CN109716107B - 用于确定微生物病原体的组合的光学光谱法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于确定微生物病原体的方法。此外，本发明涉及一种用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法。尤其，本发明涉及一种用于确定细菌和其抗生素抗性的方法。还包括用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的系统、程序单元和计算机可读介质。

Description

用于确定微生物病原体的组合的光学光谱法
技术领域
本发明涉及一种用于确定微生物病原体的方法。此外，本发明涉及一种用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法。尤其地，本发明涉及一种用于确定细菌和其抗生素抗性的方法。
背景技术
迄今建立的用于从患者材料中进行表型抗性测试的技术基于至少两个培养步骤，使得分析结果最早能够在样品提取之后48小时存在。所述方法中的第一培养步骤用于获得纯的细菌培养，第二培养步骤包含抗性测试本身。常见的用于抗性测试的试验是琼脂扩散试验、E试验(浓度梯度琼脂扩散试验)和微稀释试验。借助于拉曼光谱分析识别抗生素抗性可针对抗万古霉素肠球菌显示(
Figure GDA0003133763390000011
等著的Scientific Reports，2015年)。此外，存在如下算法，所述算法检测细菌在抗生素的影响下的形态。所述算法然而需要事先识别细菌并且在具有多个临床分离珠的试验中仍示出几乎10％的错误率(Choi等著的ScienceTranslational Medicine，2015年)。
自动化的实验需要更大量的生物学材料，所述生物学材料必须经由过夜培养来获取。此外，诊断通常持续8至10小时，或者在某些情况下甚至更长。基于对抗生素抗性的基因型的识别和表征的新型的初步方案虽然明显更快并且通常也能够直接从患者材料中执行，然而所述新型的初步方案需要准确地了解特征性的核酸序列进而通常在识别到快速突变的多重耐药的革兰氏阴性的病原体时失效。
因此，借助至今为止的技术不能执行对尚未识别的微生物病原体、如细菌的快速且可靠的抗生素抗性分析。为了使抗感染治疗、尤其抗生素治疗最优地适应于患者和其微生物病原体，期望尤其抗生素抗性的较短的确定时间。此外，由此可以减少广谱抗生素的使用以及避免在抗性位置时的错误治疗。
发明内容
因此，如下能够视作为本发明的目的，提供一种用于确定微生物病原体的改进的方法。尤其，本发明的目的得是，提供一种用于同时确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的改进的方法。特别地，如下能够视作为本发明的目的，提供一种用于同时确定细菌和其抗生素抗性的方法。
本发明的目的借助于一种用于确定样品中的微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法来实现。其他优点和改进方案在下面的描述中给出。
总的来说，本发明涉及一种用于确定微生物病原体的方法，所述方法包括如下步骤：样品的拉曼光谱分析和样品的光学探测，所述样品包括微生物病原体。
尤其，本发明涉及一种用于确定微生物病原体的方法，所述方法包括如下步骤：
-通过拉曼光谱分析来确定微生物病原体的拉曼光谱；
-通过光学探测来确定微生物病原体的形态；
-基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体。
在一个特殊的实施方式中，所述方法还包括如下步骤：
-基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体的抗感染药物抗性；
其中样品还包含抗感染药物。
光学探测能够通过显微镜检查、全息摄影探测或动态光散射进行。在优选的实施方式中，通过显微镜检查进行光学探测。显微镜检查法例如能够是透射光显微镜检查或荧光显微镜检查。作为优选的显微镜检查法使用透射光显微镜检查。
在通过光学探测来确定微生物病原体的形态时，确定定量的形态参数。相应地，微生物病原体的确定基于微生物病原体的拉曼光谱和定量的形态参数。
通过对光学形态和拉曼光谱的确定的组合，能够实现微生物病原体的快速的且可靠的确定。微生物病原体和可能其抗感染药物抗性的识别通过自动分析进行，例如根据多元统计法和与数据库的比较进行，其中所述数据库可在本地或在中央提供。
这允许在短时间内根据少量的微生物病原体来确定微生物病原体和其抗生素抗性。因此，在最短的时间和少的病原体数量之内能够针对(要确定的)微生物病原体来确定病原体种类、抗性水平和/或抗感染药物的最低抑菌浓度。根据得到的信息能够将治疗有针对性地匹配于特殊的病原体。
最低抑菌浓度作为如下浓度得出，在所述浓度下刚好未达到或还未超过阈值(例如在拉曼光谱中的谱段比值或形态变化的已经确定的程度或细菌生长与未处理的样品相比的已经确定的减少)。通过将这样确定的最低抑菌浓度与敏感度的边界值(例如根据EUCAST准则)进行比较，将未知的、要描述特征的微生物病原体分级成抗性水平，如例如敏感的、中等的或有抵抗力。
术语“确定”、“进行确定”和“识别”在本申请中能够互换使用。
一个优选的实施方式涉及一种用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：样品的拉曼光谱分析，所述样品包括至少一种微生物病原体和抗感染药物；和样品的光学探测；以及基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定抗感染药物抗性。
在一个特殊的实施方式中，所述方法还包括如下步骤：
-通过光学探测来确定微生物病原体的细胞生长，
其中抗感染药物抗性的确定基于微生物病原体的已经确定的拉曼光谱、已经确定的形态和已经确定的细胞生长。
在确定微生物病原体的抗感染药物抗性时，能够使用用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第一指标，其中用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第一指标是与阴性控制数据相比微生物病原体的不变的细胞形态。此外，在确定微生物病原体的抗感染药物抗性时，能够使用用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第二指标，其中用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第二指标是与阴性控制数据相比微生物病原体的不变的或对于特定的抗性机制特征性变化的拉曼光谱。此外，在确定微生物病原体的抗感染药物抗性时，使用用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第三指标，其中用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第三指标是与阴性控制数据相比微生物病原体的不变的或轻微变化的细胞生长。
