JP2021013336A - 細胞培養モニタリング装置及び細胞培養システム - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、培養中に細胞数をモニターすることを可能にする細胞培養モニタリング装置及び細胞培養システムを提供することを目的とする。【解決手段】細胞の増殖をモニターするための細胞培養モニタリング装置であって、培養上清中のエクソソームの粒子を検出する検出部と、得られた検出結果から細胞数を算出する解析部と、を備える、細胞培養モニタリング装置、及び当該細胞培養モニタリング装置と自動培養装置と、を備える細胞培養システムとする。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養モニタリング装置及び細胞培養システムに関する。

再生医療は細胞や組織を人工的に作製し、体内へ移植する事で欠損した細胞や組織の機能を根本から回復する事ができ，従来の医療では治療不可能であった障害や疾患を治癒出来る新しい医療である。再生医療におけるソース細胞として期待されているのがＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞である。多能性幹細胞は無限に増殖し、ほとんどの種類の細胞に分化できる多能性を有することから産業応用への可能性が高い。

再生医療に用いる細胞の培養は、細胞プロセシングセンタ（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ
ｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で、ＧＭＰ（Ｇｏ
ｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に準拠して行われる。ここでは、細胞培養は技術者の手作業によって行われるため、細胞の調製に労力とコストが非常にかかる。また、細胞培養を手作業で行うため、生物学的汚染リスクがある。これらの課題を解決する手段として、閉鎖系で細胞培養工程を自動化する装置が開発されてきた。自動培養装置では、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、細胞培養工程の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成される。

細胞培養工程では、細胞は分裂を繰り返すことにより増殖するが、培養環境が悪化すると細胞死を起こす細胞が増加し、その状態が続くとすべての細胞が死滅することがある。また、ｉＰＳ細胞等幹細胞は未分化状態を維持して増殖する必要があるが、細胞にストレスがかかる条件下では容易に未分化状態を逸脱し幹細胞としての機能である分化能が失われてしまう。また、ｉＰＳ細胞等幹細胞から目的細胞への分化誘導を行う場合、目的細胞への分化誘導が効率良く進行しなかった場合、最終製品の収量が低下してしまう。このため、細胞の自動培養装置を用いた製造の安定化や品質向上のためには、培養状態をモニタリングし、培養状態に応じて制御を加えることで、培養状態を最適化することが重要になる。特に、閉鎖系自動培養装置の場合は無菌性を維持するために閉鎖空間を保持したまま培養状態を評価する必要がある。閉鎖系での培養状態評価手法としては、位相差顕微鏡等による光学カメラ画像を用いた細胞観察もしくは画像解析が挙げられる（例えば、特許文献１及び２参照）。

その他にも、培養液中の成分を測定することにより培養をモニタリングする手法も知られている。本手法は培養中の培養上清を無菌的に抽出し、測定対象成分を高速液体クロマトグラフ等を用いて測定する技術であり、抗体医薬品をはじめとする医薬品を細胞に産生させる際に実施される（例えば、特許文献３参照）。

特開２０１１−２２９４０９号公報 特開２０１８−５７４０１号公報 特開２０１０−１８７５９４号公報

無菌性を維持するために閉鎖空間を保持したまま細胞培養状態をモニタリングするには、培養上清や細胞を閉鎖空間から外部へ取り出すことなく、インラインで培養状態を評価
する必要がある。

一方、培養した細胞の細胞数は、付着性細胞や細胞塊を形成する細胞の場合、トリプシン等の酵素処理によって細胞を剥離し、細胞数を数えることが基本であるが、この場合、自動で細胞数を測定できないので、培養中に細胞数をモニターすることは困難である。

