CN1580281A

CN1580281A - 基因芯片酶法微球放大标记

Info

Publication number: CN1580281A
Application number: CN 03142081
Authority: CN
Inventors: 宋克
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-08-06
Filing date: 2003-08-06
Publication date: 2005-02-16

Abstract

本发明提供了一种基因芯片酶法微球信号放大标记技术，其原理是，将携带某特异性反应功能团[Y－]的媒介核苷，以待测基因序列为模板，在酶的作用下掺入到靶基因序列中，合成媒介靶基因，后者与被固定在基因芯片上的探针阵列杂交[若为缺口转移标记则待测基因与探针已经事先杂交好，所以过程实质是用媒介靶基因替换原先的未标记靶基因]，形成媒介靶基因与其互补探针的杂合双链，用表面修饰有可与Y－特异性反应或结合的Y’－功能团的高荷信号载体[HSC]与该杂合双链反应并与之结合，从而实现信号放大标记。由于采用了高荷信号载体，如荧光微球，该技术的信号放大能力可以达到10²－10⁸，达到或超过PCR、IVT等目前常用的技术。在一些实施例中介绍了通过逆转录技术[RT]、体外转录技术[IVT]、缺口转移[NT]技术进行适合于寡聚DNA芯片、表达谱芯片的标记技术方案。作为杂交靶基因则可以是经修饰的DNA、RNA、cDNA、cRNA、aRNA等形式的产物。

Description

基因芯片酶法微球放大标记 Bead Amplification Labeling with Enzyme-incorporated Intermediary Nucleotides[BALEIN]

本发明所引用的文献

1.Philips，J.，Eberwine J.H.(1996)Methods 10：283-288.

2.Lockart，D.J.et al(1996)Nature Biotechnol 14：1675-1680.

3.Baugh，L.R.et al(2001)Nucl Acids Res 29(5)：e29.

4.Poirier，G.M.-C.，Erlander，M.G.(1998)A Companion to Method inEnzymology 16.

所属领域本发明属于基因芯片应用技术领域，特别是涉及到基因芯片的杂交，标记，洗脱，信号检测及数据分析技术。

本发明技术背景人类基因组计划已经完成，基因芯片技术提供了一种研究基因组复杂性的一种潜在手段。这种手段为人们从生物体的各种RNA水平直接获取核酸功能方面的信息提供了装备。

总RNA得到分离之后，各种分析方法都可以被应用于制备基因芯片分析用的靶基因。最为常用的方法是通过逆转录将荧光分子标记的碱基引入靶基因的直接cDNA标记技术。应用这种技术的一个明显制约因素是每次杂交反应所需求的RNA量大。然而，在医学研究中一些非常重要的应用常常涉及到对一些很少量的生物组织进行研究，比如一些肿瘤生物活检等。因此，一些靶基因放大技术得到应用以克服这些困难。这些方法简要分析如下：

线性cRNA放大技术通过逆转录技术，用连接到一个T7 PROMOTER上的oligodT引物，以及用T7 RNA聚合酶对所产生的DNA进行体外转录^[1，2]，可以将一个RNA靶放大100倍。该技术在一个总RNA中检测单个mRNA没有发生明显的偏差^[3，4]。

PCR放大方法基于逆转录过程，通过对cDNA进行任意PCR放大，以及用T7 RNA聚合酶对产生的PCR产品所进行的体外转录。对于表达谱研究，这种方法至少需要50纳克的总RNA[从1000个细胞或0.1mg的组织]。

本发明的目的本发明的目的之一，是为基因芯片产品提供一套通过各种酶的介导作用利用高荷信号载体大幅度提升检测灵敏度，经济实用性的信号放大标记技术及试剂盒。

本发明目的之二，是以逆转录[RT]、体外转录[IVT]、缺口翻译[NT]等技术路线为例，具体说明了针对不同样品情景的样本制备、杂交、标记等技术流程。

本发明与背景技术相比所产生的积极效果本发明中所提供的方法不仅极大提高了基因芯片检测灵敏度，处理时效，降低成本。

另外，作为一般性方法，无论是被应用于固相[如基片式基因芯片等]还是液相溶液条件下[微流体芯片，毛细管电泳芯片，实验室芯片等]，该信号放大技术，有着PCR[聚合酶链式反应，基因扩增技术]技术和用于其他基因检测中所用到的信号放大技术所不具备的诸多优点。由于该技术不依赖基因扩增，所以，该技术可以准确定量、不易造成污染、可以避免假阳性检测结果、试剂盒成本低廉、容易实现自动化等优点，而且样品制备简易。归纳起来，本发明所带来的有益效果有如下几个方面：

