效率高的观点考虑，优选使用电子束或γ射线。

作为照射剂量，优选为5～35KGy。特别是，通过照射视为灭菌剂量的25KGy左右的剂量，可同时进行膜表面修饰及灭菌，因此优选。

等离子处理的膜表面修饰

作为细胞分选膜(11)，能通过进行等离子处理直接使疏水性基材层表面亲水化，作为细胞分选膜而具备优选的特性。作为等离子处理的方案，可列举真空等离子处理或大气压等离子处理，但优选真空等离子处理。

在进行该等离子处理的方案中，细胞分选膜作为起到细胞非粘接性的作用的膜而成为表面特性经改性的膜构件，因此细胞分选工序中对象细胞对细胞分选膜的附着性降低，可大幅提升对象细胞回收率。

就进行该等离子处理所的得细胞分选膜而言，在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有共价键结有选自羟基、羧基及包含这些官能团的化合物结构中的一种以上的结构；和/或，在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有对应于该疏水性聚合物的良溶剂的不溶层。作为具体的方案，具有共价键结有羟基和/或羧基的结构。

此处，在真空等离子处理进行等离子处理的方案中，通过选定导入的气体，可精细地控制导入到表面附近的官能团。

作为由进行该等离子处理的方案所得的细胞分选膜的表面特性，可列举表示由接触角70°以下，优选60°以下，更优选50°以下所示的亲水性的特性。

作为细胞分选膜的表面特性，若表面为超亲水性的情况下，也会发挥阻碍细胞附着的性质，因此作为接触角的下限在原理上没有特别限制，作为实际的实施方式，可列举例如该值在约5°以上。

已知：在进行该等离子处理的方案中，会产生表面蚀刻，在表面附近形成羟基、羧基，因此产生随时间推移的劣化。但是，对疏水性基材层的表面进行低能量下的电压施加处理。作为施加的电压条件，例如，可列举0.01kV以上，优选0.05kV以上，更优选0.1kV以上，进一步优选0.5kV以上。施加电压越高，则表面的亲水化处理越易进行，因此优选。施加电压的上限虽没有特别限制，但越是低能量状态下越可抑制减少表面蚀刻，因此优选10kV以下，优选5kV以下。

特别是，在低施加电压下的处理中，可在膜表面附近优选地形成也不被一般可溶的溶剂(例如丙酮)溶解的层。该层被认为是抑制表面蚀刻并形成交联层的表面结构，可发挥使等离子处理效果长期持续的效果。

在进行该等离子处理的方案中，可制造疏水性基材层的表面经均匀地亲水化的细胞分选膜。另外，与γ射线照射等高能量射线处理相比，该制造方案所制造的细胞分选膜的表面蚀刻极少，因此成为在表面附近形成交联层且随时间推移的劣化少的细胞分选膜。

另外，该等离子处理也能与其他膜处理技术并用。例如，可在疏水性基材层的一个面进行该等离子处理而亲水化，在另一面进行高能量射线处理等。

膜保持结构体

细胞分选单元(2)为在构成膜保持结构体(13)的容器的面的至少一部分覆盖细胞分选膜(11)而构成的结构体。

此处，膜保持结构体(13)为在细胞分选单元中构成容器状结构体的容器部分的构件，为用于物理性保持细胞分选膜的支持构件。另外，膜保持结构体(13)具有在具备细胞分选膜的状态下能将液体注入及填充至细胞分选单元内的容器状结构，具有能使该填充的液体通过细胞分选膜的结构。

作为该结构体，例如可为筒状、大致筒状、管状、方体状、大致方体状、球状、大致球状、圆锥状、大致圆锥状、角锥状、大致角锥状、分支状、杯状(cup)、大致杯状、碟状、大致碟状、及将它们组合的结构体等，只要满足上述基本结构，就可采用各种变化的形态。

作为构成膜保持结构体(13)的材质，优选具有能物理性保持细胞分选膜的强度的材质。另外，除了用于细胞分选膜的夹持的构件(17)等以外，优选为具有透光性的材质。特别是，在不开封主体容器单元(4)而进行显微镜观察的情况下，对于在配设于与细胞分选培养容器(1)所具备的培养面对向或大致对向的位置的该结构体(13)的构成部分，优选为具有透光性的材质。此处，对向方向或大致对向方向的构成部分是指优选为相对于培养面朝向上部侧的结构部分。

作为具有透光性的材质，虽也可采用玻璃制的材质，但优选为无色、透明度高且具有操作便利性的树脂制的材质。例如，可使用聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基戊烯、透明ABS树脂等材质。

作为膜保持结构体(13)，具备至少一个可注入液体至该结构的一部分的结构。作为该结构，只要是能将液体注入膜保持结构体的内侧的结构，就可采用任意结构。例如，优选的是具有开口形状的开口部(14)这样的结构。针对该开口部的开口形状，虽没有特别限制，但优选使用圆形、大致圆形、椭圆形、4以上的多角形。

作为该开口部(14)的形成位置，优选设计于比注入于膜保持结构体内液体的液面更上侧的位置。具体而言，可列举如膜保持结构体的侧面及上表面，但优选为上表面。需要说明的是，在膜保持结构为上表面与侧面没有区别的形状的情况下，优选比注入的液体液面更上侧的位置。

作为该具体方案的一例，例如，在膜保持结构体为筒状形状的情况下，筒状的一端可作为开口部(14)。

膜保持结构体(13)为容器状结构体，优选具有能将注入的液体保持于内部的适度的容积。

此处，作为该容积，优选根据细胞分选膜的尺寸决定。例如，在细胞分选膜外径为6mm的情况下，优选容积可暂时保持的液体的液量为10～2000μL，优选50～1000μL，更优选100～500μL。

膜保持结构体(13)在构成该结构体的面的至少一部分具有细胞通过用的开口部(15)，具有该开口部被细胞分选膜(11)包覆的结构。

作为该开口部(15)的形成位置，优选设计为比注入于膜保持结构体内液体的液面更下侧的位置。具体而言，可列举膜保持结构体的侧面及底面，但优选为底面。需要说明的是，在膜保持结构为底面与侧面没有区别的形状的情况下，优选为比注入的液体液面更下侧的位置。即，作为本发明的细胞分选单元(2)，优选为在膜保持结构体的底面具备细胞分选膜的结构。

作为该具体方案的一例，例如，在膜保持结构体为筒状形状的情况下，筒状的一端可作为开口部。

该开口部(15)通过被细胞分选膜包覆，能使膜保持结构体所保持的分选对象细胞(101)或液体培养基经由细胞分选膜移动至第一次培养用单元(3)侧。

作为膜保持结构体(13)的一端物理性保持细胞分选膜(11)的方法，虽没有特别限制，可列举例如通过两个结构构件将细胞分选膜物理性夹持的方法等。

作为该方法，具体而言，可列举具备与膜保持结构体的底面部(16)卡合的结构的环结构体(17)。在此情况下，该环结构体可为与膜保持结构体呈物理性结合的状态的构件，也可为另行分离的构件。

此处，环结构体(17)为具有环状的开口部(18)的构件。通过该开口部(18)，能使膜保持结构体所保持的分选对象细胞(101)或液体培养基移动至第一次培养用单元(3)侧。

在将膜保持结构体(13)、细胞分选膜(11)、及环结构体(17)层叠的情况下，开口部(15)及开口部(18)优选变为经由细胞分选膜连通的重叠状态。

通过该构件结构，实现了膜保持结构体的底面部与环结构体之间夹持有细胞分选膜的结构。

需要说明的是，在使用环结构体(17)的方案的情况下，对于膜保持结构体侧的底面部，优选为也具有与环结构体卡合或嵌合的结构。此处，作为卡合或嵌合的结构，虽没有特别限制，例如可列举爪状结构、法兰(flange)结构、或与它们嵌合的凹型结构等。

作为膜保持结构体(13)的形状，只要满足上述基本结构，就可采用各种变化的形态。

例如，可设为采用分支结构而具备两个以上的细胞分选膜的结构体。另外，也可设为具备两个以上的注入或填充细胞的侧的结构体。另外，也可设为筒状结构具备一个以上分支筒或管的形状。

另外，也可设为使筒状结构体的筒弯曲的筒状。另外，也可设为筒径阶段性变化的形状。

作为本发明的膜保持结构体(13)的一方案，更具体而言，可列举筒状结构体。此处，筒状结构体是指具有筒的两端连通而成的形状的结构体。

此处，作为筒状形状，可列举筒的横截面为圆形状、大致圆形状、椭圆状、四角形状、大致四角形状、多角形状、大致多角形状等任意截面形状。优选的是，横截面为圆形状或大致圆形状，作为膜保持结构体优选为圆筒形状或大致圆筒形状。

另外，横截面的长轴长(圆形状的情况下为内径)可列举为4～80mm者，优选为4～24mm。

在采用该筒状结构体的形状的情况下，可列举筒状结构体的一端被细胞分选膜包覆的结构。在此情况下，为如下方案：注入于筒状结构的内部的液体通过细胞分选膜而移动至第一次培养用单元。

与第一次培养用单元连接部

作为本发明的细胞分选单元(2)，虽未排除与第一次培养用单元(3)一体化的结构体的方案，但优选为具有能与第一次培养用单元侧的第一次培养容器(21)装卸的结构的方案。在取出细胞分选单元的方案中，可从露出的开口部(23)容易地进行培养基交换等操作。

具体而言，优选的是，在第一次培养容器(21)填充液体时，在细胞分选单元的细胞分选膜(11)的膜面与第一次培养容器内所填充的液体的液面接触的状态下，能够与第一次培养容器(21)配设的结构。

此处，“膜面与液面接触的状态”是指，不仅包含细胞分选膜的膜面与第一次培养容器内所填充的液体的整体的液面均接触的状态，也包含膜保持结构体的外侧浸渍于第一次培养容器内的液体而使该膜面与液体接触的状态。另外，作为该配设状态，除了将两构件固定或连接的状态外，也包含卡合或装载等配置状态。

作为细胞分选单元(2)，优选为在膜保持结构体的底面(16)具备细胞分选膜(11)的结构体。具体而言，优选为细胞分选膜所形成的面为膜保持结构体的底面的一部分。

此处，理想的是，细胞分选膜(11)的膜面与第一次培养用单元的液体的液面可实现在不含气泡的状态下接触的状态。

气泡防止结构

在本发明的膜保持结构体(13)中，作为与第一次培养用单元(3)的连接部分的结构，在进行与第一次培养用容器进行连接或装载配置等的情况下，优选为具备可防止气泡进入细胞分选膜的膜面的结构。

作为该气泡防止结构，可采用任意形态，但例如可采用如下形状：所述膜保持结构体的被细胞分选膜包覆的开口部(15)的周边底面部(16)具备朝向所述开口部(15)且朝上方的倾斜的形状。

另外，对于膜保持结构体的底面(16)，理想的是，例如设为具备朝向开口部(15)且朝上方的倾斜的形状。此处，作为倾斜，倾斜角度可为固定，也可为角度有变化。从防止气泡的观点考虑，理想的是，倾斜角度优选为1～10°，进一步优选为1～5°。

与主体盖状部的卡合部

膜保持结构体(13)优选具有能与主体盖状部(56)连动而调整细胞分选单元(2)的细胞分选膜(11)的位置的结构。作为该方案的一例作为膜保持结构体(13)与主体盖状部为可连接的结构，可列举如下结构：通过转动主体盖状部，使膜保持结构体分离或转置，可改变细胞分选膜的膜面的位置。例如可采用如下结构：通过主体盖状部的转动，使细胞分选膜的膜面的位置上浮到上侧。

作为与主体盖状部的连接部，优选的是，在膜保持结构部的上部设置与主体盖状部卡合或嵌合的机构。

[第一次培养用单元]

本发明的细胞分选培养增殖容器(1)为具备第一次培养用单元(3)而构成的容器状结构体。

第一次培养用单元(3)为如下容器状结构体：具有能培养通过了所述细胞分选膜的细胞的第一次培养用培养面，具有能将保持于该单元内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构。详细而言，第一次培养用单元(3)：i)为容器状结构体；ii)具有：在将液体填充于该容器状结构体内时，能以细胞分选膜面(11)与填充的液面接触的状态配设所述细胞分选单元(2)的结构；iii)在构成该容器状结构体的面的至少一部分具有能培养通过了细胞分选膜的细胞的第一次培养用培养面(27)；iv)在构成该容器状结构体的面具有能将保持于容器内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧(4、5)的结构。

通过该结构体，第一次培养用单元(3)可作为如下容器发挥功能：进行对细胞分选单元所分选的细胞进行用于作为主培养的增殖培养的预培养。需要说明的是，作为构成第一次培养用单元的构件，只要不会损害本发明细胞分选培养增殖容器(1)的功能，就允许包含第一次培养用容器以外的构件。

需要说明的是，在本发明中，第一次培养用单元优选为可自由与细胞分选单元、增殖培养用单元、主体容器单元等装卸的方案。

第一次培养用容器

第一次培养用单元(3)为主要由第一次培养用容器(21)构成的容器状结构体。第一次培养用容器(21)具备确保上述第一次培养用单元所具有的功能的结构及性质。

作为构成第一次培养用容器(21)的材质，除了构成O型环等弹性构件(29)的构件等外，优选为具有透光性的材质。特别是，在不开封主体容器单元(4)而进行显微镜观察的情况下，对于形成第一次培养用培养面(27)的容器面，优选为具有透光性的材质。另外，对于位于与第一次培养用培养面对向或大致对向的位置的容器结构，也优选为具有透光性的材质。此处，对向方向或大致对向方向的容器结构是指优选为培养面的上部侧的容器结构。

作为具有透光性的材质，虽可采用玻璃制，但优选透明度高且具有操作便利性的树脂制的材质。例如可使用聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基戊烯、透明ABS树脂等材质。特别是，培养面可适当使用聚苯乙烯或PET等适合培养细胞的增殖的原材料。

第一次培养用容器(21)为可保持液体的容器状结构体。作为该容器状部分的形状，若为可发挥如上那样的第一次培养用容器的功能的结构构件，则可采用任意形状。

作为容器状部分的结构，可采用各种形状或尺寸的结构，但只要是细胞分选单元(2)所分选的细胞的细胞浓度不会过于稀薄且可形成一定程度的细胞层片或细胞群体的形状及尺寸，就可采用各种形状或尺寸。

作为该容器状部分的形状，具体而言，可为筒状、大致筒状、管状、方体状、大致方体状、球状结构体、圆锥状、大致圆锥状、角锥状、大致角锥状、分支状、杯状(cup)、大致杯状、碟状、大致碟状、及将它们组合的结构体等，只要满足上述基本结构，就可采用各种变化的形态。

作为该容器状部分的尺寸，优选的是，使用作为下述段落所述的第一次培养用培养面(27)可采用的面积。例如，虽也取决于细胞分选膜(11)的面积，但优选为使用10～400cm²。

另外，该容器状部分的容积，若为能将适于第一次培养的一定量的液体培养基保持的容积即可，例如，优选为可保持6～280mL的液体的容器。

中空管状构件插入/插出结构

作为第一次培养用容器(21)，优选容器状结构体的容器壁面具备能将中空管状构件(121)插入/插出的结构(34)。

此处，第一次培养用容器的中空管状构件插入/插出结构(34)为如下结构：用于不开封主体容器单元(4)也能实现细胞分选膜(11)与第一次培养用容器内的液面的接触断开。

需要说明的是，在第一次培养用容器的中空管状构件插入/插出结构(34)为第一次培养用容器的上方部分原本具有开放部分的方案的情况下，在为不需配设特殊结构的结构时，在第一次培养用容器的上部有顶板的结构的情况下，该结构的配设为优选方案。

此处，中空管状构件(121)是指内部为空洞且能使用外部侧的吸引机构(柱塞或减压器具)吸出或注入液体的机构。从确保插入容器内时的主体容器单元的中空管状构件插入/插出结构(60)的气密性观点考虑，优选外径为0.2～2.2mm左右。具体而言，优选使用注射针、套管(cannula)、管(tube)、管道(pipe)状管等。顶端部分优选为锐利的中空针状。更优选使用14～33针号(gauge)，进一步优选使用18～25针号等的注射针。

第一次培养用容器的中空管状构件插入/插出结构(34)为如下结构：用于能经由中空管状构件(121)进行第一次培养用容器内所填充液体的吸出或注入的液体交换。作为该结构，可采用可插入/插出中空管状构件(121)的形状及尺寸的开口结构。

此处，第一次培养用容器的该中空管状构件插入/插出结构(34)不需要具备由能保持气密性的弹性构件形成的结构，可仅采用开口结构。另外，也能与主体容器单元的中空管状构件插入/插出结构(60)同样地采用主要由可保持气密性的弹性构件构成的结构。

作为第一次培养用容器的中空管状构件插入/插出结构(34)的配设位置，优选为配设于如下位置的结构：能经由从主体容器侧的中空管状构件插入/插出结构(60)插入的中空管状构件(121)将填充于第一次培养用单元内的液体吸出的位置。优选的是，配设于第一次培养用容器的上方部分或所填充的液面的上方的侧面部分。

