JP2000157295A

JP2000157295A - 生細胞数の測定方法

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Publication number: JP2000157295A
Application number: JP10333979A
Authority: JP
Inventors: Noriaki Hatsutori; 憲晃服部; Yasuhiro Harada; 靖広原田; Keiko Yachidate; 恵子谷地舘; Seiji Murakami; 成治村上
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1998-11-25
Publication date: 2000-06-13
Also published as: EP1134291A1; AU1409700A; WO2000031292A1

Abstract

(57)【要約】【課題】試料中に含まれる生細胞数を迅速かつ高感度
で測定する方法、その測定方法に用いるための測定キッ
トおよび上記測定方法を実施するための測定装置を提供
するものである。【解決手段】生細胞を含む試料を生細胞増殖用培地を
用いて順次段階希釈し、得られた希釈物を培養処理した
のち、該希釈物中の生細胞内ＡＴＰ量をルシフェリン−
ルシフェラ−ゼ発光反応を用いて測定することにより、
試料中に含まれる生細胞数を測定する方法、その測定方
法に用いるための測定キットおよび生細胞数測定装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に含まれる
生細胞数を迅速かつ高感度に測定する方法、測定試薬キ
ットおよび生細胞数測定装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】各種工業分野、臨床医学、基礎研究等の
現場では、試料液中の生細胞数の測定が広く行なわれて
いる。特に、食品工業、医薬品工業および化粧品工業な
どの分野では、使用する工業水、原料、中間体あるいは
製品中の微生物を含めた生細胞数の管理が極めて重要で
ある。従来からは、試料中の生細胞数の測定には、試料
をそのまま、あるいは簡易なフィルタ−上に生細胞を補
足した後、試料中の生細胞を標準寒天培地で長時間培養
し、コロニ−を検出するいわゆる平板培養法が一般に行
なわれている。また、試料中に含まれる生細胞数を測定
する別の方法として最確数法（ＭＰＮ法、菌数限度試験
法とも言う）が知られており、現在、我が国では、医
薬、化粧品等の品質検査の公定法として採用されてい
る。最確数法とは、試料を順次段階希釈し、各希釈液の
一定量を液体培地に接種した後、長時間培養し、濁度に
より生細胞の生育の有無を判定し、統計学的確立論に基
づいて、試料中の生細胞数を最確数として求める方法で
ある。最近では、ルシフェリン−ルシフェラ−ゼ反応を
用いる発光反応を利用して生細胞数を測定する方法が用
いられている。

【０００３】平板培養法は、寒天培地などの固形平板培
地上に試料を塗布し、２日〜７日間ほど培養したのち、
平板培地上に生育するコロニ−を数え、生細胞数を測定
する方法で、迅速に測定できないと言う欠点を有してい
た。また、最確数法は、生細胞の生育の有無を濁度を測
定することにより判定するため、長期の培養時間を必要
とする欠点を有する。

【０００４】ルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発光反応を
利用して生細胞数を測定する方法は、生細胞よりＡＴＰ
を抽出し、抽出したＡＴＰをルシフェリン−ルシフェラ
−ゼ発光反応を用いて発光させ、その発光量からＡＴＰ
量を求め、得られたＡＴＰ量と生細胞当たりのＡＴＰ量
から生細胞数を算出する方法である。

【０００５】ルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発光反応を
利用した生物発光試薬による生細胞数測定の例として、
ルシフェ−ル２５０プラス（キッコ−マン（株）製）を
用いて作成した、発光量からEscherichia coliの菌数を
求める検量線を図１に示した。図１より明らかなよう
に、Escherichia coliの検出下限は１０³ ＣＦＵ（生細
胞数の単位）／ｍｌである。また、細菌の場合、細菌１
菌体当たりのＡＴＰ含量は、ほぼ一定であることが報告
〔小高ら、日本食品微生物学会誌、１３、２９−３４、
（１９９６）〕されていることから、細菌一般について
も、生物発光法を用いて測定するとき、前記検量線、図
１から、生細胞数を求めることができるが、この場合の
検出下限も１０³ ＣＦＵ／ｍｌである。すなわち、上記
方法を用いるとき、この検出下限以下の生細胞数を測定
することは、原理的に不可能であるという問題があっ
た。

