CN1938430A - 使用拉曼活性探针构建物来分析生物学样品的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

提供了使用拉曼活性或SERS活性探针构建物检测生物学样品中的分析物诸如体液中含蛋白质的分析物的各种方法。拉曼活性构建物中的探针部分被选择，以结合和鉴定生物学样品中特定的已知分析物，或者探针部分被设计成可以与在某些氨基酸中常见的功能基团发生化学相互作用，以便本发明方法提供关于样品中含蛋白质的分析物或片段的氨基酸组成的信息。在一些情况中，当被用于本发明方法时，拉曼活性或SERS活性探针构建物可以鉴定特定的含蛋白质的分析物或特定类型的此类分析物，以便可以获得患者样品的蛋白质谱型。当与正常样品的拉曼或SERS光谱的数据库比较时，使用所公开的方法可以鉴定患者的疾病状态。

Description

使用拉曼活性探针构建物来分析生物学样品的方法和装置
技术领域
[00001]本发明一般地涉及用于鉴定样品中分析物存在与否的方法和装置，更具体地，涉及使用拉曼活性探针构建物来分析生物学样品的方法和装置。
背景技术
[00002]基因组水平DNA测序的巨大成功使得我们可以开始获得在25年前不可想象的的知识。为了使这些具有分水岭意义的数据能够转化为对诊断人类疾病、确定人类疾病病期(staging)、了解和治疗人类疾病有帮助的知识，要求我们不仅应当知道据估计＞30,000的人类蛋白质的序列，而且要求我们鉴定出预示疾病的即将发作的蛋白质表达中的关键变化，在分子水平精确地划分疾病亚型，并且要求我们了解在疾病过程中密切涉及的蛋白质的功能、相互作用以及如何调节它们的活性。一种了解蛋白质功能的最基本方法是将表达水平变化作为生长条件、细胞周期阶段、疾病状态、外部刺激、其它蛋白质的表达水平或其它变量的函数而建立起联系。尽管DNA微阵列分析为基因组范围的(genome-wide)mRNA表达分析提供了强有力的平行方法，然而mRNA的体内浓度与其编码的蛋白质之间常常没有直接的关系。mRNA翻译为蛋白质的差异速率和蛋白质体内降解的差异速率是限制由mRNA外推到蛋白质表达图谱的两个因素。
[00003]另外，这样的微阵列分析不能检测、鉴定或量化翻译后蛋白质修饰——其经常在调节蛋白质功能方面起着关键的作用。蛋白质表达分析提供了潜在巨大的优势，因为它测量生物效应物蛋白质分子的水平，而不仅仅是其信息的水平。目前，没有一种蛋白质作图(profiling)技术能够接近微阵列分析的能力，同时描绘25,000或更多基因的mRNA表达的相对水平。
[00004]因此，对各种生物环境和有机环境中的低浓度分析物的检测和分析正被给以不断增长的关注。对这样的分析物的定性分析一般限于较高的浓度水平，而定量分析通常要求用放射性同位素或荧光剂进行标记。此类方法一般耗时而且不方便。
[00005]近来由于它们在化学、生物和药物研究以及疾病诊断学中日益增长的应用，固态传感器，特别是生物传感器已经得到相当多的关注。一般而言，生物传感器由两个元件组成：高度特异性的识别元件和将分子识别事件转化为可定量信号的转换结构。生物传感器已经被发展为检测多种生物分子复合物，包括寡核苷酸对、抗体-抗原、激素-受体、酶-底物和凝集素-糖蛋白相互作用。一般用电化学、场效应晶体管、光学吸收、荧光或干涉测量设备完成信号转换。
[00006]已知多孔硅膜可见的反射率变化的强度可以被应用于简单的生物传感器，从而可能检测、鉴定和量化小分子。尽管这样的生物传感器的确有用，但是反射率变化的检测因存在宽的峰而不是一个或多个较尖的明确的发光峰而变得复杂。
[00007]拉曼光谱术和表面等离子体共振也已被用于努力实现灵敏而准确地检测或鉴定生物样品中的单个分子的目标。当光通过感兴趣的介质时，一定数量的光由其原来的方向变换方向，这是称之为散射的现象。一些散射光在频率上与原始的激发光不同，这是由于光被吸收和电子激发到更高的能态，及随后在不同波长下发生光发射的缘故。吸收的光的能量和发射的光的能量的差异与介质的振动能量相匹配。该现象称为拉曼散射，用拉曼散射光表征和分析介质或感兴趣的分子的方法称为拉曼光谱术。拉曼发射光谱的波长表征了样品中拉曼散射分子的化学组成和结构，而拉曼散射光的强度取决于样品中分子的浓度。
[00008]拉曼光谱类似于红外光谱，是由波长分布带组成的，其对应于被分析的样品(分析物)的特定的分子振动。在拉曼光谱法的实践中，来自一般为激光的光源的光束聚焦在样品上，从而产生了非弹性散射辐射，其被光学收集并被导入波长色散光谱仪中，在其中检测器将碰撞光子的能量转化为电信号强度。
[00009]在历史上，入射辐射向非弹性散射辐射的非常低的转化率限制了拉曼光谱法应用于通过红外光谱法难于进行的应用上，例如分析含水溶液。然而，已经发现，当非常靠近粗糙银电极的分子接受拉曼激发源作用时，所产生的信号的强度增加了多至6个数量级。
[00010]尽管造成该散射效率出现很大增加的机理目前是相当多的研究的主题，但普遍认为如果满足下面三个条件，则该现象发生：(1)金属的自由电子吸收可以被250与2500纳米(nm)之间的波长的光激发，优选以激光束的形式激发；(2)所使用的金属尺寸合适(一般为5至1000nm的直径的颗粒，或者具有等价形态学的表面)，并且具有产生表面等离子体场所必需的光学性质；和(3)分析物分子具有有效匹配的光学性质(吸收)，以耦合到等离子体场。
[00011]具体而言，金、银、铜和某些其它金属的纳米颗粒可以起着增强电磁辐射的局部效应(localized effect)的作用。位于此类颗粒附近的分子对拉曼光谱分析表现出大得多的灵敏度。SERS是利用这种表面增强拉曼散射效应来表征和分析感兴趣的生物分子的技术。
[00012]在引入感兴趣的分子之前或之后，当氯化钠和氯化锂被应用于金属纳米颗粒或金属涂敷的表面时，它们被鉴定为可增强SERS信号的化学品。然而，使用这些化学增强剂的技术并没有证明对于可靠检测低浓度分析物分子例如单个核苷酸或蛋白质是足够灵敏的，结果，SERS仍不适于分析复杂生物样品例如血浆的蛋白质内容物(protein content)。
[00013]因此，在本领域，对提供关于结合的分析物特征的更多信息的分析物检测方法以及使用拉曼光谱分析技术来可靠地检测和/或鉴定各个分析物存在需求。另外，在本领域，对定性和定量检测低浓度水平的生物分子的快速且简单的手段存在需求。
附图说明
[00014]图1是显示现有技术聚合物凝胶(上图)以及浸以银纳米颗粒的本发明凝胶(下图)的示意图。
[00015]图2是示意性流程图，描述了附着有抗体探针的本发明光学条码的制备和分离。当与各种目标分子接触时，光学条码构建物中的抗体与不同的分析物特异性结合。如图示，如此形成的带有探针的复合体进行2维分离，以准备进行光学信号诸如拉曼信号的检测，所述信号通过照射分离的复合体而产生。
[00016]图3为显示了本发明活性分子拉曼代码的四个功能作用如何与探针构建物的四个结构区域相互关联的示意图。
[00017]图4是三个拉曼SERS光谱的图，其说明了通过改变等长(21个残基)的单链寡核苷酸主架上的拉曼活性标签的数量和位置而获得的对本发明活性分子拉曼代码的拉曼信号的效应。RF1是具有两个拉曼标签ROX和FAM、但是缺少氨基基团增强子的构建物的拉曼信号，其中ROX和FAM位于寡核苷酸主架的相反端。AT3、AT11和AT19是三个构建物的拉曼光谱，它们具有共同的主架和5′氨基基团增强子，但在主架的三个不同位置上具有同样的拉曼标签TAMRA。
[00018]图5是两个拉曼SERS光谱的图，说明了增强子在本发明活性分子拉曼代码中的效应。产生光谱PGPT和NPGPT的构建物都具有线性单链多聚(dT)主架，该主架携带有10个残基的多聚(dG)拉曼标签。PGPT缺少增强子基团，而NPGPT具有附着到多聚(dG)拉曼标签上的增强子部分(AmC6)，以增强由多聚(dG)拉曼标签提供的拉曼信号。
[00019]图6A-B是拉曼SERS光谱的图，说明了本发明活性分子拉曼代码中功能/结构区域的交叉效应。图6A中示出的SPTA光谱由具有ThiSS活性基团、多聚(dT)主架和5′末端的单个dA标签的分子构建物产生。该光谱显示，拉曼活性部分是单dA残基，分子主架提供了微小的增强子功能。图6B中示出的ACRGAM光谱由具有5Acrd活性基团、多聚(dG)主架和在5′端的作为增强子基团的单个AmC7的分子构建物产生。拉曼光谱主要由拉曼活性多聚(dG)主架产生，增强子扩增该信号。
[00020]图7A-D是一系列的示意性流程图，说明了使用级联结合以增强由固定的分析物产生的拉曼信号的本发明方法的四个不同实施方案。在每一个实施方案中，具有一抗和DNA主架的活性分子拉曼代码将分析物固定在基质上。图7A、7B、7C和7D分别说明了四种不同类型的次级拉曼复合体与拉曼活性核酸杂交，以增强拉曼信号：具有化学连接的互补寡核苷酸的金属纳米颗粒；由互补寡核苷酸形成的树枝状大分子；通过杂交的寡核苷酸的连接而形成的双链DNA；使用dNTP和拉曼标记的寡核苷酸对分子主架进行末端转移酶反应。
[00021]图8A-I是一系列的化学合成图，其说明了使用具有DNA拉曼活性主架和作为活性基团的功能基团的本发明活性分子拉曼代码，特异性地结合含蛋白质分子中的氨基酸残基中的功能基团。
[00022]图9是示意性流程图，说明了获得含蛋白质的样品的蛋白质谱型的本发明方法。使用了三种对氨基酸中的氨基、巯基和羧基功能基团具有特异性的活性分子拉曼代码。
[00023]图10A说明了本发明的方法，其中，级联结合和分子拉曼代码被扩增(如图7A-D所示)之后，在原位形成金属纳米颗粒，以产生SERS信号。图10B说明了在SERS活性构建物的合成过程中的三个时间产生的拉曼信号的强度。
[00024]图11说明了具有分布在不连续位置上的抗体库的芯片。放大图显示了使用在活性分子拉曼代码中的抗体亚组进行简并级联结合(degenerate cascade binding)之后的单个不连续位置。
[00025]图12是示意性流程图，说明了依据拉曼代码设计，对SERS特征进行分类，从而对分析结果进行的多重分析。如图12中的流程图所示，各个信号点(图11)可以通过进行微米级SERS扫描和信号特征分析来辨析。通过比较从对照和测试样品获得的结果，测定测试(患者)样品中的异常。
发明详述
[00026]本发明的各种实施方案涉及使用拉曼活性或SERS活性探针构建物来检测生物样品中的分析物，诸如体液中的含蛋白质的分析物。在某些实施方案中，拉曼活性构建物中的探针部分被选择用来结合生物样品中特定的已知分析物，并因此鉴定该分析物的存在与否。在其他实施方案中，拉曼活性构建物中的探针部分被设计成与在某些氨基酸中常见的功能基团发生化学相互作用，以便本发明方法提供有关样品中含蛋白质的分析物或其片段的氨基酸组成的信息。
[00027]下面的详细描述含有许多具体的细节，以便提供对本发明公开的实施方案更充分的理解。然而，对本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案无需这些具体细节也可以实施。在其他情况中，在本领域熟知的装置、方法、程序和各个组件在本文中没有进行详细地描述。
[00028]如图1所示，本发明的一个实施方案提供了固体凝胶基质300，其包括固体凝胶100和一个或多个附着有探针的SERS增强纳米颗粒200，所述探针用于与分析物特异性结合。提供一系列独特的光学特征的一系列纳米颗粒也可以被整合入凝胶基质。如本文中所述，SERS增强性纳米颗粒包括一个或多个拉曼活性标签，以及与已知的分析物诸如含蛋白质的分析物特异性结合的探针。在一个方面，包含在凝胶基质中的至少一个纳米颗粒可以具有净电荷，以有助于电泳期间分析物的分离。在另一实施方案中，每一个纳米颗粒可以提供独特的SERS信号，该信号与纳米颗粒的探针的结合特异性相关联。
[00029]因为拉曼光源可以发射通过凝胶，可以在无需将分离的分析物从凝胶中取出的情况下检测样品中分析物的存在。
[00030]在一个方面，本发明的凝胶基质掺入复合有机-无机纳米颗粒(COIN)，该COIN包括核心和表面，其中所述核心包括金属胶体，所述胶体包括第一金属和拉曼活性有机化合物。COIN和制备COIN的方法在本文下面的内容中详细描述。
[00031]为了用于分离和检测样品诸如生物样品中的蛋白质，本发明凝胶基质含有SERS活性纳米颗粒，该颗粒携带与含有蛋白质的分析物的蛋白质部分特异性结合的探针，如本文中所述。此探针包括抗体、抗原、多核苷酸、寡核苷酸、受体、配体和类似物。
[00032]在本发明凝胶基质中使用的任何纳米颗粒还可以包括荧光标记，该荧光标记促成了纳米颗粒的光学特征。
[00033]在另一种实施方案中，本发明提供了检测样品中的分析物的方法，包括：将含有分析物的样品与分离凝胶诸如本发明的凝胶基质在允许分析物与一个或多个SERS增强性纳米颗粒中的探针结合形成复合体的合适条件下接触；通过电泳或磁泳(magnetophoresis)将所述复合体与其他样品内含物分离开来；和检测由分离的复合体在凝胶中的不同位置上发出的SERS信号(即，将复合体从凝胶中移出或不移出)。由特定复合体发射的SERS信号与特定分析物的存在有关。样品可以是含有蛋白质或含蛋白质分析物的混合物的复杂生物样品，在这种情况下，凝胶基质将包括许多不同的SERS增强性纳米颗粒，以指示样品中不同分析物的存在，纳米颗粒中的探针特异性地与所述分析物结合。含有待被分离的生物学目标的样品在将该混合物引入凝胶以进行分离之前与SERS增强性纳米颗粒接触，或者样品被引入已经在其中掺有SERS活性纳米颗粒的本发明凝胶中。