阴性控制数据能够是具有微生物病原体但不具有抗感染药物的样品的数据。该样品的数据能够已经存在，例如作为如下样品的数据，所述样品已经在较早的时间点根据本发明分析。替选地，能够将具有微生物病原体但不具有抗感染药物的样品与具有抗感染药物的样品并行地分析。在另一实施方式中，阴性控制数据能够来自与抗感染药物接触之前的同一样品。
特别地，本发明涉及用于确定样品中的微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述样品包括微生物病原体和抗感染药物，所述方法包括如下步骤：培养包括至少一种微生物病原体和抗感染药物的样品；在至少两种不同的抗感染药物条件下，通过样品的拉曼光谱分析来确定微生物病原体的拉曼光谱；以及在至少两种不同的抗感染药物条件下，通过光学探测样品来确定微生物病原体的形态。
尤其地，本发明涉及一种用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：培养包括至少一种微生物病原体和抗感染药物的样品；在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行拉曼光谱分析；和在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行光学探测。
“在至少两种不同的抗感染药物条件下”在本发明的上下文中表示，样品经受不同的抗感染药物浓度和/或经受抗感染药物的不同的作用时长。在一个实施方式中，样品能够划分为两个或更多个等份(部分)，其中为每个等份添加不同浓度的抗感染药物。这包含，一个单位的样品不添加抗感染药物，而另一单位的样品添加特定浓度的抗感染药物。在抗感染药物的作用时间之后能够在一个时间点进行测量。抗感染药物的作用时间或作用时长能够是5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、45分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、120分钟或更长。对于本领域技术人员，抗感染药物的作用时长是已知的。
在另一实施方式中，在至少两个时间点确定样品的拉曼光谱和形态。其中至少在较早的时间点进行测量，此时抗感染药物还未添加或者此时抗感染药物还未发挥其作用，并且至少在较晚的时间点进行测量，此时抗感染药物能发挥其作用。
在一个实施方式中，在较早的时间点还未添加抗感染药物。替选地，抗感染药物在较早的时间点添加，并且与在较晚的时间点相比，在较早的时间点具有对样品的较短的作用时长。用于确定样品的拉曼光谱和形态的较早的时间点例如能够是在添加抗感染药物之后5分钟或更早，优选在添加抗感染药物之后3分钟或更早，更优选在添加抗感染药物之后2分钟或更早，尤其优选在添加抗感染药物之后1分钟或更早，或在添加抗感染药物之前。较晚的时间点例如能够是在添加抗感染药物之后大约10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、45分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、120分钟或更长。
通过光学形态和拉曼光谱分析的组合，在一个试验中能够实现同时识别微生物病原体以及确定抗感染药物抗性。此外，通过组合的方法能够实现更快速且同时更敏感的抗性测试。所述方法可简单地并行进而能够在常规诊断中用于测试多种抗感染药物(抗性谱)，尤其抗生素。对于所述方法，少量微生物病原体，如例如每测试100至1000个细菌是足够的。因此，能够避免时间耗费的培养和隔离步骤。
光学探测和拉曼光谱分析的组合在此不仅用于找出微生物，而且两种技术提供用于确定微生物病原体和/或其抗生素抗性的重要信息。也就是说，不仅将拉曼光谱分析的数据、而且也将通过光学探测确定的形态参数用于确定微生物病原体和/或其抗生素抗性。因此，光学探测不仅用于确定微生物病原体的局部位置。
特别地，本发明涉及用于确定包括微生物病原体和抗感染药物的样品中的微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：培养包括至少一种微生物病原体和抗感染药物的样品；在至少两种不同的抗感染药物条件下，通过样品的拉曼光谱分析来确定微生物病原体的拉曼光谱；在至少两种不同的抗感染药物条件下，通过光学探测样品来确定微生物病原体的形态；基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体；基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体的抗感染药物抗性。
尤其，本发明涉及用于确定细菌和其抗生素抗性的方法，所述方法包括如下步骤：培养包括至少一种细菌和抗生素的样品；在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行拉曼光谱分析；以及在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行光学探测。本发明尤其适合于识别多重耐药的革兰氏阴性的细菌和其抗生素抗性。因此，本发明尤其考虑分子生物学的方法，所述方法基于确定特定的抗性基因。因为借助所述方法至今为止不能可靠地检测当前越来越多地出现的多重耐药的革兰氏阴性的病原体(MRGN)，所述病原体具有其高的基因变异性。本发明还适合于确定真菌以及其抗真菌药物抗性。
典型地，拉曼光谱分析在单细胞水平上进行。也就是说，在宽场拍摄之后，分别对各个微生物病原体进行拉曼光谱分析，在所述宽场拍摄中，通过图像识别算法探测各个微生物病原体。替选地，能够对像场中的多个细菌同时进行拉曼光谱分析。为了识别混合感染，对此能够使用分解算法。
光学探测不仅能够在宽场中用于确定样品中的微生物病原体的数量，而且也能够在单细胞水平上使用，以便确定微生物病原体的细胞形态。为了能够在液体中可靠地检测微生物病原体的形态，不均匀的电场能够有助于，引起电介质的微生物在电场中的定向。通过所述定向，减少微生物的随机布置。尤其在非圆形的病原体(如例如小棒)的情况下，这是非常令人感兴趣的并且简化数据分析并且减少为了特定的精度至少光学检测的微生物的数量。
在一个实施方式中，在培养的不同的时间点测量拉曼光谱进而得到关于微生物病原体的生化指纹的信息。由此能够确定抗感染药物的作用，也就是说通过抗感染药物或感生出不同的抵抗机制引起的成功的抑菌/杀菌。因此，拉曼光谱分析法和光学形态分析的组合允许有效地确定微生物(识别)、确定样品中的微生物病原体的数量、确定是否存在抗性以及抗生素抗性的作用机制。
在现有技术中不存在可在短时间(几小时)之内从最少量的样品材料(在悬浮液中的少量细菌)中提供所述信息的方法。
在特殊的实施方式中，能够附加地借助对照样品执行所述方法，所述对照样品包含至少一种微生物病原体，然而不包含抗感染药物，例如抗生素。当然，也能够借助多个样品执行所述方法，所述样品包含至少一种微生物病原体和各另外的抗感染药物，如例如抗生素。替选地或附加地，能够在多个样品中执行所述方法，所述样品分别包含至少一种微生物病原体和浓度分别不同的抗感染药物，以便这样此外能够得到用于最低抑菌浓度(MHK)的定量结论。此外，作为其他对照样品能够使用抗生素敏感的试验菌株。为具有抗生素敏感的试验菌株的样品添加与在具有要检查的微生物病原体的样品中相同的浓度的相同的抗生素化合物。
通常，在开始培养时并且在最长60分钟、优选最长30分钟、更优选最长15分钟、特别优选最长5分钟的时间区间中进行光学探测。
