CN109306351A - 一种纳米生物探针及末端转移酶介导的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米生物探针及利用末端转移酶介导、在纳米材料表面接枝DNA的检测方法。通过在纳米材料表面接枝特异性DNA，并以特异性DNA为引物，利用末端转移酶的作用，将脱氧核糖核苷三磷酸转移到引物的3’‑羟基末端，形成长单链DNA。并通过检测长单链DNA的信号，定性或定量检测靶分子或靶序列。本发明的方法无需在纳米材料表面组装多种DNA，方法简单，灵敏度提高，可降低成本。

Description

一种纳米生物探针及末端转移酶介导的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域和纳米材料功能化应用领域，尤其是纳米生物探针及利用末端转移酶介导、在纳米材料表面接枝DNA的检测方法。
背景技术
在生物分子检测领域，DNA的检测对于疾病的诊断、遗传性疾病的治疗以及传染病原体的检测极为重要。目前，对于DNA的一般性传统分析方法，存在操作复杂、检测灵敏度不高等问题。纳米材料是尺寸在1～100nm范围内的材料，因其特殊的如小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应等性质使其在生物学、医学、要学等领域显示出良好的应用前景。功能化纳米材料在生物检测领域的应用成为相关领域的研究热点。纳米材料的功能化一般通过表面组装生物分子如组装引物DNA、蛋白质、抗体等实现的。
通常的检测方法为，将样品固定在芯片表面、纳米材料表面、96孔板表面或者待测样品表面(例如，在固相表面组装能够捕获靶分子DNA的捕获DNA,加入适量样品后靶分子与捕获DNA杂交并被固定)，再加入纳米探针进行检测。探针的纳米粒子表面至少有两种DNA：用来捕获靶分子的特异性DNA(捕获DNA)和带有荧光等标记的标记DNA。特异性DNA与靶分子结合后，标记DNA进行检测信号输出。
因此，现行的方法通常需要在纳米材料表面组装多种DNA:在一核酸目标分子检测系统里，会根据引物的作用而被划分成捕获序列、检测序列、目标序列等，这就导致同一个纳米粒子表面存在多条不同功能的引物。以现有的检测DNA/RNA方法为例，通常需要在纳米材料如纳米金表面组装至少两种DNA:一种是用来捕获靶DNA的特异性分子；另一种是标记荧光DNA，其中含有荧光基团等标记分子。两种DNA需要使用不同的引物，共同组装在纳米材料表面，这导致了实验设计的复杂性和实验成本的提高。
因此，目前使用纳米材料/引物复合生物探针进行相关核酸序列的检测时，仍旧存在诸多问题：1.多种不同功能引物共组装在纳米粒子表面时，不仅降低了每一种引物在纳米材料表面的组装数目，不能功能引物之间的相互干扰影响了生物分子的识别及检测信号的输出效率，导致了检测信号偏低，检测效果不灵敏，从而降低检测系统的效率；2.尽管当前有多种信号放大技术，如纳米PCR(polymerase Chain reaction)，纳米RCA(rollingcircle amplification,滚环扩增技术)等，可以通过纳米材料表面引物的生长、延长、扩增来实现检测的信号放大，从而极大地提高系统的检测效率，但其应用范围仍因面临的高温变性过程、复杂环状模板制备等问题而受到一定限制。
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，简称TdT，中文名称为末端转移酶，1955年，Bollum首次从小牛胸腺中纯化并称为小牛胸腺DNA聚合酶,后来因其催化聚合时不需模板的特点改名为末端转移酶。70年代初,随着基因工程技术的发展,Lobban和kaiser分别用于P22及SV40DNA片段,加接同源序列聚合尾巴,成功地在体外建成了重组子DNA。因此，末端转移酶介导的纳米材料表面引物的DNA接枝方法，为上述问题提供了可能的解决途径。
发明内容
本发明旨在提供一种利用末端转移酶介导的DNA接枝方法的应用。
本发明旨在提供一种利用末端转移酶介导的DNA接枝(扩增)方法的生物纳米探针及其应用。
本发明还提供了利用末端转移酶介导的DNA接枝技术的检测方法。
为了克服现有技术的不足，本发明利用末端转移酶介导的的方法，在纳米材料表面的序列上接枝DNA，可用于固相表面的靶分子或靶序列检测。
