JP6912477B2 - 微生物の化学物質への暴露に対する反応の決定方法 - Google Patents
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Description
飽和スペクトルの除去は、スペクトルを前処理する最初の工程である。この工程は、得られた生の(raw)スペクトルから実施する。対象とする振動数の領域の20%以上が最大強度の99%を超える強度を有するスペクトルは飽和しているものとする。
「宇宙線」とよばれる光線は、太陽光、銀河系、又は銀河系外から発せられる高エネルギーの帯電した粒子である。これらは絶えずCCD検出器(電荷結合素子、電荷移動デバイス)に衝突する。それらはスペクトルに無秩序に現れる非常に鋭いシグナルピークの原因となる。これらのピークの探索は、最初に生スペクトルの二次導関数を計算することから実行される。この二次導関数と平滑化された生スペクトルの二次導関数とを比較することにより、平滑化によってピークの高さが著しく減少した非常に鋭いピーク(すなわち宇宙線)を特定することができる。宇宙線に関連するピークは直線で置き換えられる。
異なる日付で撮影された一連のスペクトルの間にわずかな差異が認められる。この差異は、スペクトル全体にわたって一定である。それを修正することが望ましい。
バックグラウンドの差し引きは2つの工程で行われる。支持体を構成する材料の平均スペクトルからなる第1のバックグラウンドは、ガラス支持体の場合には細菌スペクトルに対して例えば450〜650cm−1の間で調整されるが、それはこの領域がスペクトルに対してガラスの影響が存在する領域だからである。この調整は、この領域の細菌におけるスペクトル以下にするという制限が課される。第2の工程は、SNIPアルゴリズムによってバックグラウンドを差し引くことからなる。
異常スペクトルの自動除去モジュールが開発された。異常の探索に使用されるスペクトルは、後続の分析で使用される規格化された正味スペクトルである。異常の探索は、所定の抗生物質濃度及び所定の日付の株に対応するスペクトル群に適用される。この方法は、各スペクトルとスペクトル群の平均スペクトルとの間のユークリッド距離(Euclidean distance)を計算することに基づいている。この異常の除去は、連続して2回行われる。その1回目は、平均スペクトルに大きな影響を及ぼすかなり異常なスペクトルを除去することを可能にする。
スペクトルが互いに比較される対象領域の選択は重要である。スペクトルは400〜3080cm−1のエネルギーオフセットで測定される。対象領域は、[650−1750]cm−1及び/又は[2800−3050]cm−1である。正味シグナルを互いに直接比較できるように規格化することが不可欠である。規格化間隔は[650−1750]cm−1又は[2800−3050]cm−1である。正味のシグナルは、この区間における正味のシグナルの平均値で除算される。好ましい実施形態では、取得された個々の細菌の全てのスペクトルから細菌の参照状態を減算する。使用された基準状態は、S0からのスペクトルから構成される基準状態である。この操作により、成長条件の変動、界面(表面)Iの変動(図2参照)を克服し、変化する抗生物質濃度への暴露に関連したシグニチャ(特徴)とよばれるシグナルを抽出することが可能になる。
使用されるラマン分光器は、レーザーによる励起後のラマン散乱光のスペクトルを生成させる分析台と、これと連結した分析される体積を顕微鏡レンズにより共焦点体積(confocal volume)に空間的に限定してラマンスペクトル測定を実施する共焦点顕微鏡台とからなるという意味で、先行技術では共焦点ラマン顕微分光器とよばれている。顕微鏡台では、装置内のカメラにより、又はもっと簡単に顕微分光器に組み込まれたもしくは独立した光源を使用して接眼レンズを介して直接観察することにより、画像を従来通りに取得することもできる。
− 顕微分光器の操作、収集されたデータの保存、及び下記の方法を実行する専用ソフトウェアを用いてこれらのデータを解析するためのコンピュータ −
上述の微生物の調整装置、並びにこれと任意選択的に結合された本発明に係る方法を実施するための分光器及びコンピュータも本発明の目的である。
−ゲンタマイシンに対する「EC10」とよばれる参照記号ATCC25922の大腸菌株の感受性表現型を決定するための本発明に係る方法の適用−
使用された調整装置は、2つの流体チャンバーから構成される。2つの抗生物質濃度c0「抗生物質なし」及びc1「耐性テスト」がテストされる。
−ゲンタマイシンに対する「EC21」とよばれる参照記号ATCC35421の大腸菌株の感受性表現型を決定するための本発明に係る方法の適用−
「EC21」とよばれるATCC35421株について、実施例1の大腸菌とは別の菌株であるが実施例1と同じテストを行い、測定の差別化の性能を確認する。結果を図5に示す。
−アモキシシリンに対する大腸菌の2株の最小発育阻止濃度(MIC)の決定−
この実施例では、実施例1及び実施例2とは異なる態様を示す抗生物質アモキシシリンについて、「EC10」とよばれる参照記号ATCC25922の大腸菌株の感受性の表現型を決定し、その最小発育阻止濃度の枠組みを特定することが目的である。
−菌株に対する未知の物質(substance)の効果の決定−
この実施例は、未知と考えられる物質に対する、例えば「EC10」とよばれる参照記号ATCC25922の大腸菌株等の細菌株の感受性表現型を決定すること、及び、その最小発育阻止濃度の枠組みを特定することが目的である。