在开始培养时并且在最长60分钟、优选最长30分钟的时间区间中进行拉曼光谱分析。
借助于本发明的方法能够在180分钟、优选150分钟、再更优选少于120分钟、最优选少于60分钟之内结束微生物病原体和其抗感染药物抗性的确定。
典型地，所述方法涉及识别致病的微生物病原体。因此，从个体、优选哺乳动物、特别优选人类中提取样品。样品例如能够是体液，如尿液样品或转移到介质中的微菌落。
对于根据本发明的方法仅需要样品中的50至1000个、优选100至1000个微生物病原体。典型地，一个样品包含5×101至1×105、优选1×102至1×105、更优选5×102至1×105个微生物病原体。在特别优选的实施方式中，样品包含1×103至1×104个微生物病原体。
在一个实施方式中，在样品腔中产生不均匀的电场。
本发明的另一方面涉及一种用于确定微生物病原体的系统，所述系统包括：
-用于提供微生物病原体的拉曼光谱的拉曼光谱仪；
-用于光学探测微生物病原体以提供微生物病原体的光学数据的设备，其中所述系统构成用于通过分析光学数据来确定微生物病原体的形态并且用于基于微生物病原体的拉曼光谱和形态数据的组合来确定微生物病原体。
在一个特殊的实施方式中，所述系统还构成用于基于微生物病原体的已经确定的拉曼光谱和已经确定的形态的组合，确定抗感染药物抗性。利用不同的抗感染药物浓度，也能够确定病原体的最低抑菌浓度。对此，能够使用在临床的“转效点”(例如出自EUCAST准则)附近的抗感染药物浓度。
在一个实施方式中，所述系统附加地包括如下设备，所述设备能够在要确定的样品中产生不均匀的电场。所述设备例如包括电极。场强在此能够个体化地匹配于样品、腔和电极几何形状，并且应当在2V和60V之间。如果不发生用于热传递的主动运动并且样品腔材料仅是导热差的，那么不应超过16V，以便避免加热效应。
本发明的另一方面涉及一种用于确定病原体的程序单元，当所述程序单元在处理器上运行时，所述程序单元引导处理器执行如下步骤：
-基于用于光学探测病原体的设备的数据来确定微生物病原体的形态；以及
-基于微生物病原体的拉曼光谱和微生物病原体的形态来确定微生物病原体。
在一个实施方式中，程序单元还引导处理器还执行如下步骤：
-基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体的抗感染药物抗性。
本发明的另一方面涉及一种计算机可读介质，在所述计算机可读介质上存储有程序单元，当所述程序单元在处理器上运行时，所述程序单元引导处理器执行如下步骤：
-基于拉曼光谱的光谱数据来确定微生物病原体的拉曼光谱；
-基于用于光学探测病原体的设备的数据来确定微生物病原体的形态；
-基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体。
在一个实施方式中，计算机可读介质能够引导处理器还执行如下步骤：基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体的抗感染药物抗性。
为了简化形态的光学检测，样品空间能够包含电极，所述电极产生不均匀的电场进而将力施加到包含在样品中的微生物上。通过所述力驱使微生物病原体具有特定的取向，和/或到达测量芯片的特定的区域。抗感染药物能够对微生物的可极化性产生影响。因此，电场对样品的作用不仅能够贡献于探测场中的积聚，而且也有助于微生物的区分。
优选的实施方式的描述
要指出的是，“包括”不排除其他元件或步骤，并且“一个”或“一”不排除多个。此外要指出的是，参照实施例之一描述的特征或步骤也能够以与其他所描述的实施例的其他特征或步骤组合的方式使用。
尤其要指出的是，用于确定一种微生物病原体的方法也涉及确定多种微生物病原体，也就是说例如在样品中包含多种不同的病原体或并行地检查具有不同的病原体的多个样品。同样，能够为样品添加多于一种抗感染药物或者并行地检查具有抗感染药物的多个样品。当然也考虑多种病原体和抗感染药物的组合。
尤其，术语“光谱”和“拉曼光谱”也包含多个光谱。
本发明涉及一种用于确定微生物病原体的方法，所述方法包括如下步骤：样品的拉曼光谱分析和样品的光学探测，所述样品包括至少一种微生物病原体。
一个优选的实施方式涉及一种用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：样品的拉曼光谱分析和样品的光学探测，所述样品包括至少一种微生物病原体和抗感染药物。
本发明的一个特殊的实施方式涉及一种用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：
-培养包括至少一种微生物病原体和抗感染药物的样品；
-在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行拉曼光谱分析；
-在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行光学探测；
特别优选的实施方式涉及用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：
-培养包括至少一种微生物病原体和抗感染药物的样品；
-在培养样品期间，在至少两个时间点通过拉曼光谱分析来确定微生物病原体的拉曼光谱；
-在培养样品期间，在至少两个时间点通过光学探测来确定微生物病原体的形态；
-基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体和其抗感染药物抗性。
另一实施方式涉及用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：
-将包括至少一种微生物病原体的样品分为至少两个等份；
-为各个等份掺入不同浓度的抗感染药物；
-培养等份；
-通过拉曼光谱分析来确定微生物病原体的拉曼光谱；
-通过光学探测来确定微生物病原体的形态；
-基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体和其抗感染药物抗性。
典型地，在抗感染药物的作用时间之后进行拉曼光谱的确定和形态的确定。
优选地使用如下浓度，所述浓度处于用于敏感度和抗性的边界值的范围内。为此，本领域技术人员例如能够遵循欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EUCAST)的转效点表格的阈值(转效点)(http://eucast.org/clinical_breakpoints/)。使用的浓度例如能够为EUCAST阈值的0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、2倍、4倍、8倍或更高倍的值。在一个实施方式中，所使用的浓度是EUCAST阈值的4倍的值。
作为内部质量控制能够附加地同样借助于拉曼光谱分析和光学分析，在添加抗感染药物之前或直接在添加抗感染药物之后的时间点检查样品。
术语“微生物病原体”包括微生物，如例如细菌、古菌和真菌。尤其，该术语涉及如下微生物，所述微生物对于动物、优选哺乳动物、尤其优选人类是致病的。
在优选的实施方式中，细菌是多重耐药的革兰氏阴性的细菌。多重耐药的革兰氏阴性的细菌的实例是肠杆菌科，例如大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌、肠杆菌属、绿脓杆菌和鲍氏不动杆菌。