先将用于捕获靶分子或靶系列的特异性DNA作为起始引物链组装在纳米材料表面，形成纳米生物探针；当溶液中有末端转移酶时，驱动脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)逐个接枝在起始引物链3’-羟基末端形成一条长的DNA聚合体。所述起始链是一段寡核苷酸、单链或双链DNA，用于捕获靶分子或靶序列。接枝反应产物为一条DNA单链，由同一脱氧核糖核苷三磷酸或不同脱氧核糖核苷三磷酸组成。
末端转移酶是一种不依赖模板的DNA聚合酶，可以不需要模板，将四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)中的一种或多种转移到引物的3’羟基末端，催化脱氧核苷酸首尾相连生成核酸长链。
本发明提供末端转移酶介导的一种在纳米材料表面引物的DNA接枝技术的制备方法。
一种纳米生物探针，包括纳米材料，所述纳米材料表面连接用于的特异性DNA。
所述的特异性DNA为寡核苷酸、单链DNA或双链DNA；长度为3～150个碱基。
所述特异性分子的5’-端连接到纳米材料表面。
所述的特异性DNA用于捕获靶分子的5’-端。
优选的，所述的纳米材料粒径1～300nm，为纳米金、纳米银、磁性纳米粒子、量子点或碳系纳米材料。
上述纳米生物探针，即纳米材料/DNA链复合物，可用于制备生物检测通用探针、SERS纳米探针或构建生物检测信号放大系统，从而应用于疾病诊疗、公共卫生监测、食品安全检测等方面。
使用上述纳米生物探针检测的方法为：将纳米生物探针与待测样品混合，洗脱未结合的纳米生物探针，并加入末端转移酶和dNTP孵育，进行扩增；所述的dNTP为dATP、dTTP、dCTP、dGTP中的一种或者任意混合物，部分或全部用荧光或同位素标记，或者未经荧光或同位素标记；反应结束后测定荧光信号、同位素信号或SERS信号进行定量或定性检测。
优选的，待测样品的靶分子或靶序列固定在固相表面，例如孔板、生物芯片、SERS基底或者其他基底表面。靶序列或靶分子的5’-端含有能与特异性DNA互补的序列。可以将靶分子或靶序列直接组装或包埋在固相表面；或者，将捕获DNA组装或包埋于固相表面，再加入含有靶分子或靶序列的样品，靶分子或靶序列的3’-端与捕获DNA杂交，从而被固定在固相表面。
扩增的条件为：由末端转移酶介导，20～37℃下扩增1～16小时。
优选的，用末端转移酶扩增后，纳米材料表面的特异性DNA链延长50～400个碱基，纳米材料表面的DNA链长度为100～500个碱基。
更优选的，用末端转移酶扩增后，纳米材料表面的特异性DNA链延长50～200个碱基，纳米材料表面的DNA链长度为150～350个碱基。
本发明还将末端转移酶介导的纳米材料表面引物的DNA接枝方法用于生物检测，具体为，检测于检测固相表面靶分子或靶序列：
(A)在纳米材料表面连接用于捕获靶分子的特异性DNA，形成纳米生物探针；优选的，所述的纳米材料粒径为1～300nm，为纳米金、纳米银、磁性纳米粒子、量子点或碳系纳米材料；所述的特异性DNA为寡核苷酸、单链DNA或双链DNA，长度为3～150个碱基；
(B)将待测样品中的靶分子或靶序列固定在固相表面，加入纳米生物探针混合杂交后，洗脱未结合的纳米生物探针；
(C)加入末端转移酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)进行扩增；所述的dNTP为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)中的一种或任意的混合物；其中部分或全部的dNTP用荧光分子或者同位素标记，或者未经荧光或同位素标记；
(D)终止反应后检测荧光信号、同位素信号或SERS信号，进行定性或定量检测。
当待测样品中含有多种靶分子(靶序列)时，可以在固相上(如96孔板的不同孔内)共组装针对这几种待测靶序列的捕获DNA；加入适量样品后，靶序列与相应的捕获DNA杂交从而被固定；再加入对应的纳米生物探针，与被固定捕获DNA固定的靶DNA杂交；洗脱多余的探针后加入不同标记的dNTP进行TDT扩增；最后通过检测标记信号的不同，确认样品中这几种靶DNA的有或无、以及含量的高低，从而实现多种靶DNA共检测的目的。
根据纳米材料的不同，可选用不同的方法将起始链连接到纳米材料表面。例如，当纳米材料为纳米胶体金时，起始链用巯基修饰并连接到纳米材料表面；当纳米材料为磁性粒子时，将磁性纳米粒子表面醛基化，并将氨基修饰的起始链连接到磁性纳米粒子表面；当纳米材料为碳系纳米材料时，用链霉亲和素修饰碳系纳米材料，并将用生物素标记的起始链连接到碳系纳米材料表面；当纳米材料为量子点时，将量子点表面用巯基乙酸修饰，再将巯基修饰的起始引物链连接到量子点表面。