そこで、本発明は、培養中に細胞数をモニターすることを可能にする細胞培養モニタリング装置及び細胞培養システムを提供することを目的とする。

本発明の一実施態様は、細胞の増殖をモニターするための細胞増殖モニタリング装置であって、培養上清中のエクソソームの粒子を検出する検出部と、得られた検出結果から細胞数を算出する解析部と、を備える、細胞増殖モニタリング装置である。前記検出部において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、前記解析部において、前記抗体量から、細胞数が算出されてもよく、前記検出部において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、前記解析部において、前記抗体量から、前記エクソソームの粒子密度が算出され、前記粒子密度から細胞数が算出されてもよく、前記検出部において、前記エクソソームの粒子数が測定され、前記解析部において、前記粒子数から、細胞数が算出されてもよい。

本発明の他の実施態様は、上記いずれかに記載の細胞培養モニタリング装置と、自動培養装置と、を備える細胞培養システムである。前記解析部で算出された細胞数のデータが、例えば算出後１時間以内に前記自動培養装置に送信されてもよい。

本発明のさらなる実施態様は、培養細胞において、細胞数を測定する測定方法であって、培養上清中のエクソソームを検出する検出工程と、検出結果から細胞数を算出する算出工程と、を含む測定方法である。前記検出工程において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、前記算出工程において、前記抗体量から、細胞数が算出されてもよく、前記検出工程において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、前記算出工程において、前記抗体量から、前記エクソソームの粒子密度が算出され、前記粒子密度から細胞数が算出されてもよく、前記検出工程において、前記エクソソームの粒子数が測定され、前記算出工程において、前記粒子数から、細胞数が算出されてもよい。

本発明のさらなる実施態様は、細胞増殖モニタリング装置に上記測定方法を実行させるためのプログラムである。

本発明のさらなる実施態様は、上記プログラムを格納したコンピュータ可読記憶媒体である。

本発明によって、培養中に細胞数をモニターすることを可能にする細胞培養モニタリング装置及び細胞培養システムを提供できるようになった。

本発明の一実施形態である細胞培養モニタリング装置の構成を示す模式図である。 本発明の一実施形態である細胞培養システムの構成を示す模式図である。 本発明の一実施形態における細胞培養システムの制御方法のフローチャートである。 本発明の一実施例において、iPS細胞の増殖培養工程における培養上清量あたりのエクソソーム顆粒数変化を示すグラフである。 本発明の一実施例において、iPS細胞の増殖培養工程における培養上清量あたりのエクソソーム顆粒数と細胞数との相関関係を示すグラフである。

以下、図面及び実施例を参照して本発明の種々の実施形態について説明する。ただし、これらの実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。なお、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。

＝＝細胞培養モニタリング装置＝＝
本発明に係る細胞培養モニタリング装置は、図１に示すようにエクソソームの測定、解析、記録を実施できる。図１に示す細胞培養モニタリング装置1は、エクソソームを検出
する検出部４と、検出結果を解析する解析部５と、解析したデータなどを記録する記録部６と、検出部４と解析部５と記録部６を制御する制御部７と、制御部７を操作できる操作部８とから構成されている。この装置は、図１では検出部を１つだけ備えているが、複数のエクソソーム検出部を備えていてもよい。その場合、複数のサンプルを同時に測定可能になる。モニタリングに使用する細胞は特に限定されず、iPS細胞やES細胞等の多能性幹
細胞、間葉系幹細胞などの幹細胞、その他ヒト由来細胞及び動物由来細胞等を挙げることができ、培養細胞であっても、初代培養細胞であってもよい。

＝＝細胞培養システム＝＝
細胞培養モニタリング装置１は図２に示すように、閉鎖系自動培養装置１００に接続し、全体として、細胞培養システムを構成してもよい。閉鎖系自動培養装置は、特に限定されず、すでに開発されている装置を応用すればよいが、一例を以下に示す。