术语“抗感染药物”包括对抗微生物的化合物，即杀死微生物或抑制所述微生物的生长的化合物。该术语例如包括抗生素(对抗细菌)，抗病毒药物(对抗病毒)，抗真菌药物(对抗真菌)和驱虫药物(对抗寄生虫)。尤其，术语“抗感染药物”包括抗生素和抗真菌药物。抗感染药物和抗生素此外包括β内酰胺、糖肽、聚酮化合物、大环内酯类抗生素、氨基苷类抗生素、多肽抗生素、喹诺酮类(和氟喹诺酮类)和磺胺类。抗生素例如通过抑制细胞壁合成(例如青霉素)、抑制蛋白质生物合成(例如卡那霉素、新霉素和氯霉素)、抑制正确的核酸聚合(例如利福平和环丙沙星)起作用。
因此，本发明的方法特别适用于确定细菌和其抗生素抗性。在此，对包括至少一种细菌和抗生素的样品进行拉曼光谱分析和光学探测。此外，本发明的方法适用于确定真菌和其抗真菌药物抗性，其中对包含至少一种真菌和抗真菌药物的样品进行拉曼光谱分析和光学探测。
有抗感染药物抗性的微生物能够减弱或完全抵消抑制生长或杀死的作用。为此，所述微生物可以使用不同的策略：例如修改抗感染药物的目标结构，使得有效成分不再能够结合；合成酶，所述酶分解抗感染药物并且使其无效；合成替代的蛋白质，所述蛋白质承担通过抗感染药物抑制的蛋白质的功能；或者开辟替选的代谢途径；大程度过量产生被抑制的分子，使得存在的抗感染药物浓度只能阻挡一部分目标结构，而其余部分仍然存在；膜结构中的变化，使得物质根本不首先进入细胞(减少摄取)或可以再次主动泵出(例如外排泵)。所有这些变化导致，尽管存在抗感染药物，微生物仍可继续生长(抗性)，然而部分地发生形态变化以及生化变化，所述变化能够以光学的方式和以拉曼光谱分析的方式检测。上述抗性机制可以单独出现以及以组合的方式出现。通过使用电场，可能可以更容易地看到变化。
优选的实施方式涉及用于确定细菌和其抗生素抗性的方法，所述方法包括如下步骤：
-培养包括至少一种细菌和抗生素的样品；
-在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行拉曼光谱分析；
-在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行光学探测。
特别优选的实施方式涉及用于确定细菌和其抗生素抗性的方法，所述方法包括如下步骤：
-培养包括至少一种细菌和抗生素的样品；
-在培养样品期间，在至少两个时间点通过拉曼光谱分析来确定细菌的拉曼光谱；
-在培养样品期间，在至少两个时间点通过光学探测来确定细菌的形态；-基于细菌的拉曼光谱和形态来确定细菌和其抗生素抗性。
替选的实施方式涉及用于确定真菌和其抗真菌药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：
-培养包括至少一种真菌和抗真菌药物的样品；
-在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行拉曼光谱分析；
-在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行光学探测。
特别优选的实施方式涉及用于确定真菌和其抗真菌药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：
-培养包括至少一种真菌和抗真菌药物的样品；
-在培养样品期间，在至少两个时间点通过拉曼光谱分析来确定真菌的拉曼光谱；
-在培养样品期间，在至少两个时间点通过光学探测来确定真菌的形态；
-基于真菌的拉曼光谱和形态来确定真菌和其抗真菌药物抗性。
在至少两个时间点之间的时间区间在其他位置定义。在特别的实施方式中，至少在第一时间点(此时进行光学探测和/或拉曼光谱分析)还未为样品掺入抗感染药物。抗感染药物的添加在下一时间点、例如第二时间点(此时进行光学探测和/或拉曼光谱分析)之前进行。
与阴性控制数据相比微生物病原体的不变的细胞形态能够是用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的指标。此外，与阴性控制数据相比微生物病原体的不变的细胞生长能够是用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的指标。此外，与阴性控制数据相比微生物病原体的不变的或对于特定的抗性机制特征性变化的拉曼光谱能够是用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的指标。换言之，在确定微生物病原体的抗感染药物抗性时，能够使用用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第一指标，其中用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第一指标是与阴性控制数据相比微生物病原体的不变的或对于抗性机制特征性变化的细胞形态。此外，在确定微生物病原体的抗感染药物抗性时，能够使用用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第二指标，其中用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第二指标是与阴性控制数据相比微生物病原体的不变的或对于特定的抗性机制特征性变化的拉曼光谱。术语“对于特定的抗性机制特征性变化的拉曼光谱”包括特征性的光谱变化，所述光谱变化对于本领域技术人员是已知的。在特定的抗性机制的情况下，可以探测到细菌的变化的氨基酸组成(例如在VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG的情况下，尤其是VanA、VanB，以及在万古霉素抗性的情况下)，在其他抗性机制的情况下，可以探测到特定酶或通过这些酶裂解的物质的提高的产量，如例如在β-内酰胺抗性的情况下，β-内酰胺酶的产量提高或所使用的β-内酰胺抗生素的β-内酰胺环的水解作用增大。
此外，在确定微生物病原体的抗感染药物抗性时，能够使用用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第三指标，其中用于微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第三指标是与阴性控制数据相比微生物病原体的不变的细胞生长。
术语“不变的生长”，如在此所使用那样，也包括微弱减少的细胞生长。也就是说，细胞生长与阴性控制数据相比减小小于10％，小于5％，小于3％或小于1％。细胞生长通常通过观察一段时间期间的细胞数量、也就是说经由生长率来确定。细胞生长例如也能够以形态的方式探测，例如通过对具有对于细胞分裂典型的形态的细胞计数。
相反，与阴性控制数据相比微生物病原体的变化的细胞形态能够是用于微生物病原体对于抗感染药物的敏感度的指标。尤其，考虑细胞形态的变化，所述变化对于微生物病原体的敏感度是特征性的。因此，在特定的实施方式中，能够忽略轻微的初始形状变化。在此，形态变化通常对于特定的抗生素类别是特征性的。此外，与阴性控制数据相比微生物病原体的变化的细胞生长能够是微生物病原体对于抗感染药物的敏感度的指标。此外，与阴性控制数据相比微生物病原体的对于抵抗抗感染药物的敏感度特征性变化的拉曼光谱能够是用于微生物病原体对于抗感染药物的敏感度的指标。