【０００６】更に、上記方法を用いて生細胞数を測定す
る場合、試料中に含まれる生細胞内ＡＴＰ以外のＡＴＰ
（バックグラウンドＡＴＰという）が、多量に存在する
と、生細胞内のＡＴＰがバックグラウンドＡＴＰに埋も
れてしまい、検出感度が低下するという問題があった。
バックグラウンドＡＴＰを分解する方法として、ＡＴＰ
分解酵素を有効成分とする試薬を用いる方法があるが、
この方法では、ＡＴＰの分解が不十分な場合が多く、問
題を解決することはできない。

【０００７】検出下限以下の試料やバックグラウンドＡ
ＴＰを多量に含む試料への対処法として、短時間培養し
て検出可能な生細胞数まで増殖させる方法がある。しか
し、この方法では、生細胞の検出は可能であるが、試料
中の生細胞数を測定することはできない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、試料
中に含まれる生細胞数を正確に、且つ短時間で測定する
方法、その測定方法に用いるための測定試薬キット、お
よび上記測定方法を実施するための生細胞数測定装置を
提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく種々検討した結果、試料を生細胞増殖用培
地で順次段階希釈した後、培養処理し、該培養処理希釈
物中の生細胞の有無をルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発
光反応を用いて判定することにより、試料中に含まれる
生細胞数を正確に且つ短時間で測定できることを見いだ
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、（１）以下の
工程を含むことを特徴とする、試料中の生細胞数の測定
方法、（ａ）試料を希釈溶液を用いて順次段階希釈する
第１工程、（ｂ）第１工程で得られた各希釈物を培養処
理する第２工程、（ｃ）第２工程で得られた培養処理し
た希釈物中の生細胞内ＡＴＰを測定する第３工程、
（ｄ）第３工程で得られた生細胞内ＡＴＰの測定結果に
基づいて、試料中の生細胞数を算出する第４工程。
（２）試料を順次段階希釈するために用いる希釈溶液
が、生細胞増殖用培地であることを特徴とする（１）記
載の生細胞数の測定方法。（３）試料を順次段階希釈す
るために用いる希釈溶液が、ＡＴＰを分解した生細胞増
殖用培地であることを特徴とする（１）又は（２）記載
の生細胞数の測定方法。（４）培養処理する第２工程に
おいて、培養処理中又は培養処理後に、希釈物中の生細
胞内ＡＴＰ以外のＡＴＰを分解することを特徴とする
（１）〜（３）のいずれか１号に記載の生細胞数の測定
方法。（５）生細胞内ＡＴＰを測定する方法が、ルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用する方法であ
る、（１）〜（４）のいずれか１号に記載の生細胞数の
測定方法。（６）（１）〜（５）のいずれか１号に記載
の生細胞数の測定方法に用いる測定試薬キットであっ
て、以下の試薬及び希釈溶液を含む測定試薬キット。
（ｅ）希釈溶液、（ｆ）ＡＴＰ抽出試薬、（ｇ）ＡＴＰ
測定試薬。（７）試料希釈装置、増殖用培養装置および
発光量測定装置を備える生細胞数測定装置を提供する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明で言う「生細胞」とは、増
殖能を有する細胞を言い、特に限定されない。例えば、
動物細胞、植物細胞、微生物（細菌、酵母糸状菌など）
などが挙げられる。「試料」としては、上記の生細胞を
含むと考えられるものであれば、いかなるものでもよ
く、例えば、飲食物、医薬品、化粧品、海水、河川水、
工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血液、喀痰、濃汁、
生細胞の培養物等が挙げられる。また、試料が固形分を
含む場合や、粘性を有する場合には、該試料を適当な溶
媒に懸濁し、溶液状の試料とすることが望ましい。溶媒
としては、例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝
液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ
る。

【００１１】本発明の第１工程では、得られた試料を希
釈溶液を用いて、順次段階希釈を行なう。希釈溶液とし
ては、前記測定対象となる生細胞の増殖用培地が好適に
用いられる。本発明で言う「生細胞増殖用培地」とは、
生細胞の増殖、発育を可能とする溶液であって、生細胞
の増殖、発育に必要な栄養成分を含む溶液のことであ
る。本発明に用いる生細胞増殖用培地として、特に限定
はされないが、対照となる生細胞にとって好適な増殖用
培地を選ぶことができる。例えば、動物細胞の増殖用培
地として、ダルベッコＭＥＭ培地、細菌の増殖用培地と
して、普通ブイヨン培地、酵母の増殖用培地として、ブ
ド−糖ペプトン培地等が挙げられる。