[00034]在另一实施方案中，在凝胶基质和凝胶分离方法中使用的纳米颗粒中的探针的特异性是未知的，来自特定的结合复合体的SERS信号提供有关探针所结合的分析物的化学结构的信息。通过对复合体在所使用的特定的分离介质(例如凝胶的类型、分离的电和磁条件)中的行为的分析，获得关于结合的分析物的其他信息，并且这样的信息可以与从拉曼信号的分析获得的信息一起编辑，和补充从拉曼信号的分析获得的信息。所有被检测的分析物的此类信息的编辑结果可以被用来产生样品的蛋白质谱图。
[00035]通过电泳或磁泳，或者通过这两种方法的组合，实现凝胶基质内的复合体的分离，后者特别被用于纳米颗粒含有磁性物质诸如金属氧化物的情况下。复合体可以基于通常与凝胶分离技术相关的任何因素进行分离，除了分离将取决于分析物/SERS增强性纳米颗粒复合体的电荷、重量等方面的净差异，而不是取决于分析物它们本身的差异。因此，通过测定因探针结合到分析物而引起的分析物迁移率变化，可以检测分析物与一个或多个纳米颗粒的结合。在某些实施方案中，其中至少两个纳米颗粒具有不同的净电荷，以在电泳期间对分析物分离施加影响。
[00036]如果感兴趣的分析物是含蛋白质的分析物，可以使用聚丙烯酰胺凝胶基质，感兴趣的分析物可以选自抗原、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白和它们的组合。例如，在非变性条件下，使用的电泳技术可以是一维或者二维电泳。可选地，本发明的凝胶分离方法还可以包括将凝胶浸在化学增强溶液中，诸如LiCl或NaCl溶液，以进一步增强分离的分析物产生的SERS信号。此外，通过干燥已应用了化学增强溶液的凝胶，样品将在检测之前被浓缩。
[00037]当样品包括两个或更多个具有基本上相同尺寸和/或基本上相同电荷密度的分析物时，本发明的凝胶分离方法——其中分析物的SERS信号在不将分析物从凝胶移出的情况下进行检测——可特别用于区别各个分析物之间的差异。当用激光照射时，两个或更多个分析物产生的SERS信号可以被用于区分和提供有关两个或更多个分析物之间的差异的结构信息，既便两者具有相同的化学式。此外，获得的SERS信号可以区分在样品中具有基本上相同尺寸和/或基本上相同电荷密度的分析物。
[00038]在一个方面，在检测SERS信号之前或之后，本发明的分离方法还可以包括对分析物进行层析或等电聚焦。由SERS分析获得的信息可以与由等电聚焦和/或层析获得的信息比较或一起编辑，以进一步增强有关特定蛋白质或样品蛋白质谱图的信息。
[00039]在本发明分离方法的一个实施方案中，SERS增强性纳米颗粒是COIN，如本文中描述。
[00040]在还有另一实施方案中，本发明提供了制备本发明凝胶基质的方法，该方法包括：通过将形成凝胶的液体和许多拉曼增强性纳米颗粒混合而形成液体组合物，所述形成凝胶的液体包括处于合适的液体中的可形成凝胶的颗粒。拉曼增强性纳米颗粒具有许多独特的光学特征，并且每一个包括用于结合分析物的探针。使用本领域已知的方法由该液体组合物获得固体凝胶基质。尽管通常用于制备分离凝胶的任何类型的形成凝胶的颗粒都可以用于本发明方法，聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶普遍用于分离化学和生物学分子。为了应用在本发明筛选复杂生物学样品的方法中，许多SERS增强性纳米颗粒可以被掺入凝胶中，其中每一纳米颗粒具有附着的探针，该探针可以特异性地与许多不同的分析物中的一种形成复合体，诸如本文中描述的COIN。
[00041]聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶是在电泳中使用的最常见的稳定介质，本领域技术人员在制备聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶中运用的原理包括如下。琼脂糖和丙烯酰胺凝胶的广泛使用源于这样的事实，这些基质在电泳期间也充当“分子筛”，它们根据其尺寸和结构限制生物分子的运动。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶是交联的、海绵状的结构。尽管它们有高达99.5％的水，这些凝胶的孔的尺寸类似于许多蛋白质和核酸的尺寸。当分子在施用的电压的驱使下通过凝胶，较大的分子比较小的分子更大程度地受到凝胶阻滞。对于任何特定的凝胶，小于凝胶确定的尺寸的分子根本不受阻滞；它们几乎如在自由溶液中一样移动。在另一极端，大于基质确定的尺寸的分子根本不能进入凝胶。因此，本领域技术人员将通过选择适当的基质浓度，调整凝胶以筛选期望尺寸范围的分子。凝胶的平均孔径由凝胶中的固体百分比决定，对于聚丙烯酰胺来说，也由交联剂的数量决定。
[00042]尽管对于琼脂糖和聚丙烯酰胺可能的凝胶密度范围有实践限制，但这两种基质能够通过电泳分离DNA链，长度由仅几个碱基对的寡核苷酸至大至几百万碱基对长的染色体或染色体片段。产生小孔凝胶的聚丙烯酰胺被用于分离尺寸从少于5个碱基至约2,000个碱基对的多核苷酸。具有大的孔径的琼脂糖凝胶可以被用于分离从50至30,000个碱基对的核酸，而且使用脉冲场技术，可以分离长度大于5×106个碱基的染色体尺寸和类似尺寸的片段。
[00043]本发明凝胶和它们的使用方法的一个重要的特征是无需将分析物从凝胶中移出，就可以检测分离的分析物，即分离的含蛋白质的分析物。通过用本领域已知的任何SERS技术照射凝胶中分离的分析物，可以完成检测。此外，由于SERS分析优异的灵敏性，生物样品中微量的分离的感兴趣的分析物可以被检测和定量测定。
[00044]在还有另一实施方案中，本发明提供了包括本发明的凝胶基质的系统，其可以被用于进行本发明的凝胶分离和检测方法。这样的系统还可以包括含有至少一个分析物的样品；和适合于检测来自纳米颗粒的SERS信号的光学检测系统。使用本发明的凝胶基质的本发明系统还可以包括计算机，该计算机包括用于分析获自样品的SERS信号的算法。
[00045]在还有另一实施方案中，本发明提供了样品中的分析物的多重检测方法，该方法通过将样品中的分析物在适于形成复合体的条件下与一组探针构建物接触。每一探针构建物包括连接有光学活性多核苷酸条形码的非核酸探针，所述条形码含有至少一个SERS活性核苷酸，如本文中所述，以提供独特的光学特征。独特的光学特征可以是独特的SERS特征。此外，组中的每一个探针构建物是特异性设计的，以在选择的电泳介质中具有独特的迁移率。如此形成的复合体通过电泳分离。分离之后，以多重的方式用合适的检测装置，检测独特的光学特征，或者在分离凝胶中或者在从分离介质中移出之后检测。合适的检测装置将取决于光学活性条形码的光学特性。因为每一特异性结合探针与发射可区分的光学特征诸如SERS信号的已知条形码连接，由构建物检测到的各光学特征因此与样品中已知分析物的身份相关。
[00046]因为多核苷酸的电泳迁移率至少部分地取决于该多核苷酸中的核酸的数量，通过在组的各个成员的条形码中使用变化数量的核苷酸，可以获得在该组中各个探针构建物的独特迁移率。类似地，通过对多核苷酸条形码中的核酸进行选择，可以获得该组中成员间净电荷的多样性。因为在电泳中复合体的迁移率由整个复合体的电荷密度决定，由于所使用的该组探针构建物的成员的独特的迁移率特征，当结合到该组探针构建物的不同成员时，可以从单个样品中分离许多类似的分析物，然后同时检测它们。
[00047]此外，游离目标和/或未结合的探针构建物的电泳特性将不同于结合的复合体的电泳特性，通过电泳将游离目标和/或未结合的探针构建物从复合体中去除是简单的事情，这例如在检测结合的复合体之前进行。在一个方面，该组探针构建物中的非核酸探针可以是特异性结合在生物样品中已知的含蛋白质目标的一组抗体。在该情况下，目标分析物将是含蛋白质的分析物，如本文中描述。可选择地，探针构建物中的非核酸探针可以是被检测的真正的分析物，这是因为非核酸探针(例如抗体、受体和类似物)与患者样品中的含蛋白质分子或复合体的结合偏好性可以是分析的目的。
[00048]本发明该实施方案中的分离的复合体可以一维地分离(例如层析或电泳)或可以二维地分离(例如首先进行层析或等电聚焦，然后进行电泳)。因为在探针复合体形成之后，目标分子的尺寸、表面特性和电荷密度可以发生变化，所以使用两种不同的分离原理将有助于复合体与未结合组分的分离。
[00049]将被使用的光学检测程序或光学检测程序的组合将取决于分析物的属性、分离装置或基质以及探针构建物的结构和特性。使用本文中描述的和本领域已知的技术，分离的复合体可以用一种光学技术或光学技术的组合进行检测，所述光学技术选自吸收、反射、偏振、折射、荧光、拉曼光谱、SERS、共振光散射、光栅耦合(grating-coupled)表面等离子体共振。
[00050]在还有另一实施方案中，本发明提供了制备一组活性拉曼分子码的方法，所述活性拉曼分子码被设计成，可以利用完善建立的DNA/肽化学术合成，以构建分子复合体。活性拉曼分子代码展示出多或寡核苷酸主架的特征，其本身具有拉曼活性，或其具有通过内置的基团以化学方法附着到主架的各个位置上的拉曼标签，以获得不同的拉曼特征，而不改变化学组成。待被用作拉曼活性分子码的每一个分子复合体具有活性基团(例如探针)，其直接而特异性地结合生物分析物的氨基酸中固有的功能基团，或结合含蛋白质的目标。
[00051]本发明活性拉曼分子码通过下述方法产生：获得一组分子主架，每一分子主架在沿着主架的不同位置包含携带两个或更多个化学反应活性部分的有机聚合物；将两个或更多个小分子拉曼活性标签连接到该组中的每一主架上，连接位置是在化学反应活性部分，其中，该组的成员的主架上的拉曼活性标签的类型、数量和相对位置以不同的方式组合，从而该组的每一成员产生独特的拉曼信号。
[00052]活性基团也与该组中的主架连接，其中每一活性基团特异性结合含蛋白质分析物中的不同类型的功能基团。例如，活性基团可以是对生物学含蛋白质分子的氨基酸中固有的化学部分具有反应活性的化学功能基团。可选择地，活性基团可以是探针，如本文中描述，其可以特异性地结合已知的含蛋白质的分子。
[00053]分子主架可以包括可以用已知的化学技术合成的任何有机聚合物。其可以是具有生物聚合物特性的结构，诸如天然存在的或合成的多糖、蛋白质、氨基酸或它们的组合。主架也可以是拉曼活性单链或双链多核苷酸片段，它们容易用标准的亚磷酰胺化学术合成。主架包括核苷酸类似物，其已进行化学修饰以适应拉曼活性标签的化学附着。化学修饰的核苷酸类似物在聚合物主架中的位置可以变化，以改变拉曼活性标签的定位。可以被引入主架以实现该目的的核苷酸类似物的例子包括2-氨基嘌呤。在不同的方面，主架可以包括2至约1000个核苷酸，约50至约400，或约10至约100个核苷酸。取决于结构和化学组成，主架可具有多达3个功能：拉曼活性标签的支持物，拉曼信号的来源和拉曼活性标签的增强物。
[00054]当除了用作拉曼活性标签的附着点的化学修饰的核苷酸类似物的位置外，该组的成员具有共同的寡核苷酸主架时，主架的合成特别方便。在这种情况下，依然可能产生一组活性分子拉曼代码，每一代码具有独特的拉曼特征，其将可以用于鉴定体液中成千上万不同的分析物。
[00055]整合入本发明活性分子拉曼代码的拉曼活性标签是小分子，其在产生拉曼信号方面具有高度的活性，并通常具有小于1kDa的分子量。满足这些要求的拉曼活性标签包括染料(例如R6G、Tamra、Rox)、氨基酸(例如精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)、核酸碱基(例如腺嘌呤或鸟嘌呤)或它们的任何组合。也可以使用具有上述特征诸如合适的分子量和拉曼特征的天然存在的或合成的化合物。拉曼活性标签可以被置于分子主链的任何位置，单个主链可以具有一个以上的此类标签。通过在合成分子拉曼代码期间，改变主链上拉曼活性标签的类型、数量和相对位置，可以调整该组的成员的拉曼特征。
[00056]在一个方面，本发明活性分子拉曼代码中的活性基团是对特定的氨基酸残基中发现的其他功能基团(例如胺、羧基、硫醇、醛或羟基基团)具有反应活性的功能基团(例如acrydite3、胺或硫醇基团)，如在本文图8A-8I中所示。例如，当氨基基团用作该活性基团时，它将以化学的方式与分析物中的Lys结合并鉴定之；用作活性基团的巯基基团将结合并鉴定含有硫醇基团的氨基酸或Cys；羧酸活性基团将结合并鉴定Asp或Glu；醛活性基团将结合并鉴定糖蛋白中的糖残基，它们使用在图8A-8I中示出的化学方法。可以与蛋白质功能基团特异性反应的其他试剂可以用于本发明的制备活性分子拉曼代码的方法。在使用中，当活性基团是这种类型的功能基团时，单个的蛋白质或蛋白质片段可以是多个活性分子拉曼代码的目标并与它们复合，每一活性分子拉曼代码产生不同的拉曼信号。在这种情况下，结合单个分析物的分子拉曼代码的组合提供关于分析物的氨基酸组成方面的信息。
[00057]在本发明的活性分子拉曼代码中使用的第二类活性基团是探针，诸如抗体、受体、凝集素或噬菌体展示的肽，它们特异性地结合已知的含蛋白质的分析物或其片段。可以附着到聚合物主架的探针分子的其它例子可以包括但是不限于寡核苷酸、核酸、抗体、抗体片段、结合蛋白质、受体蛋白质、肽、凝集素、底物、抑制剂、激活剂、配体、激素、细胞因子和类似物。使用已知的化学术，例如DNA/蛋白质化学术，将这类活性基团与主架连接，这样，探针可以被用来标记或识别它的目标分子(例如，避免对结合产生位阻)。