具体而言，优选配设于如下位置：将主体容器单元侧的中空管状构件插入/插出结构(60)与填充于第一次培养用单元内的液面连结而成的线的位置，为了使从主体容器单元(4)侧插入的中空管状构件(121)不贯通细胞分选膜(11)也能进入到填充于第一次培养用单元内的液体。

特别是，第一次培养用容器的中空管状构件插入/插出结构(34)和主体容器单元侧的中空管状构件插入/插出结构(60)优选配置为：垂直或大致垂直于填充于第一次培养用单元内的液面。

第一次培养用培养面

第一次培养用容器(21)为在构成容器状结构体的面的至少一部分具有能培养通过了细胞分选膜(11)的细胞的第一次培养用培养面(27)的容器状结构体。

第一次培养用培养面(27)优选为第一次培养用容器(21)的底部所具备的结构，但也可为将底面以外的容器侧面等一同作为该培养面的方案。另外，也可为将多个第一次培养用培养面设置于第一次培养用容器内的方案。例如，可为将底面分割或划分为两个以上的区域而分别作为培养面的方案。另外，除了底面以外，也可为将侧面等设为第一次培养面的方案。

另外，作为第一次培养用培养面，虽也可为面弯曲或具有曲率的曲面形状的培养面，但优选为平面形状或大致平面形状。特别优选的是，培养面为平坦的平面形状。

作为第一次培养用培养面(27)的结构，虽然可采用各种形状或尺寸的结构，但优选采用细胞分选单元(2)所分选细胞的细胞浓度不会过于稀薄且可形成一定程度的细胞层片或细胞群体的形状或尺寸的结构。

作为该培养面的形状，具体而言，可采用圆形、大致圆形、四角形、大致四角形、角形、大致角形、去角的多角形等形状。优选为圆形形状等的培养面。

作为该培养面的尺寸，例如优选使用10～400cm²的尺寸。

第一次培养用培养面(27)能将第一次培养用容器(21)的基材的内侧本身作为培养面。另外，第一次培养用培养面也可设为如下结构体：除了构成容器的面以外，具备平板状构件作为培养面的结构。在此情况下，作为该第一次培养用培养面(27)的平板状构件成为构成第一次培养用容器(21)的构件的一部分。

作为第一次培养用培养面(27)的平板状构件例如可层叠配置于构成第一次培养用容器的底面等。另外，也可设为嵌入该平板状构件嵌入的结构来取代容器底面本身。另外，作为与底面之间设有空隙的结构，也可形成两段以上的培养面。

作为平板状构件的形状及尺寸，可采用与上述培养面的形状及尺寸同样的条件。

具有刺激应答性细胞剥离作用的分子的表面修饰

作为本发明的第一次培养用培养面(27)的表面，优选的是，通过在培养时表现细胞粘接性且因刺激应答表现细胞剥离作用的分子进行了表面修饰。即，在该方案下，该培养面的表面施加了具有刺激应答性细胞剥离作用的分子修饰，表面特性被改性。

此处，刺激应答性优选是指：可对不开封本发明的主体容器单元(4)也可赋予的刺激(对光、温度等)有应答的性质。具体而言，优选的是，施加具有光反应性或温度应答性等刺激应答性细胞剥离作用的分子修饰。

在本发明中，作为在培养时表现细胞粘接性且因刺激应答表现细胞剥离作用的分子，例如优选使用温度应答性聚合物。在该方案中，进行了以培养时表现疏水性倾向且因温度反应急剧表现亲水性倾向的方式变化的分子修饰。

在使用温度应答性聚合物作为表面修饰分子的情况下，优选使用作为下限临界温度(LCST)的相转移温度低于分选对象的细胞培养温度且在适合细胞生存的温度区域的聚合物分子。作为该相转移温度，为了使细胞损伤、刺激少，可列举15～35℃，优选为20～35℃，更优选为22～30℃。

作为该温度应答性聚合物的构成单位，具体而言，可列举：N-n-丙基丙烯酰胺(LCST21℃)、N-n-丙基甲基丙烯酰胺(LCST27℃)、N-四氢呋喃甲基丙烯酰胺(LCST约28℃)、N-异丙基丙烯酰胺(LCST32℃)、N,N-二乙基丙烯酰胺(LCST32℃)、N-乙氧基乙基丙烯酰胺(LCST约35℃)、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺(LCST约35℃)、甲基乙烯基醚(LCST35℃)等。

作为本发明的温度应答性聚合物，优选采用上述物质的均聚物，也能使用下限临界温度(LCST)符合规定的范围的它们的共聚物。

在将上述温度应答性聚合物作为修饰分子使用而进行第一次培养用培养面(27)的表面改性的情况下，在适于细胞培养的37℃左右表现疏水性倾向，但仅进行低温处理，就能使培养面的表面从疏水性急剧变化为亲水性性质，从而发挥细胞剥离作用。

就对于第一次培养用培养面(27)的基材面的表面分子修饰处理而言，能通过将所述温度应答性聚合物接枝共聚于构成培养面的基材分子，实现表面分子修饰。可以通过利用高能量射线的共价键结法进行对基材分子的共价键结。例如，可以以日本专利3641301号为基准进行。另外，同样地，也可通过等离子处理(优选为真空等离子处理)在表面形成游离基而进行接枝共聚。

等离子处理的表面修饰

作为第一次培养用培养面(27)，能通过进行等离子处理直接将疏水性基材层表面亲水化，使其作为培养面而具备优选的性质。作为等离子处理的方案，可列举真空等离子处理或大气压等离子处理等，优选可列举真空等离子处理等。

已知：在进行该等离子处理的方案中，会产生表面蚀刻并于表面附近形成羟基或羧基，因此通常会发生随时间推移的劣化。但是，在以低施加电压进行该等离子处理的方案中，由于表面蚀刻极，表面附近形成厚的交联层，因此可实现随时间推移的劣化显著减少的培养面。另外，作为细胞进展优异且以可进行细胞粘接的程度发挥适度的亲水性作用的平板构件，为表面特性改性了的培养面。另外，在进行该等离子处理的方案中，可制造疏水性基材层的表面均匀地亲水化的培养面。

进行该等离子处理所得的第一次培养用培养面(27)：在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有共价键结有选自羟基、羧基及包含这些官能团的化合物结构中的一种以上的结构；和/或，在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有对应于该疏水性聚合物的良溶剂的不溶层。作为更具体的方案，具有共价键结有羟基和/或羧基的结构。

作为进行该等离子处理的方案所得的第一次培养用培养面(27)的表面特性，可列举表示由接触角70°以下，优选60°以下所示的亲水性的特性。作为第一次培养用培养面(27)的表面特性，在亲水性过强的情况下，会有细胞粘接本身被损害的倾向，因此接触角优选为10°以上，优选为20°以上，更优选为30°以上。

在进行该等离子处理的方案中，进行以低能量施加电压于疏水性基材层的表面的处理。作为施加的电压条件，根据基材层聚合物原材料的种类而变动，作为一方案，可列举：0.01kV以上，优选0.05kV以上，更优选0.1kV以上，进一步优选0.5kV以上。作为施加电压的上限，由于在电压过高的情况下会影响粘接，因此优选的是，例如5kV以下，优选为3kV以下，更优选为2kV以下。

特别是，在低施加电压下的处理中，可在第一次培养用培养面表面附近优选地形成也不被一般可溶的溶剂(例如丙酮)溶解的层。该层被认为是抑制表面蚀刻并形成交联层的表面结构，发挥使等离子处理效果长期持续的效果。

与细胞分选单元的连接结构

第一次培养用容器(21)为具有如下结构的结构体：在液体填充至该容器构状结构体内时，能在细胞分选膜面(11)与所填充的液面接触的状态下配设所述细胞分选单元(2)。

此处，“膜面与液面接触的状态”是指，不仅包含细胞分选膜的膜面与第一次培养用容器所填充的液体的整体液面均接触的状态，也包含膜保持结构体的外侧浸渍于第一次培养容器内的液体而使该膜面与液体接触的状态。另外，作为该配设状态，除了将两构件固定或连接的状态外，也包含卡合或装载等配置状态。

作为该容器中与细胞分选单元的连接部分的结构体，具体而言，在构成第一次培养用容器的容器面的任一面中，具有与膜保持结构体的细胞分选膜(11)相通的开口部(23)。在该连接部中，形成该开口部(23)与细胞分选单元侧的开口部(15)经由细胞分选膜连通的结构。

作为开口部(23)的形状，可列举一般的孔状开口结构，也可列举开口结构的周边为筒状的结构等。

作为开口部(23)的尺寸，只要能使来自细胞分选膜(11)的液体移动顺利，就没有特别限制，但优选为尺寸比细胞分选膜大。需要说明的是，也不排除尺寸比细胞分选膜小的形状或将该小尺寸组合的形状。

作为开口部(23)，更优选的是，在卸除细胞分选单元(2)的情况下，能经由该开口部进行各工序间的培养基交换操作等的形状。例如，优选的是，最长部分的尺寸为3～50cm，优选为5～30cm左右的开口部。

作为开口部(23)的形成位置，虽没有特别限制，但优选为构成第一次培养用容器(21)的上表面或侧面，且为可在填充液体培养基时使液体培养基面与细胞分选膜(11)接触的位置。优选的是，从细胞回收率或防止气泡的观点考虑，形成在构成第一次培养用容器的基材的上表面。需要说明的是，即使该容器为上表面与侧面没有区别的形状，只要可满足上述上限，就可采用。

优选的是，在开口部(23)周边部具有能与细胞分选单元的细胞分选膜附近的周边部(16)卡合或嵌合的结构。此处，作为卡合或嵌合的结构，虽没有特别限制，但例如可列举爪状结构、法兰(flange)结构、或与它们嵌合的凹型结构等。

优选的是如下方案：在开口部(23)周边部具备用于贮存在与细胞分选单元(2)连接或装载等的操作时溢出的培养基的培养基槽结构。

此处，在为了使用本发明的容器(1)进行细胞分选而必须使细胞分选单元的细胞分选膜面(11)处于与填充于第一次培养用单元内的液体的液面接触的状态时，从该操作时防止膜面与液面之间混入气泡的观点考虑，大多情况下，在填充培养液而进行配设操作直至处于液面几乎过满的状态。在此情况下，不优选的是，培养基在开口部(23)周边溢流，变为溢出到容器中的状态。

作为该培养基槽结构，具体而言，可采用对应开口部(23)周边配设而成的可贮存溢流的培养基的沟槽状结构或壕沟状结构等。沟槽或壕沟的配置可可采用圆形状、大致圆形状、多角状、去角的多角状等任意配置，优选为围绕开口部(23)的周围这样的配置。

作为配设第一次培养用容器(21)中的细胞分选膜(11)的位置，理想的是，细胞分选膜与配设有开口部(23)的相反侧的壁面(具体而言为培养面)之间形成有一定间隔的空隙的位置。

作为该间隔，只要为可确保能使通过了细胞分选膜的细胞在浸渍于培养基的状态下培养的空间的间隔即可。例如，细胞分选膜的膜面与第一次培养用培养面(27)的间隔可列举为1～50mm，优选为2～40mm左右的间隔。

另外，为了调整该位置，也可在第一次培养用容器内设置位置调整机构。另外，也可为另行咬合垫片构件或支撑体构件而调整该位置的方案。

在第一次培养工序中，通过在该空隙内的容器内的空间填充液体培养基，可进行分选细胞的第一次培养。

释放结构

第一次培养用容器(21)为在构成容器状结构体的面具有能将保持于容器内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元(4、5)侧的结构的容器状结构体。

该释放结构(28)在该结构关闭的状态下可保持容器内的液体，能通过将该结构变化为开启状态而使保持于容器内的细胞及液体释放至作为具有该容器的下一阶段的培养面的单元侧的外侧。

通过该结构，在第一次培养工序中，含有第一次培养用容器内的液体培养基所保持的细胞的液体培养基可释出至该容器的外侧的结构体侧。

作为释放结构(28)，只要是具有可自由控制开闭的机构且可发挥上述功能的结构体，就没有特别限制地采用。例如，可采用：可开闭的释放口结构、能开闭的释放窗结构、能将嵌合状态的栓状构件分离或转置而释放内部的结构、能将嵌合状态的容器分离或转置而释放内部的结构等。

此处，作为释放结构(28)的形成位置，在将液体填充于第一次培养用容器(21)的情况下，只要是为低于该液体的液面的位置，就没有特别限制。具体而言，可列举第一次培养用容器的底面或侧面。

另外，作为释放结构(28)的数量，也没有特别限制，但例如在释放口或释放窗的情况下，可隔开间隔设置为两个以上。另外，作为释放结构(28)的结构，只要是能将液体培养基释放至第一次培养用容器的外侧的单元(4、5)侧的形状及尺寸，就可没有特别限制地采用。

作为释放结构(28)的一方案，可列举如下结构：使第一次培养用容器(21)形成为由两个以上的结构体构成的容器状结构体，能通过它们的分离或转置将所述能释放的结构调整为释放状态。

在该方案中，第一次培养用容器成为由两个以上构件构成的容器状结构体。而且成为如下结构体：能通过构成该容器状结构体的构件的分离或转置而将所述能释放的结构调整为释放状态。

作为该方案，更具体而言，可列举如下结构：将第一次培养用容器作为主要由上部结构体(22)及下部结构体(26)构成的容器状结构体，能通过上部结构体与下部结构体的分离或转置将所述能释放的结构调整为释放状态。

需要说明的是，为了确保密封性，也可采用在上部结构体(22)与下部结构体(26)接触的位置咬合O形环等弹性构件(29)的方案。

作为可控制释放结构(28)的开闭的机构，例如，可采用将释放窗堵塞的形状的嵌入构件、填充构件、盖状构件、栓状构件、密封构件等释放结构闭塞构件(35)作为构成构件。另外，作为该开闭控制机构，也可为将上部结构体的一部分设为释放结构闭塞构件(35)的方案。

在装载了该释放结构闭塞构件(35)时，释放结构(28)变为关闭状态，因此液体被保持于第一次培养用容器内。另一方面，使该构件分离或转置时，释放结构(28)变为开启状态，因此第一次培养用容器内的液体被释放至外侧。

作为实现释放结构(28)的释放状态的方法，可列举将主体容器单元(4)开封而直接接触第一次培养用单元进行操作的方法。例如下述方法：将主体容器单元的主体盖状部(56)取出，使释放结构闭塞构件(35)分离或转释，使释放结构为开启状态。

另外，作为实现释放结构(28)的释放状态的方法，也可为如下方案：具备不开封主体容器单元(4)而从主体容器单元的外侧操作来使释放结构为开启状态的调整机构。

作为具备该调整机构的方案，具体而言，作为第一次培养用单元(3)，可采用能与主体盖状部(56)的操作连动而将能释放的结构(28)调整为释放状态的结构。作为一例，可列举如下结构：作为能将释放结构闭塞构件(35)或其连结构件与主体盖状部(56)连接的结构，通过使主体盖状部转动，挪动释放结构闭塞构件而使其分离或转置，使释放结构(28)为释放状态。例如，可采用如下结构：能通过主体盖状部(56)的转动，使释放结构闭塞构件(35)的位置朝上侧浮上而转置，使释放结构(28)释放。

作为与主体盖状部(56)的连接部，优选的是，在结构闭塞构件(35)的上部或其连接构件设置与主体盖状部卡合或嵌合的机构。

另外，作为具备该调整机构的其他方案，也可采用如下结构：通过使用磁铁等的操作而使释放结构(28)为开启状态。例如，采用如下结构：使释放结构闭塞构件(35)为由磁铁或磁性体构成的构件，通过从外侧施加磁力而使释放结构闭塞构件(35)从释放结构(28)分离或转置，使释放结构(28)为释放状态。

第一次培养用单元整体的构成

第一次培养用单元(3)是指与第一次培养用容器(21)实质上相同的范围的术语。该单元也可为将容器状部分、第一次培养用培养面、液体培养基等的释放结构、及与细胞分选单元的连接结构等全部一体化的结构体。另外，也可为将这些结构作为构件集合体实现的方案。构件集合体为构成第一次培养用容器的构件。

作为该构件集合体，能将对应各结构的构件作为零件组装。另外，可采用将2～3组的具备多个各结构的构件组合的方案。

例如，作为一例，可为分割为上部结构体(22)与下部结构体(26)的集合构件方案。作为上部结构体的一例，可为如下结构体：包含容器状部分的上表面部分、与细胞分选单元的连接结构、及液体培养基等的释放结构的开闭控制机构等。另一方面，作为下部结构体的一例，可为如下结构：包含容器状的侧面及底面、第一次培养用培养面、及液体培养基等的释放结构的窗部分等。