1、为一般的基因芯片技术产品提供了超灵敏检测的技术基础，BALEIN技术比现有的体外转录[IVT，可以产生待检测探针的100倍的放大能力]等放大技术有着更强大的信号放大效果，可以根据需要选择不同规格的高荷信号载体将信号放大倍数提高到10²-10⁷不等，满足科研和临床诊断等实用领域对超灵敏基因芯片检测技术的需求，有利于推动基因芯片技术在临床诊断、工商检疫和环境检测等方面的普及应用。

2、本发明也为降低基因芯片处理系统的成本及运行成本提供了技术支持，有利于基因芯片的普及应用。

本发明的技术原理本发明提出一种基因芯片酶法微球放大标记技术，其原理是，将携带Y-功能团的媒介核苷[Intermediary Nucleotides]，以样品中待测基因序列为模板，在酶的作用下掺入到靶基因序列中，合成媒介靶基因[intermediary target sequences]，后者与被固定在基因芯片上的探针阵列杂交，形成媒介靶基因与其互补探针的杂合双链，用表面修饰有Y’-功能团的高荷信号载体[HSC]与该杂合双链反应并与之结合，从而实现信号放大标记。

这种基因芯片由基底及其表面的镀层或涂层和固定在基底[缩写为S]或镀层[缩写为C]表面的不少于两个阵列式排列的探针组成，用于检测样品中的生物或化学靶物质。基底和/或镀层或涂层的材料可以由但不限于如下材料中任意一种或一种以上不同材料组合制成：

(1)无机片状或平板状材料类如玻璃、石英、云母，透明导电材料如透明导电氧化物类[TCO]，如氧化铟锡[indium tin oxide，ITO，或写为In₂O₃：Sn]、InAs、SnO₂：F、砷化镓[GaAs]、氧化镁等镀层，氧化锡[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，CdIn₂O₄，Cd₂SnO₄，Zn₂SnO₄和In₂O₃-ZnO等，以及碳/陶复合导电陶瓷，各种半导体材料等，以及多孔板模式，如微孔板、微滴板，

(2)单质类：铂、金、银、铝、铬[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金属以及硅等非金属，

(3)有机物类：各种有机分子及其由此制成的自组装单分子膜或自组装多分子膜，

(4)高分子类：尼龙膜、塑料、橡胶、树脂，硝酸纤维素膜。

基底的结构可以是但不限于如下种类：

(1)薄片/平板式：如玻璃片、硅片、尼龙膜、塑料片、

(2)多孔板式：如微孔板，微滴板式等，

(3)电极式：在薄片式基因芯片上以一定规律排列而成的各种电极阵列，如在半导体、绝缘体等基底上制成的铂电极、金电极等，

(4)微管式：由毛细管或有毛细管管状内腔结构特点的其它材料，按预先设定的位置对应规则排列而成的各种矩阵式毛细管基因芯片[二维平面排列]、线形毛细管基因芯片[一维线形排列]、以及在基片式结构中制作出的各种不少于一个微管道式空腔结构的矩阵式并行排列[即微流体电泳芯片等]，

本发明所说的基因芯片用来检测的探针、靶或者模板可以是，但不限于如下种类之一或不同种类的组合或下面种类的某种成分，提取物：

(1)核糖核酸[RNA]，各种核糖核酸[″ribonucleic acid″and″RNA″]，包括信使RNA[简称mRNA]、转录RNA[简称tRNA]、放大核糖核酸[amplified RNA]或反义核糖核酸[anti-sense RNA，简称aRNA]、互补RNA[cRNA]等，

(2)脱氧核糖核酸[DNA]如DNA，互补DNA[cDNA]等，

(3)寡核苷酸[oligonucleotide]，包括寡聚脱氧核糖核酸[oligodeoxynucleotide，简称ODNs]，寡聚核糖核酸[oligoribonucleotide，ORNs]，多聚核苷酸[polynucleotide]，