[00058]用于本发明的活性分子拉曼代码的拉曼活性标签选自拉曼活性染料、氨基酸、核苷酸或它们的组合。适于整合入拉曼活性标签的拉曼活性氨基酸的例子包括精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和其组合。适于整合入拉曼活性标签的拉曼活性核苷酸的例子包括腺嘌呤、鸟嘌呤和其衍生物。
[00059]本发明一组活性分子拉曼代码中的至少一个成员还可以包括结合到拉曼活性主架或标签的增强子部分，它们强化了独特的拉曼光谱的强度。例如，多聚(dT)主架不但充当主架而且充当dA标签的增强子，附着到多聚(G)拉曼标签上的胺基基团充当该标签的增强子部分。
[00060]在另一实施方案中，本发明提供了用上述方法制备的活性分子拉曼代码和活性分子拉曼代码组。在若干的本文上述方法中，本发明的活性分子拉曼代码可用于分析生物学样品。
[00061]在还有其他实施方案中，本发明提供了通过使用本发明的活性分子拉曼代码来分析生物学样品的方法，如本文中所述。为了使用本发明的活性分子拉曼代码来构建蛋白质谱图，可以遵照下面的示范性程序。利用本文中提供的详细指导，通过利用活性基团、分子主架和拉曼标签的不同组合，本领域技术人员可以设计出各种变化形式。在该实施方案中，蛋白质样品首先可以可选地被消化，例如用胰蛋白酶，或各种本领域已知的序列特异性蛋白酶。不同的蛋白酶消化和不同的连接化学术的组合可以由原始的样品产生大量的子样品(sub-samples)。
[00062]尽管可以使用本发明的任何活性分子拉曼代码组，在该示范性方法中，使用包含3种代码的一组代码，每一代码包括三种活性基团中的其中一种(即氨基、羧基和硫醇基团)，并被附着到不同的拉曼活性主架，例如选自聚(dA)、聚(dG)和聚(AG)的主架(图9)。将整个或消化的蛋白质的样品(或分离的子样品)与三种拉曼代码接触，以进行结合。然后使用任何合适的分离机制分离结合的复合体，诸如电泳(例如在凝胶基质中)、尺寸排阻层析、亲和结合、离子交换、等电聚焦和类似方法。当使用电泳时，复合体(不存在SDS)的迁移率取决于总体尺寸和净负电荷。毛细管电泳是用于检测少量的各分析物优选的分离方法。每一样品或子样品在它各自的通道或凝胶基质泳道中分离。在SERS检测之前，或者在基质中，或者转移出基质，拉曼代码/蛋白质复合体的分离的复合体的拉曼(SERS)信号被检测。在SERS检测之后，将SERS光谱与拉曼代码信息关联起来，可以编辑关于样品的蛋白质内容物的大量信息，这对于蛋白质作图(proteinprofiling)是重要的。
[00063]在还有另一实施方案中，本发明提供了测定样品中分析物存在与否的方法，其中级联结合与拉曼活性探针构建物联合，用于进行SERS检测。由于生物学和化学系统的复杂性，非完美的(简并的(degenerated))反应或结合并不是少见的。研究简并的结合事件可以帮助鉴定有用的药物或疾病标志物。目前，针对许多试剂和生物分子的成百上千的抗体可以利用，并可以是用于药物筛选、疾病标志物鉴定等等的极其有价值的工具。因此，在该实施方案中，本发明方法包括将含分析物的样品与附着到固体支持物不连续位置上的第一组探针，诸如抗体或受体接触，以在所述不连续的位置上形成探针/分析物复合体。然后将探针/分析物复合体与至少一组另外组的本发明活性分子拉曼代码接触，其中第一组的探针(例如抗体和受体)中的部分探针被用作第二组探针构建物(即，本发明活性分子拉曼代码的探针构建物)中的活性试剂。
[00064]本发明方法基于下面的假设：1)存在这样的受体库，库中的受体浓度基本上相同，并且当允许非完美的(简并的)结合时，库中的每一受体具有较高的可能性结合样品中的两个或更多个分析物。2)存在着含有不同丰度的配体的样品。对于每一配体，当允许简并的结合时，可能具有两个或更多个可利用的受体。当受体是抗体，配体是蛋白质时，这些假设在生物学系统中通常是真实的。
[00065]由于简并结合，由第一结合形成的复合体中的一些有可能将被探针构建物结合(即，分析物被相同的抗体或被结合分析物或含分析物的复合体上的两个表位的两个不同的抗体识别两次)。只有那些“阳性结果”会被拉曼活性代码标记。阳性鉴定的分析物可以是样品中低丰度的分析物，这是因为就第二结合事件而言，在第一结合事件中被结合的蛋白质可以被相对地富集(相比它在样品中的浓度)。
[00066]然后，将包含拉曼活性代码的结合的复合体用金属薄层在原位覆盖，如本文中所述，以增强拉曼活性探针构建物的拉曼信号。紧紧靠近分析物的金属层，将产生SERS信号，并且整个固体支持物可以用单一光源照射，同时从在固体支持物的不连续位置上结合的含拉曼代码的复合体收集SERS信号，例如利用SERS扫描收集SERS信号。获自不连续的位点的一个或多个SERS光谱将探针部分与特定分析物在样品中的存在联系起来，或者将该探针部分鉴定为与样品中的分子或复合体具有亲和性(例如，至今未知的)。
[00067]在一个方面，其中拉曼活性探针构建物包括寡核苷酸主架，尤其是拉曼活性寡核苷酸主架，该方法还可以包括在沉积金属层之前，扩增固体支持物上的结合的含拉曼代码的复合体中的主架。例如，使用本领域已知的技术，PCR3或末端转移酶反应扩增可以被用于扩增拉曼活性主架。在末端转移酶反应中，使用的dNTP混合物可选地含有一种或多种拉曼标记的核苷酸或拉曼活性核苷酸，如本文中所述。
[00068]金属薄层在扩增的拉曼代码上的沉积可以以金属纳米颗粒的形式在原位形成，以整合扩增的拉曼代码。参考图10A-B进行描述，固体支持物110涂覆以连接层(linker layer)120，以连接一抗130。一旦与样品接触，一抗130将目标140固定化。连接有拉曼代码的二次抗体150特异性地结合携带固定化抗原140的一抗130，并使用任何上述技术扩增该拉曼代码。通过与还原剂接触，金属阳离子从胶体溶液沉淀出来，从而形成金属纳米颗粒170，所述金属纳米颗粒合并了扩增的拉曼代码160。
[00069]为了检测结果，对各个分子结合事件的SERS信号，或从基质上每一不连续的位置(例如“抗体点”)发出的信号点进行计数。如图11所示，基质210具有许多不连续的位置，“即，抗体点”，其中，一抗被固定在基质上。单个抗体点的放大图显示出了信号点230，在那里，由于至少一个活性分子拉曼代码与通过一抗固定在不连续位置220的分析物结合，SERS信号被检测到。通过该程序获得的结果的多重分析涉及根据拉曼代码设计对SERS特征进行分类。通过实施微米级SERS扫描和信号特征分析，可以辨别各个信号点，如图12的流程图所示。
[00070]抗体和受体是附着到固体支持物上的不连续位置的、并入第二组拉曼活性探针构建物的探针的非限制性例子。噬菌体展示的肽、核酸、适体、配体、凝集素和它们的组合也可以在本发明的方法中用作探针。尽管样品可以是体液，样品也不必一定是体液，而是可以包括任何的分析物混合库，包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸、病毒颗粒、多糖、类固醇和其组合。在一个方面，样品包括已知患有或怀疑患有特定的疾病的患者的体液库。
[00071]为了使用本发明方法来检测疾病标志物，该方法被重复，不同的是，取代代表疾病的患者样品，分析物库由获自正常的对照患者的相应样品(例如，同样的类型的体液)构成。该方法然后还包括将获自患者样品的SERS光谱与获自正常对照患者样品的SERS光谱进行比较，以鉴定差异，其中该差异表明在已知或怀疑患有疾病的患者的样品中存在疾病标志物(图12)。
[00072]在一个方面，第一组探针(例如整组抗体)被随机划分，以获得多个亚组的探针，它们在其中一个第二组中使用(例如用作活性分子拉曼代码中的探针)。可选择地，第一组的探针可以被分成含有等量探针的亚组。在后一种情况中，在原始探针组的亚组中的每一个探针被用作单个第二组活性分子拉曼代码中的活性试剂，并且在单个亚组中的每一拉曼代码对于该单个亚组的成员是独特的，但是每一个第二组含有相同组的拉曼代码。
[00073]本发明的分析生物学样品的方法的另一实施方案中，使用本文中描述的或本领域已知的任何方法，将样品的分析物在固体支持物上分离，并且将分离开的分析物与初级组的活性拉曼分子代码接触，以便允许活性拉曼分子代码与样品中的一个或多个含蛋白质的分析物特异性结合，形成复合体。然后将如此形成的复合体与次级拉曼代码复合体接触，以便扩增由复合体中的活性拉曼分子代码产生的拉曼信号。检测由次级拉曼代码产生的扩增的拉曼信号，并与样品中分析物的存在联系起来，其中，活性拉曼分子代码的活性试剂特异性地结合分析物。
[00074]在一个方面，与次级拉曼复合体的接触涉及在活性拉曼分子代码组的被结合的成员与次级拉曼代码中的多核苷酸或寡核苷酸之间的缔合，以扩增拉曼信号。例如，在这种情况下，其中活性拉曼分子代码组的成员包括寡核苷酸主架，可选地，具有拉曼活性，并且次级拉曼复合体包括互补的寡核苷酸，这两者之间选择性杂交之后进行扩增反应，以扩增拉曼信号。在另一方面，在选择性杂交之后，引入适于导致杂交的双链片段连接的条件，以便形成扩增拉曼信号的线性或分支拉曼活性复合体(图7C)。
[00075]在另一方面，其中活性拉曼分子代码组的被结合的成员包括在其3′端具有自由羟基的拉曼活性多核苷酸主架，该方法还包括：在适于形成长度为几百个或数千个核苷酸的单链拉曼活性分子的条件下，将被结合的复合体在存在末端转移酶的情况下暴露于dNTPs，以扩增主架的拉曼信号。此技术通常称为“滚环扩增”。为了进一步改变被扩增的拉曼信号，用于扩增各种被结合的复合体的单链DNA主架的dNTPs组成可以发生变化。可选地，拉曼标记的核苷酸可以被添加到使用的dNTP中(图7D)。
[00076]在还有另一方面，次级拉曼复合体可以包括使用本文中描述的方法被附着到金属纳米颗粒上的寡核苷酸或多核苷酸(图7A)。次级拉曼序列中的核酸序列被选择，以与活性分子拉曼代码中的至少一部分的主架多核苷酸互补。互补核酸序列与拉曼活性分子主架的选择性杂交将放大因照射而产生的拉曼信号。在这种情况下，由于纳米颗粒靠近分析物，放大的拉曼信号是SERS信号。在还有另一方面，其中次级拉曼复合体包括附着有拉曼活性标签的互补的寡核苷酸或多核苷酸，次级拉曼复合体是由互补的寡核苷酸产生的树枝状大分子，如本文中所述和本领域已知的(图7B)。在一个或多个树枝状大分子中的互补寡核苷酸选择性地与各种活性拉曼分子代码中的多核苷酸主架杂交，以放大拉曼信号。
[00077]已知，DNA可以被扩增1×104倍(滚环扩增)直至达1×106倍(PCR3)。因此，DNA扩增和SERS放大的组合可以产生1×1014倍的增强因子。此增强因子使得检测单个分子成为可能。典型地，蛋白质分子或DNA片段具有10-100nm的尺寸。如果，扩增之后，信号从1μm2的面积产生，1cm2的芯片将能够容纳1×108个蛋白质或DNA片段分析物。因为激光束点可以小至1μm，或更小，血清中大多数细胞因子的浓度在1×105至1×1010分子/μl范围内(Nature Biotechnology，April 200220：359-356)，所以微小数量的样品对于本文中描述的许多定量分析是足够的。
[00078]在还有另一实施方案中，本发明提供了测定分析物库中的分析物存在的方法，该方法包括将分析物库与附着到固体支持物的不连续位点上的、具有已知的结合特异性的第一组探针接触，以在不连续位点上形成探针/分析物复合体。然后，将如此形成的探针/分析物复合体连续地与多组第二组本发明活性拉曼分子代码接触，以形成含拉曼代码的复合体，其中每一第二组利用第一组探针的亚组探针作为活性试剂。然后，将含有结合的拉曼代码的复合体在原位与金属离子接触，以用金属薄层覆盖含拉曼代码的复合体，如本文中描述，从而在照射复合体时产生SERS信号。通过同时照射固体支持物的不连续位点上结合的含拉曼代码的复合体而产生的SERS信号被检测，并将检测到的一个或多个SERS光谱与不连续位点上是否存在来自样品的特定分析物联系起来。可选地，在形成金属层以增强SERS信号之前，可以扩增被结合的含有拉曼代码的复合体中的多核苷酸主架，例如通过本文中描述的PCR3或滚环扩增来实现。在一个方面，SERS信号可以使用SERS扫描技术并通过根据拉曼代码设计对SERS光谱分类进行多重分析来检测。在该实施方案中，可以使用的示范性的探针包括抗体、噬菌体展示的肽、受体、核酸、配体、凝集素和类似物，可以被检测的示范性的分析物包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸、病毒颗粒、多糖、类固醇和类似物。优选地，分析物库包括已知或怀疑患有疾病的患者的体液样品。在一个方面，该方法被重复，不同的是，分析物库包括正常的对照患者的相应样品，并且该方法还包括将获自患者分析物库的SERS光谱与获自正常对照患者分析物库的SERS光谱进行比较，以鉴定差异，其中该差异表明在已知或怀疑患有疾病的患者的样品中存在疾病标志物。
[00079]本文中描述的本发明各种方法可以被用于编辑拉曼或SERS光谱的文库，所述拉曼或SERS光谱与健康个体以及鉴定具有特定疾病状态的个体的特定类型的生物学样品相关。对于各种生物学样品和各种疾病状态，可以构建类似的文库。然后可以将这样的文库中的拉曼或SERS光谱与使用本发明方法和装置由任何个体获得的结果比较，以帮助基于他们的各自光谱来诊断个体是否具有或可能具有特定的生物学表型或疾病(参见图12)。尽管本文中描述的任何生物学样品可以用于此目的，但特别合适的生物学样品是血，例如血清。
[00080]下面的段落讨论了对于理解本发明各种实施方案有帮助的各种概念和术语。