优选的是，在收纳于作为外侧的容器状结构体的主体容器单元(4)或增殖培养用单元(5)时，在第一次培养用容器的外表面具备与外侧容器卡合的结构。作为卡合或嵌合的结构，虽没有特别限制，但例如可列举爪状结构、法兰(flange)结构、或与它们嵌合的凹型结构等。

另外，该卡合结构或嵌合结构也可为另行采用垫片构件、支撑体构件而实现的方案。

[主体容器单元]

本发明的细胞分选培养增殖容器(1)为具备主体容器单元而构成的容器状结构体。

主体容器单元(4)为如下容器状结构体：具备能培养从上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽，具有能收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构。详细而言，主体容器单元(4)为一种容器状结构体，其特征在于：i)为主要由主体容器(41)及主体盖状部(56)构成的容器状结构体；ii)具备能培养从上一阶段的培养用单元(3、5)释放的细胞的增殖培养用培养面(55)，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽；iii)在该容器状结构体的内部具有能收纳细胞分选单元(2)及到上一阶段的所有培养用单元(3、5)的结构；iv)所述主体盖状部为能使容器整体处于密闭状态的盖状结构体。

主体容器单元(4)具有能使本发明的容器整体的内部空间维持为密闭状态的结构。由此，在本发明中，能将细胞分选、第一次培养、增殖培养等各培养工序在同一容器内进行。另外，其也为起到能担保本发明的细胞分选培养增殖容器(1)的物理强度的框体功能的结构。

该主体容器单元(4)为在增殖培养工序中发挥主要功能的构件。特别是，通过使其为具备气体交换口(47)、培养基交换口(51)的方案，在增殖培养工序中成为优选的方案。

作为构成主体容器单元(4)的构件，只要不损害本发明细胞分选培养增殖容器(1)的功能，就可含有上述以外的构件。

另外，主体容器单元优选为可与第一次培养用单元或增殖培养用单元等自由装卸的方案。

主体容器

主体容器(41)为可保持液体的容器状结构体。主体容器(41)为具备可确保上述主体容器单元(4)所具有的容器状部分的功能的结构的结构体。

作为主体容器(41)的容器结构，可采用各种形状或尺寸，只要是上一阶段的培养用单元所释出的细胞的细胞浓度不会过于稀薄且可形成一定程度的细胞层片或细胞群体的形状及尺寸，就可采用各种形状或尺寸。

作为该容器状部分的形状，具体而言，可为筒状、大致筒状、管状、方体状、大致方体状、球状结构体、圆锥状、大致圆锥状、角锥状、大致角锥状、分支状、杯状、大致杯状、碟状、大致碟状、及将它们组合的结构体等，只要满足上述基本结构，就可采用各种变化的形态。

作为构成主体容器(41)的材质，除了构成O型环等弹性构件(57)的构件外，优选为具有透光性的材质。特别是，在不开封主体容器单元(4)而进行显微镜观察的情况下，对于形成增殖培养用培养面(55)的容器面，优选为具有透光性的材质。另外，对于位于与增殖培养用培养面对向或大致对向位置的容器结构，也优选为具有透光性的材质。此处，位于对向方向或大致对向方向的容器结构是指优选为相对于培养面在上部侧的容器结构。

作为具有透光性的材质，虽也可采用玻璃制的材质，但优选为透明度高且具有操作便利性的树脂制的材质。例如，可使用聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基戊烯、透明ABS树脂等材质。特别是，对于培养面，可适当使用聚苯乙烯或PET等适合培养细胞的增殖的原材料。

作为主体容器(41)的容器状部分的尺寸，优选使用可作为下述段落所述的增殖培养用培养面(55)而采用的面积。例如，若假定为在培养器等中使用的情况下，优选使用30～1600cm²，但在大规模规格等使用的情况下，对此没有特别限制。

另外，作为该容器状部分的容积，只要是可保持适于细胞增殖培养的一定量的液体培养基的容积即可，例如，若假定为在培养器等使用的情况下，优选为可保持30～1500mL左右的液体的容器，但在大规模规格等使用的情况下，对此没有特别限制。

中空管状构件插入/插出结构

作为主体容器(41)，优选为容器状结构体的容器壁面具备能将中空管状构件(121)插入/插出的结构(60)。

主体容器的中空管状构件插入/插出结构(60)为用于不开封主体容器单元(4)也可实现细胞分选膜(11)与第一次培养用容器内的液体的液面接触断开的结构。

此处，作为中空管状构件(121)，是指内部为空洞且能使用外部侧的吸引机构(柱塞或减压器具)吸出或注入液体的构件。详细内容如上述第一次培养用容器(21)的说明所详述的那样。

主体容器的中空管状构件插入/插出结构(60)为用于经由中空管状构件(121)将填充于第一次培养用容器内的液体吸出或注入的可交换排出液体的结构。作为该结构，可采用如下结构：主要由能保持中空管状构件的未插入状态下的气密性及中空管状构件的插入状态下的气密性的弹性构件构成。

具体而言，优选的是，在中空管状构件(121)穿孔贯通该结构时，能将与中空管状构件的外侧接触的部分密合而保持气密性的材质。另外，优选的是，在拔出穿孔贯通的中空管状构件时，能使贯通孔部分的内侧相互密合而保持气密性的材质。

作为构成该中空管状构件插入/插出结构(60)的构件，可列举树脂性弹性构件等。例如可列举硅树脂、氨基甲酸酯树脂、橡胶等。

作为主体容器的中空管状构件插入/插出结构(60)的配设位置，优选为能经由从该中空管状构件插入/插出结构所插入的中空管状构件将填充于第一次培养用单元内的液体吸出的位置。优选的是，配设于主体容器(41)的上方部分或所填充的液面的上方的侧面部分。更优选的是，配设于主体盖状部(56)。

具体而言，优选的是，从外侧插入的中空管状构件(121)不贯通细胞分选膜(11)也能进入到填充于第一次培养用单元内的液体。特别优选的是，垂直或大致垂直于填充于第一次培养用单元内的液面。

增殖培养用培养面

主体容器(41)为如下容器状结构体：在构成容器状结构体的面的至少一部分具有能培养从上一阶段的培养用单元(3，5)释放的细胞的增殖培养用培养面(55)。

增殖培养用培养面(55)优选为主体容器(41)的底面所具备的结构，但也可为将底面以外的容器侧面等一同作为该培养面的方案。另外，也可为在主体容器内设置多个增殖培养用培养面的方案。例如可为将底面分割或划分为两个以上的区域而分别作为培养面的方案。另外，也可为将底面以外的侧面等作为增殖培养用培养面的方案。

另外，作为增殖培养用培养面(55)，虽也可为面弯曲或具有曲率的曲面形状的培养面，但优选为平面形状或大致平面形状。特别优选的是，培养面为平坦的平面形状。

作为增殖培养用培养面(55)的结构，可采用各种形状或尺寸，只要是上一阶段的培养用单元(3、5)所释出的细胞的细胞浓度不会过于稀薄且可形成一定程度的细胞层片或细胞群体的形状及尺寸，就可采用各种形状或尺寸。

该培养面的形状，具体而言，可采用圆形、大致圆形、四角形、大致四角形、角形、大致角形、去角的多角形等形状。优选为去角的四角形的培养面。

作为增殖培养用培养面(55)的尺寸，优选的是，以上一阶段的培养用单元(3、5)的培养面的面积为1时，面积比的范围为20以下且大于1，优选为1.5～15，更优选为2～10，进一步优选为3～8的范围。面积比为该范围的情况下，能维持细胞特性且可适当培养，因此优选。

此处，在面积比的值过大的情况下，单位培养面积中的细胞数变少，因此有使细胞间难以传递信息而使增殖能力降低的倾向，故不优选。另外，也可能使细胞特性进一步变化，因此不优选。

另一方面，在面积比的值过小的情况下，单位培养面积的细胞数变多，有使继代次数增大的倾向，从作业性的观点考虑不优选。另外，继代时可能产生因细胞聚集导致的分化诱导，因此细胞特性容易变化，故不优选。

增殖培养用培养面(55)可以将主体容器(41)的内侧面本身设为培养面。另外，增殖培养用培养面(55)也可设为如下结构体：除了构成容器的面以外，具备平板状构件作为培养面的结构。在此情况下，该增殖培养用培养面用的平板状构件成为构成主体容器的构件的一部分。

作为增殖培养用培养面(55)的平板状构件，例如可层叠配置于构成主体容器的底面等。另外，作与底面之间设有空隙的结构，也可配置为形成2段以上的培养面的结构。

具有刺激应答性细胞剥离作用的分子修饰

作为本发明的增殖培养用培养面(55)的表面，优选的是，通过在培养时表现细胞粘接性且因刺激应答表现细胞剥离作用的分子进行了表面修饰。即，在该方案下，该培养面的表面施加了具有刺激应答性细胞剥离作用的分子修饰，表面特性被改性。

可与第一次培养用培养面(27)的表面修饰方法相同的方式进行对增殖培养用培养面的表面的分子修饰。需要说明的是，在本发明中，针对增殖培养用培养面的表面修饰，也能以与第一次培养用培养面不同的方法进行。例如，可由温度应答性分子进行第一次培养用培养面的表面修饰，也可以由光反应性分子等进行增殖培养用培养面的表面修饰。

等离子处理的表面修饰

作为本发明的增殖培养用培养面(55)的表面，能通过进行等离子处理直接将疏水性基材层表面亲水化，由此使其作为培养面而具备优选的性质。

已知：在进行该等离子处理的方案中，会产生表面蚀刻并于表面附近形成羟基或羧基，因此通常会发生随时间推移的劣化。但是，在以低施加电压进行该等离子处理的方案中，由于表面蚀刻极少，在表面附近形成厚的交联层，因此可实现随时间推移的劣化显著减少的培养面。另外，作为细胞进展优异且以可进行细胞粘接的程度发挥适度的亲水性作用的平板构件，为表面特性改性了的培养面。另外，在进行该等离子处理的方案中，可制造疏水性基材层的表面均匀地亲水化的培养面。

进行该等离子处理所得的增殖培养用培养面(55)：在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有共价键结有选自羟基、羧基及包含这些官能团的化合物结构中的一种以上的结构；和/或，在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有对应于该疏水性聚合物的良溶剂的不溶层。作为更具体的方案，具有共价键结有羟基和/或羧基的结构。

可与于第一次培养用培养面(27)的表面修饰方法相同的方式进行对增殖培养用培养面的表面的等离子处理。

特别是，在低施加电压下的处理中，可在膜表面附近优选地形成也不被一般可溶的溶剂(例如丙酮)溶解的层。该层被认为是抑制表面蚀刻并形成交联层的表面结构，发挥使等离子处理效果长期持续的效果。

上一阶段培养用单元的收纳结构

主体容器(41)为如下容器状结构体：在该容器状结构体的内部具有能收纳细胞分选单元(2)及到上一阶段的所有培养用单元(3、5)的结构。

主体容器(41)为具备用于插入/插出细胞分选单元及培养用单元等的开口部(43)的结构体。细胞分选单元及培养用单元等可通过该开口部(43)收纳于主体容器(41)内部。

作为开口部(43)的形状，可列举一般的孔状开口结构，优选的是，开口结构的周边为适于与主体盖状部嵌合的形状等。作为开口部(43)的尺寸，只要是可顺利地进行上一阶段的培养用单元(3、5)的插入/插出，则没有特别限制。特别理想的是，比上一阶段的培养用单元的外壳尺寸大的尺寸。进而，优选的是，比上一阶段的培养用单元的外壳尺寸稍大的形状，且能与该开口部的内侧物理连接。

作为开口部(43)的结构，优选的是，在开口部(43)的内侧壁具备能与上一阶段的培养用单元的外壳卡合或嵌合的形状，优选为具有可固定该上一阶段的培养用单元的结构。作为卡合或嵌合的结构，虽没有特别限制，但例如可列举爪状结构、法兰(flange)结构、或与它们嵌合的凹型结构等。

在主体容器(41)收纳培养用单元等的状态下，处于主体容器的内侧配设有细胞分选单元(2)及培养用单元(3、5)等的状态。

作为该收纳状态，作为实现本发明容器(1)的紧凑的收纳状态的方案，可列举上一阶段的培养用单元(3、5)的容器底面外壁与主体容器(41)的内侧面(具体而言为増殖培养面(55))接触的状态下收纳的方案。另外，为了确保增殖培养面(55)的面积，也可根据期望，在主体容器内设置对上一阶段的培养用单元(3、5)的容器底面外壁的高度方向的位置进行调整的调整机构。另外，也可采用如下方案：另行咬合垫片构件或支撑体构件而对上一阶段的培养用单元(3、5)的容器底面外壁的高度方向的位置进行调整。

另外，若为未设置所述位置调整机构的方案的情况下，为了确保增殖培养面(55)的面积，也可采用如下方案：上一阶段的培养用单元(3、5)的容器底面的外壁未预先接触主体容器(41)的内侧面(具体而言为底面)的状态下收纳。

为了实现细胞分选单元(2)及培养用单元(3、5)等的收纳状态，主体容器(41)为在垂直方向具有一定容器高度的结构体。

主体容器(41)的垂直方向的容器高度只要能收纳细胞分选单元及培养用单元等，则没有特别限制。另外，即使在该垂直方向的容器高度比培养用容器等的容器高度低的情况下，通过使主体盖状部(56)的结构设为圆顶状等，也可实现该收纳。

作为主体容器(41)的容器高度，例如可列举可担保在显微镜观察下的载物台聚光镜间隔的容器高度。

主体容器的开口部(43)优选为如下结构体：在主体容器(41)与主体盖状部(56)嵌合连接时，以主体盖状部(56)可包覆开口部(43)的方式嵌合连接。因此，作为主体容器的开口部(43)的周边结构，优选具有能与主体盖状部(56)嵌合的结构。

作为能与主体盖状部(56)的侧面结构嵌合的主体容器侧的结构(45)，没有特别限制，但例如可采用螺杆结构、法兰(flange)结构、爪状结构等能与一般的盖卡合的结构。

主体盖状部

主体容器单元(4)为具备主体盖状部(56)的结构。主体盖状部(56)为能使容器整体处于密闭状态的盖状结构体。

作为主体盖状部(56)的结构，虽然可采用上述各种形状及尺寸，只要是以主体容器(41)的容器状结构体的内部收纳有细胞分选单元(2)及至上一阶段为止所有培养用单元(3、5)的状态下可发挥使容器整体密闭的功能的结构，就没有特别限制地采用。

主体盖状部(56)具备能与主体容器的开口部(43)嵌合的结构。另外，作为该盖部分的与主体容器卡合或嵌合的结构，就没有特别限制，根据主体盖状部(56)的侧面结构，可采用与主体容器的开口部侧的结构体嵌合的结构、与主体容器的开口部侧呈螺丝状螺接的结构、经由法兰(flange)结构卡合的结构等、经由爪状结构而卡合的结构等一般的盖结构。

需要说明的是，为了确保主体容器整体的气密性，主体容器(41)与主体盖状部(56)的嵌合部优选采用咬合O形环等弹性构件(57)的结构。

作为主体盖状部(56)的上表面的结构，只要可确保细胞分选单元(2)及至上一阶段为止全部的培养用单元(3、5)被收纳的状态，就没有特别限制。可采用例如平板状或圆顶状等任意的形状。

另外，优选的是，在主体盖状部的上表面内侧具备用于与主体容器内部的空间所收纳的细胞分选单元及/培养用单元的一部分接触固定或卡合固定的嵌合结构(58)。

作为主体盖状部(56)，可为使主体盖状部(56)的转动操作连动而操作各构成单元的状态变化的方案。作为该方案，可列举例如第一次培养用单元的能释放的结构(28)的调整状态。另外，可列举第一次培养用容器底面的外壁高度的调整状态。另外，也可列举细胞分选单元的细胞分选膜(11)的位置状调整状态。

另外，也可为仅以主体盖状部(56)的转动操作实现它们多种状态变化的方案。

作为主体盖状部(56)，优选具有与主体盖状部的操作连动而能将第一次培养用单元的能释放的结构(28)调整为释放状态的结构。

作为该方案的一例，作为可将主体盖状部(56)与释放结构闭塞构件(35)或其连结构件连接的结构，可列举如下结构：通过使主体盖状部转动(56)，可挪动释放结构闭塞构件(35)而使其分离或转置，使释放结构(28)为释放状态。具体而言，可采用使释放结构闭塞构件(35)或其连结构件朝上分离或转置的方案。

在该方案中，优选的是，即使在进行主体盖状部的转动的情况下，仍可保持主体容器单元(4)的气密性的结构。

作为主体盖状部(56)，优选具有如下结构：与主体盖状部的操作连动，使第一次培养用容器(21)的底面外壁从增殖培养面(55)朝上分离或转置，从而可调整第一次培养用容器底面的外壁高度。能通过该结构而在第一次培养用容器(21)的底面外壁与增殖培养面(55)之间形成空隙或空间，增加能培养细胞的增殖培养面(55)的面积。