当纳米材料为纳米胶体金、纳米胶体银时，起始链通过以下方法连接到纳米材料上：巯基修饰的起始链与纳米材料溶液混合震荡8～16小时，并加入80～150mmol/L磷酸缓冲液稀释10～100倍；反应8～16小时后加入老化液继续稀释10～100倍。
当纳米材料为碳系纳米材料如碳纳米管时，起始链通过以下方法连接到纳米材料上：EDC和NHS处理碳纳米管，加入链霉亲和素组装8～16小时，洗涤去除未连接的链霉亲和素；加入生物素标记的起始链震荡反应。
本发明提供了一种纳米材料/DNA链复合物，并将其用作纳米生物探针。通过在纳米材料表面接枝特异性DNA，并以特异性DNA为引物，利用末端转移酶的作用，将四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)中的一种或多种转移到纳米材料表面引物序列的3’-羟基末端，形成长单链DNA。通过DNA的标记的荧光或同位素信号，或者通过拉曼小分子的SERS信号，可定性或定量检测样品中的靶分子或靶序列。这种纳米生物探针可用作生物检测通用探针、或构建生物检测信号放大系统、制备SERS纳米探针从而应用于疾病诊疗、公共卫生监测、食品安全检测等。
本发明的有益效果在于：
(1)只需要在纳米材料表面组装一种DNA，即用来捕获靶分子的特异性DNA，不需要在纳米材料表面另行组装用于检测信号输出的标记DNA，使得纳米材料表面组装的DNA条数大大增加，不会因为组装不同DNA导致相互干扰，使得探针的制备方法得到简化，可降低成本。
(2)特异性DNA与靶分子结合后，进行TdT扩增，纳米材料表面每一条DNA链末端都会延伸出一长段DNA，且可以通过荧光修饰或同位素标记的dNTP进行扩增反应，延伸的链中嵌入大量的荧光基团或同位素标记，促使荧光信号或同位素信号大大增强，检测灵敏度大幅度提升，检测的方法更为简便。
(3)当待测样品中含有多种靶分子(靶序列)时，还可以实现多种靶分子(靶序列)的同时检测。
附图说明
图1为实施例1纳米金表面连接起始链前后紫外吸收光谱的变化，吸收在519处为纳米金(AuNPS)，吸收在521.5处为其表面组装了poly A(Au-polyA)。
图2为琼脂糖凝胶电泳成像结果，M代表Marker；泳道1～6分别为实施例1～6纳米材料表面引物接枝DNA后产物。
图3为实施例1纳米金表面引物接枝DNA后产物的原子力显微镜(AFM)成像结果，黑色箭头代表纳米金，白色箭头代表单链DNA。
具体实施方式
实施例1
(1)100μL粒径15nm、浓度10nM胶体金溶液中加入10μL巯基修饰的起始链(SH-polyA10，100μM)，加水稀释至起始链终浓度为5μM。室温震荡过夜后加入100mM的PB buffer(磷酸缓冲液)，至磷酸缓冲液终浓度为10mM；室温过夜后加入老化液(10mM PB，2M NaCl，pH7.4)使得溶液中NaCl的终浓度为0.15M。
(2)混合物溶液室温放置过夜后，4℃、12000rpm离心20min，离心洗涤4次后，沉淀物即纳米金-起始链复合物(即Au-PolyA10，5’-端连接纳米金表面)于200μLPB(10mM，0.15MNaCl，pH7.4)溶液中重悬浮，4℃保存。
如图1所示，纳米金表面接枝起始引物链前后的紫外吸收光谱发生变化，说明形成了纳米金-起始链复合物。
(3)4μL复合物金-起始链中加入1μL末端转移酶(10U/μL)、1μL的dNTP(4种dNTP混合液，总浓度10mM)、2μL Reaction Buffer，补足至总体积为10μL，溶液充分混匀后置于37℃水浴中孵育过夜，使dNTP接枝于起始链的3’端。反应结束后70℃水浴15min，使酶失活。
取4μL上样，进行1％琼脂糖电泳，电压110V，27min。结果如图2泳道1所示，不能显示结果，说明接枝产物为单链DNA。
取4μL接枝反应产物上样，用1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化。分离纯化后产物的AFM(原子力显微镜)表征结果如图3所示，黑色箭头指示处为纳米金(粒径约15nm)，白色箭头指示处为长单链DNA；结果表明，在金纳米颗粒表面形成了长单链DNA，长度约200个碱基。
实施例2