[00081]广泛用于本文中的术语“多核苷酸”指通过磷酸二酯键连接起来的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。方便起见，用于本文中的术语“寡核苷酸”指用作引物或探针的多核苷酸。一般而言，可用作选择性地与选择的核苷酸序列杂交的探针或引物的寡核苷酸的长度为至少约10个核苷酸、通常至少约15个核苷酸，例如约15至约50个核苷酸之间。
[00082]多核苷酸可以是RNA或可以是DNA，其可以是基因或其一部分，cDNA、合成的多脱氧核糖核酸序列或类似物，并且可以是单链的或双链的，以及DNA/RNA杂合物。在各种实施方案中，多核苷酸，包括寡核苷酸(例如探针或引物)可以含有核苷或核苷类似物，或除了磷酸二酯键之外的主架键。一般而言，核苷酸，包括多核苷酸，是天然存在的脱氧核糖核苷酸，诸如连接到2′-脱氧核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或核糖核苷酸，诸如连接到核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。然而，多核苷酸或寡核苷酸也可以含有核苷酸类似物，包括非天然存在的合成的核苷酸或修饰的天然存在的核苷酸。这样的核苷酸类似物是本领域熟知的并且可以通过商业渠道获得的，含有这样的核苷酸类似物的多核苷酸也是如此(Lin等， Nucl.Acids Res.22：5220-5234(1994)；Jellinek等，Biochemistry 34：11363-11372(1995)；Pagratis等， Nature Biotechnol.15：68-73(1997)。
[00083]连接多核苷酸的核苷酸的共价键一般是磷酸二酯键。然而，共价键也可以是大量的其他键中的任何一种，包括硫代二酯键、硫代磷酸酯键、肽-样键或本领域技术人员知道的用作连接核苷酸以产生合成的多核苷酸的任何其他键(参见例如Tam等， Nucl.Acids Res.22：977-986(1994)；Ecker和Crooke， BioTechnology 13：351360(1995))。当多核苷酸要被暴露于可能含有核苷酸降解活性的环境，包括例如组织培养基，或被施用给活对象时，整合非天然存在的核苷酸类似物或连接核苷酸或类似物的键可能非常有用，这是因为修饰的多核苷酸对降解较不敏感。
[00084]如本文中使用地，术语“选择性杂交作用”或“选择性杂交”指在中等严紧性或高度严紧性条件下的杂交，这样，相比无关的核苷酸序列，核苷酸序列优先与选择的核苷酸序列结合至足以可用于鉴定选择的核苷酸序列的程度。将被认识到的是，一些数量的非特异性杂交是不可避免的但是可以接受的，只要与目标核苷酸序列的杂交具有足够的选择性，以便它可以与非特异性交叉杂交区分开来，例如，与不同于目标分子的核酸分子相比较，特别是与不同于目标核酸分子的基本上类似的(即，同源的)核酸分子相比较，具有至少约2倍的选择性，一般至少约3倍的选择性，通常至少约5倍的选择性，特别地至少约10倍的选择性，这例如通过与目标核酸分子结合的标记寡核苷酸的数量来测定。允许进行选择性杂交的条件可以经验性地确定，或可以基于例如杂交寡核苷酸和它要与之杂交的序列的相对GC：AT含量、杂交寡核苷酸的长度、寡核苷酸和它要与之杂交的序列之间的错配(如果有的话)的数量来估计(参见例如Sambrook等，“Molecular Cloning：Alaboratory manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989))。
[00085]逐渐增高的严紧性条件的例子如下：2×SSC/0.1％SDS，大约室温中(杂交条件)；0.2×SSC/0.1％SDS，大约室温中(低严紧性条件)；0.2×SSC/0.1％SDS，约42EC中(中等严紧性条件)；0.1×SSC，约68EC中(高严紧性条件)。可以使用这些条件中的仅仅一种，例如高严紧性条件进行洗涤，或可以使用这些条件中的每一种条件，例如各10-15分钟，以上面列出的顺序，重复任何或所有列出的步骤。然而，如上文所提及，最佳条件将会变化，这取决于涉及的特定的杂交反应条件，并可以经验性地确定。
[00086]本文中使用的术语“树枝状大分子”是合成的3维分子，其从简单的分支单体单元以逐步的方式制备而得，其特征和功能可以容易地控制。树枝状大分子的形成描述在万维网上，网址是almaden.ibm.com/st/projects/dendrimers。
[00087]公开的方法和组合物并不限制所使用的探针的类型，本领域已知的任何类型的探针部分都可以连接到条码或分子主架上，并用于公开的方法中。因此，本文中使用的“探针部分”或“探针”指作为分析物或一类分析物的特异性结合伴侣的分子或构建物。这样的探针包括但是不限于抗体片段、亲和体(affibodies)、嵌合抗体、单链抗体、配体、结合蛋白质、受体、抑制剂、底物等。
[00088]在一些实施方案中，用于本发明方法的拉曼活性或SERS活性构建物包括抗体探针。如本文中使用地，术语“抗体”以最广义的方式使用，以包括多克隆抗体和单克隆抗体，以及这样的抗体的抗原结合片段。用于本发明方法的抗体或其抗原结合片段的特征是例如对分析物的表位具有特异性结合活性。可选择地，如下面所解释的，分析物可以是探针抗体，特别是在用作探针(例如活性试剂)的抗体被暴露于体液以筛选一组可用作药物候选物的抗体的本发明实施方案中。
[00089]抗体，例如包括天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括例如单链抗体、嵌合抗体、双功能抗体和人源化的抗体，以及它们的抗原结合片段。这样的非天然存在的抗体可以用固相肽合成方法构建，可以重组产生或可以例如通过筛选组合文库而获得，所述组合文库由可变重链和可变轻链组成(参见Huse等，Science 246：1275-1281(1989))。制备例如嵌合抗体、人源化抗体、CDR接枝抗体、单链抗体和双功能抗体的这些和其他方法是本领域技术人员熟知的(Winter和Harris，Immunol.Today 14：243-246，1993；Ward等，Nature 341：544-546，1989；Harlow和Lane，Amibodies：A laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988)；Hilyard等.，Protein Engineering：A practical approach(IRL Press1992)；Borrabeck，Antubody Engineering，第二版(Oxford University Press 1995))。适合用作探针的单克隆抗体也可以从许多商业来源获得。对于许多不同的目标，都可以获得这样的商业抗体。抗体探针可以用下面讨论的标准化学方法与分子主架连接。
[00090]当涉及抗体时，术语“特异性结合”或“特异性结合活性”指抗体和特定表位的相互作用具有至少约1×10-6、一般至少约1×10-7、通常至少约1×10-8，特别地至少约1×10-9或1×10-10或更小的解离常数。因此，对抗原的表位保持特异性结合活性的抗体的Fab、F(ab′)2、Fd和Fv片段包括在抗体的定义之中。
[00091]在本发明的上下文中，术语“配体”指受体的天然存在的特异性结合伴侣、受体的合成的特异性结合伴侣以及天然和合成配体的合适衍生物。配体的测定和分离是本领域已知的(Lemer，Trends Neurosci.17：142-146，1994)。如本领域技术人员认识到的，分子(或大分子复合体)可以是受体或配体。一般而言，具有较小分子量的结合伴侣称为配体，而具有较大分子量的结合伴侣称为受体。
[00092]在某些方面，本发明属于用于检测样品中的分析物的方法。“分析物”指针对它可以找到探针的任何分子或化合物。分析物可以是固相、液相、气相或汽相。“气相或汽相分析物”是指存在于例如液体顶部空间、环境空气、呼吸样品、气体中的分子或化合物，或在任何前述中作为污染物存在的分子或化合物。将被认识到的是，通过压力、温度以及由于盐的存在或加入盐等影响液体的表明张力，气相或汽相的物理状态可以被改变。
[00093]如上所示，在某些方面，本发明的方法检测分析物与拉曼活性探针的结合。分析物可以由特异性的结合对(sbp)的成员构成，可以是配体，其是单价的(单个表位)或多价的(多个表位)，通常是抗原性的或半抗原性的，为单个化合物或共有至少一个共同的表位或决定簇位点的多个化合物。分析物可以是细胞的一部分，细胞诸如细菌或携带血型抗原如A、B、D等或HLA抗原的细胞，或者微生物，例如细菌、真菌、原生动物或病毒。在本发明的某些方面，分析物是带电荷的。
[00094]特异性结合对的一个成员(“sbp成员”)是两个不同分子中的其中一种，其在表面或腔中具有一区域，该区域特异性地结合另一分子的特定空间和极性结构，因此被定义为与该特定空间和极性结构互补。特异性结合对的成员被称为配体和受体(抗配体)或分析物和探针。因此，探针是特异性结合分析物的分子。这些通常是免疫对诸如抗原-抗体的成员，尽管其他特异性结合对诸如生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、核酸双链体、IgG-蛋白A、多核苷酸对诸如DNA-DNA、DNA-RNA和类似物不是免疫对，但是也包括在本发明和sbp成员的定义中。
[00095]特异性结合是两个不同的分子中的其中一个对于另一个分子的特异性识别，这是相比与其他分子弱得多的识别而言的。一般而言，这些分子在它们的表面或腔中具有引起两分子之间特异性识别的区域。示例性的特异性结合是抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸相互作用等等。
[00096]非特异性结合是分子间相对独立于特定表面结构的非共价结合。非特异性结合可以由若干因素包括分子间的疏水相互作用引起。
[00097]描述在本文中的用于本发明方法的拉曼活性探针构建物可以被用于检测特定的目标分析物例如核酸、寡核苷酸、蛋白质、酶、抗体或抗原的存在。纳米颗粒也可以被用于筛选生物活性试剂，即药物候选物，用于结合特定的目标或检测诸如污染物的物质。如上讨论，通过将探针整合入公开的拉曼活性构建物中，在本发明的方法中可以检测任何分析物，对于该分析物，探针部分诸如肽、蛋白质、寡核苷酸或适体可以被设计。
[00098]多价配体分析物通常是聚(氨基酸)，即多肽和蛋白质、多糖、核酸和其组合。这样的组合包括细菌、病毒、染色体、基因、线粒体、核、细胞膜和类似物的组分。
[00099]就大部分而言，本发明可以应用的多表位配体分析物将具有至少约5,000的分子量，更常见地具有至少约10,000的分子量。在聚(氨基酸)类型中，感兴趣的聚(氨基酸)通常将具有约5,000至5,000,000的分子量，更通常约20,000至1,000,000的分子量；在感兴趣的激素中，分子量将通常在约5,000至60,000的分子量范围内。
[000100]单表位配体分析物通常分子量将为约100至2,000，更通常地分子量为125至1,000。分析物包括药物、代谢物、杀虫剂、污染物和类似物。包括在感兴趣的药物中的是生物碱。在生物碱中有吗啡生物碱，其包括吗啡、可待因、海洛因、右甲吗喃、它们的衍生物和代谢物；可卡因生物碱，其包括可卡因和苄基芽子碱、它们的衍生物和代谢物；麦角碱生物碱，其包括麦角酸的二乙酰胺；类固醇生物碱；咪唑基生物碱；喹唑啉生物碱；异喹啉生物碱；喹啉生物碱，其包括奎宁和奎纳丁；二萜生物碱，它们的衍生物和代谢物。
[000101]术语分析物还可以包括多核苷酸分析物，诸如下面定义的那些多核苷酸。这些包括m-RNA、r-RNA、t-RNA、DNA、DNA-RNA双链体等。术语分析物也包括作为多核苷酸结合试剂的受体，诸如限制性酶、激活剂、阻遏物、核酸酶、聚合酶、组蛋白、修复酶、化学治疗剂和类似物。
[000102]分析物可以是直接在样品诸如宿主体液中发现的分子。样品可以直接检查，或可以预先处理，以使得分析物更容易被检测。还有，可以通过检测感兴趣的分析物的鉴定性试剂，诸如与感兴趣的分析物互补的特异性结合对成员来测定感兴趣的分析物，仅仅当感兴趣的分析物存在于样品中时，才检测到该鉴定性试剂的存在。因此，分析物的该鉴定性试剂变成在分析中被检测的分析物。体液可以是例如尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、唾沫、脑脊髓液、泪液、粘液和类似物。
[000103]如本文中所使用地，术语“胶体”是悬浮在液体通常是水中的金属离子。考虑应用于本发明金属胶体并形成纳米颗粒的典型的金属包括透明性金属，例如银、金、铂、铝和类似物。
[000104]为了增强由拉曼活性探针产生的拉曼光谱，在本发明方法的某些实施方案中，考虑在拉曼活性探针与分析物或含分析物的复合体结合之后，在原位将拉曼活性探针转变为SERS活性探针。为了实现该目的，将具有粗糙表面的透明金属薄层沉积在基质和/或被结合的复合体的顶层上。粗糙特征在数十纳米级别；并且相对于入射激发辐射的波长是较小的。该小尺寸的颗粒允许金属颗粒的表面等离子体的激发在颗粒上局部化。可以用许多方法产生在金属表面的金属粗糙特征；例如，金属颗粒的汽相沉积，或将金属胶体涂覆在生物传感器的上层。因为金属的表面电子受到颗粒的限制，颗粒的尺寸又小，所以等离子体激发也受到该粗糙特征的限制。所得的等离子体的电磁场非常强，相比拉曼信号，大大增强了SERS信号。