作为该方案的一例，作为可将主体盖状部(56)与第一次培养用容器(21)或其连结构件连接的结构，可列举如下结构：通过使主体盖状部转动(56)，能使第一次培养用容器的底面朝上分离或转置。在该方案中，优选的是，即使在进行主体盖状部的转动的情况下，仍可保持主体容器单元(4)的气密性的结构。

作为主体盖状部(56)，优选具有如下结构：与主体盖状部的操作连动，可调整细胞分选单元的细胞分选膜(11)的位置。

作为该方案的一例，作为可将主体盖状部(56)与膜保持结构体(13)连接的结构，可列举如下结构：通过使主体盖状部转动(56)，能使膜保持结构体(13)分离或转置，从而挪动细胞分选膜(11)的膜面的位置。优选的是，即使在进行主体盖状部的转动的情况下，仍可保持主体容器单元(4)的气密性的结构。

作为构成主体盖状部(56)的材质，除了构成O型环等弹性构件(57)的构件等外，优选为具有透光性的材质。特别是，在不开封主体容器单元(4)而进行显微镜观察的情况下，优选由具有透光性的材质构成主体盖状部的至少一部分。

转动调节机构

在本发明的容器中，在采用能与主体盖状部(56)的转动操作连动而进行上述操作的方案的情况下，可采用能使主体盖状部(56)的转动程度与容器形状的状态变化阶段性对应的转动调节机构(61)。

本发明的容器的转动调节机构(61)可列举如下机构：含有i)可阶段性调节在与主体盖状部的嵌合结构(45)的外周所配设的控制主体盖状部的转动状态的结构体；ii)嵌合于上述结构体的主体盖状部(56)的侧面结构所具备的结构体，该机构为可使操作人员阶段性认知主体盖状部的转动程度的机构。

作为构成转动调节机构(61)的构件的一方案，可采用排列而具备与设于主体盖状部的突起部(66)宽松嵌合的调节部(63)的环状结构体(62)。在该方案中，环状结构体(62)与主体盖状部侧的突起部(66)为构成转动调节机构(61)的构件。

作为该环状结构体(62)，可列举接触配设在与主体盖状部的嵌合结构(45)的外周部分的方案。构成转动调节机构(61)的该环状结构体(62)也可为如下方案：也可为与嵌合结构(45)的外周部分、主体容器的开口部(43)一体化的结构。

另外，作为构成转动调节机构(61)的该构件，也可为不使用环状结构体的方案。例如，也可采用如下方案：在嵌合结构(45)的外周部分、主体容器的开口部(43)的周边直接排列调节部(63)。

作为调节部(63)，可列举如下结构体：能与主体盖状部侧的突起部(66)宽松嵌合，且容易通过转动操作下的施力来解除嵌合状态。作为调节部(63)的具体方案，可列举例如由两个凸台(64)构成的凸台结构。优选的是，该凸台结构的相反面可采用凹状或凹陷的结构(65)。采用这种结构(65)的情况下，可实现如下结构：主体盖状部侧的突起部(66)以宽松的状态嵌合于两个凸台结构(64)的内侧，由转动操作的按压力而通过凸台(64)时，产生按压力变化的感触。

作为构成调节部(63)的原材料，只要是可达成该功能的原材料，就没有特别限制地采用，优选使用具备弹性的硬质树脂。例如，优选使用聚碳酸酯或透明ABS树脂制的原材料。另外，特别优选为具有透光性的原材料。

作为构成调节部(63)的凸台(64)的形状，可采用凸状或山型状等一般的突起形状。另外，也可采用如下方案：对于构成调节部(63)的一个凸台，为了防止逆转动，设为在内侧具有垂直面的梯形形状的防逆转凸台(64b)。

作为调节部(63)的配设样式，可配设为：在环状结构体(62)或主体容器的开口部(43)附近，从该环状结构或主体容器的开口部的中心等角度排列。作为一方案，可配设为：以5～90°，优选以5～45°左右的间隔进行排列。

作为主体盖状部侧的突起部(66)，可列举如下结构：配设在主体盖状部(56)的侧面结构的能与调节部(63)嵌合的位置。作为突起部(66)的形状，可列举山型形状或三角形状等突起状的形状。作为突起部(66)的配设样式，可列举在该可嵌合的任意位置配设一个的方案。优选的是，在环状结构体(62)或主体容器的开口部(43)的中心的点对称的位置配设两个。另外，也可以以位于调节部(63)的对应位置的方式排列配置与节部(63)同数量的突起部(66)。

在具备转动调节机构(61)的方案中，当主体盖状部侧的突起部(66)在调节部(63)的邻侧移动时，可认知到一阶段的转动程度。例如，在将数个阶段的转动程度与对应其的第一培养用单元的状态变化连动的方案的情况下，操作人员可容易地阶段型认知主体盖状部的转动操作的转动程度及容器结构的状态。

在本发明的容器中，由转动操作而通过凸台(64)时的按压力变化的感触，能使操作人员容易地认知到主体盖状部的转动程度及与其对应的容器结构的变形状态。另外，也可为由转动操作的按压力而通过凸台(64)时使其发出咔嗒声的结构。更优选采用可确认到按压力变化的感触与咔嗒声这双方的结构。

气体交换口

主体容器单元(4)优选为具备气体交换口(47)的结构。在本发明的细胞分选工序、第一次培养工序、增殖培养工序中，可经由气体交换口(47)与外界气体进行气体交换。

作为气体交换口(47)的形成位置，优选为主体容器(41)的上表面或侧面上方。优选为上表面部。另外，也可在主体盖状部(56)形成。另外，在侧面上方或上表面及侧面没有区别的容器中，理想的是，将气体交换口配置为所填充的液体的液面的上方。

为了高效地进行气体交换，气体交换口(47)的数量优选为两个以上。在此情况下，一部分为气体吸入口，其他为气体排出口。

在经由气体交换口进行与外界气体的气体交换时，理想的是，气体交换口具备通气用的灭菌滤器的结构。另外，在关闭气体交换口的情况下，优选使用栓盖等栓类结构体。

在此，作为灭菌滤器(49)，可列举能使气体通过且阻止菌等通过的微细结构滤器。作为这样的灭菌滤器(49)，能使用组装了常用的孔径0.22μm以下的膜的市售的盘滤器、聚四氟乙烯(PTFE)等阻止菌通过的结构的滤器。另外，在气体交换口组装了中空滤器的结构体的情况下，本发明的容器整体可变紧凑且不占空间，因此优选。

灭菌滤器(49)所使用的膜的面积可根据培养容器内的气体容量进行决定。通常优选为可让容器体积的10倍左右的气体在数分钟～10分钟内滤过的面积。作为灭菌滤器(49)所使用的膜的种类，可任意使用平面状或中空膜状等。

另外，作为灭菌滤器(49)的原材料，能使用亲水性或疏水性的任一原材料的滤器。作为优选方案，由于可避免与水分接触而导致的闭塞，优选使用疏水性的原材料的滤器。

作为本发明的容器(1)，从气体交换口(47)经由管等填充任意组成的气体后，以栓盖等关闭气体交换口，在这样的结构的情况下，可实现调整为容器整体为所期望的气氛的培养条件的环境。在此情况下，不需调整培养器整体的气氛组成也可廉价地调整培养条件。

培养基交换口

主体容器单元(4)优选为如下结构：具备能朝主体容器(41)进行培养基注入及培养基排出的培养基交换口(51)。特别在增殖培养工序中，可经由培养基交换口(51)简易地进行培养基交换。

作为培养基交换口(51)的形成位置，也可在具备栓盖等密闭结构而形成在底面、侧面下方，但优选为主体容器(41)的上表面或侧面上方。优选为上表面部。另外，在侧面上方或上表面及侧面没有区别的容器中，优选将培养基交换口配置为所填充的液体的液面的上方。

培养基交换口(51)的数量没有特别限制，优选为一个以上。另外，在关闭培养基交换口时，优选使用栓盖等栓类结构体。为了不易脱落，栓盖等栓类结构体也可组装为例如鲁尔锁(Luer lock)结构。

培养基交换口(51)也可具备用于使培养基交换容易进行的辅助构件。例如可为如下结构：具备可嵌入培养基交换口、且可插入至主体容器(41)附近的管状构件(52)等。

主体容器单元整体的构成

作为主体容器单元(4)，可为将主体容器、主体盖状部、收纳结构、气体交换口关联的结构、培养基交换口关联的结构等全部一体化的结构体，也可为将这些结构作为构件集合体而实现的方案。

此处，作为该构件集合体，能将对应各结构的构件作为零件组装。另外，可采用将2～3组的具备多个各结构的构件组合的方案。

例如，作为一例，可为分割为上部结构体(42)与下部结构体(54)的集合构件方案。作为上部结构体的一例，可为如下结构体：包含容器状部分的上表面部分、与主体盖状部的连接结构等。另一方面，作为下部结构体的一例，可为如下结构：包含容器状部分的侧面及底面等。

另外，作为收纳状态，也可为根据所需另行采用垫片构件、支撑体构件而实现的方案。

[增殖培养用单元]

本发明的细胞分选培养增殖容器(1)可为具备上述单元和一个以上增殖培养用单元(5)的容器状结构体。

在该方案中，本发明的细胞分选培养增殖容器(1)成具备一个以上可多阶段进行第一次培养后的增殖培养的增殖培养用单元而成的细胞分选培养增殖容器。

通过该结构，在阶段性进行预处理的培养形态的情况、进行诱导操作的情况、多阶段进行增殖培养的情况下，可为优选的培养容器形态。

增殖培养用单元(5)为一种结构体，其特征在于：i)为容器状结构体；ii)具备能培养由上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面大；iii)在该容器状结构体的内部具有能装载或收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构；iv)在于构成该容器状结构体的面具有能将保持于该容器内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构。

对于增殖培养用单元(5)的基本结构，可采用主体容器(41)及第一次培养用容器(21)的结构。具体而言，上述i)～iii)的结构可采用与主体容器(41)同样的结构。另外，对于上述iv)的结构，可采用第一次培养用容器(21)的结构。

此处，作为增殖培养用单元(5)的特征结构，可列举具有能装载或收纳到上一阶段的所有培养用单元的结构的点。增殖培养用单元(5)的容器状部分与主体容器不同，不需收纳上一阶段的培养用单元。由此，与可为仅将上一阶段的培养用单元装载于增殖培养用单元(5)的容器状结构内的方案。

增殖培养用单元(5)可在该单元的内侧壁具备与上一阶段的培养用单元嵌合形状，具有可固定该上一阶段的培养用单元的卡合或嵌合结构。

作为卡合或嵌合结构，没有特别限制，可列举爪状结构、法兰(flange)结构、或与它们嵌合的凹型结构等。另外，该卡合结构或嵌合结构也可为另行采用垫片构件或支撑体构件而实现的方案。

增殖用培养单元(5)为具有第一次培养用单元(3)的下一阶段的培养面的单元，为主体容器单元(4)的上一阶段的培养用单元。此处，也可为将两个以上增殖培养用单元嵌套而装载或收纳的方案。

作为增殖培养用单元(5)的增殖培养用培养面，可采用与主体容器的增殖培养用培养面(55)或第一次培养用容器的第一次培养用培养面(27)具备相同特征的培养面。

作为增殖培养用单元(5)的增殖培养用培养面的尺寸，优选的是，以将上一阶段的培养用单元的培养面的面积设为1的情况下，面积比的范围为20以下且大于1，优选为1.5～15，更优选为2～10，进一步优选为3～8的范围。

2.本发明的细胞分选培养容器所具备的功能

通过使用本发明的细胞分选培养容器(1)，可高效地从组织、细胞群体将所期望的细胞分选并增殖。通过使用本发明的细胞分选培养容器(1)，操作简易，且可廉价又稳定地将所期望的细胞高效地分选并培养增殖。

[同一容器内操作的细胞分选及增殖培养]

细胞分选培养容器所具备的主要功能

本发明的细胞分选培养容器(1)能通过进行细胞分选工序、第一次培养工序、细胞剥离工序及增殖培养工序等一系列的操作而在同一容器内通过简便操作实施所期望的对象细胞的分选与增殖培养。另外，不需要用于在其他容器进行增殖培养的细胞移送操作等操作，即可实施该一系列的工序。

本发明的细胞分选培养容器(1)所具备的优异功能为：通过各构件单元所具有的特殊的结构及性质相互作用才发挥的功能。

具体而言，本发明的细胞分选培养容器可在该容器内维持封闭的环境或防止来自外部的污染等的灭菌环境的状态下进行细胞分选或各种培养等一系列的工序。

根据此点，使作为上一阶段的培养用单元的第一次培养用单元等在主体容器单元内为收纳状态，使用同一容器在密闭状态下进行细胞分选工序或第一次培养工序，通过构思出此点而发挥效果。

另外，构思出在构成第一次培养用单元的容器部分具备可自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构，通过构思出此点而实现本发明的细胞分选培养容器。

特别是，在使用本发明的细胞分选培养容器的情况下，可优选使用于：需确保霉浆菌或病毒等感染、来自其他细胞源的污染、癌化的危险性等关于GMP的安全性的干细胞的分选培养增殖。

对象分选细胞的回收效率

在本发明的细胞分选培养容器(1)中，通过具有刺激应答性细胞剥离作用的分子进行基材表面修饰，将表面修饰了的基材作为培养用单元的培养面使用，更容易进行细胞移送。在采用该方案的情况下，可大幅减少细胞剥离时的物理损伤。特别是，在需要进行胰蛋白酶等的酵素处理等的细胞等中，可减少酵素处理导致的对细胞的刺激。

此处，在预处理阶段、即第一次培养后，由于对象分选细胞量尚未充足，应尽可能避免物理性损伤、酵素处理导致的刺激。特别是，在分选刺激敏感性强而容易丧失多能性的干细胞等的情况下，为了不对细胞功能、结构造成不好影响而能获得高质量细胞，避免刺激是重要的。由此，以具有刺激应答性细胞剥离作用的分子进行基材表面修饰，并将表面修饰了的基材作为基材使用的方案在第一次培养用单元中采用，这是特别有效的。

在本发明的细胞分选培养容器(1)中，将由疏水性聚合物构成的基材由亲水性聚合物表面修饰，并将此基材作为细胞分选单元的细胞分选膜(11)使用，可防止细胞附着于细胞分选膜，更高效地进行对象细胞分选。特别是，当对象细胞为贵重的干细胞等的情况下，防止细胞附着并提升回收效率，这是重要的。

分选细胞的种类

只要是可附着于培养面并培养的细胞，本发明的细胞分选培养容器(1)可将任意细胞设为分选对象。在原理上，可适用于对表现附着性的所有真核生物的细胞。具体而言，可列举适用于动物细胞，特别适用于脊椎动物细胞，更进一步适用于哺乳类细胞。

另外，根据上述理由，特别优选作为分选干细胞并使其增殖用的容器。特别是，可确保霉浆菌或病毒等感染、来自其他细胞源的污染、癌化的危险性等关于GMP的安全性并且可高效地分选培养增殖，基于此点是优选的。

作为对象的干细胞，例如可列举胚胎干细胞、组织干细胞、间叶干细胞、iPS细胞等，但适用可不限于此。

[避免主体容器单元开封的方案]

作为本发明的细胞分选培养容器(1)，为了进一步减少感染及污染的风险，优选采用可在培养操作中避免主体容器单元的开封的方法和/或结构。

透光性构件

本发明的细胞分选培养增殖容器(1)优选为如下方案：将特定位置的构件由具有透光性的材质构成，并作为构成细胞分选培养增殖容器的容器构成构件，通过具有透光性的部分可观察容器内部的培养面。

通过采用该构成，细胞分选培养增殖容器(1)可实现如下结构体：成为在细胞分选工序、第一次培养工序、细胞剥离工序及增殖培养工序的所有工序中，不开封主体容器单元(4)也可由显微镜等观察容器内部。具体而言，能使用实体显微镜、倒立显微镜、位相差显微镜等越过容器直接观察。特别是，在使用位相差显微镜进行焦点像鲜明连结的实时观察时为优选。

作为该方案的具有透光性的部分，优选的是，能经由该部分观察容器内部的培养面的位置由具有透光性的材质构成。具体而言，优选的是，由具有透光性的材质构成细胞分选培养容器所具备的所有培养面的至少一部分，更优选为构成所有培养面的整个面。此处，作为培养面，是指第一次培养用容器的培养面(27)及主体容器单元的培养面(55)，但也包含具备增殖培养用单元(5)时的增殖培养用单元的培养面。

另外，作为具有透光性的部分，优选的是，由具有透光性的材质构成位于主体容器单元(4)的培养面的对向或大致对向的容器结构的至少一部分，优选为构成全部。此处，对向方向或大致对向方向的构成结构是指优选为相对培养面朝上部侧的结构部分。

具体而言，优选的是，由具有透光性的材质构成主体盖状部(56)的至少一部分，优选为构成主体盖状部除了弹性构件以外的全部部分。

另外，作为具有透光性的部分，优选的是，在各种培养用单元(3、5)或细胞分选单元(2)的结构中，由具有透光性的材质构成配设于相对于培养面对向或大致对向的位置的结构的至少一部分。优选由具有透光性的材质构成全部。