(1)100μL粒径15nm、浓度10nM胶体金溶液中加入10μL巯基修饰的起始链(SH-polyT15，100μM)，加水稀释至起始链终浓度为5μM。室温震荡过夜后加入100mM的PB buffer(磷酸缓冲液)，至磷酸缓冲液终浓度为10mM，室温过夜后加入老化液(10mM PB，2M NaCl，pH7.4)使得溶液中NaCl的终浓度为0.15M。
(2)混合物溶液室温过夜后，4℃、12000rpm离心20min，离心洗涤4次后，沉淀物即纳米金-起始链复合物Au-polyT15(5’-端连接纳米金表面)于200μLPB(10mM，0.15M NaCl，pH7.4)溶液中重悬浮，4℃保存。
(3)4μL复合物金-起始链中加入1μL末端转移酶(10U/μL)、1μL的dNTP(总浓度10mM，部分用荧光标记)、2μL Reaction Buffer，补足体积至10μL，溶液充分混匀后置于室温或37℃水浴中孵育1h。反应结束后70℃水浴15min，使酶失活；取4μL上样，进行1％琼脂糖电泳，电压110V，27min，结果如图2的泳道2，同实施例1，接枝产物为单链DNA。
取4μL接枝反应产物上样，用1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化。分离纯化后产物的AFM(原子力显微镜)表征结果显示，在金纳米颗粒表面形成了长单链DNA，长度约200个碱基。
将poly T15作为捕获DNA固定包被于96孔板内(5’-端游离)，加入不同含量的靶DNApoly A25；杂交后洗涤去除上清液，加入10μL步骤(1)、(2)获得的探针即复合物Au-polyT15孵育杂交，去除上清液，洗涤去除未杂交的探针后加入1μL末端转移酶(10U/μL)、1μL荧光标记的dNTP(10mM)、2μL Reaction Buffer，补足体积至10μL。充分混匀后室温孵育1h；检测荧光信号，结果显示，能够定性或定量检测poly A25。
或者，将不同含量的poly A25固定包被于96孔板内(5’-端游离)，加入10μL步骤(1)、(2)获得的探针，杂交后去除上清液，洗涤去除未杂交的探针后加入1μL末端转移酶(10U/μL)、1μL荧光标记的dNTP(10mM)、2μL Reaction Buffer，补足体积至10μL。充分混匀后室温孵育1h；检测荧光信号，结果显示，能够定性或定量检测poly A25。
根据靶分子序列的不同，本实施例的polyT15可替换为其他不同长度和碱基序列的特异性DNA序列。
实施例3
(1)1mg单壁碳纳米管分散于1mL pH＝7的磷酸缓冲液中，超声10min后加入0.4mLEDC(400mM)和NHS(100mM)溶液，室温振荡15min。上述溶液在4℃，15000rpm/min离心5min，重复两次去除多余的EDC和NHS。然后加入20μL 1mg/mL链霉亲和素(straptavidin)溶液，室温下振荡组装过夜。然后4℃，15000rpm/min离心10min，重复三次去除未连接的链霉亲和素，然后加入20μL生物素标记的起始链polyT15(biotin-iDNA，10μM)；
(2)室温下振荡连接1h后离心(4℃，15000rpm/min，10min)三次。沉淀物于1mL pH＝7.4磷酸缓冲液(10mM，0.15M NaCl)溶液中重悬浮，4℃保存；
(3)4μL复合物碳纳米管-起始链中加入1μL末端转移酶、1μL的dNTP(10mM)、2μLReaction Buffer，补足体积至10μL的溶液充分混匀后置于室温孵育1h。后取4μL上样，进行1％琼脂糖电泳，电压110V，27min。结果如图2的泳道3，同实施例1，接枝产物为单链DNA。
AFM(原子力显微镜)表征结果显示，在碳纳米管表面形成了长单链DNA，长度约200个碱基。
同样，步骤(2)的复合物可以定性或定量检测含有互补序列的靶DNA。根据实际需要，本实施例中的polyT15可以替换为其他不同长度和碱基序列的特异性DNA序列。
实施例4
胶体金的粒径为30nm时，其余操作同实施例1，结果不变。琼脂糖凝胶电泳结果如图2泳道4，显示接枝产物为单链DNA。
复合物检测的效果同实施例2。
实施例5
(1)按实施例2步骤(1)、(2)的方法，在粒径15nm的胶体金表面连接巯基修饰的起始链(SH-polyT15)，获得Au-polyT15复合物。
按照相同体系与方法在纳米金的表面组装上起始链SH-polyT15。