[000105]估计，只有1/10的分析物分子在拉曼光谱术中非弹性地散射。然而，在本发明方法的实施方案中，其中散射分子的拉曼信号的强度在SERS条件下被大大增强，低至皮摩尔和飞摩尔浓度的拉曼活性分析物也能被检测到。在一些情况中，通过沉积透明金属薄层，以便与含有拉曼标记的被结合的复合体接触，本发明方法可以被用于检测复杂生物学样品诸如血清中单个分析物分子的存在。金、银、铜和铝是该技术最有用的透明金属。
[000106]使用若干方法中的其中一种方法可以产生粗糙的金属表面。用于本文中的术语“薄金属层”指通过化学气相沉积沉积在含有拉曼标记的结合的复合体上的金属层。可选择地，薄金属层指通过将金属阳离子的胶体溶液施以还原条件以在原位上形成金属纳米颗粒而形成的纳米颗粒层。在一些实施方案中，纳米颗粒将含有结合的复合体。可选择地，种源颗粒(seed particles)，例如附着到拉曼代码上的种源颗粒，可以由金属胶体溶液沉淀形成纳米颗粒。通过使用附着到探针构建物上，例如附着到探针构建物中的分子主架或条码上的酶标签催化还原金属阳离子溶液，金属原子也可以沉积在活性分子拉曼代码上。在该上下文中，“薄”指厚度约为照射光源(通常是激光)的波长的一半，以获得SERS的益处，例如约15nm至约500nm，诸如约100nm至约200nm。
[000107]在其他实施方案中，用于本发明某些方法中的光学探针构建物或拉曼活性探针构建物被描述成含有“主架”，探针和光学活性标签附着到该主架上。在一个方面，拉曼代码主架可以由包括有机结构的聚合物链构成，包括核酸、肽、多糖和/或化学衍生的聚合物序列的任何组合。在某些实施方案中，主架可以包括单链或双链核酸。在一些实施方案中，主架可以附着到探针部分，诸如寡核苷酸、抗体或适体。可以掺入寡核苷酸模拟物，以产生有机主架。糖和核苷间键接，即核苷酸单元的主架，都可以用新的基团取代。
[000108]在另一方面，分子探针可以被用于与合适的核酸目标化合物杂交。已被显示具有优异的杂交特性的寡聚化合物或寡核苷酸模拟物的一个例子被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-主架用含酰胺的主架，例如氨基乙基甘氨酸主架取代。在该实例中，核苷碱基(nucleobases)被保留，直接或间接地结合到主架的酰胺部分的氮杂氮原子上。公开PNA化合物的制备的若干美国专利包括例如美国专利5,539,082；5,714,331和5,719,262。此外，PNA化合物公开在Nielsen等(Science，1991，254，1497-15)。
[000109]为了将一种活性分子拉曼代码与其它的活性分子拉曼代码区分开来，标签可以直接添加到主架。标签可以通过成像方法来读取，成像方法例如荧光显微术、FTIR(傅立叶转换红外)光谱术、拉曼光谱术、电子显微术和表面等离子体共振。已知不同变化形式的成像可以检测标签的形态学、拓扑学、化学和/或电特性，包括但是不限于导电率、隧穿电流、电容电流等。使用的成像方法将取决于标签部分的属性和所产生的信号。利用它们的拓扑学、化学、光学和/或电特性，不同类型的已知标签，包括但不限于荧光、拉曼、纳米颗粒、纳米管、富勒烯和量子点标签可以被用于鉴定拉曼代码。这些特性将作为所使用的标签部分的类型和标签在主架上的相对位置的函数而变化，从而对于每一条码产生可区分的信号。
[000110]标签可以包括例如拉曼活性标签或荧光标签，如本文中所述。因为例如通过荧光共振能量转移(FRET)或其他机制，相邻的标签可以相互作用，由同一组标签部分获得的信号可以取决于标签之间的位置和距离而变化。因此，具有相似或相同的主架的活性分子拉曼代码可以可区别地被标记。在本发明的某些实施方案中，活性分子拉曼代码的主架可以由磷酸二酯键、肽键和/或糖苷键形成。例如，标准亚磷酰胺化学术可以被用于制备包括DNA链的主架。制备磷酸二酯键连接的主架的其他方法是已知的，诸如聚合酶链式反应(PCRTM)扩增。主架的末端可以具有不同的功能基团，例如生物素、氨基基团、醛基团或硫醇基团。功能基团可以被用来结合探针部分或用于连接标签。标签可以被进一步修饰以获得不同的尺寸、电或化学特性以帮助检测。例如，抗体可以被用来结合地高辛或荧光标签。链霉抗生物素蛋白可以被用来结合生物素标签。
[000111]当主架包括肽部分时，或标签包括一个或多个氨基酸部分时，该肽可以被磷酸化，以便进行标签的修饰或用于与标签的化学反应。
[000112]在本发明的某些实施方案中，产生聚合物主架，拉曼活性标签通过化学的方式附着在该聚合物主架上。主架部分可以由适合于聚合的任何类型的单体构成，包括但是不限于核苷酸、氨基酸、单糖或各种已知塑料单体的任何单体，诸如乙烯基、苯乙烯、碳酸酯/盐、乙酸酯/盐、乙烯、丙烯酰胺等。聚合物主架可以连接到探针部分，诸如寡核苷酸、抗体、凝集素或适体探针。当聚合物主架由核苷酸单体构成时，与抗体探针的连接将使探针和主架这两组分与不同的目标分子结合的可能性最小化。可选择地，在使用核苷酸单体作为主架的本发明某些方面，因为基于核苷酸的主架本身将产生拉曼发射光谱，其会潜在地干扰对连接的拉曼活性标签的检测，所以产生极少或不产生拉曼发射信号的主架可以被用来优化信号检测并使信噪比最小化。
[000113]目前用于探针标记和检测的方法具有各种缺点。例如，附着到有机荧光标签上的探针提供了高的检测灵敏性但是具有低的多重检测能力。荧光标签展示了宽的发射峰，且荧光共振能量转移(FRET)限制了可以被附着到单个探针分子的不同荧光标签的数量，同时自淬灭降低了荧光信号的量子产率。如果探针含有一种以上类型的发色团，荧光标签需要多个激发源。它们也由于光漂白而不稳定。另一类型的潜在的探针标签是量子点。量子点标签是多层的相对较大的结构。除了制备复杂之外，量子点上的涂层干扰荧光发射，使用量子点标签可以产生的可区分信号的数量也有限制。第三类探针标记由注入染料的珠子组成。这些往往具有非常大的尺寸，常常大于探针分子的尺寸范围。对注入染料的珠子的检测是定性的，而不是定量的。
[000114]相反，“拉曼活性标签”提供了产生尖的光谱峰、允许较大数量的可区分标记附着到探针上的这样的优点。表面增强的拉曼光谱术(SERS)或类似技术的使用使得可以产生可与荧光标签媲美的检测灵敏性。在本发明的各种实施方案中，将一个或多个拉曼活性标签部分附着到探针构建物(例如附着到其中的分子主架)，以帮助检测和/或鉴定。使用的拉曼活性标签的非限制性例子包括TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯并-2--1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、TET(6-羧基-2′，4，7，7′-四氯荧光素)、HEX(6-羧基-2′，4，4′，5′，7，7′-六氯荧光素)、Joe(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素)5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、Tamra(四甲基罗丹明)、6-羧基罗丹明、Rox(羧基-X-罗丹明)、R6G(罗丹明6G)、酞菁、偶氮甲碱(azomethine)、花青(例如Cy3、Cy3.5、Cy5)、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、N，N-二乙基-4-(5′-偶氮苯并三唑)-苯基胺以及氨基吖啶。这些和其他拉曼活性标签可以从商业来源获得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。
[000115]一般而言，可以考虑，拉曼活性标签可以包括一个或多个双键，例如碳氮双键。也可以考虑，拉曼活性标签包括环结构，该环结构具有连接到该环结构的侧基，通常环结构诸如多环芳香化合物。增加拉曼强度的具有侧基的化合物包括具有共轭环结构的化合物，诸如嘌呤、吖啶、罗丹明染料和花菁染料。聚合物活性分子拉曼代码的整体极性可以考虑是亲水性的，但是疏水性的侧基可以被包括在其中。可以使用的其他标签包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。
[000116]在某些实施方案中，用于本发明方法和构建物的拉曼活性标签可以独立地选自核酸、核苷酸、核苷酸类似物、碱基类似物、荧光染料、肽、氨基酸、修饰的氨基酸、有机部分、量子点、碳纳米管、富勒烯、金属纳米颗粒、电子致密颗粒和晶体颗粒，或其任何两种或更多种的组合。
[000117]拉曼活性标签可以直接连接到用于制备本发明拉曼活性探针构建物的分子主架或其他有机部分，或可以通过各种连接化合物进行连接。共价连接到拉曼活性标签的核苷酸可以从标准的商业渠道获得(例如Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。含有设计用于与其他分子诸如核苷酸或氨基酸共价反应的活性基团的拉曼活性标签可从商业渠道获得(例如，MolecularProbes，Eugene，OR)。
[000118]在一个方面，本领域技术人员将认识到使用的拉曼活性标签不限于在本文中公开的那些，而是可以包括任何已知的拉曼活性标签，它们附着到主架或探针构建物并被检测。许多这样的拉曼活性标签是本领域已知的。
[000119]产生聚合物拉曼标签的示例性方法涉及将生长着的聚合物拉曼标签锚定在固体支持物上，诸如多孔玻璃珠、塑料(包括但不限于丙烯酸类塑料、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonJ等)、多糖、尼龙、硝化纤维、复合材料、陶瓷、塑料树脂、硅石、基于硅石的材料、硅、改性硅、碳、金属、无机玻璃、光学纤维束或任何其他类型的已知固体支持物。一个或多个连接分子(诸如碳原子链)可以附着到支持物上。连接分子的长度可以变化。例如，连接子的长度可以是2-50个原子。化学合成聚合物的方法是本领域已知的，可以包括例如寡核苷酸的亚磷酰胺合成和/或肽的固相合成。功能基团的保护和去保护方法也是本领域熟知的，如同在寡核苷酸或肽合成技术中的情况。
[000120]附着到单个聚合物主架上的各个拉曼活性标签可以相互不同。可选择地，聚合物拉曼标记可以含有两个或更多个拷贝的同样的拉曼活性标签。为了使可区分的活性分子拉曼代码的数量最大化，可以考虑的是，当多个拉曼活性标签整合在单个聚合物主架中时，它们通常是不同的，或它们位于聚合物主架的不同位置。使用附着到单个聚合物主架上的多个拉曼活性标签，能够产生非常大数量的可区分的活性分子拉曼代码。4-mer拉曼标记的平均分子量大小为约4000道尔顿。因此，聚合物拉曼标记将能产生几乎没有位阻的探针-标记结合。
[000121]聚合物主架可以由有机结构构成，例如由核酸、肽、多糖和/或化学衍生聚合物的任何组合构成。聚合物拉曼标记的主架可以由磷酸二酯键、肽键和/或糖苷键形成。例如，标准亚磷酰胺化学术可以被用于制备包括DNA链的主架。制备磷酸二酯键连接的主架的其他方法是已知的，诸如聚合酶链式反应(PCRTM)扩增。主架的末端可以具有不同的功能基团，例如生物素、氨基基团、醛基团或硫醇基团。这些功能化基团可以被用于将两个或更多个亚聚合物单元连接在一起。一旦聚合物主架被合成至期望的长度，可以将两个或更多个不同的拉曼活性标签顺序地或同时引入，以与包含在修饰的残基中的活性功能基团结合。使用本领域已知的和本文中描述的方法，其他标签，例如荧光标签、纳米颗粒、纳米管、富勒烯或量子点标签可以附着到主架上的一个或多个位置，以进一步使由一组活性分子拉曼代码产生的拉曼信号多样化。
[000122]将分子与纳米颗粒交联的各种方法是本领域已知的，可以使用任何的此类已知方法。例如，在EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)存在下，通过将羧基基团与胺基团交联，可以将一个以上的多核苷酸连接到单个纳米颗粒上。
[000123]待被测序的核酸分子可以用任何标准技术制备。在一个实施方案中，核酸可以是天然存在的DNA或RNA分子。当使用RNA时，将RNA转变为互补的cDNA可能是有利的。事实上，任何天然存在的核酸都可以用本发明的方法制备并测序，包括但是不限于染色体DNA、线粒体DNA或叶绿体DNA或信使RNA、不均一核RNA、核糖体RNA或转运RNA。用于制备和分离各种形式的细胞核酸的方法是已知的。(见，例如， Guide to Molecular Clonine Techniques，eds.Bereer andKimmel，Academic Press，New York，NY，1987； Molecular Clonine：A Laboratory Manual，2nd Ed.，eds.Sambrook，Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)。非天然存在的核酸也可以用公开的方法和组合物测序。例如，用标准扩增技术诸如聚合酶链式反应(PCRTM)扩增制备的核酸可以在本发明范围内测序。核酸扩增的方法是本领域熟知的。
[000124]核酸可以从许多来源分离得到，包括但是不限于病毒、细菌、真核细胞、哺乳动物和人、质粒、M13、λ噬菌体、P1人工染色体(PACs)、细菌人工染色体(BACs)、酵母人工染色体(YACs)和其他克隆载体。