本開示の細胞培養システムは、第１の液体を入れるための第１の容器１０２と、第１の液体を入れるための第２の容器１０８を有する。第１の容器１０２は、第１の液体である細胞培養用の培地を保存しておく容器である。第２の容器１０８は、細胞培養用の容器であって、形状はディッシュ、ボトルなど、特に限定されない。第１の容器１０２、第２の容器１０８は、その目的を考慮し、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。それぞれ、外気に開放している気圧調節管１０３を有し、容器内の気相に末端を有する。第２の容器１０８も、その目的を考慮し、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。第２の容器１０８は外気に開放している気圧調節管１３０を有し、容器内の気相に末端を有する。

閉鎖系自動培養装置１００は、第１の容器１０２中の第１の液体を送液するための第１の送液管１０５と、第１の送液管１０５中の第１の液体を第２の容器１０８に送液するための第２の送液管１０７を有する。第２の送液管１０７は、第１の送液ポンプ１０６を有し、第２の送液管１０７内の送液を調節する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。第１の送液管１０５は第１の弁１１３及び第２の弁１１４を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。

また、閉鎖系自動培養装置１００は、第２の容器１０８中の第１の液体を捨てるための第３の容器１２１を有する。第３の容器１２１は目的を考慮し、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。外気に開放している気圧調節管１２３を有し、容器内の気相に末端を有する。

閉鎖系自動培養装置１００は、さらに、第２の容器中１０８の第１の液体を排出するた
めの第３の送液管１１６と、第３の送液管１１６に接続し、第２の容器１０８中の第１の液体を第３の送液管１１６を通じて第３の容器１２１に排出する第４の送液管１２２と、を備える。第３の送液管１１６は、第２の送液ポンプ１１５を有し、第３の送液管１１６内の送液を制御する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。第４の送液管１２２は第３の弁１２５を有し、開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替え、細胞培養モニタリング装置１の測定を開始・停止することができる。

閉鎖系自動培養装置１００は、独自に制御部１２９を設けてもよく、ポンプの作動や弁の開閉などを自動的に制御できるようにすることが好ましい。

＝＝細胞数の測定方法＝＝
本開示の培養細胞の細胞数の測定方法は、培養上清中のエクソソームを検出する検出工程と、検出結果から細胞数を算出する算出工程を含む。

ここで、エクソソームの検出方法は特に限定されないが、エクソソームのマーカーを用いる方法、電気抵抗ナノパルス法、ナノ粒子トラッキング法、動的光散乱法、赤外分光やラマン分光を用いた方法が例示できる。なお、検出工程で得られる検出結果は、エクソソーム粒子数と細胞数との両方に相関関係があるものであればよく、マーカーの発現量やエクソソーム粒子数が例示できる。

マーカーを用いる場合、例えば、培養上清を取得する工程と、取得した培養上清をマーカーの抗体と接触させる工程と、エクソソームに結合した抗体を検出する工程と、を含んでもよい。これらの工程は、自動で行うことができる。ここで用いるマーカーは特に限定されないが、Ａｌｉｘ、ＣＤ２４、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＴＳＧ１０１が例示できる。抗体検出方法は特に限定されず、ＥＬＩＳＡや電気泳動法などを用いることができる。

算出工程において、マーカーの発現量などのエクソソームの検出結果から培養上清中のエクソソームの粒子密度が算出されてもよく、あらかじめ粒子密度とマーカーの発現量との標準曲線を作ることによって、マーカーの発現量から、粒子密度を算出することができる。マーカーの発現量は、抗体を用いた測定値そのものであってもかまわない。電気抵抗ナノパルス法などでは、検出結果として粒子数が得られるため、粒子密度は容易に得られる。そして、あらかじめ粒子密度と細胞数との標準曲線を作ることによって、粒子密度から細胞数を算出できる。

また、算出工程において、あらかじめマーカーの発現量と細胞数の標準曲線を作ることによって、マーカーの発現量から直接的に細胞数を算出できる。ここで、マーカーの検出にマーカーの抗体を用いた場合、マーカーの発現量として、結合抗体の量の検出値を用いてもかまわない。