【００１２】順次段階希釈とは、希釈溶液を用いて試料
を希釈し、第１段階の希釈物を得、次に、同様に、希釈
溶液を用いて、得られた第１段階の希釈物を希釈し、第
２段階の希釈物を得、このようにして順次段階的に希釈
を行なうことである。順次段階希釈により、希釈倍率を
挙げてゆくことができ、更に、任意の希釈倍率を自由に
選択することもできる。一般には、例えば、試料１部に
対して、希釈溶液９部を合わせ、１０倍希釈物が得られ
る。以下、順次段階希釈により、１００倍、１０００倍
と、１０倍単位の希釈倍率の希釈物を得ることができ
る。

【００１３】本発明の第２工程では、第１工程で得られ
た希釈物を培養処理する。本発明で言う「培養処理」と
は、生細胞増殖用培地を用いて、温度、酸素濃度、時間
などの外部条件を制御しながら、生細胞を人工的に増殖
させることを言う。例えば、細菌の場合、試験管に分注
された生細胞増殖用培地で希釈された細菌を含む希釈物
を、３０℃、６時間、１００ｒｐｍで振盪培養する。対
象となる生細胞により、培養温度は５〜８０℃、振盪条
件は静置培養〜５００ｒｐｍの振盪培養、培養時間は１
〜１２０時間の範囲で培養処理条件を適宜選択すること
ができる。

【００１４】本発明では、生細胞内に含まれるＡＴＰ量
に基づいて得られた発光量から生細胞の有無を判定する
ため、希釈物中に含まれるバックグラウンドＡＴＰは、
検出感度の低下を引き起こす。そのため、生細胞内ＡＴ
Ｐの抽出に先立ち、希釈溶液および希釈物中又は培養処
理した希釈物中のバックグラウンドＡＴＰを分解するこ
とが望ましい。バックグラウンドＡＴＰを分解する方法
としては、ＡＴＰ分解酵素を有効成分とする試薬（以
下、ＡＴＰ消去剤という）を用いる方法が例示される。
ＡＴＰ分解酵素としては、例えば、アデノシンリン酸デ
アミナ−ゼ、アピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸
性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ、ホスホジエステラ
−ゼ等が挙げられる。これらの酵素は、単独又は２種類
以上を組み合わせて使用できる。バックグラウンドＡＴ
Ｐを分解した後は、希釈物中のＡＴＰ消去剤を除去ある
いは失活させることが望ましい。ＡＴＰ消去剤は、該消
去剤の阻害剤を作用させることにより失活させることも
できる。

【００１５】本発明において、バックグラウンドＡＴＰ
を分解する方法としては、第１工程に用いる希釈溶液と
して、前もってＡＴＰ消去剤によりＡＴＰを分解した希
釈溶液を用いる方法や第２工程の培養処理中又は培養処
理後にＡＴＰ消去剤を用いてバックグラウンドＡＴＰを
分解する方法が用いられる。

【００１６】本発明において、更に検出感度を上げる方
法として、フィルタ−を用いて集菌する方法を組み合わ
せても良い。例えば、第１工程で得られた各希釈物をフ
ィルタ−濾過して集菌した後、第２工程の培養処理を行
なう方法や第２工程で得られた培養処理した各希釈物を
フィルタ−濾過して集菌した後、第３工程の生細胞内Ａ
ＴＰの測定を行なう方法などがある。