(4)核酸结构相似物[DNA-DNA，RNA-RNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes orquadroplexes，等]]如肽核酸[peptide nucleic acids，简称PNA]，

(5)脱氧核糖核酸、核糖核酸及其结构相似物的互补双链、三[重]链、四[重]链等形式的杂交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等。

本发明在基因芯片处理技术中采用高荷信号载体(高分子荧光微球或含有大量荧光染料、半导体纳米晶量子点、电致发光分子等的高分子颗粒，通过合成技术将大量信号分子聚合为一体的各种形式的巨型信号分子，硅氧光学磁珠[silica beads]，胶体金[或纳米金颗粒，colloidal gold nanoparticles]，或通过任何其他手段将荧光染料，非荧光染料，半导体量子点、电致发光、化学发光或生物发光物质信号分子等固定于微粒的表面或包埋于其内部等多种形式的高荷信号载体)作为标记物进行分子信号放大。

本发明所要介绍的基因芯片信号放大标记技术，是以各种形式的高荷信号载体或信号体应用于标记各种形式的基因芯片探针、靶或探针-靶杂交体。

这里所说的基因芯片包括但不限于如下类型：基因芯片[包括各种DNA芯片，如玻璃基因芯片，膜芯片，实验室芯片，微流体芯片等]、以电化学原理或生物电子学原理为基础的各种生物传感器等。

本发明所使用基因芯片的检测原理可以是，但不限于如下种类之一或不同原理的结合：

(1)通过对固相表面定位在不同位置的探针-靶特异性亲合反应结合体或杂交体进行光学信号[如荧光分子、化学发光等]标记，然后经激发产生荧光、化学或生物发光并进行检测。以玻璃、硅片、尼龙膜等为材质的基因芯片、蛋白芯片、免疫芯片多采取这种模式；

(2)通过对标记的或未标记的探针或靶在施加了电压的液相中的移动速度或迁移率进行检测，即电泳技术或由电泳技术与其他技术结合而产生的其他技术，如毛细管电泳[capillary electrophoresis，CE]、毛细管区带电泳[capillary zoneelectrophoresis，CZE]、毛细管凝胶电泳[CGE]、高效毛细管电泳[HPCE]、毛细管等电聚焦[capillary isoelectric focusing(CIEF)]、等速电泳[isotachophoresis(ITP)]、动电色谱[electrokinetic chromatography(EKC)]、胶束动电毛细管色谱[micellar electrokinetic capillarychromatography(MECC OR MEKC)]、毛细管电色谱法[capillaryelectrochromatography(CEC)]、非水相毛细管电泳[non-aqueouscapillary electrophoresis(NACE)]等，

(3)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们的标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析，如亲和层析[affinity chromatography]，SEC[size exclusionchromatography]，GPC[gel permeation chromatography]，MCC[metal chelatechromatography]等，

(4)利用具有氧化还原性质的分子或分子的部分结构[即化学基团或功能团]、金属络合物或(核酸)嵌入剂与被定位并固定在固相表面不同位置或电极上的探针、靶或探针-靶络合物结合并在外加适当方式或适当大小的电压(或电势差)作用(直流电压或交变电流或脉冲电场或电压)下，发生氧化还原反应，致使从还原性分子或基团(电子授体，electron donor)的电子转移到氧化性分子或基团(电子受体，electron acceptor)，形成电子流，通过电极传送到检测系统进行测量，所测得的电流强度大小与杂交并被标记的双链核酸的量成正比，

(5)利用双链核酸和单链核酸的导电性能差异，或利用由序列完全互补配对的核酸杂交所形成的双链核酸分子与有错配碱基对(Mismatches)存在的双链核酸(nucleic acids duplexes)分子之间在导电性能差异，通过对经由核酸分子传导的电子流大小的测量而对核酸分子由此所反映的其他方面所进行的各种鉴别、检测和考察，如在基因突变、基因多态性、基因测序、基因表达谱研究、疾病机理分析和疾病诊断等方面的应用，

(6)将发生在核酸分子上或由具有氧化还原性质的物质(包括但不限于，具有氧化还原性质的金属络合物以及由金属络合物或金属络合物的衍生物为单体聚合而成的聚合物、荧光分子、核酸嵌入剂等)所发生的电子或电荷转移反应或电子流转换成其他可检测或可考察形式的检测技术，如通过电致发光[Electroluminescence]原理，利用电致发光分子将电子流转换为光信号所进行的检测，