＝＝細胞培養システムの作動方法＝＝
以下に細胞培養システムの作動方法を詳述する。この細胞培養システムの制御は、手で行ってもよく、制御部７に行わせてもよい。制御部７に行わせるときのフローチャートを図３に示す。

まず、細胞培養を開始し、培養を継続する（Ｓ０）。所定期間培養後、細胞上清中エクソソームについて、上述したような方法を用い、検出部４でエクソソームを検出する（Ｓ１）。例えば、エクソソームの検出にマーカーを用いる場合、粒子密度とマーカーに対する抗体の検出量との標準曲線を記録部に記録させておくことによって、解析部５で、抗体の検出量の測定値からエクソソームの粒子密度を算出することができる。そして、粒子密
度と細胞数との標準曲線を記録部に記録させておくことによって、解析部５で、得られた粒子密度から細胞数を算出することができる。ここで、エクソソームの粒子密度を算出せずに、抗体の検出量と細胞数との標準曲線を記録部に記録させておけば、解析部５で抗体の検出量の測定値から、直接細胞数を算出することができる。エクソソームの検出に電気抵抗ナノパルス法などを用いる場合、粒子数が得られるので、解析部５で、粒子密度を算出するだけでよい。そして、粒子密度と細胞数との標準曲線を記録部に記録させておくことによって、解析部５で、得られた粒子密度から細胞数を算出することができる。

細胞数が所定の基準値を達成しなかった場合（Ｓ２）、細胞培養モニタリング装置の解析部で算出された細胞数のデータが、例えば算出後１２時間以内に、好ましくは６時間以内に、より好ましくは３時間以内に、さらに好ましくは１時間以内に、自動培養装置に送信され、細胞培養を続ける。細胞数が所定の基準値を達成した場合（Ｓ２）、そのまま細胞を継代するか、細胞数のデータが自動培養装置に送信され、細胞培養を終了する。

このような方法を実行させるためのプログラムや、プログラムを格納したコンピュータ可読記憶媒体も本発明の権利範囲に入りうる。

〔実施例１〕
本実施例では、培養上清中のエクソソーム顆粒数が細胞の培養過程に応じて継時的に増加すること、そしてエクソソーム顆粒数と細胞数が高い相関関係をもつことを示す。具体的には、ｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を使用して、1週間培養を行い、エクソソームの顆粒数
及び細胞数をモニターした。なお、細胞の培養条件は、通常のｉＰＳ細胞に用いられる条件を適用した。

ｉＰＳ細胞の培養期間中、毎日回収した培養上清について、ＥＬＩＳＡ法によりエクソソームマーカーであるＣＤ６３の発現量を定量し、予め作成したＣＤ６３の発現量とエクソソーム顆粒数の標準曲線を使用してエクソソームの顆粒数を算出した。図６に、培養上清量あたりのエクソソーム顆粒数と、細胞播種後の培養日数との関係を示す。グラフから明らかなように、培養上清中培養期間が長くなるにつれて、エクソソーム顆粒数が増加した。このように、細胞が増殖するにしたがって、エクソソーム顆粒数が増える。

次に、同時に測定した細胞数について、細胞数とエクソソーム顆粒数の関係を図７に示す。

グラフから明らかなように、細胞数とエクソソーム顆粒数の間に、相関関係がみられた。そこで、細胞数とエクソソーム顆粒数の相関係数を算出したところ、０．９５８７であり、高い相関性を持っていた。このように、エクソソーム顆粒数が細胞増殖の指標となりうる。

本発明は、細胞を培養する際の細胞培養モニタリング装置として有用である。

１…細胞培養モニタリング装置、４…エクソソーム検出部、５…解析部、６…記録部、７…制御部、８…操作部、１００…閉鎖系自動培養装置、１０２…第１の容器、１０３…気圧調節管、１０４…フィルター、１０５…第１の送液管、１０６…第１の送液ポンプ、１０７…第２の送液管、１０８…第２の容器、１０９…フィルター、１１０…接続部、１１１…フィルター、１１３…第１の弁、１１４…第２の弁、１１５…第２の送液ポンプ、１１６…第３の送液管、１２１…第３の容器、１２２…第４の送液管、１２３…気圧調節管、１２４…フィルター、１２５…第３の弁、１２９…制御部、１３０…気圧調節管