(2)4μL复合物Au-polyA10中加入1μL末端转移酶、1μL荧光标记的dATP(10mM)、2μLReaction Buffer，补足体积至10μL；溶液充分混匀后室温孵育1h。室温孵育过夜。
4μL复合物Au-polyT15中加入1μL末端转移酶、1μL的dTTP(10mM)、2μL ReactionBuffer，补足体积至10μL；溶液充分混匀后置于室温孵育过夜。后各自于70℃水浴15min，使酶失活。
取出后混合两溶液室温冷却并孵育1h杂交。取4μL上样，进行1％琼脂糖电泳，电压110V，27min，结果如图2泳道5。扩增出来的A单链和扩增出来的T单链杂交形成了双链，且分子量很大，因此滞留在进样孔里出不来，形成明亮的条带。AFM表征结果显示，在纳米颗粒表面形成了长单链DNA，长度约200碱基。
实施例6
(1)100μL(10mg)200nm表面醛基化的四氧化三铁磁性纳米粒子溶液中加入10μL氨基修饰的起始链(SH-polyA10，100μM),起始链终浓度为5μM。室温震荡过夜后加入100mM的PBbuffer(磷酸缓冲液)，终浓度为10mM，室温过夜后加入老化液(10mM PB，2M NaCl，pH 7.4)使得溶液中盐的终浓度为0.15M。
(2)混合物溶液室温过夜后，磁分离洗涤4次后，沉淀物于200μL，PB(10mM，0.15MNaCl，pH7.4)溶液中重悬浮，4℃保存。
(3)4μL复合物磁性纳米粒子-起始链中加入1μL末端转移酶、1μL的DNTP(10mM)、2μL Reaction Buffer，补足体积至10μL的溶液充分混匀后置于37℃水浴中孵育1h。
后取4μL上样，进行1％琼脂糖电泳，电压110V，27min，结果如图2的泳道6，接枝产物为单链DNA。。AFM表征结果显示，在磁性纳米粒子表面形成了长单链DNA，长度约200碱基。
将不同含量的polyT20固定包被于96孔板内(5’-端游离)；并加入10μL步骤(1)、(2)获得的复合物磁性纳米粒子-polyA10孵育杂交，去除上清液，洗涤后加入1μL末端转移酶(10U/μL)、1μL荧光标记的dNTP(10mM)、2μL Reaction Buffer，补足体积至10μL。充分混匀后室温孵育1h；检测荧光信号，结果显示，能够定性或定量检测polyT20。
将poly A10作为捕获DNA固定包被于96孔板内(5’-端游离)，加入不同含量的靶DNApoly T20；杂交后洗涤去除上清液，加入10μL步骤(1)、(2)获得的探针即复合物Au-polyT15孵育杂交，去除上清液，洗涤去除未杂交的探针后加入1μL末端转移酶(10U/μL)、1μL荧光标记的dNTP(10mM)、2μL Reaction Buffer，补足体积至10μL。充分混匀后室温孵育1h；检测荧光信号，结果显示，能够定性或定量检测poly T20。
根据靶分子序列的不同，本实施例的polyA10可替换为其他不同长度和碱基序列的特异性DNA序列。
实施例7
检测靶分子或靶DNA的方法如下：
(一)按照实施例1的步骤(1)、(2)进行操作，并将poly A10替换为特定的特异性DNA；得到胶体金-起始链复合物，即纳米生物探针，特异性DNA的5’-端连接到纳米材料表面；
(二)将捕获DNA所对应的靶分子或靶序列固定于96孔板表面(直接固定；或者先将捕获DNA固定在96孔板内，加入含有靶序列或靶分子的样品杂交，使靶分子或靶序列固定)，加入步骤(一)的特异性纳米生物探针100μL孵育杂交，去除上清液，洗涤再加入10μL末端转移酶(浓度10U/μL)、10μL的荧光标记的dATP(浓度10mM)、20μL Reaction Buffer，补足体积至100μL，充分混匀后37℃孵育1小时，70℃水浴15min使酶失活。
特异性DNA与靶序列杂交，纳米生物探针被固定，并检测产物的荧光强度，并根据不同靶分子含量所对应的荧光强度，绘制标准曲线。由此可以对靶分子或靶序列进行定性和定量检测。
步骤(二)中，也可以将靶DNA或靶分子固定于生物芯片上，用同样方法加入特异性纳米生物探针孵育杂交，去除上清液，洗涤后用末端转移酶、不加荧光标记或者用荧光标记的dTTP进行扩增，然后进行SERS检测。
实施例8
当待测样品中含有三种不同的靶DNA时，检测方法如下：
(一)按照实施例1的步骤(1)、(2)进行操作，得到三种连接不同特异性DNA的胶体金-起始链复合物即纳米生物探针；
(二)96孔板的不同孔内共组装针对这三种待测靶DNA的捕获DNA；加入样品后，捕获DNA分别与对应的靶DNA杂交；