【００１７】本発明の第３工程である、生細胞内ＡＴＰ
を測定するためには、先ず、培養処理した希釈物または
適量に分取された該希釈物の一部に含まれる生細胞内の
ＡＴＰを抽出し、次いで、抽出されたＡＴＰ量を測定す
る。生細胞内のＡＴＰの抽出方法としては、例えば、該
希釈物にＡＴＰ抽出試薬を添加し、生細胞内ＡＴＰを生
細胞外に抽出する方法が例示される。ＡＴＰ抽出試薬と
して、公知の試薬、即ち、リゾチ−ム、エタノ−ルとア
ンモニアの混合液、メタノ−ル、エタノ−ル、界面活性
剤（塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、トリ
トンＸ−１００など）、トリクロル酢酸、過塩素酸など
を使用できる。例えば、市販のルシフェ−ルＬＵプラス
（キッコ−マン（株）製）に付属のＡＴＰ抽出試薬を使
用することができる。次に、抽出されたＡＴＰを測定す
る方法としては、公知の種々のＡＴＰ測定方法を用いる
ことができる。例えば、ＡＴＰ抽出後の希釈物に、ＡＴ
Ｐ測定試薬を添加する方法が挙げられる。用いられるＡ
ＴＰ測定試薬としては、ＡＴＰ測定用試薬であれば、い
かなる測定試薬でもよく、具体的には、ルシフェリン−
ルシフェラ−ゼ発光反応法を用いたＡＴＰ測定試薬を採
用し得る。本発明のルシフェリンおよびルシフェラ−ゼ
としては、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカボタ
ル、ツチボタル等を由来とするものを用いることができ
る。ルシフェラ−ゼは上記生物の発光組織から精製した
天然型ルシフェラ−ゼや遺伝子工学的手法により調整し
た天然型ルシフェラ−ゼ、さらには天然型ルシフェラ−
ゼのアミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸に付加、
欠失、置換等の変異を導入した変異型ルシフェラ−ゼを
使用することができる。

【００１８】ルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発光反応法
では、まず、ルシフェリン、ルシフェラ−ゼ、マグネシ
ウム等を含むＡＴＰ測定試薬（以下、生物発光試薬と言
う）をＡＴＰを抽出した希釈物に添加する。生物発光試
薬とＡＴＰが反応して発光が生じるので、その発光量を
ルミノメ−タ−等の測定器を用いて測定する。生物発光
試薬としては、市販の試薬、例えば、ルシフェ−ルＬＵ
２５０プラス（キッコ−マン（株）製）に付属の生物発
光試薬を使用することができる。上記、ルシフェリン−
ルシフェラ−ゼ発光反応法の変法として、ピルベ−トオ
ルトホスフェ−トジキナ−ゼを含む生物発光法（以下Ｐ
ＰＤＫ発光法という）を用いることにより測定感度を更
に向上することができる（特開平９−２３４０９９号公
報）。

【００１９】第４工程では、培養処理した各希釈物中の
細胞内ＡＴＰの測定結果に基づいて、初発試料中の生細
胞数を測定する。即ち、発光量、発光量から得られるＡ
ＴＰ量、そして希釈倍率等から試料中の生細胞数やオ−
ダ−レベルの生細胞数を算出できる。又、最確数法を用
いて試料中の生細胞数を算出することもできる。

【００２０】生細胞数の測定試薬キットは、前述の希釈
溶液、ＡＴＰ抽出試薬およびＡＴＰ測定試薬を含むもの
である。ＡＴＰ抽出試薬およびＡＴＰ測定試薬として
は、例えば、ルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発光反応法
に基づいた市販の菌体内ＡＴＰ測定用試薬、ルシフェ−
ル２５０プラス（キッコ−マン（株）製）を挙げること
ができる。高感度での測定のため、バックグラウンドＡ
ＴＰを分解する必要がある場合には、前述した方法で、
例えば、市販のルシフェ−ルＡＴＰ消去剤（キッコ−マ
ン（株）製）を用いて、ＡＴＰ抽出試薬を添加する前に
バックグラウンドＡＴＰを分解する。キットは上記の希
釈溶液、試薬以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の
試薬としてはＡＴＰ消去剤等が挙げられる。

【００２１】さらに、本発明に係る生細胞数測定装置
は、前述の生細胞数測定方法を実施するための装置であ
り、試料希釈装置、増殖用培養装置および発光量測定装
置を備えるものである。試料希釈装置は試料を試験管に
順次段階希釈するための装置であり、市販の希釈装置、
例えば、システムダイリュ−タ−（販売元：グンゼ産業
（株））を用いることもできる。希釈装置のプログラム
設定により、任意かつ望ましい希釈溶液の容量や段階希
釈倍率を自動的に選択することができる。次に、増殖用
培養装置は、希釈物中の生細胞の培養処理を行なうため
の装置であり、恒温かつ振盪機能を有することが望まし
い。