特别优选的是，构成第一次培养用单元(3)的上表面或顶板的结构部分为具有透光性的材质。

更优选的是，构成细胞分选培养增殖容器(1)的构件中除了弹性构件、分选膜外的实质上全部由具有透光性的材质构成。

细胞分选膜的位置调整机构

在本发明的细胞分选培养增殖容器(1)中，为了实现细胞分选膜(11)的膜面不与第一次培养用容器内的液体的液面接触的状态，能使用具备细胞分选膜的位置调整机构的方案。通过具备该位置调整机构，不开封主体容器单元也能从细胞分选工序转移到第一次培养工序。需要说明的是，此处的位置调整是指细胞分选膜在垂直方向或大致垂持方向上的位置调整。

作为该位置调整机构，具体而言，作为将主体盖状部(56)与细胞分选单元(2)连接的结构，可列举如下结构：能与主体盖状部的操作连动而调整细胞分选膜的位置的结构。更具体而言，可列举如下结构：通过转动主体盖状部使细胞分选单元(2)从第一次培养用单元分离或转置，可挪动细胞分选膜的膜面的位置。例如，可列举如下结构：通过主体盖状部的转动，能使细胞分选膜(11)的膜面的位置朝上侧浮上。

在该方案中，通过从主体容器单元的外侧的操作，可实现细胞分选膜(11)与第一次培养用容器内的液体的液面的接触被截断的状态，不开封主体容器单元也能转移至第一次培养工序。

第一次培养用容器内的培养基面调整结构

在本发明的细胞分选培养增殖容器(1)中，通过配设能将中空管状构件插入/插出于主体容器等的结构(60)，不开封主体容器(4)也可进行从细胞分选工序转移至第一次培养工序。

在该方案中，将中空管状构件(121)插入主体容器等中的中空管状构件插入/插出结构(60)，经由该插入的中空管状构件吸出填充于第一次培养用单元内的液体，由此，不开封主体容器单元也能使第一次培养用容器所填充的培养基液面降低。

通过该液面的降低，可实现细胞分选膜(11)与第一次培养用容器内的液体的液面的接触被截断的状态，不开封主体容器单元也能转移至第一次培养工序。

另外，利用该机构，不开封主体容器单元也能进行第一次培养工序的中途的培养基交换。

第一次培养用容器等中释放结构的调整机构

在本发明的细胞分选培养增殖容器(1)中，通过具备通过来自主体容器单元(4)外侧的操作而使第一次培养用容器等的释放结构(28)为释放状态的调整机构，不开封主体容器单元也能进行朝下一阶段的培养工序的移行。

此处，作为不开封主体容器单元也能使该释放结构为释放状态的方法及结构，详细如上述段落“1.细胞分选培养增殖容器”的释放结构的说明段落所记载的那样。

在第一次培养单元(3)具备该调整机构的情况下，不开封主体容器单元也能从第一次培养工序转移至下一阶段的增殖培养工序。

另外，在增殖培养用单元具备该调整机构的情况下，不开封主体容器单元也能转移至下一阶段的增殖培养工序。

第一次培养用容器底面的外壁高度调整机构

在本发明细胞分选培养增殖容器(1)的方案中，通过设为如下方案的容器，可实现紧凑的的容器形态：在将第一次培养用容器收纳于主体容器的状态下，第一次培养用容器(21)的底面外壁接触主体容器的增殖培养面(55)。

但是，在该方案的容器的情况下，优选的是，在增殖培养工序中，使第一次培养用容器(21)的底面外壁从增殖培养面(55)朝上方分离或转置，使两者之间形成空隙或空间，增加能培养细胞的增殖培养面(55)的面积。由此，在该方案中，优选采用如下方案：具备可通过从主体容器单元(4)的外侧操作而调整第一次培养用容器底面的外壁高度的机构。

此处，作为不开封主体容器单元也能调整该外壁高度的方法及结构，详细如“1.细胞分选培养增殖容器”的段落说明所记载的那样。

在第一次培养单元(3)具备该调整机构的情况下，不开封主体容器单元也能从第一次培养工序转移至下一阶段的增殖培养工序。另外，在增殖培养用单元具备该调整机构的情况下，不开封主体容器单元也能转移至下一阶段的增殖培养工序。

等离子处理的表面修饰

作为本发明的细胞分选培养增殖容器(1)，在使用疏水性基材作为构成各结构体的容器壁、支撑体结构的情况下，可在其表面进行等离子处理而使疏水性基材层表面亲水化。在进行该等离子处理的方案中，由于表面蚀刻少，在表面附近形成交联层，因此可实现随时间推移劣化少的容器表面。特别是由低施加电压进行该等离子处理的方案中，由于在表面蚀刻极少，在表面附近形成厚的交联层，因此可实现随时间推移劣化显著少的容器表面。

在进行该等离子处理的方案中，可制造疏水性基材层的表面附近均匀地形成交联层的容器。

作为构成可进行等离子处理的细胞分选培养增殖容器(1)的各结构体，可列举例如：构成细胞分选单元的结构体(13)、构成第一次培养用单元的容器状结构体(21)、构成主体容器单元的容器状结构体(41)、构成主体容器单元的主体盖状部(56)、构成增殖培养用单元(5)的容器状结构体等。作为该等离子处理，可对这些结构体的一种以上的结构体的至少一部分进行。另外，也可对这些结构体的一种以上的结构体的整体进行。另外，也可对全部结构体的整体进行。

构成进行该等离子处理所得的细胞分选培养增殖容器(1)的各结构体在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有共价键结有选自羟基、羧基及包含这些官能团的化合物结构中的一种以上的结构；和/或，在由疏水性聚合物构成的基材层的表面附近具有对应于该疏水性聚合物的良溶剂的不溶层。作为更具体的方案，具有共价键结有羟基和/或羧基的结构。

可与于第一次培养用培养面(27)的表面修饰方法同样的方式进行对该结构体的表面的等离子处理。特别是，在低施加电压下的处理中，可在膜表面附近优选地形成也不被一般可溶的溶剂(例如丙酮)溶解的层。该层被认为是抑制表面蚀刻并形成交联层的表面结构，发挥使等离子处理效果长期持续的效果。

3.构成细胞分选培养增殖方法的工序

在本发明的细胞分选培养增殖方法中，为进行以下所示的细胞分选工序、第一次培养工序、细胞剥离工序及增殖培养工序等一系列操作的方法。另外，在本发明的方法中，只要可达成本发明的细胞分选及增殖，也不排除包含除此以外的工序。

细胞分选工序

在本发明的细胞分选培养增殖方法中，进行用于从含有各种细胞的组织等培养液的状态下选出对象细胞的细胞分选工序。如图7所示，表示细胞分选工序一例的模式图。

在细胞分选工序中，在将细胞分选用培养基(112)填充至第一次培养用单元的容器状结构体(21)的状态下，以细胞分选膜(11)的膜面与细胞分选用培养基(112)的液面接触的状态配设细胞分选单元(2)，将含有分选细胞的细胞悬浮液注入细胞分选单元而进行。此处，若气泡混入细胞分选膜的膜面与液面之间，则分选效率会降低，因此不优选。

作为本发明的细胞分选工序的方案，只要是可选择分选对象细胞的方案，就可采用任意方案，优选的是，为了主动分选对象细胞，由对对象细胞的移动进行诱导或活性化的方法进行。特别优选的是，在利用趋化因子的方案中，由对对象细胞的移动进行诱导或活性化的方法进行。

作为细胞分选工序所使用的细胞分选用培养基(112)及细胞悬浮用培养基(111)，能使用适于分选对象的细胞(101)的所期望的液体培养基。另外，这些培养基的趋化因子的含有形态，也可根据以下所示的趋化因子的利用方案的不同而进行调整。

作为本发明的细胞分选工序的趋化因子的利用方案，具体而言，可为以下方案。

作为细胞分选工序的方案，可列举如下方案：i)作为第一次培养用单元侧所填充的细胞分选用培养基，使用含趋化因子的培养基。在该方案中，在细胞分选单元内注入含分选对象细胞的细胞悬浮液的情况下，可实现如下状态：通过第一次培养用单元侧的趋化因子的作用而选择性地诱导对象细胞，使其通过细胞分选膜的微细孔而移动至第一次培养用单元侧。

另外，作为细胞分选工序的方案，可列举如下方案：ii)使注入细胞分选单元前的细胞悬浮液含有趋化因子，预先使所期望的对象细胞的移动活性发生活性化。此处，能通过在使细胞悬浮液中含有趋化因子的状态下培养数小时而达成趋化因子的细胞活性的预先活性化。

在该方案中，由于趋化因子的作用导致对象细胞的移动活性被选择性活性化，因此，即使在第一次培养用单元侧所填充的细胞分选用培养基不含有趋化因子，仍可实现使其通过细胞分选膜的微细孔而移动至第一次培养用单元侧的状态。

需要说明的是，在该方案中，处于注入细胞分选单元前的细胞悬浮液中的对象细胞的移动活性的活性化为被预先诱导的状态。因此，即使在注入至细胞分选单元前进行除去趋化因子的培养基洗涤操作的情况下，仍能维持对象细胞的移动活性的活性化。即，在该方案中，可在含有趋化因子的状态下进行细胞分选单元的注入操作，也可在趋化因子通过培养基洗涤操作被除去的状态下立即进行细胞分选单元的注入操作。

作为细胞分悬工序的更优选方案，优选为如下方案：将上述i)及ii)的方案组合，使所期望的对象细胞的移动活性预先活性化后，由第一次培养用单元侧的细胞分选用培养基的趋化因子诱导对象细胞。

更优选的是，在使所期望的对象细胞的移动活性预先活性化后，进行以培养基洗涤操作除去趋化因子的操作，然后使用含趋化因子的培养基作为第一次培养用单元侧所填充的细胞分选用培养基。在该方案中，可更高效地进行分选细胞经由细胞分选膜的微细孔朝第一次培养用单元侧的移动。

以使所期望的对象细胞通过细胞分选膜的微细孔而移动的方式，利用对作为分选对象的细胞具有诱导作用及活性化作用的趋化因子进行本发明的细胞分选工序。

作为趋化因子，可适当使用适合所期望的分选对象的细胞。例如，作为干细胞的分选能使用的趋化因子，优选使用G-CSF、bFGF、SDF-1、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原儿茶酸(protocatechuic acid)及血清等。作为趋化因子的浓度，只要为可发挥诱导作用或移动活性化作用且不发挥细胞分化作用、驱避作用的浓度即可。例如优选为1～500ng/mL左右，但并不限于此。

作为注入细胞分选单元的细胞悬浮液所含的细胞浓度，可考虑包含对象细胞的比例等而进行适当调整，例如，在膜面积为0.3cm²时，优选为3×10²～3×10⁴细胞/100μL左右。在细胞浓度实在过浓的情况下，就有发生孔堵塞等的疑虑，因此不优选。

另外，在细胞分选工序中，优选的是，根据作为对象的分选细胞的种类及性质，选择细胞分选膜的微细孔的尺寸而使用。

作为细胞分选的培养条件，可采用适合作为对象的分选细胞的条件。在主体容器单元具有具备灭菌滤器等的气体交换口的方案的情况下，可在所期望的气氛下在培养器内培养。另外，也可预先在主体容器内注入所期望的气氛而进行培养。

就细胞的分选状态的确认操作而言，理想的是，为了减少感染或污染的风险，不开封主体容器状盖，越过容器用显微镜进行观察。

第一次培养工序

在本发明的细胞分选培养增殖方法中，对细胞分选工序中经分选的对象细胞进行第一次培养工序。

该第一次培养为相当于增殖培养前的预培养的前培养阶段，为如下培养：为了一边保持可适当进行细胞间信息传递的关系，一边使细胞密度达到适合作为下一阶段的增殖培养的细胞密度而进行的培养。如图8所示，表示第一次培养工序的一例的模式图。

可在维持细胞分选膜(11)与第一次培养用容器内的培养基的液面为接触状态下同时进行第一次培养工序，优选的是，在所期望的细胞分选状态被确认后，截断细胞分选膜与第一次培养用容器内的培养基面的接触而进行。通过防止分选细胞朝细胞分选单元侧逆向移动及附着于细胞分选单元结构体等，可防止已分选的细胞的损失。

此处，作为截断细胞分选膜(11)的膜面与第一次培养用容器内的培养基的液面的方法，可为以下方案：

作为该接触截断方法，i)通过将细胞分选单元(2)从第一次培养单元(3)物理性地分离或转置，可实现细胞分选膜的膜面与第一次培养用容器内的培养基面未接触的状态。就该细胞分选单元的分离或转置而言，可开封主体容器单元而手动进行，也可采用不开封主体容器单元的结构而进行。

另外，作为该接触截断方法，ii)通过使第一次培养用容器内的培养基的培养基面下降，可实现细胞分选膜的膜面与第一次培养用容器内的培养基面未接触的状态。就该第一次培养用容器内的培养基面的液面降低而言，开封主体容器单元而通过吸出操作进行，也可采用不开封主体容器单元的结构而通过吸出操作进行。

此处，对于上述i)及ii)所述的方法及结构，详细如上述段落“1.细胞分选培养增殖容器”及“2.本发明的细胞分选培养容器所具备的功能”中记载了容器结构的段落所示的那样。

在第一次培养用单元的容器状结构体(21)所填充的液体培养基内进行第一次培养工序。在上述工序中，通过细胞分选膜(11)移动至第一次培养用单(3)的分选细胞在第一次培养用单元内的第一次培养用培养面(27)上被培养。

作为进行第一次培养用的第一次培养用液体培养基(113)，能使用适合作为分选对象的细胞的优选液体培养基。优选的是，在细胞分选用培养基含有趋化因子的情况下，在进行第一次培养前将含有趋化因子的细胞分选用培养基去除，交换为不含趋化因子的新鲜的液体培养基，进行第一次培养。

作为第一次培养的培养条件，可采用适合作为对象的分选细胞的条件。在主体容器单元具有具备灭菌滤器等的气体交换口的方案的情况下，可在所期望的温度气氛下在培养器内培养。另外，也可预先在主体容器内注入所期望的气氛而进行培养。就细胞的增殖状态的确认操作而言，理想的是，为了减少感染或污染的风险，不开封主体容器状盖，越过容器用显微镜进行观察。

作为从第一次培养工序移行至下一阶段的增殖培养工序的标准，基本上优选维持适度细胞密度，培养至50～100％细胞满度(confluent)的状态，优选为60～80％细胞满度。特别干细胞这样的容易受到刺激的细胞，优选为保持在70％以下。

优选的是，在第一次培养工序中，在培养进展到一定程度的阶段中，使第一次培养用单元的培养面(27)的细胞剥离，通过同培养面再播种，使其均匀地状态，继续进行第一次培养工序。

详细而言，在第一次培养工序中，在上一阶段的细胞分选工序中，通过了细胞分选膜的细胞，有偏向存活于细胞分选膜的下附近培养面的倾向，因此特别在作为对象的分选细胞为附着细胞的情况下，仅以浸透等将难以使其均匀地分散的状态。由此，为了避免细胞局部性过密状态导致的不良影响，优选于培养途中进行剥离操作及再播种。采用该方案的情况下可保持细胞间信息传递为良好状态，得到质量高的细胞，并提升增殖培养的效率，从这几点考虑，因此优选。

此处，细胞的剥离操作可依据后述的细胞剥离工序所述的方法进行。

细胞剥离工序

在本发明的细胞分选培养增殖方法中，在各培养工序之间或培养工序后，为了使细胞移动至进行培养的单元的外侧，进行从细胞面的细胞剥离工序。即，在本发明的方法中，优选的是，在第一次培养用单元(3)的培养后、在主体容器单元(4)的培养后、在进一步根据期望的增殖培养用单元(5)的培养后，进行细胞剥离操作。

作为培养面的细胞剥离方法，只要对象细胞的生存或癌化等在安全性上没有问题，可采用物理性剥离、酶法剥离、化学性剥离等任意方法。但是，若考虑尽可能降低对象细胞的损伤或影响，优选的是，使用通过在培养面显示细胞剥离作用的分子进行了表面修饰的基材，进行细胞剥离。

特别是，在第一次培养后，由于作为对象的分选细胞的量尚不充分，因此优选的是，在第一次培养用培养面(27)使用由表现细胞剥离作用的分子进行了表面修饰的基材。

就细胞的剥离状态的确认操作而言，理想的是，为了减少感染或污染的风险，不开封主体容器状盖(56)，越过容器用显微镜进行观察。如图9所示，表示细胞剥离的一例的模式图。

就表面修饰的基材从培养面变成在培养基中呈浮游状态的细胞而言，能通过调整培养用单元的容器状结构体所具备的释放结构为释放状态，被释放至各培养单元容器的外侧。例如，在第一次培养工序的情况下，从第一次培养用容器的释放结构(28)变为浮游状态的细胞能与培养基一起释放至主体容器单元侧(或增殖培养用单元侧)。