将步骤(一)获得的三种纳米生物探针100μL分别加到不同的样品孔内，孵育杂交，去除上清液，洗涤再加入10μL末端转移酶(浓度10U/μL)、10μL的荧光标记的dATP(浓度10mM)、20μL Reaction Buffer，补足体积至100μL，充分混匀后37℃孵育1小时，70℃水浴15min使酶失活。
特异性DNA分别与相应的靶序列杂交，检测样品的荧光强度和荧光信号的不同，可以判断样品中这三种靶序列的有或无以及含量的高低。
根据不同靶分子含量所对应的荧光强度，绘制标准曲线。由此可同时对三种不同的靶分子或靶序列进行定性和定量检测。
或者，步骤(二)的操作中，加入单一种类的dNTP，通过TdT反应在其末端形成拉曼小分子，检测长单链DNA(同种碱基)的拉曼信号。

Claims (10)

1.一种纳米生物探针，其特征在于，包括纳米材料，所述纳米材料表面连接捕获靶分子的特异性DNA，所述的特异性DNA为寡核苷酸、单链DNA或双链DNA。
2.权利要求1所述纳米生物探针，其特征在于，所述的特异性DNA长度为3～150个碱基。
3.权利要求1所述的纳米生物探针，其特征在于，所述的纳米材料为纳米金、纳米银、磁性纳米粒子、量子点或碳系纳米材料。
4.权利要求1所述的纳米生物探针，其特征在于，所述特异性DNA的5’-端连接到纳米材料表面。
5.权利要求1～4任一项所述纳米生物探针在制备生物检测通用探针、SERS纳米探针或构建生物检测信号放大系统方面的应用。
6.权利要求1～4任一项所述纳米生物探针用于固相表面靶分子或靶序列检测。
7.使用权利要求1～4任一项所述纳米生物探针检测的方法，其特征在于，步骤包括：
将纳米生物探针与待测样品混合，洗脱未结合的纳米生物探针，并加入末端转移酶和dNTP进行扩增；所述的dNTP为dATP、dTTP、dCTP、dGTP中的一种或者任意混合物，部分或全部用荧光或同位素标记，或者未经荧光或同位素标记；反应结束后测定荧光信号、同位素信号或SERS信号进行定量或定性检测。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的待测样品中的靶DNA固定在固相表面。
9.末端转移酶介导的检测方法，其特征在于，步骤包括：表面连接特异性DNA的纳米生物探针与固相表面靶分子或靶序列结合，洗脱未杂交的纳米生物探针，加入末端转移酶和dNTP进行DNA扩增反应；
所述的特异性DNA用于捕获靶分子或靶序列；所述的dNTP为dATP、dTTP、dCTP、dGTP中的一种或者任意混合物，部分或全部用荧光或同位素标记，或者未经荧光或同位素标记。
10.末端转移酶介导的纳米材料表面引物的DNA接枝方法在生物检测方面的应用，其特征在于，用于检测固相表面靶分子或靶序列。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110646610A (zh) * 2019-06-28 2020-01-03 上海海洋大学 一种基于TdT信号放大技术的试纸条及其制备方法
CN110646486A (zh) * 2019-10-14 2020-01-03 宁波大学 基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器研究
CN112462046A (zh) * 2020-11-12 2021-03-09 上海海洋大学 一种基于比色适配体传感器快速检测抗生素的方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1475576A (zh) * 2002-08-16 2004-02-18 � 赵 一种单链dna快速制备技术及试剂盒
CN1580281A (zh) * 2003-08-06 2005-02-16 宋克 基因芯片酶法微球放大标记
CN1607258A (zh) * 2003-10-15 2005-04-20 宋克 间接法基因芯片线性放大标记技术
US7169556B2 (en) * 1996-07-29 2007-01-30 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
CN1938430A (zh) * 2003-12-30 2007-03-28 英特尔公司 使用拉曼活性探针构建物来分析生物学样品的方法和装置