阴性控制数据能够出自具有微生物病原体但不具有抗感染药物的样品。所述样品的数据能够已经存在，例如作为如下样品的数据，所述样品已经在较早的时间点根据本方法分析。替选地，具有微生物病原体但不具有抗感染药物的样品能够与具有抗感染药物的样品并行地分析。在另一实施方式中，阴性控制数据可以出自与抗感染药物接触之前的同一样品。此外，阴性控制数据可以出自具有或不具有抗感染药物的、有抗感染药物抗性的菌株的样品，尤其出自有抗感染药物抗性的菌株的样品。
作为阳性控制能够使用具有微生物病原体的抗感染药物的样品，所述微生物病原体对于所述抗感染药物是敏感的(对比病原体)。
优选地，对比病原体出自相同的类别，尤其优选出自要检查的病原体的相同种类。未知的微生物病原体的类别和种类例如能够直接在这里所描述的方法中确定。于是与阳性控制数据相比微生物病原体的不变的细胞形态能够是用于微生物病原体对于抗感染药物的敏感度的指标。此外，与阳性控制数据相比微生物病原体的不变的细胞生长能够是用于微生物病原体对于抗感染药物的敏感度的指标。此外，与阳性控制数据相比微生物病原体的不变的拉曼光谱能够是用于微生物病原体对于抗感染药物的敏感度的指标。
光学探测能够通过显微镜检查、全息摄影探测或动态光散射、优选显微镜检查进行。典型地，显微镜检查是光学显微镜检查。术语“光学显微镜检查”是本领域技术人员已知的并且尤其包括透射光显微镜检查、入射光显微镜检查、荧光显微镜检查、全息摄影、干涉对比显微镜检查、极化显微镜检查和共聚焦显微镜检查或其组合。在优选的实施方式中，将透射光显微镜检查用于光学探测。在一个特别优选的实施方式中，在透射光模式中使用共聚焦显微镜。
因此，对于实施本发明的方法适合的是具有集成的用于光学探测的设备的拉曼光谱仪，所述设备尤其是显微镜，如透射光显微镜或共聚焦显微镜。尤其适合的是具有集成的透射光和/或荧光显微镜(例如德国，乌尔姆的WiTEC的alpha300，英国的RENISHAW的inViaconfocal Raman microscope或HORIBA的XploRATMPLUS)的拉曼光谱仪。这种透射光和/或荧光显微镜优选是共聚焦显微镜。此外有利的是，用于光学探测的白光光源是集成的。激光源尤其需要用于拉曼光谱分析。拉曼光谱仪具有探测器、光谱仪并且通常具有至少一个滤光器。
为了单细胞分析使用具有高的数值孔径的物镜，也就是说具有大于或等于0.8、优选大于或等于0.9的数值孔径。
替选地，各个微生物可以通过使用不均匀的电场局部地聚集(例如通过负的介电电泳，细菌在样品器皿中部积聚)。随后，可借助于拉曼光谱分析来检测所有位于焦点中的微生物病原体的平均值光谱。
用于确定抗感染药物抗性的拉曼光谱分析法是本领域技术人员已知的(施罗德等)。在拉曼光谱分析中，通过单色光(激光)激发样品。由此在样品上也产生非弹性散射的光，所述光的频率不同于进行激发的光的频率。所述频率差异、即所谓的拉曼位移包含关于分子的振荡状态的信息，进而包含关于微生物的化学组成的信息。
典型地，在单细胞水平上进行拉曼光谱确定。为此，例如在白光中执行微孔腔的宽场拍摄。通过耦合于仪器的硬件的图像识别算法，探测各个细菌。这些细菌可以自动地、例如通过样品台的运动或通过光学装置的运动而移动。随后为各个细菌进行拉曼测量。在Z焦点平面中优化信号。在纯的介质中，能够附加地充分利用光阱的效应，以便实现最优的焦点。在优化的聚焦的情况下，介质的背景荧光几乎没有作用。对于鲁棒的数据分析而言，能够附加地使用调制波长的激发。如果各个微生物的信号过弱，那么所述微生物也能够在样品器皿中的特定部位处，例如在测量区域内聚集(例如通过使用不均匀的电场)。聚集随后在样品器皿中的之前限定的部位处进行，所述部位可自动地移动。为了对数量和形态进行光学分析，所有在显微镜的像场中可见的微生物被检测并且用于评估。对于拉曼光谱分析使用通过电场的作用积聚的微生物。电极结构应匹配于要检查的微生物的大小。
样品器皿能够是多井板的凹陷部(井)、孔腔、微容器或测量芯片的样品区域，但不局限于此。
通过光学探测能够确定样品中的微生物病原体的细胞数量、生长率和/或细胞形态。由此例如能够探测形态变化，所述形态变化通过抗感染药物的影响引起。通过可选地使用不均匀的电场，还能够更容易地看到可极化性的变化，进而可应用于抗性的更快的识别。旨在的可通过施加电场实现的取向能够降低确定的光学参数的变动。由此可以缩短确定抗感染药物抗性的时长。
术语“形态”涉及如下参数，所述参数描述微生物病原体的形状，例如大小、圆度、面积、面积与周长的比值、最长伸展(长度)与最短伸展(宽)的比值。优选的参数是大小、圆度和面积。通过自动的图像识别算法能够从光学探测的数据中提取所述参数或从中推导出的特征变量(例如泽尔尼克多项式的参数)。
为了确定关于形态变化的定量信息，在单细胞水平上进行显微镜检查。为此，在每个时间区间首先在白光中进行宽场拍摄，并且通过相应的图像识别算法自动识别不同的细菌并且描述特征(参见上文)。
抗感染药物抗性的确定通过光学探测和通过拉曼光谱分析进行。也就是说，为了评估，使用光学探测的数据，尤其显微镜检查图像数据和拉曼光谱。
在使用全息摄影方式或动态光散射时，能够检测在图像局部上取平均值的数据。尤其在全息摄影方式中，通过数据评估也能够确定各个微生物的特征。
附加地能够进行微生物病原体的生长率的确定。为此，在培养样品的不同的时间点进行宽场拍摄。通过自动的图像识别算法来确定样品中的微生物的数量。根据样品中的微生物的数量随时间的变化来确定生长率。
通过根据多元统计法的自动分析来确定微生物病原体和可能其抗感染药物抗性，所述统计法例如是主要成分分析、神经网络或支持向量机以及不同相关算法。这些自动分析法借助具有不同的抗感染药物(尤其抗生素)的不同的微生物(尤其细菌)的图像数据和拉曼光谱进行训练。光学数据和光谱数据是独立的，但反映微生物中的相同的变化。由此，通过信息的组合提高精度。借此能够实现在高精度下更短的分析时间。对于光谱信息和图像数据的组合评估，在此两种方式是可能的：1.从图像数据中确定定量参数(例如微生物病原体的数量，圆度，大小，形状因子(纵横比)等)并且将这些定量参数作为其他变量补充至拉曼数据(关于波数的强度)用于多元统计学评估；2.从拉曼数据中借助于统计学评估来识别标记谱带(对于所使用的抗感染药物的作用机制是特定的)并且从标记谱带中的相对强度中产生各个变量，所述变量可以与来自光学分析的定量参数一起在混合的统计学模型中评估。
典型地，在本发明的方法中将微生物病原体(例如细菌)作为纯的悬浮液使用。为此，将微生物病原体(例如细菌)作为悬浮液的等份引入到微孔板的对于分析特定的腔中。因为对于所有腔总是需要相同的体积和相同的浓度，所以能够自动地通过相应的设备进行填充。通过重力，微生物(例如细菌)沉到底部。替选地，也可以将微生物嵌入到适合的嵌入介质，例如琼脂糖中。在此，必须观察抗感染药物的相应的扩散时间。替选地，病原体悬浮液(例如细菌悬浮液)可以通过适合的微流控板传导。
术语“微孔板”和“微量滴定板”能够可互换地使用并且涉及具有0.1μl至2000μl、优选0.5μl至1000μl、更优选1μl至500μl、再更优选2μl至200μl、最优选5μl至100μl、例如10μl的填充体积的滴定板。微孔板通常由塑料构成。优选的是具有玻璃底部的微孔板。底部可以具有由琼脂糖或聚-L-赖氨酸构成的薄的涂层。这可以有利于细菌在玻璃底部附近的聚集。如果应使用电极(以产生不均匀的电场)，那么所述电极同样也施加到底板上。对于这里描述的应用也可考虑在孔腔的壁中的设置。在优选的实施方式中使用孔腔板，所述孔腔板不影响微生物病原体的生长。通过使用微孔板仅需要少量的细菌材料。微孔板是价格便宜的，进而适用于低成本的常规诊断应用。孔板的腔的底部应通过病原体悬浮液润湿。腔的大小能够匹配于所应用的显微镜的像场。