(7)直接或间接以具有氧化还原性物质(如二茂铁基)对探针或靶分子标记物，通过标记后可以使标记物接近电极表面而发生电子转移反应从而实现对发生在电极表面的生物或化学反应的检测。如摩托罗拉公司的eSensor Chips。

(8)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们的标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析，如亲和层析[affinity chromatography]，SEC[size exclusionchromatography]，GPC[gel permeation chromatography]，MCC[metal chelatechromatography]、动电色谱[electrokinetic chromatography(EKC)]、胶束动电毛细管色谱[micellar electrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛细管电色谱法[capillaryelectrochromatography(CEC)]等。

这里所说基因芯片的高荷信号载体[HSC]包括但不限于如下类型，以各种微小颗粒形式存在的高负荷光学、磁性、电子学或电化学信号载体，它可以是量子点微球[QD-taggedMicrobeads]、高聚物荧光微球或高分子荧光微球[polymer microspheres]或胶体微珠[latexbeads]、表面修饰有荧光染料的硅氧磁珠[silica beads]、胶体发光半导体纳米晶量子点[colloidal fluorescent semiconductor nanocrystal quantum dots]、树枝状高聚物纳米球[dendrimers]、星形树枝状高分子或树形分子[star dendrimers，dendrimeric stars ordendrimers]、蛋白质包裹的半导体纳米颗粒或微小颗粒或量子点[如Chaperonin mediatedsemiconductor nanoparticles.Chaperonin中以Chaperonin GroEL蛋白和T.th cpn蛋白包裹效果最佳]、胶束[micelles]、分子磁体[molecular magnets]、胶囊式微球[encapsulatedspheres]、胶体纳米金[colloidal gold nanoparticles]、电致发光分子[electroluminescentmolecules]、二茂金属基共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如二茂铁基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂锆[polyzirconocene，PZC]、多聚二茂金属基修饰或接枝的树枝状高分子[包括但不限于，聚二茂铁基接枝的树枝状高分子(polyferrocenyl-branched dendrimers)]、二茂金属基或多聚二茂金属基修饰或接枝的纳米金胶体[包括但不限于，胺基二茂铁基功能化的纳米金胶体(Gold colloids functionalized with amidoferrocenyl structures)等]、共聚物微球或纳米球、含有富勒烯结构的或以富勒烯为单体之一的高聚物或共聚物、其它含荧光染料或化学发光[chemiluminescence]、生物发光[bioluminescence]材料的载体，藻胆蛋白类[phycobiliproteins]及其各种衍生物或生物或化学修饰物，以及上述每一种载体中不同参数[如大小、光学发射光波长、电磁学性质、表面生物或化学功能团修饰等物理或化学性质]载体的组合，或各种不同载体之间的相互组合。

本发明所要介绍的信号放大技术，是一种酶介导的基因芯片信号放大标记技术，其特征是，将修饰了的核苷[modified nucleotides]和未经修饰的核苷在酶的作用下，利用样品中的待测基因(DNA或RNA)为模板，合成修饰了的新模板。再用表面修饰有可与该新模板上的功能团发生特异性反应的生物或化学基团的高荷信号载体与基因芯片上的新模板进行化学共价键或非共价键偶联，实现对杂交事件的特异性信号放大标记。

酶法标记反应可以用如下通式表示，

1.核酸模板(XNA，可以是各种单链或双链的DNA和RNA)在酶(Enz)的作用下，利用Y-功能团修饰了的媒介核苷(与未经修饰的核苷混合在一起)，在杂交前或杂交后，合成媒介靶基因ZNA(Y)n[ZNA可以是DNA或RNA片段]，

XNA+nY-dNTP/NTP+Enz→ZNA(Y)n [I]

2.若a)过程为杂交前标记，则媒介靶基因ZNA(Y)n与基因芯片上的核酸探针杂交，通式为，

ZNA(Y)n+_XNA→_XNA:ZNA(Y)n [II]

若过程a)发生在杂交过程之后，则其通式为，

_XNA:ZNA+nY-dNTP/NTP+Enz→_XNA:ZNA(Y)n [I’]

3.表面修饰有可与Y-功能团特异性反应的生物或化学基团Y’-的高荷信号载体与基因芯片上的XNA:ZNA(Y)n进行化学共价键或非共价键偶联，

_XNA:ZNA(Y)n+HSC(Y’)m→

_XNA:ZNA(Y)_n-p[-Y-Y’-]_p-HSC(Y’)_m-p [III]

上述n，m，p为从0到无穷大的任一自然数数值1，2，3...