−オキサシリンに対する「SA44」とよばれる参照記号ATCC25923の黄色ブドウ球菌株の感受性表現型を決定するための本発明に係る方法の適用−
選択された調整装置は2つの流体チャンバーで構成され、2つの抗生物質濃度(c0:「抗生物質なし」及びc1:「耐性テスト」)がテストされる。
Claims (16)
- ラマン分光法の分析を実施することによって、抗生物質への暴露に対する、少なくとも1つの目的細菌の反応を決定する方法であって、
上記目的細菌を含有し得る生物学的サンプルを取得する取得工程と、
生存する1つ以上の上記目的細菌を含む、上記生物学的サンプルの少なくとも2つの画分を調製する調製工程と、
それぞれの画分において、結合パートナーを用いて生存する1つ以上の上記目的細菌を捕捉する捕捉工程と、
上記画分の少なくとも1つを、少なくとも1種類の濃度の少なくとも1つの所定の抗生物質に暴露し、他の画分を対照画分とする暴露工程と、
上記画分に含まれる捕捉された目的細菌に入射光を照射し、ラマン分光法により捕捉された目的細菌のラマン散乱光を分析して、細菌と同数のラマンスペクトルを得る工程と、
上記抗生物質への暴露に対する目的細菌の反応のスペクトルシグニチャ及び対照のスペクトルシグニチャを得るために上記ラマンスペクトルを処理する工程と、
目的細菌ごとに得られた上記スペクトルシグニチャを、異なる細菌及び少なくとも上記抗生物質について上記と同じ条件下で決定された参照ベースと比較する比較工程と、
上記抗生物質に対して、上記目的細菌の感受性臨床プロファイルを決定する決定工程と、
からなる方法。 - 請求項1に記載の方法において、
上記生物学的サンプルの2つ以上の画分が調製され、少なくとも2つの画分がそれぞれ、増加する濃度の上記抗生物質に暴露される
ことを特徴とする方法。 - 請求項1又は2に記載の方法において、
画分がそれぞれ暴露される抗生物質の濃度は、疫学的カットオフ、臨床的ブレークポイントの閾値、又は、参照の方法で使用される濃度のパネルを含む、抗生物質/生物種の対に特異的な値から選択される少なくとも1つの値を含む濃度範囲を構成する少なくとも1つ値を含む
ことを特徴とする方法。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法において、
上記画分に存在する上記目的細菌が、支持体上に直接的又は間接的に固定化された結合パートナーによって捕捉される
ことを特徴とする方法。 - 請求項4に記載の方法において、
上記結合パートナーは、上記目的細菌と特異的に相互作用することができ、好ましくは、タンパク質、抗体、抗原、アプタマー、ファージ、ファージタンパク質から選択されることを特徴とする方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法において、
捕捉された細菌は、例えば画像化又は分光光度法によって、特定され及び分類される
ことを特徴とする方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において、
上記目的細菌に入射光を照射する前に、捕捉されていない細菌を除去する
ことを特徴とする方法。 - 請求項7に記載の方法において、
上記細菌は、上記抗生物質に暴露する上記暴露工程の前又は後に除去される
ことを特徴とする方法。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法において、
上記画分についての上記暴露工程の後で、上記画分と上記対照画分とを濃縮し、それに引き続いて上記捕捉工程を実施する
ことを特徴とする方法。 - 請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法において、
上記抗生物質を、上記目的細菌を少なくとも生存させておくことのできる生理的溶液に入れておく、
ことを特徴とする方法。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法において、
上記抗生物質への暴露を18℃以上40℃以下の温度範囲で実施する
ことを特徴とする方法。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法において、
上記抗生物質への暴露を、10分以上4時間以下のインキュベーション時間とよばれる時間で実施する
ことを特徴とする方法。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法において、
上記スペクトルシグニチャを得るために、上記抗生物質に暴露された各画分について、対照のラマンスペクトルを上記生物学的サンプルのラマンスペクトルからそれぞれ差し引く
ことを特徴とする方法。 - 請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法において、
対象菌株が上記抗生物質に対して、感受性あり、中間、又は、耐性あり、のいずれの状態であるかを決定する
ことを特徴とする方法。 - 請求項14に記載の方法において、
上記対象菌株の上記抗生物質についての最小発育阻止濃度を決定する
ことを特徴とする方法。 - 請求項14又は15に記載の方法において、
少なくとも2つ、好ましくは少なくとも5つのシグナルを得るために、各画分が少なくとも2つ、好ましくは5つの目的細菌を含む
ことを特徴とする方法。
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