对于微生物的培养适合的是如下介质，所述介质适合于培植微生物的广谱，例如脑心浸液肉汤(典型的组成：小牛脑浸液12.5g/l；牛心浸液5.0g/l；蛋白胨10.0g/l；葡萄糖2.0g/l；氯化钠5.0g/l；磷酸氢二钠2.5g/l；pH 7.4±0.2；例如来自Carl Roth，德国)。
微生物病原体的培养在如下温度下进行，所述温度对于病原体的细胞分裂是尽可能最优的。通常，在25℃至39℃之间、优选在30℃和38℃之间、特别优选在37℃进行培养。为了连续地得到所述温度，例如能够使用样品腔，所述样品腔设定为期望的温度，例如设定为37℃。因为与培养并行地进行拉曼光谱分析和光学探测，所以在设备中样品腔设置在具有集成的光学探测设备的拉曼光谱仪处或周围，使得样品在拉曼光谱分析和光学探测期间可以保持在期望的温度上。在此，温度保证可以局部地进行(例如通过热薄膜)或全局地进行(包括微孔板和光学构造的一部分)。在此可以通过光学纤维进行导光。
在一个特别的实施方式中，设备具有两个不同调温的样品腔。例如，可以将样品腔设定为30℃并且将第二样品腔设定为37℃。首先将样品引入到这两个腔中的一个中，例如引入到37℃调温的腔中并且通过光学探测和/或拉曼光谱分析来识别微生物病原体。如果从所识别的病原体中已知的是，所述病原体在30℃下更好地生长，那么将微孔板引入到第二腔中。样品到腔中的引入可自动地进行。替选地，可以使用样品腔并且将样品腔的温度在识别微生物病原体之后匹配于病原体的最优的生长温度。在另一实施方式中，并行地将在微生物病原体和(可能)抗生素方面相同的两个样品并行地在两个不同调温的腔中、例如在调温至37℃和调温至30℃的腔中培养。
所描述的方法原则上适合于所有抗感染药物(尤其抗生素)。典型地，作为控制使用不具有抗感染药物添加的纯的样品或不具有抗感染药物抗性的纯的样品。替选地可以使用对比数据组，所述对比数据组对于与相应的抗感染药物组合的相应的病原体(例如相同种类的对比病原体)已经存在。在一个实施方式中使用对比数据组，其中添加与要检查的样品相同的抗感染药物，但是在微生物病原体方面与要检查的样品不同。抗感染药物能够以已经冻干的形式在孔板的腔中存在。根据样品材料的来源(血液培养、呼吸道、尿道等)能够选择和填充相应的药筒。
在以拉曼光谱分析的方式识别病菌之后将抗感染药物计量分配到腔中。为此，例如能够将具有注射接头的储存器皿装入到仪器中。在所述型式中推荐在一排腔中一起注入具有已知的灵敏度的试验菌株，以便同时具有对抗感染药物的有效性的控制。
在一个特殊的实施方式中，将大量细菌悬浮液(对于所需的抗生素测试加控制是足够的)填入到中央腔中。在仪器中以拉曼光谱分析的方式识别病原体之后选择微孔板，所述微孔板包含具有重要的浓度的重要的抗生素，并且细菌悬浮液以微流体的方式传导到相应的腔中。
在一个实施方式中，执行具有至少一个控制样品的方法。所述控制样品可以包含至少一种微生物病原体但不包含抗感染药物。由此，能够将包括微生物病原体和抗感染药物的(多个)样品的生长率和细胞形态与包括微生物病原体但不包括抗感染药物的(多个)控制样品的生长率和细胞形态进行比较。
附加地能够在包括抗感染药物敏感的试验菌株的样品中执行所述方法。
在一个实施方式中，对分别包含微生物病原体并且分别包含不同的抗感染药物的多个样品执行所述方法。因为本发明的方法能够容易地并行，所以由此可以同时测试微生物病原体对于多种抗感染药物的抗性。这由于越来越常出现的多重耐药的微生物病原体、尤其多重耐药的细菌(例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，多重耐药的艰难梭菌，但是还有多重耐药的革兰氏阴性的细菌(MRGN)，如例如多重耐药的绿脓杆菌，鲍氏不动杆菌或肠道菌，如大肠杆菌和克雷伯氏肺炎菌)是极其重要的。
在一个实施方式中，对分别具有微生物病原体和浓度分别不同的抗感染药物的多个样品执行所述方法。由此能够以简单的方式确定最低抑菌浓度。
明显的是，本发明同样适合于并行地分析分别具有不同的浓度的不同的抗感染药物。
在特殊的实施方式中，在开始培养时并且在最长120分钟、优选60分钟、特别优选最长30分钟、更优选最长15分钟、再更优选最长5分钟的时间区间中进行光学探测。在开始培养时并且在最长120分钟、优选最长60分钟、特别优选最长30分钟的时间区间中进行拉曼光谱分析。
借助于本发明的方法能够在180分钟、优选150分钟、更优选120分钟、特别优选60分钟之内结束微生物病原体和其抗感染药物抗性的确定。作为所应用的技术，将拉曼光谱分析用于确定微生物病原体的类别和种类并且将由拉曼光谱分析和光学分析的组合方法用于确定抗感染药物敏感度。在此可以在相同的设备中进行识别和抗性确定。在此不需要其他的样品预处理步骤。所需的样品材料是最小化的。
典型地，所述方法涉及识别致病的微生物病原体。因此，从个体、优选哺乳动物、尤其优选人类中提取样品。样品可以是体液，例如尿液样品，或转移到介质中的微菌落。尿液样品典型地借助于过滤器过滤，分离杂质，然而微生物病原体可以通过。将复杂的样品如在微生物实验室中所制定并且本领域技术人员已知的那样展开并且在短时间内、例如少于6小时、优选少于4小时、更优选少于3小时、特别优选少于2小时内培养，所述样品通常具有多种组成部分，如例如血液样品，或还具有定植菌群，如例如吸气材料。因为只需要少量的细菌材料，所以大约2至3小时的短的孕育时间足以获得足够的样品材料。替选地，也可考虑微流体的纯化步骤，所述纯化步骤使得直接从复杂的患者材料中可接近微生物病原体，用于借助这里所描述的发明进一步分析。这种预纯化也可以直接耦合于这里所描述的滴定板系统。
对于根据本发明的方法，仅需要样品中的50至1000个、优选100至1000个微生物病原体。典型地，一个样品包含5×101至1×105、优选1×102至1×105、更优选5×102至1×105个微生物病原体。在特别优选的实施方式中，样品包含1×103至1×104个微生物病原体。因为仅少量病原体需要用于确定病原体以及用于确定其抗感染药物抗性，所以可以放弃一个或多个预培养步骤，所述预培养步骤在现有技术中的方法中是必要的。因为所述预培养步骤通常持续6小时和24小时之间，所以在本方法中从提取样品起明显更快地实现结果。用于确定病原体和/或其抗感染药物抗性的本发明的方法的时长能够相应地缩短。因此，可以在提取样品之后的180分钟、优选150分钟、特别优选120分钟之内确定微生物病原体和其抗感染药物抗性。
本发明的一个特殊的实施方式涉及一种用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述方法包括如下步骤：
-培养包括至少一种微生物病原体和抗感染药物的样品；
-培养包括至少一种微生物病原体但不包括抗感染药物的控制样品；
-在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行拉曼光谱分析；
-在培养样品期间，在至少两个时间点对样品进行光学探测；
本发明的另一方面涉及一种用于确定微生物病原体的系统，所述系统包括：