上述通式中所说的酶[Enz]可以是，但不限于：

1.DNA聚合酶，如Taq酶，大肠埃希菌或大肠杆菌DNA聚合酶I，

2.RNA聚合酶，如SP6，T7和T3噬菌体RNA聚合酶[phage RNApolymerases]，可用于体外转录[in vitro transcription]法标记，Superscript II RT，

3.逆转录酶，包括但不限于Superscript II RT(LifeTechnologies；Cat#18064-014)、禽白血病毒(Avian Myoblastosis Virus，AMV)逆转录酶和小鼠反转录病毒(MMLV)逆转录酶，或者StrataScript逆转录酶(StrataGene公司，Cat#600085)、PowerScript逆转录酶(CloneTech公司，Cat#8460-2)]，可用于逆转录过程中掺入媒介核苷，如Taq酶，

4.缺口转移、切口平移法或缺口翻译法[NickTranslation]标记中使用的大肠埃希菌或大肠肝菌[E.coli]DNA聚合酶I和(胰腺)DNaseI，Klenow片段，

5.连接酶，如T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶，

6.限制性内切酶，如I型、II型限制性内切酶，

7.核酸酶，如核酸酶S1，DNase，RNase，RNaseA，RNaseH，

8.末端转移酶，末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal DeoxyribonucleotidylTransferase，缩写为TdT)，

9.碱性磷酸酶，细菌碱性磷酸酶(BAP)和牛小肠磷酸酶(CIP)，

10.T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)，简称为T4激酶，Y-功能团修饰核苷[modified nucleotides]可以是，但不限于：

1.氨基烯丙基-核苷，如氨基烯丙基-dUTP[aa-dUTP]，

2.生物素化的核苷，如生物素-dUTP[biotin-dUTP]、生物素-UTP[biotin-UTP]、

3.地高辛修饰的核苷，如DIG-11-UTP，

其中的Y-和Y’-可以分别是，但不限于如下表所示的反应对之一或它们的组合：

Y-或Y’-	Y-NTP/dNTP实例	Y’-或Y-
Y-或Y’-	Y-NTP/dNTP实例	Y’-或Y-	Phenyldiboronic acid，PDBA地高辛，DIG氨基，如氨基烯丙基-，aa-生物素基-，	PDBA-UTPDIG-11-UTPaa-dUTP，aa-UTP[Ambion，(Cat.#8437]Biotin-UTP，biotin-dCTP，biotin-dUTP	SHA抗地高辛N-羟基琥珀酰亚胺基-，亲和素-，链霉亲和素-

这些修饰核苷的特点是，可以在核酸合成、转录或逆转录过程中，能够在酶的作用下，被掺入到合成后的靶基因序列中去。

本发明的酶法标记反应，可以是，但不限于如下过程之一或不同过程之组合，

(1)反转录或逆转录过程[Reverse Transcription]，

(2)体外转录过程，[in vitro transcription]

(3)缺口翻译过程或缺口转移过程或缺口平移过程[Nick Translation]，

(4)末端脱氧核苷酸转移过程，

(5)末端核苷酸转移过程，

(6)DNA合成反应过程或RNA合成反应过程，

(7)DNA连接反应，

(8)DNA[限制性内切酶作用下的]酶切反应，

(9)磷酶酶作用下将DNA末端中的5’-端磷酸基除去，使其5’-端变成了OH基的反应，

(10)T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)作用下将ATP中γ位上的磷酸基转移到具有5′-端羟基的DNA或RNA分子上的反应，

(11)末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase，缩写为TdT)作用下将三磷酸脱氧核苷酸中的单磷酸核苷转移到DNA分子的3′-端羟基上的反应，

(12)牛胰腺脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)作用下降解双链DNA为5′-磷酸低聚核苷酸的反应，