此处，对于使该释放结构为释放状态的方法或结构，详细如上述段落“1.细胞分选培养增殖容器”及“2.本发明的细胞分选培养容器所具备的功能”中记载容器结构的段落所示的那样。

增殖培养工序

在本发明的细胞分选培养增殖方法中，在进行第一次培养工序后的细胞剥离工序后，进行增殖培养工序。该增殖培养相当于用于增加对象细胞量的本培养。表示增殖培养工序的一例的模式图示于图10。

为了进行增殖培养，理想的是，在第一次培养中一边可确保细胞间信息传递适当进行的关系，一边使细胞密度达到对于增殖培养适当的细胞密度，在达到此状态后开始增殖培养。

增殖培养工序可在主体容器单元(4)或增殖培养用单元(5)的容器状结构体所填充的液体培养基内进行。上一阶段的培养工序中被培养的细胞在细胞剥离工序后，可仅通过使其从上一阶段的培养用单元的释放结构流出至主体容器单元或增殖培养用单元所填充的液体培养基内，执行细胞移动。

该移动后培养细胞在主体容器单元或增殖培养用单元的培养面上培养。

用于进行增殖培养的增殖培养用液体培养基(114)能使用适合作为分选对象的细胞的优选液体培养基。

在鉴于培养面积的确保及培养基交换等的操作性的情况下，在增殖培养工序中，可在将上一阶段的培养用单元(3、5)从主体容器单元(4)取出的状态下进行。另外，也可在将上一阶段的培养用单元(3、5)朝上方分离或转置的状态下进行。作为将该上一阶段的培养用单元朝上方分离或转置的方法，例如可采用上述段落所述的与主体盖状部的转动操作连动的结构而实现。

作为增殖培养的培养条件，可采用适合作为对象的分选细胞的条件。在主体容器单元(4)具有具备灭菌滤器等的气体交换口(47)的方案的情况下，可在所期望的气氛下在培养器内培养。另外，也可预先在主体容器内注入所期望的气氛而进行培养。

作为增殖培养的终止的标准，基本上可进行培养直到作为对象的分选细胞为所期望的细胞量。

另外，在增殖培养的过程中，理想的是，在中途交换新鲜的液体培养基而继续培养。基于此点，主体容器单元(4)优选采用具有培养基交换口(51)的形态。

细胞的增殖状态的确认操作，为了减少感染或污染的风险，理想的是，不开封主体容器状盖而越过容器用显微镜进行观察。

就本发明的增殖培养工序而言，作为基本的方案，可列举：在第一次培养工序后使用主体容器单元(4)仅进行一次增殖培养工序的方案。

另外，在本发明增殖培养工序中，可采用多阶段进行增殖培养的方案。具体而言，可列举如下方案：在第一次培养工序后进行使用增殖培养用单元(5)增殖培养工序后，最后进行使用了主体容器单元(4)的增殖培养工序。进而，也可为如下方案：将增殖培养用单元(5)配置为两个以上的嵌套状，进行三次以上增殖培养工序。

另外，根据期望，作为培养工序的一部分，也可设定所期望的细胞处理(诱导、分化等)的特殊的培养条件而进行增殖培养。

实施例

以下，列举实施例来对本发明进行说明，但本发明的范围不限于此。

需要说明的是，在本实施例中，“G-CSF”是指作为颗粒性白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor)的一种细胞激素(cytokine)的术语，其作为干细胞的趋化因子使用。另外，“FBS”作为指胎牛血清的术语而使用。

另外，在以下的实验操作中，就将容器设为释放状态而对细胞进行的操作而言，在没有特别记载的情况下，在确保灭菌状态用的无菌操作台内进行。

[实施例1]『细胞分选培养增殖容器』

作为本发明的细胞分选培养增殖容器(1)的一方案，制造了如附图所示的容器状结构体。以下，参照分解图(图1)及结构图(图2～6)等对本实施例所制造的细胞分选培养增殖容器进行说明。

(1)“整体结构”

本实施例所制造的细胞分选培养增殖容器(1)为主要由细胞分选单元(2)、第一次培养用单元(3)及主体容器单元(4)构成的容器状结构体。

(2)“细胞分选单元”

本实施例的细胞分选单元(2)为含有筒状结构体(13)、细胞分选膜(11)及环状结构体(17)而成的结构体。在本实施例的方案中，环状结构体(17)为作为膜保持结构体的筒状结构体(13)的辅助构件。此处，筒状结构体(13)为由聚苯乙烯构成的有透光性的透明构件，为外径12mm、内径10mm及筒长30mm的圆柱状的结构构件。该筒状结构的底面外周部形成有环宽为10mm的环结构部。

环状结构体(17)为中央部具备的开口部(18)的内径有10mm的有孔构件。

筒状结构体的底面(16)，作为与填充于第一次培养用单元内的培养基的液面接触时细胞分选膜与液面的防止气泡对策，构成具有朝开口部方向朝上的缓坡倾斜的结构(图3)。

细胞分选膜(11)为具有作为细胞透过孔的微细孔(12)的膜状结构构件，基材层为由PE构成且通过亲水性聚合物进行了表面分子修饰的基材层。其为膜厚度20μm且外径18mm的膜构件。

按照WO2014/171365公报的记载，通过制成微细的模具的印刷中(imprinting)法进行对膜的微细孔处理。本实施例的细胞分选膜(11)具有以平均孔径8μm的微细孔的开孔率20％呈格子状合规地配置的微细结构。该孔径作为在干细胞的分选中适合的孔径而发挥功能。

依据WO2012/133803号公报的记载，对膜表面进行亲水性聚合物的共价键结处理而制造细胞分选膜(11)。具体而言，将通过印刷中(imprinting)开孔的PE膜浸渍于含有聚乙烯吡咯烷酮-聚醋酸乙烯酯共聚物1000ppm及乙醇0.1wt％的溶液，封装后照射γ线25KGy。本实施例所制造的细胞分选膜(11)的膜表面的性质被改性，可抑制对膜表面的细胞附着。本实施例的细胞分选膜的评价试验的结果示于实施例3。

作为细胞分选单元(2)的组合后的状态，为如下状态：在筒状结构体的底面(16)与环状结构体(17)之间夹持有细胞分选膜(11)的状态下将筒状结构体的底面(16)与环状结构体(17)卡合而固定。

此处，从筒状结构体的上部开口部(14)添加至筒状结构内的液体培养基等为如下结构：若未通过细胞分选膜(11)，将无法到达第一次培养用单元(3)侧(图4、图7)。

另外，在筒状结构体的底面(16)中，除了与环状结构(17)的卡合结构以外，还具备可向第一次培养容器(21)的上部中央部分装载的卡合结构。

(3)“第一次培养用单元”

本实施例的第一次培养用单元(3)为主要由第一次培养用容器(21)构成的结构体。在本实施例中，第一次培养用容器(21)是可分离为上部结构体(22)与下部结构体(26)的构件。

此处，第一次培养用容器的下部结构体(26)为由聚苯乙烯构成的透光性构件，为外径61mm(包含嵌合结构而为64mm)、内径58mm、且筒长36.5mm(包含抓持部而为41.5mm)的圆筒状构件。该圆筒结构的底面部具有具备用于保持作为第一次培养用培养面的平板状构件(27)的宽度3mm的内框。另外，在下部结构体(26)的侧面下部形成垂直方向宽度4mm且水平方向宽度20mm的窄缝状的释放窗(28)。释放窗(28)形成在圆筒剖视下彼此为相反侧的两处位置。

第一次培养用容器的下部结构体(26)形成与上部结构体(22)的爪状结构(25)卡合的锁孔(33)。锁孔(33)形成在圆筒剖视下彼此为相反侧的两处位置。

另外，下部结构体(26)具备通过以间隔2cm施加垂直槽且使槽间比周围圆筒高5mm而形成抓持部(30)。抓持部(30)形成在圆筒剖视下彼此为相反侧的两处位置。在本实施例的方案中，通过施加抓持部(30)适度的物理性压力，使容器外形稍微变形及扭曲，可容易进行上部结构体的分离。

另外，在抓持部(30)的圆筒剖视下彼此为相反侧的两处位置具有与主体容器单元的主体容器的爪状结构(44)卡合的锁孔(32)。

形成上部结构体(22)的容器上表面的部分为外径57mm、内径50mm、构件高度外部尺寸9.1mm、且构件高度内部尺寸7.1mm的圆筒状的盖状结构体。由作为聚苯乙烯的透光性构件构成。圆筒形状部分的外壳底部具备作为用于保持第一次培养容器的密闭性的弹性构件O型环(29)。该外壳底部是作为释放结构闭塞构件(35)而发挥功能的结构部分。

虽然上部结构体(22)的上表面整体上为平坦形状的顶盖结构，但该结构的中央部分具有内径22.4mm的开口部(23)。该开口部(23)的周边位置具有能与细胞分选单元侧的筒状结构体的底面(16)卡合的结构。

在上部结构体(22)的上部外缘形成有以宽度20mm且比周围圆筒29.7mm高的方式形成的抓持部(24)。抓持部(24)形成在圆筒剖视下彼此为相反侧的两处位置。通过施加给抓持部(24)适度的物理性压力，使容器外形产生稍微的变形及扭曲，可容易地对本发明的主体容器单元的下部结构体(26)进行装卸。

从抓持部(24)的上端往下10.5mm的位置具备可与下部结构体(26)的锁孔(33)卡合的爪状结构(25)。爪状结构(25)形成在圆筒剖视下彼此为相反侧的两处位置。

第一次培养用培养面的平板状构件(27)为进行了具有细胞剥离作用的表面修饰的培养平板，为形成第一次培养用培养面的构件。作为本实施例的平板状构件(27)，为由聚苯乙烯树脂构成的透光性构件，为外径57mm且基材厚度1mm的圆板形状构件。

平板状构件(27)的基材表面具有以作为温度应答性聚合物的聚-N-异丙基丙烯酰胺接枝共聚于基材分子而成的表面修饰结构。在本实施例中，使用赛鲁希德(CELL SEED)公司制的UpCell(注册商标)为第一次培养用平板状构件。

关于作为本实施例的第一次培养用培养面的平板状构件(27)的细胞剥离作用的评价试验结果示于实施例4。

如图4所示，作为第一次培养用单元(3)的组合状态后的状态，为如下结构：在下部结构体(26)的内侧底面嵌入有作为第一次培养用培养面的平板状构件(27)，进一步在其上侧装载上部结构体(22)。

此处，作为第一次培养用培养面的平板状构件(27)通过下部结构体(26)的底部内框及上部结构体(22)的侧面而经由作为弹性构件的O型环(29)夹持的结构。因此，在上部结构体(22)插入至最下的状态下，下部结构体(26)的释放结构(28)为关闭状态，为可保持内部的液体培养基等的结构。在本实施例中，上部结构体的侧面底部作为释放结构闭塞构件(35)而发挥功能。

通过如此构件结构，在本实施例的第一次培养用单元中，构成第一次培养用容器(21)的集合构件结构体的内侧部分为实质上能培养的有效内径

该容器中能培养的有效底面积为19.62cm²，另一方面，在使上部结构体(22)朝上侧移动的情况下，释放窗(28)为开启状态。

(4)“主体容器单元”

本实施例的主体容器单元(4)为主要由主体容器(41)及主体盖状部(56)构成的容器状结构体。

本实施例的主体容器由上部结构体(42)与下部结构体(54)构成。

下部结构体(54)为大致长方体状的容器形状的构件，为由聚苯乙烯构成的透光性构件。下部结构体(54)的内侧底面为增殖培养用的培养面(55)。容器内侧底面的内部尺寸为97.5mm×81.5mm，容器底面积为78.6cm²。该面积约为第一次培养用单元的培养面积的四倍。另外，主体容器(41)的外部尺寸为98mm×83mm。另外，容器高度的内部尺寸为30mm，外部尺寸为34.2mm。

上部结构体(42)为在中央附近具备可插入/插出培养单元的开口部(43)的构件，为与下部结构体(54)嵌合固定而构成主体容器的上表面周边部的构件。为由聚苯乙烯构成的透光性构件。在本实施例中，是为了确保气密性而与下部结构体(54)粘接固定的形态。

在开口部(43)为内径61.4mm的圆形开口结构，在形成开口部的内框部分具有能与作为上一阶段的培养单元的第一次培养用单元侧卡合的爪状结构(44)。爪状结构(44)形成在圆筒剖视下彼此为相反侧的两处位置。另外，在开口部(43)的外缘形成有从主体上部延伸的短圆筒状结构(45)。该短圆筒状结构作为与主体盖状部(56)嵌合连接的嵌合结构部(45)而发挥功能。该短圆筒状的嵌合部的外侧面形成有能与主体盖状部(56)卡合的爪状结构(46)。爪状结构(46)形成在圆筒剖视下彼此为相反侧的两处位置。

上部结构体(42)具有培养基交换口(51)，该口连接有能使增殖培养用的培养基的交换容易实施的培养基交换用管(52)。培养基交换用管(52)为内径3.6mm、外径7.6mm、圆筒长度40.2mm的管道状结构体，为其下端固定于高于主体容器(41)底面0.1～0.2mm的位置的结构体。通过将栓盖(53)连接于培养基交换用管(52)，能使主体容器单元(4)维持为密闭状态。

上部结构体(42)具有如下结构：具有气体交换口(47)，连接有与具备灭菌滤器(49)的气体交换用端口(48)。在本实施例中，在上部结构体(42)形成两处气体交换口(47)。

主体盖状部(56)为可与主体容器的上部结构体(42)卡合的盖状构件。其外径81.2mm、内径74mm、盖高度外部尺寸10.8mm、且盖高度内部尺寸8.8mm的圆筒状结构物。为由聚苯乙烯构成的透光性构件。

主体盖状部(56)的上表面为平坦圆板形状。主体盖状部(56)的侧面结构具有能与上部结构体的嵌合结构部(45)的爪状结构(46)卡合的锁孔(59)。进而，在主体盖状部(56)的侧面结构的上部内侧具备用于保持密闭性的O型环(57)。

另外，在主体盖状部(56)的底面中央部具备用于与细胞分选单元的筒状结构体(13)的上表面卡合而接触固定的短圆筒状结构(58)。

如图2所示，作为主体容器单元(4)的组合后的状态，为主体容器下部结构体(54)与主体容器上部结构体(42)在确保气密性的状态下被粘接固定的状态。另外，在上部结构体(42)中，为如下结构：在培养基交换口(51)连接有培养基交换用管(52)，在气体交换口(47)连接有具备灭菌滤器(49)的气体交换用端口(48)。

主体盖状部(56)经由O型环(57)与主体容器上部结构体(42)的盖嵌合结构部(45)嵌合，可使容器处于密闭状态。另外，主体容器单元(4)在将细胞分选单元(2)及第一次培养用单于(3)收纳于主体容器单元内的状态下，能使容器整体为密闭状态。

[实施例2]『干细胞的细胞分选及增殖』

使用上述实施例所制造的细胞分选培养增殖容器，进行对干细胞的细胞分选工序、第一次培养工序、细胞剥离工序、及增殖培养工序。

(1)“细胞及培养基”

在本实施例中，作为分选前的组织细胞及各种液体培养基，使用如下表所示的组织细胞及液体培养基。需要说明的是，作为抗生素使用正大霉素(gentamicin)及双性霉素(amphotericin)。另外，作为趋化因子使用G-CSF。

[表2]

(2)“细胞分选工序”

如图1、2所示，使用实施例1所制造的细胞分选培养增殖容器(1)，组装并准备细胞分选单元(2)、第一次培养用单元(3)及主体容器单元(4)，分选源自狗大犬齿的齿髓组织的干细胞。表示本实施例的细胞分选工序的概念的模式图示于图7。

如图4所示，从细胞分选培养增殖容器(1)将细胞分选单元(2)及主体盖状部(56)取出，从第一次培养用容器上部结构体的开口部(23)将含趋化因子的细胞分选用培养基注入至第一次培养用容器内，使气泡从该开口部(23)脱气。

将细胞分选单元(2)配置于该开口部(23)的上部而卡合固定，细胞分选膜(11)装载为不混入气泡地接触于细胞分选用培养液的液面。

接着，将使源自狗大犬齿的齿髓组织细胞悬浮的细胞悬浮液从膜保持结构体的上侧开口部(14)注入填充到内侧，安装主体盖状部(56)，在CO₂浓度5％且37℃的培养器内培养48小时。此处，两处气体交换口(47)为开启状态，培养基交换口(51)为关闭状态。

分选培养后，不开封主体盖状部(56)，使用相位差显微镜从该容器上方观察。其结果观察到：在第一次培养用培养面(27)上分选出70～280个细胞程度的细胞。另外，细胞膜分选膜(11)上未确认到细胞附着。本工序的分选培养后的细胞的照片图像示于图11A。

(3)“第一次培养工序”