-用于提供微生物病原体的拉曼光谱数据的拉曼光谱仪；
-用于提供微生物病原体的光学数据的用于光学探测微生物病原体的设备，
其中所述系统构成用于通过分析光学数据来确定微生物病原体的形态，并且用于基于微生物病原体的拉曼光谱和形态数据的组合来确定微生物病原体。
一个实施方式涉及一种用于确定微生物病原体的系统，所述系统包括：
-用于提供微生物病原体的拉曼光谱数据的拉曼光谱仪；
-用于提供微生物病原体的光学数据的用于光学探测微生物病原体的设备，
其中所述系统构成用于处理微生物病原体的拉曼光谱，通过分析光学数据来确定微生物病原体的形态，并且用于基于微生物病原体的拉曼光谱和形态数据的组合来确定微生物病原体。
在一个特殊的实施方式中，所述系统还构成用于基于微生物病原体的已经确定的拉曼光谱和已经确定的形态的组合，确定抗感染药物抗性。
本发明的另一方面涉及一种用于确定病原体的程序单元，当所述程序单元在处理器上运行时，所述程序单元引导处理器执行如下步骤：
-基于用于光学探测微生物病原体的设备的数据来确定微生物病原体的形态；以及
-基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体。
另一实施方式涉及一种用于确定病原体的程序单元，当所述程序单元在处理器上运行时，所述程序单元引导处理器执行如下步骤：
-处理微生物病原体的拉曼光谱；
-基于用于光学探测微生物病原体的设备的数据来确定微生物病原体的形态；以及
-基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体。
术语“处理拉曼光谱”包括常规的本领域技术人员已知的、用于拉曼光谱的信号优化的方法，如例如背景校正、标准化或波数校正。
在一个实施方式中，程序单元引导处理器还执行如下步骤：
-基于在与抗感染药物相互作用之后微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体的抗感染药物抗性。
程序单元能够是计算机程序的一部分，然而所述程序单元也能够是独立的。例如，程序单元能够用于更新已经存在的程序单元，以便实现本发明。
本发明的另一方面涉及一种计算机可读介质，在所述介质上存储有程序单元，当所述程序单元在处理器上运行时，所述程序单元引导处理器执行如下步骤：
-基于用于光学探测病原体的设备的数据来确定微生物病原体的形态；以及
-基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体。
另一实施方式涉及一种计算机可读介质，在所述介质上存储有程序单元，当所述程序单元在处理器上运行时，所述程序单元引导处理器执行如下步骤：
-处理微生物病原体的拉曼光谱；
-基于用于光学探测病原体的设备的数据来确定微生物病原体的形态；以及
-基于微生物病原体的经处理的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体。
在一个实施方式中，计算机可读介质还可以引导处理器执行如下步骤：基于微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定微生物病原体的抗感染药物抗性。
计算机可读介质可以考虑作为存储介质，例如作为USB棒、CD或DVD、数据存储器、硬盘或每种任意的其他介质，在所述介质上可以存储上文所描述的程序单元。
实施例1
-制成细菌悬浮液并且将所述细菌悬浮液引入微孔腔板的腔中(腔的填充体积≤100μl，等份10μl)：一个微孔腔不包含抗生素，其他微孔腔包含一种抗生素或分别包含不同的抗生素。
-通过拍摄测量腔中的多个单病原体的单光谱以拉曼光谱分析的方式识别病原体，并且将光谱与用于数据库比较以确定细菌种类：通过耦合于仪器的硬件的相应的图像识别算法，不同的细菌能够自动地移近。在37℃下孕育细菌。
-借助于白光显微镜检查和随后的图像评估跟踪细菌生长：为此每大约15分钟对每个孔腔进行宽场拍摄。通过图像识别算法得到关于形态变化的定量信息。在评估中，将所述信息相对于不具有抗生素的控制进行评估。
-拉曼光谱分析的特征描述：在60分钟之后和在120分钟之后，根据各个腔中的大约10至20个细菌执行拉曼光谱分析的特征描述。通过拉曼光谱的分析，得到关于生化指纹的定量信息，也就是说关于细菌的生化组成的信息。在评估中，将所述信息相对于不具有抗生素的控制来确定。在此，基于图像信息，通过样品台的自动移动自动地移近细菌。
-通过将关于生长曲线的数据、关于形态变化的定量信息以及拉曼光谱分析的特征描述结合，自动地分析抗生素抗性：为此将添加抗生素的腔中的细菌拉曼光谱的光谱变化与没有添加抗生素的控制腔中的细菌拉曼光谱的光谱变化进行比较。如果出现对于抗生素的作用机制特征性的变化，那么这是表示敏感度的指标。如果不能确定区别或对于特定的抗性机制特征性的区别，那么这是表示抗性的指标。所述比较在此利用多元法(例如主要成分分析、线性判别分析、支持向量分析等)通过统计学评估(预先处理的)拉曼光谱来进行。类似地，从生长特征和形态变化的分析中得到表示抗性和敏感度的指标。这三个指标借助于加权统计法应用于：得出关于被检查的细菌相对于不同抗生素的抗性或敏感度。
光学检测在具有用白光照射的集成的共聚焦显微镜的拉曼光谱仪上进行(例如英国RENISHAW的inVia共聚焦拉曼显微镜或HORIBA的XploRATM PLUS)。
实施例2
-将细菌悬浮液的等份引入微孔腔板的腔中(腔的填充体积≤100μl，等份10μl)。在每个腔中存在不同浓度的抗生素，所述抗生素的抗性应被测试(浓度范围：0μg/ml至根据EUCAST准则的转效点的4倍)。腔配设有电极，所述电极能够实现产生电场。
-接通电场。细菌集中于孔腔中的限定的部位。通过在测量芯片中的限定的部位处记录拉曼光谱以拉曼光谱分析的方式识别病原体，并且将光谱与数据库比较以确定细菌种类。随后在37℃下的细菌孕育能够在不产生电场的情况下进行。
-借助于白光显微镜检查和随后的图像评估跟踪细菌生长：为此每大约5至15分钟在每个孔腔中进行宽场拍摄。通过图像识别算法得到关于形态变化的定量信息。为了细菌的聚集和定向(尤其针对小棍形的细菌令人感兴趣的)可以直接在拍摄显微镜图像之前接通电场。评估包括光学参数(和可能的极化)的动态变化。作为控制在此使用时间点0分钟和不具有抗生素的等份。
-拉曼光谱的特征描述：在30、60分钟之后和在90分钟之后进行在通过电场聚集的细菌云之内的拉曼光谱的特征描述。在此，拍摄每个测量腔中的多个光谱。通过分析拉曼光谱，获得关于生化指纹的定量信息，即关于细菌的生化组成的信息。评估根据抗生素可包括形成谱带比值或与不具有抗生素的控制相比的多元统计法。
-抗生素抗性的自动分析和最低抑菌浓度的确定：为此为每种抗生素浓度一起评估图像信息以及拉曼数据。这包括关于细菌生长、形态的定量参数以及特征性的拉曼谱带的信息。为每种抗生素浓度确定，添加的抗生素浓度是否足以抑制细菌生长。最低抑菌浓度作为如下浓度得到，在所述浓度下刚好未达到或还未超过阈值(例如在拉曼光谱中的谱带比值或形态变化的特定程度或与未经处理的样品相比细菌生长的特定的减少)。阈值对于特定的抗生素作用分类和作用时长是特征性的。通过将这样确定的最低抑菌浓度与敏感度的边界值(例如根据EUCAST准则)比较，对未知的、要描述特征的细菌归入抗性水平：敏感的、中等的(针对一些细菌抗生素组合定义)或有抗性的。
附图说明