本発明の一実施態様は、細胞の増殖をモニターするための細胞培養モニタリング装置であって、培養上清中のエクソソームの粒子を検出する検出部と、得られた検出結果から細胞数を算出する解析部と、を備える、細胞培養モニタリング装置である。前記検出部において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、前記解析部において、前記抗体量から、細胞数が算出されてもよく、前記検出部において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、前記解析部において、前記抗体量から、前記エクソソームの粒子密度が算出され、前記粒子密度から細胞数が算出されてもよく、前記検出部において、前記エクソソームの粒子数が測定され、前記解析部において、前記粒子数から、細胞数が算出されてもよい。

本発明のさらなる実施態様は、細胞培養モニタリング装置に上記測定方法を実行させるためのプログラムである。

ｉＰＳ細胞の培養期間中、毎日回収した培養上清について、ＥＬＩＳＡ法によりエクソソームマーカーであるＣＤ６３の発現量を定量し、予め作成したＣＤ６３の発現量とエクソソーム顆粒数の標準曲線を使用してエクソソームの顆粒数を算出した。図４に、培養上清量あたりのエクソソーム顆粒数と、細胞播種後の培養日数との関係を示す。グラフから明らかなように、培養上清中培養期間が長くなるにつれて、エクソソーム顆粒数が増加した。このように、細胞が増殖するにしたがって、エクソソーム顆粒数が増える。

次に、同時に測定した細胞数について、細胞数とエクソソーム顆粒数の関係を図５に示す。

Claims (13)

1. 細胞の増殖をモニターするための細胞増殖モニタリング装置であって、
   培養上清中のエクソソームの粒子を検出する検出部と、
   得られた検出結果から細胞数を算出する解析部と、を備える、細胞増殖モニタリング装置。
2. 前記検出部において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、
   前記解析部において、前記抗体量から、細胞数が算出される、
   請求項１に記載の細胞増殖モニタリング装置。
3. 前記検出部において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、
   前記解析部において、前記抗体量から、前記エクソソームの粒子密度が算出され、前記粒子密度から細胞数が算出される、
   請求項１に記載の細胞増殖モニタリング装置。
4. 前記検出部において、前記エクソソームの粒子数が測定され、
   前記解析部において、前記粒子数から、細胞数が算出される、
   請求項１に記載の細胞増殖モニタリング装置。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養モニタリング装置と、自動培養装置と、を備える細胞培養システム。
6. 前記解析部で算出された細胞数のデータが、前記自動培養装置に送信される構成を有する、請求項５に記載の細胞培養システム。
7. 前記細胞数のデータは、算出後１時間以内に前記自動培養装置に送信される、請求項６に記載の細胞培養システム。
8. 培養細胞において、細胞数を測定する測定方法であって、
   培養上清中のエクソソームを検出する検出工程と、
   検出結果から細胞数を算出する算出工程と、
   を含む測定方法。
9. 前記検出工程において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、
   前記算出工程において、前記抗体量から、細胞数が算出される、
   請求項８に記載の測定方法。
10. 前記検出工程において、前記エクソソームのマーカーに結合する抗体量が測定され、
    前記算出工程において、前記抗体量から、前記エクソソームの粒子密度が算出され、前記粒子密度から細胞数が算出される、
    請求項８に記載の測定方法。
11. 前記検出工程において、前記エクソソームの粒子数が測定され、
    前記算出工程において、前記粒子数から、細胞数が算出される、
    請求項８に記載の測定方法。
12. 細胞増殖モニタリング装置に請求項８または９に記載の測定方法を実行させるためのプログラム。
13. 請求項１２のプログラムを格納したコンピュータ可読記憶媒体。