【００２２】発光量測定装置は、生細胞内のＡＴＰを抽
出するための処理を行なう抽出処理装置と、抽出された
ＡＴＰをルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発光反応法によ
り発光させ、生じた生物発光を測定する発光測定装置
（ルミノメ−タ−）からなる。抽出処理装置は培養処理
した希釈物を含む試験管に、一定量のＡＴＰ抽出剤を添
加し、室温にて、自動的に抽出処理を行なうことができ
る。抽出処理を終えた試験管に一定量のルシフェリン−
ルシフェラ−ゼ発光試薬を添加し、生じた発光量を測定
する。例えば、発光量測定装置としては、市販のルミテ
スタ−Ｋ−１００（販売元：（株）盛進）を用いること
ができる。

【００２３】測定の結果、得られた発光量から、初発試
料中の生細胞数を算出する。本発明の生細胞数測定装置
に、以下の算出プログラムを組み込んだ演算装置を装備
しても良い。（１）発光量と希釈条件に基づく算出プロ
グラム。（２）発光量と希釈条件から、統計学的確立論
を用いた最確数法に基づく算出プログラム。なお、この
装置においては、各種デ−タ−の記憶、保存、およびプ
リントアウト等の機能を装備することもできる。

【００２４】本発明に係る、試料希釈装置、増殖用培養
装置および発光量測定装置を個々に機能的に結合させ
て、生細胞数測定装置として使用することもできるが、
上記３個の装置を一体化して、試料をセットすることに
より、自動的に試料中の生細胞数が得られるような、生
細胞数測定装置とすることが望ましい。

【００２５】以下、実施例により、本発明を更に具体的
に説明する。但し、本発明の技術的範囲は、これら実施
例により、何ら限定されるものではない。

【実施例】〔実施例１〕標準菌株を用いた生細胞数の測
定標準菌株として、エシェリチアコリ−（Escherichia
coli）ＡＴＣＣ２５９２２（以下、Ｅ株という）および
バチルスサチリス（Bacillus subtilis）ＡＴＣＣ９
３７２（以下、Ｂ株という）を用いた。この標準菌株２
株を普通ブイヨン液体培地３ｍｌに接種し、３５℃で一
晩培養した。この培養液をあらかじめ滅菌した生理的食
塩水で適宜希釈し、それぞれ試料として以下の生細胞数
の測定に供した。生細胞数の多い試料を試料１、生細胞
数の少ない試料を試料２とした。（１）本発明法オ−トクレ−ブで滅菌したチオグリコ−ル酸培地ＩＩ
（栄研化学（株）製）９０ｍｌに、濾過滅菌した１０ｍ
ｌのＡＴＰ消去剤（キッコ−マン（株）製）を添加して
得た、ＡＴＰを分解した生細胞増殖用培地を、希釈溶液
として用いた。試料１ｍｌを９ｍｌの希釈溶液に添加
し、良く撹拌し１０倍希釈物を得た。次に、１０倍希釈
物１ｍｌを９ｍｌの希釈溶液に添加し、撹拌し、１００
倍希釈物を得た。同様な操作を繰り返し、１０００倍、
１００００倍と１０倍単位で順次段階希釈された希釈物
を得た。得られた希釈物を３５℃、６時間培養処理し
た。培養処理後、その０．１ｍｌをキュベットに取り、
ルシフェ−ル２５０プラス（キッコ−マン（株）製）を
用いて、生細胞中のＡＴＰの抽出と該ＡＴＰによる生物
発光を行なった。生じた発光量をルミテスタ−Ｋ−１０
０（キッコ−マン（株）製）を用いて測定した。希釈溶
液０．１ｍｌを用いたときの発光量をブランク値とし、
ブランク値の１．５倍以上の発光量が得られた場合に、
培養処理した希釈物中に生細胞が存在すると判定した。
生細胞が存在すると判定された希釈物のうち、最大の希
釈倍率の希釈物の希釈倍率の値より、初発試料中の生細
胞数を算出した。（２）対照法１滅菌した生理的食塩水を希釈溶液として用いた。試料を
順次段階希釈し、１０倍単位で希釈された希釈物を得
た。希釈物の１００μｌを、シャ−レに分注し、固めた
標準寒天培地（栄研化学（株）製）上に塗布し、３５
℃、２日間培養した。出現したコロニ−数と希釈倍率よ
り、初発試料中の生細胞数を算出した。（３）対照法２試料１．０ｍｌをキュベットに取り０．１ｍｌのＡＴＰ
消去剤を添加し、室温にて３０分間反応させた。その
０．１ｍｌをキュベットに取り、ルシフェ−ル２５０プ
ラス（キッコ−マン（株）製）およびルミテスタ−Ｋ−
１００（キッコ−マン（株）製）を用いて生細胞内ＡＴ
Ｐによる発光量を測定した。得られた発光量から図１の
検量線により生細胞数を算出した。（４）結果（ａ）Ｅ株を用いたとき：本発明法による測定結果を表１に示す。