[000125]蛋白质或肽可以用本领域技术人员知道的任何技术制备，包括通过标准的分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源中分离蛋白质或肽，或化学合成蛋白质或肽。对应于各种基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列之前已被公开，并可以在本领域普通技术人员知道的计算机化数据库中找到。一个这样的数据库是美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的Genbank和GenPept数据库，其可以在万维网上获得。已知基因的编码区域可以用本文中公开的技术或本领域技术人员将知道的技术扩增和/或表达。可选择地，蛋白质、多肽和肽的各种商业制备物是本领域技术人员知道的。
[000126]制备本发明的多肽的另一技术是使用肽模拟物，用于产生单克隆抗体。模拟物是模拟蛋白质二级结构的要素的含肽分子。参见例如Johnson等，″PeptideTurn Mimetics″in  Biotechnology And Pharmacy，Pezzuto等，Eds.，Chapman and Hall，New York (1993)。使用肽模拟物的基本原理是，蛋白质的肽主架主要以使得氨基酸侧链的方向有助于诸如抗体和抗原之间的分子相互作用的方式存在。肽模拟物被预期允许类似于天然分子的分子相互作用。这些原理可以被用来工程改造第二代分子，所述分子具有本文中公开的靶向肽的许多天然特性但也具有改变的甚至改进的特征。
[000127]本发明的其他实施方案可以使用融合蛋白。这些分子一般具有靶向肽的所有部分或实质部分，它们的N-或C-末端连接到第二多肽或蛋白质的所有部分或一部分。例如，融合可以使用来自其他种的前导序列，以允许在异源宿主中重组表达蛋白质。另一种有用的融合包括加入免疫学活性结构域，诸如抗体表位，以帮助纯化融合蛋白。在融合连接点处或附近包含切割位点将有助于在纯化之后移除外来多肽。其他有用的融合包括连接功能结构域，诸如酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区域。可以在本发明范围内考虑的是，事实上任何蛋白质或多肽都可以被整合入包括探针肽的融合蛋白。产生融合蛋白的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。这样的蛋白质可以例如通过使用双功能交联试剂进行化学连接来产生，通过完整融合蛋白的从头合成来产生，或者通过将编码靶向肽的DNA序列与编码第二肽或蛋白质的DNA序列连接，再表达整个融合蛋白来产生。
[000128]用于本发明方法和构建物的肽和多核苷酸可以合成产生。各种自动合成仪可以从商业渠道获得并可以根据已知的实验方案使用。参见例如Stewart和Young，(1984)；Tam等(1983)；Merrifield，(1986)；以及Barany和Merrifield(1979)。短肽序列，通常约6直至约35至50个氨基酸，可以容易地用这样的方法合成。可选择地，可以使用重组DNA技术，其中编码本发明肽的核苷酸序列被插入表达载体，转化或转染入合适的宿主细胞，并在适于表达的条件下培养。
[000129]如本文中使用的术语“分析物”包括核酸、蛋白质、肽、脂类、碳水化合物、糖脂、糖蛋白或任何其他潜在的目标，针对该目标可以制备出特异性探针。如上讨论，抗体或适体探针可以被整合入本发明的活性分子拉曼代码，并被用来鉴定任何目标，针对该目标，可以制备出适体或抗体。可以同时分析样品中多个分析物的存在，因为组中的每一成员可以可区分地标记并检测。对分析物的量化可以用光谱分析领域熟知的标准技术进行。例如，可以通过测量产生的信号强度，并与由已知数量的类似的拉曼探针构建物标准品制订的校正曲线比较，来测定结合到本发明拉曼探针构建物上的分析物的数量。这样的量化方法完全在本领域的常规技术范围内。
[000130]“基质”或“固体支持物”指可以被修饰以含有适合于连接或结合分析物的不连续的各个点并适用于至少一种检测方法的任何材料。一般而言，选择基质以允许在基质上进行考虑使用的光学检测方法或增强光学检测方法，且不会明显干扰信号发射。
[000131]如本文中使用的术语“基质”，包括熟知的装置诸如芯片或微量滴定板，它们可以包括有图案的表面，该表面含有可以如本文中描述的那样处理以结合各个分析物或各类分析物的各个不连续位点。可选择地，在探针拉曼构建物被附着到基质上的实施方案中，各个位点在阵列上的位置与位于该特定位点的拉曼代码或探针之间建立起关联。
[000132]阵列组合物可以包括具有许多不连续的基质位点的至少一个表面。阵列的尺寸将取决于阵列的最终用途。可以制备含有约2个至几百万个不同的不连续基质位点的阵列。一般而言，取决于表面的尺寸，阵列将包括2个至多达十亿个或更多这样的位点。因此，可以制备极高密度的、高密度的、中等密度的、低密度的或极低密度的阵列。极高密度的阵列的一些范围为每个阵列约10,000,000至约2,000,000,000个位点。高密度的阵列的范围为约100,000至约10,000,000个位点。中等密度的阵列的范围为约10,000至约50,000个位点。低密度的阵列通常少于10,000个位点。极低密度的阵列少于1,000个位点。
[000133]位点构成图案，即，规则的设计或构造，或可以随机分布。可以使用规则图案的位点，这样，位点可以被定址于X-Y坐标平面上。基质的表面可以进行修饰以允许将分析物附着在各个位点。因此，基质的表面可以进行修饰，以形成不连续的位点。在一个实施方案中，基质的表面可以进行修饰，以含有孔，即，在基质表面上的凹陷。这可以用各种已知的技术来完成，包括但不限于照相平版术、冲压技术、模塑技术和微蚀刻技术。如本领域技术人员将认识到的，使用的技术将取决于基质的组成和形状。可选择地，基质的表面可以进行修饰以含有化学衍生的位点，化学衍生的位点可以被用来将分析物或探针附着到基质上的不连续位置。加入具有一定型式的化学功能基团，诸如氨基基团、羧基基团、氧基团和硫醇基团，可以被用来共价连接含有相应的反应活性功能基团的分子或连接分子。
[000134]生物学“分析物”可以含有天然存在的蛋白质或天然存在的蛋白质的片段。因此，例如，可以使用含有蛋白质的细胞提取物，或蛋白质细胞提取物的随机或定向的消化物。这样，可以建立原核和真核细胞蛋白质的文库，用于筛选本文中描述的系统。例如，可以产生细菌、真菌、病毒和哺乳动物蛋白质的文库用于筛选目的。
[000135]生物学分析物可以是约5至约30个氨基酸或约5至约15个氨基酸的肽。肽可以是天然存在的蛋白质的消化物或随机肽。因为通常随机肽(或随机核酸)是化学合成的，它们可以在任何位置整合任何核苷酸或氨基酸。可以设计合成过程以产生随机的蛋白质或核酸，以允许在该序列的长度范围内形成所有或大部分可能的组合，因此形成随机生物学分析物的文库，用于使用本发明的方法和构建物进行筛选。
[000136]可选择地，生物学分析物可以是核酸。核酸可以单链或双链的，或其混合物。核酸可以是DNA、基因组DNA、cDNA、RNA或杂合物，其中核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，和碱基的任何组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤，和碱基对类似物诸如硝基吡咯和硝基吲哚等。
[000137]寡核苷酸合成的方法是本领域熟知的，并且可以使用任何此类已知的方法。例如，寡核苷酸可以使用商业上可获得的寡核苷酸合成仪(例如AppliedBiosystems，Foster City，CA)合成。连接到各种标签的核苷酸前体可以从商业渠道获得(例如Molecular Probes，Eugene，OR)，并整合入寡核苷酸或多核苷酸中。可选择地，可以购得含有各种反应活性基团诸如生物素、地辛高、巯基、氨基或羧基基团的核苷酸前体。寡核苷酸合成之后，标签可以用标准化学方法连接。具有任何期望序列的寡核苷酸——其具有或没有用于连接标签的活性基团——也可以从各种来源购得(例如Midland Certified Reagents，Midland，TX)。
适体探针
[000138]“适体”是通过称为SELEX的体外进化方法衍生而得的寡核苷酸(例如Brody和Gold，Molecular Biotechnology 74：5-13，2000)。SELEX方法涉及：反复将潜在的适体(核酸配体)暴露于目标，使得能够发生结合，将结合的核酸配体与自由的核酸配体分离，扩增结合的配体并重复结合过程。一定数量的循环之后，可以事实上针对任何类型的生物学目标制备显示出高亲和力和特异性的适体。因为它们小的尺寸、相对的稳定性以及制备的容易性，适体能够特别适合于用作探针。因为适体由寡核苷酸组成，它们能容易地被整合入核酸类型的主架。产生适体的方法是熟知的(例如美国专利5,270,163；5,567,588；5,670,637；5,696,249；5,843,653)。可选择地，针对特异性目标的各种适体可以从商业来源获得(例如Somalogic，Boulder，CO)。适体是相对小的分子，在7至50kDa的级别。
[000139]如本文中使用的术语“COIN”指SERS活性纳米颗粒，其被掺入本发明凝胶基质中，并被用于本文中描述的某些其他分析物分离技术。COIN是复合有机-无机纳米颗粒。这些SERS活性探针构建物包括核心和表面，其中所述核心包括金属胶体，所述金属胶体包括第一金属和拉曼活性有机化合物。COIN还可以包括不同于第一金属的第二金属，其中所述第二金属形成覆盖纳米颗粒的表面的层。COIN还可以包括覆盖金属层的有机层，该有机层包括探针。用于附着到SERS活性纳米颗粒的表面的合适探针包括但是不限于抗体、抗原、多核苷酸、寡核苷酸、受体、配体和类似物。
[000140]获得合适的SERS信号所需要的金属是COIN所固有的，并且各种拉曼活性有机化合物可以被掺入颗粒中。事实上，通过利用含有不同结构、混合物和比率的拉曼活性有机化合物的纳米颗粒，可以产生大量独特的拉曼特征。因此，描述在本文中的利用COIN的方法可用于同时检测样品中的许多分析物，从而快速地定性分析体液的“谱型”内容。此外，因为许多COIN可以被整合入单个纳米颗粒中，来自单个COIN颗粒的SERS信号相对强于由不含有在本文中描述为COIN的纳米颗粒的拉曼活性材料获得的SERS信号。该情形导致，相比不利用COIN的拉曼技术，灵敏性增加。
[000141]使用标准的金属胶体化学术，可以容易地制备COIN以用于本发明方法。COIN的制备也利用金属吸附有机化合物的能力。事实上，因为在金属胶体形成期间，拉曼活性有机化合物被吸附在金属上，所以无需特别的连接化学方法，许多拉曼活性有机化合物就可以被整合入COIN中。
[000142]大体上，用于本发明方法的COIN如下地制备。制备含有合适的金属阳离子、还原剂和至少一种合适的拉曼活性有机化合物的含水溶液。然后使溶液的组分经受将金属阳离子还原形成中性的胶体金属颗粒的条件。因为金属胶体在合适的拉曼活性有机化合物存在下形成，在胶体形成期间，拉曼活性有机化合物容易被吸附到金属上。该简单类型的COIN被称为I类COIN。典型地，I类COIN可以通过膜过滤分离。此外，不同尺寸的COIN可以通过离心富集。
[000143]在可选择的实施方案中，COIN可以包括不同于第一金属的第二金属，其中第二金属形成覆盖纳米颗粒表面的层。为了制备这类SERS活性纳米颗粒，将I类COIN置于含有合适的第二金属阳离子和还原剂的含水溶液中。然后使溶液的组分经受将第二金属阳离子还原以便形成覆盖纳米颗粒表面的金属层的条件。在某些实施方案中，第二金属层包括金属诸如银、金、铂、铝和类似物。该类型的COIN被称为II类COIN。II类COIN可以用与I类COIN同样的方式分离或富集。典型地，I类和II类COIN基本上是球形的，尺寸范围在约20nm至60nm。选择纳米颗粒的尺寸约为在检测期间用来照射COIN的光波长的一半。
[000144]典型地，通过将有机化合物共价连接于金属层的表面，有机化合物被附着到II类COIN中的第二金属层。用本领域技术人员熟知的各种方法，诸如通过硫醇-金属键，可将有机层共价连接到金属层。在可选择的实施方案中，附着到金属层上的有机分子可以进行交联以形成分子网络。
[000145]用于本发明方法的COIN可以包括核心，该核心含有磁性物质诸如铁氧化物和类似物。无需离心，使用常见的可利用的磁性颗粒处理系统便可以处理磁性COIN。事实上，磁性可以被用作分离生物目标的机制，所述生物目标被附着到用特定生物学探针标记的磁性COIN颗粒上。
[000146]如本文中所使用地，“拉曼活性有机化合物”指响应于激光的激发，产生独特的SERS信号特征的有机分子。各种拉曼活性有机化合物被考虑用作COIN中的组分。在某些实施方案中，拉曼活性有机化合物是多环芳香化合物或多环杂芳化合物。典型地，拉曼活性有机化合物具有少于约300道尔顿的分子量。
[000147]此外，用于COIN中的拉曼活性有机化合物的非限制性例子包括TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯并-2--1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱、菁、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶和类似物。这些和其他的拉曼活性有机化合物可以从商业来源获得(如Molecular Probes，Eugene，OR)。