CN104597240A (zh) * 2015-02-02 2015-05-06 广西医科大学 石墨烯/类过氧化物酶双信号放大检测白血病的生物传感方法
CN105842453A (zh) * 2015-01-12 2016-08-10 南京理工大学 一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测dna的方法
CN106119344A (zh) * 2016-06-20 2016-11-16 清华大学 一种结合荧光强度和荧光偏振检测dna的纳米探针
CN106282323A (zh) * 2015-05-29 2017-01-04 南京理工大学 基于聚胸腺嘧啶为模板生成铜纳米粒子的高灵敏度dna荧光分析方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7169556B2 (en) * 1996-07-29 2007-01-30 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
CN1475576A (zh) * 2002-08-16 2004-02-18 � 赵 一种单链dna快速制备技术及试剂盒
CN1580281A (zh) * 2003-08-06 2005-02-16 宋克 基因芯片酶法微球放大标记
CN1607258A (zh) * 2003-10-15 2005-04-20 宋克 间接法基因芯片线性放大标记技术
CN1938430A (zh) * 2003-12-30 2007-03-28 英特尔公司 使用拉曼活性探针构建物来分析生物学样品的方法和装置
CN105842453A (zh) * 2015-01-12 2016-08-10 南京理工大学 一种基于末端延伸、金纳米粒子和酶三级放大电化学传感器检测dna的方法
CN104597240A (zh) * 2015-02-02 2015-05-06 广西医科大学 石墨烯/类过氧化物酶双信号放大检测白血病的生物传感方法
CN106282323A (zh) * 2015-05-29 2017-01-04 南京理工大学 基于聚胸腺嘧啶为模板生成铜纳米粒子的高灵敏度dna荧光分析方法
CN106119344A (zh) * 2016-06-20 2016-11-16 清华大学 一种结合荧光强度和荧光偏振检测dna的纳米探针

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINYUAN CHEN 等: "Electrochemical DNA biosensor based on graftong-to mode of terminal deoxynucleoside transferase-mediated extension", 《BIOSENS BIOELECTRON》 *
徐凤州: "基于铜纳米颗粒和石墨烯材料的荧光生化传感研究和应用", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑》 *
杜玉梅: "基于TdT酶和RCA两种等温扩增技术构建用于检测恩诺沙星的适体传感器", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)工程科技辑》 *
胡宇芳 等: "基于TdT的"树枝状"信号放大的无标记电化学生物传感器", 《中国化学会第29届学术年会》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110646610A (zh) * 2019-06-28 2020-01-03 上海海洋大学 一种基于TdT信号放大技术的试纸条及其制备方法
CN110646610B (zh) * 2019-06-28 2023-04-14 上海海洋大学 一种基于TdT信号放大技术的试纸条及其制备方法
CN110646486A (zh) * 2019-10-14 2020-01-03 宁波大学 基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器研究
CN112462046A (zh) * 2020-11-12 2021-03-09 上海海洋大学 一种基于比色适配体传感器快速检测抗生素的方法

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