【００２６】

【表１】対照法１による測定結果を表２に示す。

【００２７】

【表２】対照法２による測定結果を表３に示す。

【００２８】

【表３】（ｂ）Ｂ株を用いたとき：本発明法による測定結果を表４に示す。

【００２９】

【表４】対照法１による測定結果を表５に示す。

【００３０】

【表５】対照法２による測定結果を表６に示す。

【００３１】

【表６】

【００３２】表１、表２、表４、及び表５の結果から、
本発明法で求めた生細胞数と対照法１で得られた生細胞
数は、Ｅ株、Ｂ株とも、試料１及び試料２のいずれにつ
いても、オ−ダ−レベルで一致していることが示され
た。一方、表３及び表６に示した通り、対照法２におい
ては、Ｅ株、Ｂ株とも、生細胞数を多く含む試料１で
は、図１の検量線より得られた生細胞数は、本発明法及
び対照法１により得られた結果とオ−ダ−レベルで一致
したが、試料２については、いずれの標準菌株について
も、試料中の生細胞数が１０³ ＣＦＵ／ｍｌ以下であっ
たため、発光量はブランク値と同等であり、実質的に測
定不可能であった。

【００３３】以上の結果は、本発明法が、対照法２で測
定できない生細胞数（１０³ ＣＦＵ／ｍｌ以下）の試料
も含めて、生細胞数の多少にかかわらず、短時間で生細
胞数をオ−ダ−レベルで測定することができることを示
した。〔実施例２〕カット野菜中に含まれる汚染菌（生細胞）
数の測定市販されているカット野菜、３種類を購入した。それぞ
れカット野菜１０ｇに滅菌した生理的食塩水１００ｍｌ
を添加して、ストマッカ−（販売元：オルガノ（株））
を用いて、ストマッカ−処理をした。得られたストマッ
キング液を試料とした。（１）本発明法上記試料を用い、〔実施例１〕に記載の本発明法に準じ
て測定した。但し、培養温度は３０℃、培養時間は８時
間とした。（２）対照法１上記試料を用い、〔実施例１〕に記載の対照法１に準じ
て測定した。但し、培養温度は３０℃、培養時間は２日
間とした。（３）対照法２上記試料を用い、〔実施例１〕に記載の対照法２に準じ
て測定した。但し、０・２２μｍのフィルタ−で除菌し
た試料を用い、同様な操作を行なって得られた発光量を
ブランク値とした。（４）結果本発明法による測定結果を表７に示す。

【００３４】

【表７】対照法１による測定結果を表８に示す。

【００３５】

【表８】対照法２による測定結果を表９に示す。

【００３６】

【表９】

【００３７】本発明法により短時間で測定した生細胞数
（表７）と対照法１により得た生細胞数（表８）とは、
３種類のいずれの試料についても、オ−ダ−レベルで同
じ結果を示した。対照法２を用いて測定したとき、表９
に示したように、試料のブランク値が４４９０ＲＬＵ
（発光量の単位）と高い値を示し、試料１及び試料３で
は、その測定値がブランク値とほぼ同等であったため、
生細胞数を測定することができなかった。しかし、汚染
菌を多く含む試料２では、その測定値がブランク値と比
較して有意に大きいため、本発明法の生細胞数とオ−ダ
−レベルで一致した測定結果を得ることができた。