[000148]在某些实施方案中，拉曼活性化合物是腺嘌呤、腺嘌呤、4-氨基-吡唑并(3，4-d)嘧啶、2-氟腺嘌呤、N6-苯甲酰嘌呤(benzolyadenine)、激动素、二甲基-烯丙基-氨基-腺嘌呤、玉米素、溴-腺嘌呤、8-氮杂-腺嘌呤、8-氮杂-鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、4-氨基-6-巯基吡唑并(3，4-d)嘧啶、8-巯基腺嘌呤或9-氨基-吖啶4-氨基-吡唑并(3，4-d)嘧啶或2-氟腺嘌呤。在一种实施方案中，拉曼活性化合物是腺嘌呤。
[000149]当“荧光化合物”被整合入COIN时，荧光化合物包括但是不限于染料、固有荧光蛋白质、镧系元素、磷和类似物。可用于整合入COIN的染料包括例如罗丹明和衍生物，诸如德克萨斯红染料、ROX(6-羧基-X-罗丹明)、罗丹明-NHS和TAMRA(5/6-羧基四甲基罗丹明NHS)；荧光素和衍生物，诸如5-溴甲基荧光素和FAM(5′-羧基荧光素NHS)、荧光黄、IAEDANS、7-Me2、N-香豆素-4-醋酸盐、7-OH-4-CH3-香豆素-3-醋酸盐、7-NH2-4CH3-香豆素-3-醋酸盐(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘，诸如Cascade Blue和monobromotrimethyl-ammoniobimane。
[000150]下面的段落包括关于含拉曼活性探针的构建物(例如拉曼条码、活性分子拉曼代码和复合有机-无机纳米颗粒(COIN))的示例性应用的进一步详细细节。将被理解的是，大量其他的利用此类拉曼活性探针构建物的具体应用例子可以用本说明书的教导来鉴定。本领域技术人员将认识到，多肽和它们的目标分子之间的许多相互作用可以使用具有作为探针的多肽的某些公开的拉曼活性探针构建物来检测。在一组示例性应用中，具有作为探针部分的抗体的这样的拉曼活性构建物被用来检测拉曼活性抗体标记的构建物与抗原在溶液中或者固体支持物上的相互作用。将被理解的是，利用拉曼活性探针构建物，这样的免疫测定分析可以使用已知的方法，诸如用于例如ELISA分析、Western印迹或蛋白质阵列的方法进行，所述拉曼活性探针构建物具有作为探针的抗体，并充当一抗或二抗，代替用酶或放射性化合物标记的一抗或二抗。在另一例子中，拉曼活性探针构建物被连接到酶探针，用于检测酶与底物的相互作用。
[000151]另一组示例性方法使用本文中描述的拉曼活性构建物来检测目标核酸。此方法可用于例如检测临床样品中的传染性介质、检测由基因组DNA或RNA或信息RNA产生的扩增产物，或检测克隆中的基因(cDNA)插入子。对于旨在检测目标多核苷酸的某些方法，使用本领域已知的方法合成寡核苷酸探针。寡核苷酸然后被用来对拉曼活性构建物进行功能化作用。对拉曼活性探针构建物中的特定拉曼标记的检测，鉴定出寡核苷酸探针的核苷酸序列，其进而提供了有关目标多核苷酸的核苷酸序列的信息。
[000152]在本发明的实践中，拉曼分光计可以是设计用来检测和量化由拉曼光谱术产生的本发明拉曼信号的检测装置的一部分。用拉曼光谱术检测拉曼标记的分析物例如核苷酸的方法是本领域已知的。(参见，例如美国专利5,306,403；6,002,471；6,174,677)。关于表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)和相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)的变化形式已经被公开。
[000153]拉曼检测单元的一个非限制性例子公开在美国专利6,002,471。激发光束由倍频钕：钇铝石榴石(Nd：YAG)激光器产生，波长为532nm；或者由倍频钛：蓝宝石(Ti：sapphire)激光器产生，波长为365nm。可以使用脉冲激光束或连续激光束。激发光束经过共聚焦光学元件和显微物镜，聚焦在流动通路和/或流通池上。来自拉曼标记的构建物的拉曼发射光由显微物镜和共聚焦光学元件收集，然后耦合到单色仪上进行光谱分离。共聚焦光学元件用于降低背景信号，包括双色滤片、阻挡滤光片、共聚焦孔、透镜和平面镜的组合。标准的全视场光学元件可以同共聚焦光学元件一起使用。拉曼发射信号由拉曼检测器检测，该检测器包括与用于信号计数和数字化的计算机相连接的雪崩光电二极管。
[000154]拉曼检测单元的另一个例子公开在美国专利5,306,403，其包括SpexModel 1403双栅分光光度计，并配有砷化镓光电倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries Model C3103402)，它以单光子计数模式运作。激发源包括来自SpectraPhysics的514.5nm线氩离子激光器，Model 166和氪离子激光器(Innova 70，Coherent)的647.1nm线。
[000155]可选择的激发源包括337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm的氦-镉激光器(Liconox)(美国专利6,174,677)、发光二极管、Nd：YLF激光器和/或各种离子激光器和/或染料激光器。激发光束可以用带通滤波器(Corion)进行光谱纯化，并可以用6×物镜(Newport，Model L6X)聚焦到流动通路和/或流通池上。可以用物镜来激发拉曼活性探针构建物和收集拉曼信号，其中使用全息光束分离器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，以产生激发光束和发射的拉曼信号的直角几何关系。可以使用全息陷波滤波器(Kaiser OpticalSystems，Inc.)来减少瑞利散射辐射。可选择的拉曼检测器包括ISA HR-320摄谱仪，其配有红增强放大电荷耦合器件(RE-ICCD)检测系统(Princeton Instruments)。可以使用其他类型的检测器，如傅立叶变换摄谱仪(基于Michaelson干涉仪)、电荷注入仪、光电二极管阵列、InGaAs检测器、电子倍增CCD、增强CCD和/或光电晶体管阵列。
[000156]本领域已知的任何适当形式或构型的拉曼光谱术或相关技术都可以用来检测本发明的拉曼活性探针构建物，包括但不限于常规拉曼散射、共振拉曼散射、表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)、受激拉曼散射、反拉曼光谱术、受激增益拉曼光谱术、超拉曼散射、分子光学激光检测器(MOLE)或拉曼显微探针或拉曼显微镜或共聚焦拉曼微光谱测定法、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱术、时间分辨共振拉曼、拉曼退耦光谱术或紫外-拉曼显微术。
[000157]在本发明的某些方面，检测本发明的拉曼活性探针构建物的系统可以包含信息处理系统。一个示例性的信息处理系统可以整合有计算机，其包括用于信息交流的总线和用于信息处理的处理器。在本发明的一个实施方案中，处理器选自Pentium系列处理器，包括但不限于Pentium II系列、Pentium III系列和Pentium 4系列处理器，它们可以从Intel Corp.(Santa Clara，Calif.)获得。在本发明的可选实施方案中，处理器可以是Celeron、Itanium或Pentium Xeon处理器(Intel Corp.，Santa Clara，Calif.)。在本发明的各种其他实施方式中，处理器可以基于Intel结构，如Intel IA-32或Intel IA-64结构。作为选择，可以使用其他处理器。信息处理和控制系统可以进一步包括本领域已知的任何外围设备，例如存储器、显示器、键盘和/或其它设备。
[000158]在本发明的特定例子中，检测单元可以在操作上连接到信息处理系统。来自检测单元的数据可由处理器处理，然后数据储存在存储器中。关于各种拉曼标记或代码的发射谱图的数据也可储存在存储器中。处理器可以比较流动通路和/或流通池中拉曼活性探针构建物的发射光谱，以鉴定探针构建物中的拉曼活性部分。处理器可以分析来自检测单元的数据，以确定例如本发明的拉曼活性探针构建物的探针结合的多肽的序列。信息处理系统也可以实施标准程序，诸如减去背景信号或比较由不同的样品产生的信号。
[000159]虽然本发明的某些方法可在程控处理器的控制下进行，但在本发明的可选实施方式中，这些方法可以完全或部分地由任何可编程的或硬编码的逻辑来实施，例如现场可编程门阵列(FPGAs)、TTL逻辑或专用集成电路(ASICs)。另外，可以通过程序控制的通用目的计算机组件和/或客户硬件组件的任意组合来实施所公开的方法。
[000160]在数据采集操作之后，数据通常会被报告给数据分析操作。为了方便分析操作，由检测单元获得的数据通常是使用数字计算机来分析，如上所述的计算机。典型地，计算机被恰当地编程以接受和存储由检测单元获得的数据，以及分析和报告收集到的数据。
[000161]在本发明的某些实施方式中，可以使用客户定制软件包来分析由检测单元获得的数据。在本发明的可选实施方式中，可以使用信息处理系统及公开可利用的软件包，进行数据分析。
下面的实施例旨在举例说明本发明而不是限制本发明。
实施例1
[000162]为了鉴定癌症相关的生物标志物，收集患者样品和对照样品。为了增加筛选效率，将多个患者样品汇集起来，使差异归一化。将类似的程序应用于对照样品。1000个单克隆抗体的库(pool)被获得，并被分为共200群的第一组(每一群具有5个成员)。5个抗体阵列被制备，每一阵列具有200个不连续的位置，这些位置被处理以固定抗体。然后同样的1000个抗体以随机的次序进行分群，以形成共40个亚组的第二组(每一亚组25个成员)，用于活性分子拉曼代码的合成。使用总共40种拉曼代码，将这40个亚组中的每一亚组的所有25个成员连接到相同的分子拉曼代码，以完成活性分子拉曼代码的合成。之后，基于抗体，25群40个成员为一群的活性分子拉曼代码被形成，40个成员中的每一个具有不同拉曼代码。
[000163]然后这25群活性分子拉曼代码被用于检测分析物，所述分析物已被捕获并固定在第一结合中的不连续位置。在移除自由的拉曼代码之后，被结合在阵列上的拉曼代码被扩增，SERS扫描被用于收集抗体阵列的每一不连续位置(位点)内的所有信号点的拉曼特征。测定具有相同特征的信号点的数量。重复相同的程序，直到所有25个拉曼代码群都被测试。最后，分析患者样品和对照样品之间的差异，以检测患者样品中的差异。这样的检测产生了癌症标志物的初步候选者。
[000164]尽管本发明已经参考上述实施例而被描述，将被理解的是，对其所作的修饰和变化包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明仅仅由权利要求书限定。

Claims (93)

1.固体凝胶基质，其包括固体凝胶和一个或多个SERS增强性纳米颗粒，所述纳米颗粒携带有连接着的探针，所述探针特异性地与分析物结合。
2.权利要求1的凝胶基质，其包括许多纳米颗粒以提供许多独特的光学特征。
3.权利要求2的凝胶基质，其中所述SERS增强性纳米颗粒包括一个或多个拉曼活性标签，所述标签独立地选自核酸、核苷酸、核苷酸类似物、碱基类似物、荧光染料、肽、氨基酸、修饰的氨基酸、有机部分、量子点、碳纳米管、富勒烯、金属纳米颗粒、电子致密颗粒和晶体颗粒。
4.权利要求1的凝胶基质，其中至少一个纳米颗粒具有净电荷。
5.权利要求1的凝胶基质，其中所述纳米颗粒每一个提供独特的SERS信号，所述信号与所述纳米颗粒的探针的结合特异性关联。
6.权利要求1的凝胶基质，其中所述拉曼活性标签包括腺嘌呤或其类似物。
7.权利要求1的凝胶基质，其中所述纳米颗粒是复合有机-无机纳米颗粒(COIN)，其包括核心和表面，其中所述核心包括金属胶体，所述金属胶体包括第一金属和拉曼活性有机化合物。
8.权利要求7的凝胶基质，其中所述COIN还包括不同于所述第一金属的第二金属，其形成覆盖于所述纳米颗粒的表面的层。
9.权利要求8的凝胶基质，其中所述COIN还包括覆盖金属层的有机层，该有机层包括探针。
10.权利要求1的凝胶基质，其中所述探针选自抗体、抗原、多核苷酸、寡核苷酸、受体和配体。
11.权利要求10的凝胶基质，其中所述探针包括多核苷酸。
12.权利要求1的凝胶基质，其中至少一些纳米颗粒还包括产生光学特征的荧光标记。
13.产生凝胶基质的方法，该方法包括：
a)通过将下列物质混合在一起形成液体组合物：
形成凝胶的液体，其包括处于合适的液体中的形成凝胶的颗粒；和
许多拉曼增强纳米颗粒，其具有许多独特的光学特征，和连接的用于结合分析物的探针；和
b)由所述液体组合物获得固体凝胶基质。
14.权利要求13的方法，其中所述凝胶基质包括许多SERS增强纳米颗粒，每一颗粒具有连接的探针，所述探针与已知的分析物特异性结合，以形成复合体。
15.权利要求14的方法，其中所述SERS增强纳米颗粒是COIN。
16.检测样品中的分析物的方法，包括：
将含有分析物的样品与权利要求1的凝胶基质在允许所述探针与所述分析物结合以形成复合体的条件下接触；
通过电泳或磁泳将所述复合体与其他的样品内含物分离开；和
检测由在凝胶内的不同位置处分离的复合体发出的SERS信号，其中由特定复合体发出的SERS信号与特定分析物的存在建立关联。