下面，根据附图详细讨论本发明的实施例：
图1示出关于用于确定微生物病原体的系统的概览
在图1中示出用于确定微生物病原体的系统(1)，所述系统具有用于光学探测的相机。要确定的病原体(5)位于孔腔板(3)的孔腔中，所述孔腔板具有多个孔腔(4)。光学形态探测经由相机(2)进行。为了照明在此使用白光源(9)，所述白光源通过物镜(8)照亮样品。激光器(6)和具有探测器(7)的色散元件形成拉曼光谱仪。激发光路径以及探测光路径经过物镜(8)。探测器(7)用于拉曼光谱探测。计算单元(10)用于通过基于相机的数据确定病原体的形态和基于微生物病原体的拉曼光谱和形态确定病原体(和可能其抗感染药物抗性)来确定病原体和可能其抗感染药物抗性。
图2：2A.示出在不同浓度的环丙沙星的90分钟的作用时间之后的大肠杆菌菌株的拉曼光谱。与传统的微生物学方法一致，将该菌株的MHK确定为0.032μg环丙沙星/ml。由此，该菌株是对环丙沙星敏感的。
2B.示出图2A的局部的放大图(对于～1485cm-1处的谱带，光谱顺序遵循在右边给出的浓度，对于1450cm-1处的拉曼谱带，顺序是刚好相反的)。
图3：3A.示出在不同浓度的环丙沙星的90分钟的作用时间之后的另一种大肠杆菌菌株的拉曼光谱。与传统的微生物学方法一致，将该菌株的MHK确定为1μg环丙沙星/ml。由此，该菌株对环丙沙星具有抗性。3B.示出图3A的局部的放大图(对于～1485cm-1处的谱带，光谱顺序遵循在右边给出的浓度，对于1450cm-1处的拉曼谱带，顺序是刚好相反的)。
图4：未经抗生素处理(4A和4C)和用哌拉西林/他唑巴坦(4B：敏感的菌株；4D：有抗性的菌株)处理180分钟之后的大肠杆菌菌株的形态。

Claims (20)

1.一种用于确定样品中的微生物病原体和其抗感染药物抗性的方法，所述样品包括微生物病原体和抗感染药物，所述方法包括如下步骤：
-培养包括至少一种微生物病原体和抗感染药物的样品；
-在至少两种不同的抗感染药物条件下，通过所述样品的拉曼光谱分析来确定所述微生物病原体的拉曼光谱；
-在至少两种不同的抗感染药物条件下，通过光学探测所述样品来确定所述微生物病原体的形态；
-基于所述微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定所述微生物病原体；
-基于所述微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定所述微生物病原体的抗感染药物抗性。
2.根据权利要求1所述的方法，
其中所述至少两种不同的抗感染药物条件是不同的抗感染药物浓度和/或所述抗感染药物的不同的作用时长。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法包括如下步骤：
-培养包括至少一种微生物病原体和抗感染药物的样品；
-在培养所述样品期间，在至少两个时间点通过所述样品的拉曼光谱分析来确定所述微生物病原体的拉曼光谱；
-在培养所述样品期间，在至少两个时间点通过光学探测所述样品来确定所述微生物病原体的形态；
-基于所述微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定所述微生物病原体；
-基于所述微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定所述微生物病原体的抗感染药物抗性。
4.根据权利要求1或2所述的方法，
其中通过显微镜检查、全息摄影探测或动态光散射进行所述光学探测，其中所述显微镜检查是透射光显微镜检查或荧光显微镜检查。
5.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括如下步骤：
-通过光学探测来确定所述微生物病原体的细胞生长；
其中抗感染药物抗性的确定基于所述微生物病原体的已经确定的拉曼光谱、已经确定的形态和已经确定的细胞生长。
6.根据权利要求1或2所述的方法，
其中至少一种微生物病原体是细菌并且抗感染药物是抗生素。
7.根据权利要求1或2所述的方法，
其中在确定所述微生物病原体的抗感染药物抗性时，使用表示所述微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第一指标，其中表示所述微生物病原体对于抗感染药物的抗性的所述第一指标是与阴性控制数据相比所述微生物病原体的不变的细胞形态，并且其中可选地在确定所述微生物病原体的抗感染药物抗性时，使用表示所述微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第二指标，其中表示所述微生物病原体对于抗感染药物的抗性的所述第二指标是与阴性控制数据相比所述微生物病原体的不变的或对于特定的抗性机制特征性变化的拉曼光谱，和/或其中可选地在确定所述微生物病原体的抗感染药物抗性时，使用表示所述微生物病原体对于抗感染药物的抗性的第三指标，其中表示所述微生物病原体对于抗感染药物的抗性的所述第三指标是与阴性控制数据相比所述微生物病原体的不变的细胞生长。
8.根据权利要求7所述的方法，
其中所述阴性控制数据来自如下样品，所述样品包括所述微生物病原体但不具有抗感染药物。
9.根据权利要求1或2所述的方法，
其中附加地借助包含所述至少一种微生物病原体但不具有抗感染药物的控制样品执行所述方法，和/或其中所述方法持续小于180分钟。
10.根据权利要求9所述的方法，
其中所述方法持续小于150分钟。
11.根据权利要求9所述的方法，
其中所述方法持续小于120分钟。
12.根据权利要求9所述的方法，
其中所述方法持续小于60分钟。
13.根据权利要求1或2所述的方法，
其中所述样品从个体中提取和/或包含1*102至1*105个微生物病原体。
14.根据权利要求13所述的方法，
其中所述个体是哺乳动物。
15.根据权利要求13所述的方法，
其中所述个体是人类。
16.根据权利要求13所述的方法，
其中所述样品包含5*103至1*104个微生物病原体。
17.根据权利要求1或2所述的方法，
其中在所述样品中产生不均匀的电场。
18.一种用于确定微生物病原体和其抗感染药物抗性的系统，所述系统包括：
-拉曼光谱仪，用于提供所述微生物病原体的拉曼光谱；
-用于光学探测所述微生物病原体的设备，用于提供所述微生物病原体的光学数据；
其中所述系统构成用于通过分析所述光学数据来确定所述微生物病原体的形态，和基于所述微生物病原体的拉曼光谱和形态的组合来确定所述微生物病原体；
其中所述系统还构成用于基于所述微生物病原体的拉曼光谱和形态的组合来确定抗感染药物抗性。
19.根据权利要求18所述的系统，
其中所述系统附加地包括如下设备，所述设备能够在要确定的样品中产生不均匀的电场。
20.一种计算机可读介质，在所述计算机可读介质上存储有程序单元，当所述程序单元在处理器上运行时，所述程序单元引导所述处理器执行如下步骤：
-基于用于光学探测病原体的设备的数据来确定微生物病原体的形态；
-基于所述微生物病原体的拉曼光谱和所述微生物病原体的形态来确定所述微生物病原体；
其中所述计算机可读介质还可选地引导所述处理器执行如下步骤：
-基于所述微生物病原体的拉曼光谱和形态来确定所述微生物病原体的抗感染药物抗性。
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