【００３８】以上より、本発明法は、対照法２で測定す
ることができないような高いブランク値を含む、種々の
ブランク値を有する試料についても短時間で生細胞数を
測定することができ、野菜等の食品中に含まれる汚染菌
数の測定にも、何ら問題なく使用できた。〔実施例３〕食肉中に含まれる汚染菌（生細胞）数の測
定市販の食肉３種類を購入した。それぞれ食肉１０ｇに滅
菌した生理的食塩水１００ｍｌを添加して、ストマッカ
−を用いて、ストマッカ−処理をした。得られたストマ
ッキング液を試料とした。（１）本発明法上記試料を用い、〔実施例１〕に記載の本発明法に準じ
て測定した。但し、培養温度は３０℃、培養時間は８時
間とした。発光量の測定試薬はルシフェ−ルＨＳプラス
（キッコ−マン（株）製）を用いた。（２）対照法１上記試料を用い、〔実施例１〕に記載の対照法１に準じ
て測定した。但し、培養温度は３０℃、培養時間は２日
間とした。（３）対照法２上記試料を用い、〔実施例１〕に記載の対照法２に準じ
て測定した。但し、０．２２μｍのフィルタ−で除菌し
た試料を用い、同様な操作を行なって得られた発光量を
ブランク値とした。発光量の測定試薬は、ルシフェ−ル
ＨＳプラス（キッコ−マン（株）製）を用いた。（４）結果本発明法による測定結果を表１０に示した。

【００３９】

【表１０】対照法１による測定結果を表１１に示した。

【００４０】

【表１１】対照法２による測定結果を表１２に示した。

【００４１】

【表１２】

【００４２】対照法２では、表１２に示した通り、ブラ
ンク値の発光量が５３６９２ＲＬＵと非常に高く、３種
類の試料いずれについても、試料の発光量とほぼ同等で
あり、生細胞数を測定できなかった。一方、本発明法と
対照法１の生細胞数の測定結果は、３種類の試料いずれ
についても、オ−ダ−レベルで一致した。よって、本発
明法により、対照法２では全く測定できない、ブランク
値の非常に高い試料についても、短時間で、生細胞数を
測定することができた。本発明法は、食肉等の食品中に
含まれる汚染菌数の測定にも、有効に用いられる。

【００４３】

【発明の効果】本発明は、生細胞を含む試料を、生細胞
増殖用培地を希釈溶液として、順次段階希釈し、得られ
た希釈物を短時間培養処理した後、生細胞内ＡＴＰを測
定することにより、試料中の生細胞数を測定する方法に
関する。また、上記方法において使用される測定試薬キ
ット、及び生細胞数測定装置に関する。

【００４４】本発明を用いることにより、試料中の生細
胞数を感度良く、かつ短時間に測定することができる。
生鮮食品は言うに及ばず、食品においては、短時間に食
品中に含まれる汚染菌数を測定することが強く望まれて
おり、本発明は、好適に利用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】従来の技術に記載した検量線、および実施例
１、２および３の対照法２において用いた検量線を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者村上成治千葉県野田市野田339番地キッコ−マン株式会社内Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ03 QQ05 QQ06 QQ08 QQ09 QQ15 QQ16 QQ17 QQ18 QQ19 QQ63 QR02 QR41 QR69 QS20 QS24 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の工程を含むことを特徴とする、試料
中の生細胞数の測定方法。（１）試料を希釈溶液を用いて順次段階希釈する第１工
程。（２）第１工程で得られた各希釈物を培養処理する第２
工程。（３）第２工程で得られた培養処理した希釈物中の生細
胞内ＡＴＰを測定する第３工程。（４）第３工程で得られた生細胞内ＡＴＰの測定結果に
基づいて、試料中の生細胞数を算出する第４工程。
【請求項２】試料を順次段階希釈するために用いる希釈
溶液が、生細胞増殖用培地であることを特徴とする請求
項１記載の生細胞数の測定方法。
【請求項３】試料を順次段階希釈するために用いる希釈
溶液が、ＡＴＰを分解した生細胞増殖用培地であること
を特徴とする請求項１又は２記載の生細胞数の測定方
法。
【請求項４】培養処理する第２工程において、培養処理
中又は培養処理後に、希釈物中の生細胞内ＡＴＰ以外の
ＡＴＰを分解することを特徴とする請求項１〜３のいず
れか１項に記載の生細胞数の測定方法。
【請求項５】生細胞内ＡＴＰを測定する方法が、ルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用する方法であ
る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生細胞数の測
定方法。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載の生細
胞数の測定方法に用いるための測定試薬キットであっ
て、以下の試薬及び希釈溶液を含む測定試薬キット。（１）希釈溶液。（２）ＡＴＰ抽出試薬（３）ＡＴＰ測定試薬。
【請求項７】試料希釈装置、増殖用培養装置および発光
量測定装置を備える生細胞数測定装置。