17.权利要求16的方法，其中所述凝胶基质包括两个或更多个所述复合体，由所述两个或更多个复合体产生的信号表明存在两个或更多个不同的分析物。
18.权利要求16的方法，其中来自特定复合体的SERS信号提供了关于分析物的化学结构的信息。
19.权利要求18的方法，其中所述凝胶基质是聚丙烯酰胺凝胶，所述分析物选自抗原、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白和它们的组合。
20.权利要求16的方法，其中至少两个所述纳米颗粒是含有金属的SERS增强纳米颗粒，其具有不同的净电荷。
21.权利要求20的方法，其中所述SERS增强纳米颗粒是COIN。
22.权利要求16的方法，其中所述分析物被包含在生物学样品中。
23.权利要求16的方法，其中所述建立关联包括测定由探针结合分析物而引起的迁移率变化。
24.权利要求16的方法，其中所述分离包括电泳。
25.权利要求16的方法，其中所述方法还包括在检测之前或之后，对所述分析物进行层析或等电聚焦。
26.权利要求24的方法，其中所述电泳是在非变性条件下进行的一维或二维电泳。
27.权利要求16的方法，其中所述方法还包括在检测之前将所述凝胶浸在化学增强物溶液中，并将所述凝胶干燥以浓缩所述样品。
28.权利要求16的方法，其中所述样品包括一种或多种具有基本上相同尺寸和/或相同电荷密度的额外的分析物，并且所述方法包括：基于复合体在凝胶中改变的迁移率，将光学信号与所述至少一种分析物的身份关联起来，所述改变的迁移率是与所述样品中具有基本上相同尺寸和/或相同电荷密度的额外的分析物的迁移率相比较而言的。
29.权利要求28的方法，其中所述信号是SERS光谱，并将所述光谱与含有许多分析物的SERS光谱的SERS数据库比较，以鉴定结合的分析物。
30.权利要求29的方法，其中将样品中的一种或多种分析物的SERS光谱与SERS光谱的集合进行比较，以测定差异，其中所述差异与已知的生物学表型或疾病相关。
31.权利要求16的方法，其中所述样品是体液。
32.权利要求31的方法，其中所述样品是血清。
33.检测样品中分析物的系统，包括：
权利要求1的凝胶基质；
含有至少一种分析物的样品；和
适合于检测来自纳米颗粒的SERS信号的光学检测系统。
34.权利要求33的系统，还包括计算机，该计算机包括用于分析由所述样品获得的SERS信号的算法。
35.对样品中的目标分子进行多重检测的方法，所述方法包括：
将样品中的目标分子在适合于允许样品中的分析物形成复合体的条件下与一组探针构建物接触，每一构建物包括与光学活性核酸条码结合的非核酸探针，所述条码包括至少一个SERS活性核苷酸，并在电泳中具有独特的迁移率和独特的光学特征；
通过电泳分离所述复合体；
用合适的检测装置，以多重的方式检测独特的光学特征；和
将来自所述构建物的各光学特征与样品中相应的分析物的身份关联起来。
36.权利要求35的方法，其中所述独特的迁移率是因所述组中的构建物在所述条码中具有变化数量的核苷酸而产生。
37.权利要求35的方法，其中至少一些构建物具有净电荷。
38.权利要求35的方法，还包括通过电泳将自由的目标和/或自由的未结合的探针构建物与所述复合体分离开。
39.权利要求35的方法，其中所述非核酸探针是抗体，其特异性地与含有已知蛋白质的目标结合。
40.权利要求35的方法，其中所述分离的复合体通过光学技术检测，所述光学技术选自吸收、反射、偏振、折射、荧光、拉曼光谱、SERS、共振光散射、光栅耦合表面等离子体共振和它们的组合。
41.制备一组用于检测非拉曼活性分析物的活性拉曼分子代码的方法，所述方法包括：
获得一组分子主架，每一分子主架包括有机聚合物，所述有机聚合物沿该主架含有两个或更多个化学反应活性位置；
在所述化学反应活性位置，将至少一个小分子拉曼活性标签连接到所述组中的每一主架，其中，将在所述组的成员的主架上的拉曼活性标签的类型、数量和相对位置进行不同的组合，从而使所述组的每一成员产生独特的拉曼信号；和
将活性基团与所述组中的所述主架连接，其中每一活性基团与已知的分析物特异性结合。
42.权利要求41的方法，其中所述分子主架包括天然存在的或合成的多糖、蛋白质、氨基酸或它们的组合。
43.权利要求42的方法，其中所述主架是单链或双链多核苷酸片段，其包括至少一个已被修饰以用于化学连接拉曼活性标签的残基。
44.权利要求43的方法，其中所述修饰的残基是2-氨基嘌呤。
45.权利要求43的方法，其中所述主架通过标准亚磷酰胺化学术合成。
46.权利要求41的方法，其中所述拉曼活性标签选自染料或天然存在的拉曼活性氨基酸或核酸。
47.权利要求的41方法，其中所述拉曼活性标签是一系列连续的核酸，并且通过标准亚磷酰胺化学术将标签合成在主架上，所述标签被线性地连接到聚合物主架上。
48.权利要求45的方法，其中所述主架包括2至1000个核苷酸。
49.权利要求41的方法，其中所述组中的成员具有共同的主架。
50.权利要求49的方法，其中所述拉曼活性标签选自拉曼活性染料、氨基酸、核苷酸或它们的组合。
51.权利要求50的方法，其中所述拉曼活性氨基酸选自精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和它们的组合。
52.权利要求50的方法，其中所述拉曼活性核苷酸选自腺嘌呤、鸟嘌呤和它们的衍生物。
53.权利要求41的方法，其中所述组的至少一个成员还包括结合到拉曼活性标签或拉曼活性主架上的增强物部分，以增加所述独特的拉曼信号的强度。
54.权利要求41的方法，其中所述拉曼活性标签是多聚G，所述增强物是胺基团或AmC6。
55.权利要求41的方法，其中所述活性基团是反应活性功能基团，选自acryditeTM、胺和硫醇基团。
56.权利要求41的方法，其中所述活性基团与已知的目标特异性结合，且选自抗体、受体、凝集素或噬菌体展示肽。
57.权利要求41的方法，其中所述生物学分析物是含蛋白质的分析物。
58.权利要求57的方法，其中所述含蛋白质的分析物选自抗原、肽、多肽、蛋白质和含有含蛋白质分析物的复合物。
59.权利要求41的方法，其中所述主架是多核苷酸，所述标签是拉曼活性核苷酸，并且所述方法还包括通过标准亚磷酰胺化学术，将所述标签线性地连接到主架上。
60.区分样品中的生物学分析物的方法，所述方法包括：
将包含许多生物学分析物的样品与一组活性拉曼分子代码接触，所述接触在适合于允许其中的探针与所述样品中存在的分析物特异性结合以形成复合体的条件下进行；
分离结合的复合体；
检测所述结合的复合体中的所述活性拉曼分子代码发出的拉曼信号，其中所述拉曼信号表示所述样品中存在已知的生物学分析物。
61.权利要求60的方法，其中期望的生物学分析物是许多不同的含蛋白质的分析物，所述组中的探针是抗体，其中每一抗体与不同的已知生物学分析物特异性结合。
62.权利要求60的方法，其中，收集所述拉曼信号以提供样品的蛋白质谱型。
63.分析生物学样品的方法，包括
在固体支持物上分离样品中的分析物；
将分离的分析物与权利要求41的初级组的活性拉曼分子代码接触，以便允许活性拉曼分子代码与样品中的一个或多个含蛋白质的分析物特异性结合以形成复合体；
将所述复合体与次级拉曼代码复合体接触，以便扩增由所述复合体中的所述活性拉曼分子代码产生的拉曼信号；
检测由所述次级拉曼代码产生的放大的拉曼信号；和
将检测到的放大的拉曼信号与分析物在所述样品的存在关联起来，所述活性拉曼分子代码中的活性试剂与所述分析物特异性结合。
64.权利要求63的方法，还包括收集来自分离的复合体的放大的拉曼光谱，以构成所述样品的蛋白质谱型。
65.权利要求63的方法，其中所述与次级拉曼复合体的接触，涉及所述组的活性拉曼分子代码中的结合的成员与次级拉曼代码中的多核苷酸或寡核苷酸之间的化学结合，以放大所述拉曼信号。
66.权利要求65的方法，其中所述组的活性拉曼分子代码中的成员包括拉曼活性寡核苷酸主架，所述次级拉曼复合体包括与所述主架杂交的互补寡核苷酸，其中所述方法还包括扩增所述拉曼活性寡核苷酸主架。
67.权利要求66的方法，其中所述杂交伴随以所述杂交的互补寡核苷酸的连接，从而形成放大所述拉曼信号的线性或分支的拉曼活性复合体。
68.权利要求65的方法，其中所述组的活性拉曼分子代码中的结合的成员包括在其3′端具有自由羟基的拉曼活性多核苷酸主架，并且所述方法还包括将结合的复合体在末端转移酶存在下暴露于dNTP，以形成长度为上百个核苷酸的单链拉曼活性分子，其放大所述主架的拉曼信号。
69.权利要求65的方法，其中所述组的活性拉曼分子代码中的结合的成员包括带有线性拉曼活性核酸标签以及在其3′端具有自由羟基的多核苷酸主架，并且所述方法还包括将结合的复合体在末端转移酶存在下暴露于dNTP，以形成长度为上百个核苷酸的单链拉曼活性分子，其放大所述主架的拉曼信号。
70.权利要求68的方法，其中所述方法包括改变用于扩增各种结合的复合体的单链拉曼活性分子的dNTP，以进一步改变放大的拉曼信号。
71.权利要求69或70的方法，其中所述扩增技术是滚环扩增。
72.权利要求65的方法，其中所述次级拉曼复合体包括连接到金属纳米颗粒的互补多核苷酸，所述互补多核苷酸与所述多核苷酸杂交，其中所述放大的拉曼信号是SERS信号。
73.权利要求72的方法，其中所述金属纳米颗粒选自银、金、铜和铝。
74.权利要求65的方法，其中所述次级拉曼复合体包括具有连接的拉曼活性标签的互补多核苷酸，并且所述方法还包括由所述次级拉曼复合体产生树枝状大分子，以及将所述树枝状大分子与所述多核苷酸主架杂交，以放大拉曼信号。
75.权利要求63的方法，其中所述生物学样品包括体液。
76.权利要求75的方法，还包括收集来自放大的拉曼信号的放大的拉曼光谱，以获得所述生物学样品的蛋白质谱型。
77.测定分析物库中的分析物的存在的方法，该方法包括：
a)将分析物库与附着到固体支持物上的不连续位点的第一组探针接触，以在所述不连续位点形成探针/分析物复合体；
b)将所述探针/分析物复合体与多个另外组活性拉曼分子代码接触，其中所述另外组中的每一组利用所述第一组的探针的亚组作为活性试剂，以形成含拉曼代码的复合体；
c)将结合的含拉曼代码的复合体在原位与金属离子接触，以用金属薄层覆盖所述含拉曼代码的复合体；
d)检测SERS信号，所述SERS信号通过用光源同时照射在所述固体支持物的不连续位点的结合的含拉曼代码的复合体而产生，和
e)将一个或多个SERS光谱与所述样品中特定分析物的存在关联起来。
78.权利要求77的方法，其中所述金属层通过使金属阳离子的胶体溶液经受还原条件以在原位形成含有结合的复合体的金属纳米颗粒而形成。
79.权利要求77的方法，还包括在c)之前，扩增在所述固体支持物上的结合的含拉曼代码的复合体中的多核苷酸主架。
80.权利要求78的方法，其中所述扩增是PCR3或滚环扩增。
81.权利要求77的方法，其中所述关联包括对所述不连续位点中的每一信号点产生的SERS信号计数，以测定具有同样的特征的信号点的数量。
82.权利要求81的方法，其中所述关联还包括进行多重分析，以根据拉曼代码设计对SERS光谱分类。
83.权利要求77的方法，其中结合物选自抗体、噬菌体展示肽、受体、核酸、配体、凝集素和其组合。
84.权利要求77的方法，其中所述分析物选自蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸、病毒颗粒、多糖、类固醇和其组合。
85.权利要求77的方法，其中所述分析物库包括已知或怀疑患有疾病的患者的体液的样品。
86.权利要求85的方法，其中，所述方法被重复进行，例外的是，分析物库包括正常的对照患者的相应样品，并且该方法还包括将获自患者分析物的SERS光谱与获自正常对照患者分析物的SERS光谱进行比较，以鉴定差异，其中所述差异表明在已知或怀疑患有所述疾病的患者的样品中疾病标志物的存在。
87.权利要求77的方法，其中所述第一组的探针被随机分开，以获得所述多个另外组中的活性试剂，其中在单个另外组中的每一拉曼代码对于该单个另外组的成员是独特的，且所述另外组的每一组含有相同组的拉曼代码。
88.分析生物学样品中的蛋白质内含物的方法，所述方法包括：
a)获得一组活性分子拉曼代码，其含有作为活性试剂的功能基团；
b)将样品与该组拉曼活性分子代码接触，以便允许所述组中的成员与样品中含蛋白质的分析物中的蛋白质功能基团化学连接，以形成代码/蛋白质复合体；
c)分离所述代码/蛋白质复合体；
d)检测由分离的代码/蛋白质复合体产生的SERS信号；和
e)将所述SERS信号与所述样品中特定的含蛋白质的分析物关联起来。
89.权利要求88的方法，其中所述组是由三种拉曼活性分子代码组成的组，所述组的每一成员具有选自氨基基团、羧基基团和硫醇基团的三种活性基团中的一种，并且具有提供对于所述组独特的拉曼特征的寡核苷酸主架。
90.权利要求89的方法，其中所述组的每一成员包括选自多聚dA、多聚dG和多聚AG的三种拉曼活性分子代码中的一种。
91.权利要求88的方法，其中所述方法还包括在b)之前将所述样品分为子样品，对每一子样品重复b)、c)和d)，并在e)之前，对所有所述子样品中的每一信号点的拉曼信号进行计数。
92.权利要求88的方法，其中在与活性分子拉曼代码接触之前，将所述样品消化。
93.权利要求92的方法，还包括使用获自拉曼光谱的信息来编辑所述样品的蛋白质谱型。
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