在上述(2)所述的细胞分选工序后，进行增殖到规定细胞量的第一次培养。表示本实施例的第一次培养工序的概念图示于图8。

在上述分选培养后，开封主体盖状部(56)，如图4所示那样将细胞分选单元(2)及主体盖状部(56)取出，从第一次培养用容器上部结构体的开口部(23)将含趋化因子的细胞分选用培养基交换为第一次培养用培养基。然后，关闭主体盖状部(56)，再次在CO₂浓度5％及37℃的培养器内培养，直至细胞满度为60～70％。

培养后，不开封主体盖状部(56)，使用相位差显微镜从该容器上方观察。其结果确认到：在第一次培养用培养面(27)上培养有干细胞。本实施例的容器中，考虑到第一培养用培养面的底面积与主体容器的增殖培养用面(55：第二次培养用培养面)的底面积比，确认了：已增殖到适合下一阶段的增殖培养的充分细胞量。本工序的第一次培养后的细胞的照片图像示于图11B。

(4)“细胞剥离工序”

在上述(3)所述的第一次培养工序后，进行将所培养的细胞从第一次培养用培养面剥离的操作。表示本实施例的细胞剥离工序的概念的模式图示于图9。

在上述第一次培养后，开封主体盖状部(56)，从第一次培养用容器上部结构体的开口部(23)交换第一次培养用容器内的培养用培养基，再次密封主体盖状部(56)。

然后，为了使容器整体降温至第一次培养用培养面(27)的表面修饰分子的相转移温度，在4℃下冷却60分钟，从该容器上方使用相位差显微镜进行观察而确认了剥离状态。

接着，如图5所示，开封主体盖状部(56)，取出第一次培养用上部结构体(22)，使在第一次培养容器下部结构体的侧面部的释放窗(28)为释放状态，使含有悬浮状态的剥离细胞的液体培养流出到主体容器(41)侧。另外，再次由液体培养基对第一次培养用培养面(27)进行淋洗，使残余的全部细胞也流出到主体容器(41)侧。

此处，本工序后的从第一次培养用培面的细胞剥离率为90％以上。本工序的细胞剥离后的细胞的照片图像示于图11C。

(5)“增殖培养工序”

在上述(4)的操作后，进行用于增殖培养的第二次培养。表示本实施例的增殖培养工序的概念的模式图示于图10。

在上述剥离工序的一系列的操作后，如图6所示，将第一次培养用容器下部结构体(26)取出，密闭主体盖状部(56)，摇动整个容器而使底面的细胞均匀化。然后，在CO₂浓度5％且37℃的培养器内进行培养。

增殖培养后，不开封主体盖状部(56)，从该主体容器的上方使用相位差显微镜进行观察。其结果确认到：干细胞已充分粘接并增殖。本工序的增殖培养后的细胞的照片图像示于图11D。

(6)“细胞特性评价”

对于通过上述(1)～(5)的一系列操作及工序所分选培养增殖的细胞，评价细胞特性。

针对作为干细胞表面抗原标记的CD105、G-CSFR、CXCR4，使用各抗体进行流式细胞术的解析。作为对照组，使用未分选的源自狗大犬齿的齿髓细胞，通过流式细胞术方法，进行与本发明的细胞分选培养增殖法所分选的细胞特性的比较。表示干细胞标记的阳性率的结果示于表3。

其结果确认到：通过上述(1)～(5)的一系列操作及工序所得的细胞为表现出高于作为对照组的未分选细胞的干细胞标记阳性率，表现干细胞的特征的细胞。

另外，作为第一次培养工序后的细胞剥离工序，即使在利用温度感受性聚合物进行细胞剥离工序的情况下，确认到对干细胞的细胞特性仍无影响。

[表3]

(7)应用例

如上述(1)所记载的那样，虽然本实施例为作为细胞分选前的组织细胞使用了齿髓组织细胞的实证例，但若合并考虑细胞分选膜(11)的微细孔的孔径、趋化因子的特征、及WO2012/133803号公报的记载，可知：使用本实施例的容器也可从骨髓组织及脂肪组织等直接分选干细胞并使其增殖。

〔实施例3〕『关于细胞分选膜的评价』

对于上述制造的细胞分选培养增殖容器，对构成细胞分选单元的细胞分选膜的微细结构及抑制细胞附着能力进行了验证。

(1)“关于微细结构的结构评价”

对构成上述制造的细胞分选单元的细胞分选膜的微细结构进行了验证。

对于上述实施例1(2)以印刷中(imprinting)法制造的细胞分选膜，用扫描型电子显微镜(SEM)观察了表面微细结构。显微镜照片的拍摄结果示于图12。

其结果确认到：上述实施例所制造的细胞分选膜为具有将平均孔径8μm的微细孔以开孔率20％配置的微细结构的膜。另外，孔基本垂直地连通膜表面，以等间隔合规地配置为格子状，因此并未确认到孔彼此的重叠造成的微细孔的扩大的情况。

另一方面，作为对照组，在以传统方法的重粒子照射对PE形成微细孔的膜中，孔的排列随机，存在重叠且大的孔，进一步在粒子未垂直贯通的情况下，为椭圆状的孔(图13)。已知：随着开孔率提升，该现象更显著。

根据该结果可知，上述实施例所制造的细胞分选膜为根据尺寸对细胞的选择性高的膜，且微细结构显示其为透过效率优异的膜。需要说明的是，该孔径为特别适合干细胞的分选的孔径。

(2)“关于抑制细胞附着能力的功能评价”

对构成上述实施例所制造的细胞分选单元的细胞分选膜的抑制细胞附着能力进行了验证。

对于上述实施例1(2)以印刷中(imprinting)法制造的细胞分选膜，进行了亲水性聚合物不同浓度下的抑制细胞附着能力的评价。

将以印刷中(imprinting)法开孔的PE膜浸渍于含有表4所述的浓度的聚乙烯吡咯烷酮-聚醋酸乙烯酯共聚物及0.1wt％乙醇的溶液，然后以该状态照射γ线25KGy。

所得的进行了亲水性聚合物表面修饰的细胞分选膜融接于适合聚苯乙烯制的24孔培养盘的嵌套(insert)容器，播种含干细胞的细胞分选用培养基，于CO₂浓度5％的培养器内培养48小时。

在本实施例中，对于源自狗犬齿髓组织的FI65N DPSCs的第三代继代的干细胞，每孔(well)使用2×10⁴个细胞。另外，作为培养用培养基，使用含10％FBS的DMEM培养基。

培养后，从容器取出膜而进行吉姆萨(Giemsa)染色，以图像解析软件Image J测定细胞(核)数及面积。使用所得的值，根据后述式(1)计算出对PE膜的细胞未粘接面积率(％)。结果示于表4及图14。另外，细胞分选膜的显微镜照片图像示于图15。

式(1)：细胞未粘接面积率(％)＝(图像总面积-细胞面积)/图像总面积×100

其结果示出：通过使用亲水性聚合物浓度0.1％以上的溶液对PE膜进行表面处理，能使PE膜表面的性质显著改变，充分发挥对细胞分选膜的抑制细胞附着效果(试样3-2～3-4)

[表4]

[实施例4]『关于细胞剥离的评价』

对于上述制造的细胞分选培养增殖容器，对第一次培养用单元的第一次培养用培养面的细胞剥离作用进行了验证。

在培养皿配置上述实施例1(3)所述的作为第一次培养用培养面的板状结构体(细胞剥离功能平板)。该板状结构体为具有该表面被作为温度应答性聚合物的聚-N-异丙基丙烯酰胺分子修饰了的结构的平板。

在作为该板状结构体的平板上，播种含有干细胞的培养基，在CO₂浓度5％的培养器内培养24小时。在本实施例中，对于源自狗犬齿髓组织的FI65N DPSCs的第4代继代的干细胞，在每一平板

上播种4×10⁴个细胞。另外，作为培养用培养基，使用含10％FBS的DMEM培养基。

培养后，为了降温至平板的表面的修饰分子的相转移温度，在4℃下冷却60分钟。分别在即将低温培养前、经低温培养30分钟后、经低温培养60分后、及低温处理后的移液吸排后，对板状结构体的平板表面进行观察及浮游细胞数(未粘接细胞数)的计数。

使用所得的数值，根据下述(2)计算出对板状结构体的细胞剥离率。结果示于表5及图16。另外，板状结构体的平板表面的显微镜照片图像示于图17。

式(2)：细胞剥离率(％)＝(浮游细胞数/播种细胞数)×100。

其结果显示：在使用以聚-N-异丙基丙烯酰胺进行了表面修饰的平板的情况(试样4-1)下，通过低温处理，平板表面发生相转移，发挥了从板状结构体的平板表面的细胞剥离作用。详细而言，显示：通过30分钟的低温处理，有约54％的细胞剥离。进而，确认到：在60分钟的低温处理中，剥离效果被显著提升至87％，进一步通过进行移液吸排的物理性处理，有93.5％的细胞剥离。

[表5]

[实施例5]『不开封主体容器单元而进行全部工序的方案』

对上述实施例所制造的细胞分选培养增殖容器进行改良，不开封主体容器单元而进行对干细胞的细胞分选工序、第一次培养工序、细胞剥离工序、及增殖培养工序。

(1)“细胞分选培养增殖容器”

在上述实施例所制造的细胞分选培养增殖容器中，除了变更构成构件的一部分规格以外，以与实施例1所述方法同样地制造细胞分选培养增殖容器(1)。本实施例中变更的构件如下所述。

i)构件构成的规格变更

第一次培养用单元的第一次培养用容器上部结构体(22)，使用上表面部的顶板部具备作为中空管状构件插入/插出结构(34)的8mm的开口部的结构体。另外，作为上部结构体(22)，设为在两个把持部(24)的上端配设能与主体盖状部的侧面结构的锁孔连接的爪状部的结构体。

作为主体容器单元中的主体盖状部(56)，使用如下结构体：具备在离上部的顶板中心37mm的位置埋设有外径37mm且构件厚度0.5mm的圆筒形状的硅树脂而成的中空管状构件插入/插出结构(60)。另外，设为如下结构：在主体盖状部(56)的侧面结构的内侧具备能与第一次培养用容器上部结构体的把持部的爪状部卡合的具备锁孔的结构。

ii)组装结构的规格变更

在本实施例中的细胞分选培养增殖容器(1)的组装中，除了变更一部分的构成外，以与实施例1所述方法同样地进行。本实施例的变更处如下所述。

在本实施例的容器中，为如下结构：在将第一次培养用单元(3)收纳于主体容器单元内(4)，以主体盖状部(56)密封主体容器时，第一次培养用容器上部结构体的把持部(24)的爪状部与主体盖状部(56)的锁孔卡合连接。

通过该结构，能与主体盖状部的转动操作连动，将侧面底部被作为释放结构闭塞构件(35)的第一次培养用容器上部结构体朝上方转置，因此使第一次培养用容器下部结构体的释放窗(28)变为释放状态。在该操作中，由于主体盖状部的上部内侧的O型环(57)可确保气密性，因此主体容器单元可在维持密封状态下实施。

另外，在本实施例的容器中，在将第一次培养用单元收纳于主体容器单元的状态下，变为主体容器的增殖培养面与第一次培养用容器的底面外壁之间设有可增殖细胞的空隙的状态。

在本实施例的容器中，为如下结构：主体盖状部的中空管状构件插入/插出结构(60)与第一次培养用容器上部结构体的中空管状构件插入/插出结构(34)配设为俯视时位于重叠位置。

(2)“干细胞的细胞分选及培养增殖”

使用上述(1)所制造的细胞分选培养增殖容器(1)，进行对干细胞的细胞分选工序、第一次培养工序、细胞剥离工序及增殖培养工序。在本实施例中，对实施例2，变更下述操作而进行实验。另外，除此以外的操作、实验条件以与实施例2所述方法同样地进行。

i)第一次培养用容器内的培养基交换操作

在进行细胞分选后，将具备20G针长38mm注射针的注射器针插入主体盖状部的中空管状构件插入/插出结构(60)，经由第一次培养用容器上部结构体的中空管状构件插入/插出结构(34)进行将第一次培养用容器(21)内的细胞分选用培养基交换为第一次培养用培养基的操作。此处，在培养基交换下的注入新鲜的培养基时，以第一次培养用培养基的液面低于细胞分选膜(11)的膜面的方式填充。不开封主体容器单元(4)而进行该一系列的操作。表示该操作的概略的模式图示于图18。

ii)第一次培养工序的再播种操作

从开始第一次培养经过4天后，在4℃下冷却60分钟而进行细胞剥离操作。然后，使整个容器震荡而使剥离细胞在培养基中均匀化，再次在CO₂浓度5％且37℃的培养器内培养，直至细胞满度为60～70％。不开封主体容器单元(4)而进行该一系列的操作。

iii)释放结构的释放操作

进行终止第一次培养工序后的细胞剥离后，转动主体盖状部(56)使第一次培养用容器上部结构体(22)朝上方转置，使第一次培养用容器下部结构体的释放窗(28)为释放状态。使主体容器震荡，使已剥离的悬浮细胞完全流出到主体容器(41)侧。不开封主体容器单元(4)而进行该一系列的操作。

iv)增殖培养工序

将第一次培养用容器等维持为收纳状态，不开封主体容器单元(4)而进行增殖培养工序。

(3)“评价”

对于上述一系列操作及工序分选增殖的细胞，与实施例2同样地评价了细胞特性。其结果确认到：本实施例所得的细胞为表现出高于对照组的未分选细胞的阳性率，表现干细胞的特征的细胞。

另外，在本实施例中，很明显：在进行第一次培养工序的再播种操作时，与实施例2相比干细胞含有率变高，增殖培养工序的增殖速度也提升。

如上所示，通过使用本实施例的细胞分选培养增殖容器(1)，不开封主体容器单元(4)也能实施干细胞的细胞分选及培养增殖。即，可在大幅降低感染、污染的状态下进行干细胞的细胞分选及培养增殖。

另外，示出：第一次培养工序的中途阶段的再播种操作在提升干细胞的回收效率上方面是有效的。

[实施例6]『具备转动调节机构的方案』

对上述实施例所制造的细胞分选培养增殖容器进行改良，制作具备使主体容器单元的主体盖状部的转动操作的操作性提升的转动调节机构的细胞分选培养增殖容器。

(1)“细胞分选培养增殖容器”

在上述实施例所制造的细胞分选培养增殖容器中，除了变更构成构件的一部分规格外，以与实施例1所述方法同样地制造如图19所示的细胞分选培养增殖容器(1)。本实施例所变更的构件如下所述。

i)构件构成的规格变更

作为第一次培养用单元的第一次培养用容器上部结构体(22)，使用上表面部的顶板部具备作为中空管状构件插入/插出结构(34)的8mm的开口部的结构体。另外，设为如下结构体：在两个把持部(24)的上端配设了能与主体盖状部的侧面结构的锁孔连接的爪状部。另外，作为第一次培养用容器下部结构体(26)，设为如下结构体：在两个把持部(30)的上部具有法兰(flange)结构，该法兰上配设了能与主体盖状部的侧面结构的锁孔连接的嵌合结构。

作为主体容器单元的主体容器上部结构体(42)，在与主体盖状部的嵌合结构(45：短圆筒结构)的外周接触配设了扣锁环(62)(参照图19)。扣锁环(62)为具备弹性的硬质树脂制(聚碳酸酯制)的环状结构构件，为具备八个排列的调节部(63)的结构的构件(图20A)。

调节部(63)将四个从扣锁环(62)的中心以辐射角20～35°的间隔并列配设于环圆周的结构，在该环(62)的中心的对称侧也分别配设四个。调节部(63)在上表面具备构件高度为0.2mm的两个一组的凸台(64)，其下部结构形成有对凸台上侧施加压力时能使下侧挠曲变形的凹陷结构(65)(图20B)。另外，在该实施例的方案中，将构成调节部(63)的两个凸台中的其中一个设为用于防止逆转转动而在内侧具有垂直面的梯形形状的防止逆转凸台(64b)。

作为主体容器单元的主体盖状部(56)，使用如下结构体：具备在离上部的顶板中心37mm的位置埋设有外径37mm且构件厚度0.5mm的圆筒形状的硅氧树脂而成的中空管状构件插入/插出结构(60)。

另外，作为主体盖状部(56)，设为如下结构：在主体盖状部(56)的侧面结构的内侧具备能与第一次培养用容器上部结构体的把持部(24)的爪状部卡合的具备锁孔的结构。另外，设为如下结构：在主体盖状部(56)的侧面结构的内侧具备能与第一次培养用容器下部结构体的把持部(30)的法兰上的嵌合结构卡合的具备锁孔的结构。另外，为如下结构：在主体盖状部(56)的侧面结构的下侧具备扣压用突起部(66)。扣压用突起部(66)为将下侧作为顶点的山型三角形状的结构体，在从扣锁环(62)的中心呈点对称的位置形成两个。

ii)组装结构的规格变更

在本实施例的细胞分选培养增殖容器(1)的组装中，除了变更一部分的构成以外，以与实施例1所述方法同样地进行。本实施例的变更处如下所述。

在本实施例的容器方案中，为如下结构：通过主体盖状部的转动操作，在主体盖状部(56)的侧面结构的下侧所配设的扣压用突起部(66)通过构成调节部(63a)的凸台(64)时，会产生按压力变化的感触及咔嗒声。由此，本发明的容器能使操作人员容易地认知到主体盖状部的转动程度的阶段及与其对应的容器结构的变形状态。

在本实施例的容器中，为如下结构：将第一次培养用单元(3)收纳于主体容器单元(4)内，以主体盖状部(56)密封主体容器时，第一次培养用容器上部结构体的把持部(24)的爪状部与主体盖状部(56)的锁孔卡合连接。在该状态下，在构成扣锁环(62)所配设的四组中最右侧的调节部(63a)的两个凸台(64)之间，变为收纳了主体盖状部(56)的侧面结构的下侧所配设的扣压用突起部(66)的状态(图21A)。

在该状态下转动主体盖状部而使扣压用突起部(66)移动至从右侧数第二个调节部(63b)时，与该操作连动，侧面底部作为释放结构闭塞构件(35)的第一次培养用容器上部结构体朝上方转置，使第一次培养用容器下部结构体的释放窗(28)变为释放状态(图21B)。

而且，通过该主体盖上部的转动操作，可实现第一次培养用容器下部结构体的把持部(30)的法兰(flange)结构上的嵌合结构与主体盖状部(56)的锁孔卡合连接的状态。此处，在本实施例的容器中，在扣压用突起部(66)位于从右侧数第一个调节部(63a)或第二个调节部(63b)的状态下，第一次培养用容器下部结构体(26)的底面外壁为接触主体容器的增殖培养面(55)的状态(图21B)。

在此状态下进一步进行主体盖状部的转动而使扣压突起部(66)移动至右侧数第三个调节部(63c)时，与该操作连动，第一次培养用容器下部结构体(26)的底面朝上方转置，在第一次培养用容器下部结构体(26)的底面外壁与主体容器的增殖培养面(55)之间形成细胞可增殖的空隙。在本实施例的容器中，实现了通过该空隙的形成而使进行增殖培养工序时的培养面的面积增大的对容器形状的结构变形(图21C)。

在本实施例的容器中，主要构件为：具备八个排列(两组各四个)的上述调节部(63)的扣锁环(62)及扣压突起部(66)构成的转动调节机构(61)。

就本实施例的容器的上述操作而言，由于主体盖状部的上部内侧的O型环(57)确保气密性，因此可在主体容器单元维持密封状态下实施。

另外，在本实施例的容器中，为如下结构：主体盖状部的中空管状构件插入/插出结构(60)与第一次培养用容器上部结构体的中空管状部插入/插出结构(34)配设为俯视时位于重叠的位置。

(2)“干细胞的细胞分选及培养增殖”

使用上述(1)所制造的细胞分选培养增殖容器(1)，进行对干细胞的细胞分选工序、第一次培养工序、细胞剥离工序及增殖培养工序。在本实施例中，对于实施例2，变更下述操作而进行实验。另外，除此以外的操作或实验条件以与实施例2所述方法同样地进行。

i)第一次培养用容器内的培养基交换操作

使上述(1)所制造的细胞分选培养增殖容器(1)处于第一次培养用容器下部结构体(26)的底面与主体容器培养面(55)接触而被收纳的状态。在该状态下扣压突起部(66)处于与右侧数第一个调节部(63a)宽松嵌合的状态。进行细胞分选后，在主体盖状部的中空管状构件插入/插出结构(60)插入具备20G针长38mm注射针的注射器，经由第一次培养用容器上部结构体的中空管状构件插入/插出结构(34)，进行将第一次培养用容器(21)内的细胞分选用培养基交换为第一次培养用培养基的操作。不开封主体容器单元(4)而进行该一系列的操作。

ii)第一次培养工序的再播种操作

从开始第一次培养经过4天后，在4℃下冷却60分钟而进行细胞剥离操作。然后，使整个容器震荡而使剥离细胞在培养基中均匀化，再次于CO₂浓度5％且37℃的培养器内培养，直至细胞满度为60～70％。不开封主体容器单元(4)而进行该一系列的操作。

iii)释放结构的释放操作

进行终止第一次培养工序的细胞剥离后，将主体盖状部(56)朝右方转动，使扣压突起部(66)移动直到其与右侧数第二个调节部(63b)呈现宽松嵌合的状态。通过该操作，第一次培养用容器上部结构体(22)朝上方转置，使第一次培养用容器下部结构体的释放窗(28)变为释放状态(图21B)。

而且，震荡主体容器而使已剥离的悬浮细胞完全流出到主体容器(41)侧。不开封主体容器单元(4)而进行该一系列的操作。

iv)增殖培养工序

将主体盖状部(56)进一步朝右方转动，使扣压突起部(66)移动直到其与右侧数第三个调节部(63c)呈现宽松嵌合的状态。通过该操作，将第一次培养用容器下部结构体(26)的底面朝上方转置，变为第一次培养用容器下部结构体(26)的底面外壁与主体容器的增殖培养面(55)之间形成能使细胞增殖的空隙的状态(图21C)。而且，轻微震荡以使已剥离的悬浮细胞扩散于增殖培养面(55)。

在本实施例中，将第一次培养用容器等维持为收纳状态下，不开封主体容器单元(4)而进行增殖培养工序。

在培养终止后，将主体盖状部(56)进一步朝右方转动，使扣压突起部(66)移动直到其与右侧数第四个调节部(63d)呈现宽松嵌合的状态。该状态下将主体盖状部朝上方提起，整个取出与主体盖状部为连接状态的第一次培养用单元及细胞分选单元，回收主体容器内的培养细胞。

(3)“评价”

对于上述一系列操作及工序分选增殖的细胞，与实施例2同样地评价了细胞特性。其结果确认到：本实施例所得的细胞为表现高于对照组的未分选细胞的阳性率，表现干细胞的特征的细胞。

如上所示，通过使用本实施例的细胞分选培养增殖容器(1)，不开封主体容器单元(4)也可实施干细胞的细胞分选及培养增殖。即，可在大幅降低感染及污染的状态下进行干细胞细胞分选及培养增殖。

而且确认到：通过采用在主体盖上部具备与第一培养用单元的形状变化连动的转动调节机构(61)的方案，能使操作人员阶段性地认知到主体盖状部的转动操作的转动程度及与容器结构的状态。

[实施力7]『利用等离子处理的细胞分选膜的制造』

作为细胞分选膜的制造方案，对是否能通过等离子处理进行疏水性基材层表面的亲水处理进行了验证。

(1)疏水性基材的等离子处理

对可作为细胞分选膜(11)的基材层利用的膜厚度20μm的聚乙烯(PE)膜，进行低能量下的真空等离子处理。真空等离子处理使用艾斯提克(ESTEC)株式会社制的钟罩(belljar)型真空等离子装置，以表6所示电压施加条件进行。测定PE膜表面的接触角的结果示于表6。

其结果显示，通过进行0.5～1.75kV的电压施加下的真空等离子处理，PE膜表面的接触角减少且形成亲水化的膜结构体。显示出：该亲水化倾向为与施加电压的上升相关而提升的倾向。

另外，由于该接触角的值在PE膜上大致均匀，显示可在PE膜表面实现均匀亲水化。

根据以上结果显示：通过对PE膜进行低能量下电压施加的等离子处理，可制造疏水性基材层的表面呈均匀地亲水化的细胞分选膜。已知：该制造方案中所制造的细胞分选膜与高施加电压处理相比，6个月后也无接触角的变化，可认为：表面蚀刻极少而随时间推移劣化少的细胞分选膜。

[表6]

[实施例8]『培养面基材层的等离子处理』

作为第一次培养用培养面及增殖培养用培养面的制造方案，对是否能通过等离子处理进行疏水性基材层表面的亲水处理进行了验证。

(1)培养面表面的等离子处理

对可作为第一次培养用培养面及增殖培养用培养面利用的聚苯乙烯(PS)制的板状平板构件

进行低能量下的真空等离子处理。真空等离子处理，使用艾斯提克(ESTEC)株式会社制的钟罩(bell jar)型真空等离子装置，以0.5kV或1.0kV的电压施加条件进行。

测定该构件表面的接触角，显示：其角度与作为对照组的未处理的PS制平板构件(市售培养平板：接触角90.5°)相比，改变为亲水化的表面特性。需要说明的是，该平板表面的亲水化的程度由接触角的值判断，被认为：不损害细胞的粘接程度下的适度亲水化。

另外，在该等离子处理后的平板构件进行丙酮处理，确认到：有薄的不溶层的残留，因此确认于在疏水性基材表面形成有表面交联层。但是，在施加电压1.0kV的条件下，与施加电压0.5kv的情况相比，经丙酮处理而残留的不溶层的量少，因此推测施加电压高会导致蚀刻产生，降低表面的改性的程度，使接触角变大。

从以上结果可知，通过该等离子处理的制造方案所制造的培养平板构件为表面蚀刻少而随时间推移劣化少的平板构件。显示出：特别0.5kV的处理下交联层形成得多，为表面蚀刻极少而随时间推移劣化耐性特别优异的平板构件。

[表7]

(2)细胞培养试验

将上述(1)所制造的平板构件切割为四等分，在已切割的平板的表面，每一平板播种1×10⁴个细胞的干细胞，在CO₂浓度5％的培养器内培养60小时，随时间推移观察培养状态。作为干细胞，使用源自狗犬齿髓组织的VW190 DPSCs继代第5代的细胞。另外，作为培养用培养基，使用含有10％FBS的DMEM培养基。随时间推移观察结果示于图22及表8。

其结果显示，即使在使用通过等离子处理将表面特性适度亲水化的平板构件的情况下，也可达成与作为对照组的未处理的平板构件(市售培养平板)相同程度的细胞增殖。

根据以上结果显示，由等离子处理将表面特性适度亲水化的平板构件可优选地作为第一次培养用培养面及增殖培养用培养面使用。

[表8]

附图标记说明

1.细胞分选培养增殖容器

2.细胞分选单元

11.细胞分选膜

12.微细孔(细胞透过孔)

13.膜保持结构体、筒状结构体

14.开口部(液体注入部)

15.开口部(液体流出部)

16.底面部

17.环状结构体

18.开口部

3.第一次培养用单元

21.第一次培养用容器

22.上部结构体(第一次培养用容器上部结构体)

23.开口部(第一次培养用容器的上部开口部)

24.抓持部

25.爪状结构(与下部结构体的卡合用)

34.中空管状构件插入/插出结构

35.释放结构闭塞构件

26.下部结构体(第一次培养用容器下部结构体)

27.第一次培养用培养面、平板状构件

28.释放结构、释放窗

29.弹性构件、O型环

30.抓持部

31.法兰结构

32.锁孔(与本体容器的卡合用)

33.锁孔(与上部结构体的卡合用)

4.本体容器单元

41、本体容器

42.上部结构体(本体容器上部结构体)

43.开口部(培养单元插入/插出部)

44.爪状结构(与第一次培养用容器的卡合用)

45.嵌合结构(与本体盖状部的嵌合用)、短圆筒结构

46.爪状结构(与本体盖状部的卡合用)

47.气体交换口

48.气体交换用端口

49.通气用灭菌滤器

50.接合器

51.培养基交换口

52.培养基交换用管

53.栓盖

54.下部结构体(本体容器下部结构体)

55.增殖培养用培养面

56.本体盖状部

57.弹性构件、O型环

58.嵌合结构(与细胞分选单元的嵌合用)

59.锁孔

60.中空管状构件插入/插出结构

61.转动调节机构

62.扣锁环、具备调节部的环状结构体

63.调节部

63a～d.调节部

64.凸台

64a.凸台(山型三角形状)

64b.防逆转凸台(具有垂直面的梯形形状)

65.凹陷结构

66.扣压突起部

5.增殖用培养用单元

101.对象细胞

102.对象以外的细胞

111.细胞悬浮培养基

112.细胞分选用培养基

113.第一次培养用培养基

114.增殖培养用培养基

121.中空管状构件

Claims

1.一种能密闭的细胞分选培养增殖容器，其为能将所期望的对象细胞分选并培养增殖的容器状结构体，其特征在于，

(C)所述第一次培养用单元为如下容器状结构体：为容器状结构体，在该容器状结构体的内侧底面具有能培养通过了所述细胞分选膜的细胞的第一次培养用培养面，所述第一次培养用培养面的面积为10～400cm²，在该容器状结构体的侧面具有能将保持于该单元内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构；

(D)所述主体容器单元为如下容器状结构体：为容器状结构体，在该容器状结构体的内侧底面具备能培养从上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面，与第一次培养用单元具有的所述第一次培养用培养面为不同的培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽，具有能收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构。

2.根据权利要求1所述的细胞分选培养增殖容器，其中，

所述(C)所述的第一次培养用单元为：(c-1)容器状结构体，且(c-2)具有在将液体填充于该容器状结构体内时，能以细胞分选膜面与填充的液面接触的状态配设所述细胞分选单元的结构，(c-3)在该容器状结构体的内侧底面具有能培养通过了细胞分选膜的细胞的第一次培养用培养面，(c-4)在该容器状结构体的侧面具有能将保持于该容器内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构；

所述(D)所述的主体容器单元为：(d-1)主要由主体容器及主体盖状部构成的容器状结构体，(d-2)在该容器状结构体的内侧底面具备能培养从上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽，(d-3)在该容器状结构体的内部具有能收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构，(d-4)所述主体盖状部为能使容器整体处于密闭状态的盖状结构体。

3.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选单元为用于经由细胞分选膜在第一次培养用单元的容器状结构体侧将所期望的对象细胞分选的单元。

4.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，以将上一阶段的培养用单元的培养面的面积设为1的情况下的面积比计，所述增殖培养用培养面的面积在大于1且20以下的范围。

5.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选培养容器：

6.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述第一次培养用单元为由两个以上的构件构成的容器状结构体，且具有能通过构成该容器状结构体的构件的分离或转置而将所述能释放的结构调整为释放状态的结构。

7.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述第一次培养用单元具有能与来自主体容器单元的外部的操作连动而将所述能释放的结构调整为释放状态的结构。

8.根据权利要求2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述第一次培养用单元能与主体盖状部的操作连动而将所述能释放的结构调整为释放状态。

9.根据权利要求2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选培养容器为：

10.根据权利要求2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选单元具有能与主体盖状部的操作连动而调整细胞分选膜的位置的结构。

11.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述主体容器单元具备气体交换口而成。

12.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述主体容器单元具备能朝主体容器注入培养基及从主体容器排出培养基的培养基交换口。

13.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选单元为主要由细胞分选膜及膜保持结构体构成的容器状结构体，且所述膜保持结构体的被细胞分选膜覆盖的开口部的周边底面部为具备朝向所述开口部且朝上方的倾斜的形状。

14.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选培养增殖容器为：

(g-1)所述增殖培养用单元为容器状结构体，(g-2)在该容器状结构体的内侧底面具备能培养由上一阶段的培养用单元释放的细胞的增殖培养用培养面，该增殖培养用培养面的面积比上一阶段的培养用单元的培养面的面积宽，(g-3)在该容器状结构体的内部具有能装载或收纳细胞分选单元及到上一阶段的所有培养用单元的结构；(g-4)在构成该容器状结构体的侧面具有能将保持于该容器内部的细胞及液体自由地释放至具有下一阶段的培养面的单元侧的结构。

15.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，形成于所述细胞分选膜的微细孔的平均尺寸为1～20μm，该细胞分选膜的开孔率为5～50％。

16.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，形成于所述细胞分选膜的微细孔在垂直于和/或大致垂直于膜表面的方向开孔。

17.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，形成于所述细胞分选膜的微细孔的一部分或全部排列为格子状、大致格子状、交错状、大致交错状、漩涡状、大致漩涡状、同心圆状、大致同心圆状、或将它们组合的形状。

18.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选膜在由疏水性聚合物构成的基材层的表面具有共价键结有亲水性聚合物的结构。

19.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选膜：

20.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，通过在培养时表现细胞粘接性且因刺激应答而表现细胞剥离作用的分子，在所述第一次培养用培养面的表面和/或所述增殖培养用培养面的表面进行了表面修饰。

21.根据权利要求20所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述表现细胞剥离作用的分子是作为下限临界温度的相转移温度为15℃～35℃的温度应答性聚合物分子。

22.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述第一次培养用培养面和/或所述增殖培养用培养面：

23.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，构成所述细胞分选培养增殖容器的结构体：

24.根据权利要求1或2所述的细胞分选培养增殖容器，其中，所述细胞分选培养增殖容器为用于主动分选干细胞并使其增殖的容器。

25.一种细胞分选培养增殖方法，其特征在于，使用权利要求1～24中任一项所述的细胞分选培养增殖容器。

26.根据权利要求25所述的细胞分选培养增殖方法，其中，作为分选增殖对象的细胞而包含干细胞。