(13)核酸酶RNaseA作用下特异性地作用于嘧啶核苷酸的反应，

(14)核酸酶RNase H作用下，专一性地分解DNA/RNA杂交分子中的RNA分子，从而在cDNA合成过程中除去cDNA-RNA中的RNA链的反应。

HSC表示以各种微小颗粒形式存在的高负荷光学、磁性、电子学或电化学信号载体，它可以是高聚物或共聚物荧光微球、表面修饰有荧光染料的硅氧磁珠[silica beads]、半导体等无机物的量子点[quantum dots]、半导体等无机物纳米晶[nanocrystal particles]、树枝状高聚物纳米球[dendrimers]、星形树枝状高聚物纳米球[dendrimeric stars]、胶束[micelles]、分子磁体[molecular magnets]、胶囊式微球[encapsulated spheres]、胶体纳米金[colloidal goldnanoparticles]、电致发光分子[electroluminescent molecules]、多聚二茂金属共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如多聚二茂铁共聚物[polyferrocene block copolymers，PFC]微球，多聚二茂锆[polyzirconocene，PZC]共聚物微球或纳米球、含有富勒烯结构的或以富勒烯为单体之一的高聚物或共聚物、其它含荧光染料或化学发光[chemiluminescence]、生物发光[bioluminescence]材料的载体，以及上述每一种载体中不同参数[如大小、光学发射光波长、电磁学性质、表面生物或化学功能团修饰等物理或化学性质]载体的组合，或各种不同载体之间的相互组合，其表面修饰有可以与通式(I)，(II)，(III)化合物中的探针分子接头Y’-特异性反应的功能团或作用对Y-。

实例一氨基烯丙基逆转录标记[Amino Allyl Reverse Transcription Labeling]。

为了基因芯片分析，RNA通常用荧光染料(即Cy^TM3或Cy^TM5)进行标记。标记物可以在cDNA合成时直接引入，aRNA放大或者后aRNA逆转录反应[post-aRNA reversetranscription(RT)reaction]，或在任何酶反应之后通过化学偶联反应进行连接。直接标记需要酶反应在cDNA，aRNA或RT产物中引入Cy标记的dNTP/NTP。

间接标记通常在将要被荧光染料标记的核酸分子上引入一个碱基媒介。虽然直接标记法看上去更方便，但却存在各种问题。

氨基烯丙基-dUTP[Amino allyl-dUTP]在碳烷烃连接臂上有一个有反应活性的氨基功能团。在偶联反应中，cDNA或aRNA合成之后，这个氨基基团与高和信号载体表面的NHS酯键反应。氨基烯丙基-UTP[Amino allyl UTP，Ambion公司]能够被引入到转录产物中形成氨基烯丙基标记的RNA，以供后面与高和信号载体进行化学偶联。氨基烯丙基-dUTP/UTP[amino allyl dUTP/UTP，美国Ambion公司]能够被引入任何逆转录反应。

用间接标记法，氨基修饰的NTP(amino allyl-dUTP/UTP)在逆转录或aRNA放大时可以被引入。在酶反应如逆转录反应过程中，氨基烯丙基-NTP[Amino allyl-NTPs]的引入效率与未经修饰的NTP[unmodified NTPs]相似。往氨基烯丙基cDNA，aRNA或合成产物[post-synthesis]分子上偶联高荷信号载体会产生与探针数量相同的标记效率。

氨基烯丙基逆转录[Amino allyl Reverse Transcription]

4.在10-20μg总容积为15.5μl的总RNA中加入1μl oligo dT(2.5μg/μl)，在65℃加热样本10分钟。再冷却到室温10分钟。

5.混合：6μl 5×第一链缓冲液，3μl0.1M DTT，和3μl10× dNTP，当RNA正在冷却时混合，并于42℃温浴。(10×dNTP mix＝5mM[每个dA，dC，dG]；3mM dTTP和2mM氨基烯丙基-dUTP，简写aa-dUTP)，在42℃，将RNA样本加入到预热了的反应混合物中。加入2μl的200单位/μl Superscript II[逆转录酶，Superscript II RT(LifeTechnologies；Cat#18064-014).可用于此反应的其他逆转录酶还有AMV和MMLV。或者StrataScriptReverse Transcriptase(StrataGene 600085)或PowerScript ReverseTranscriptase(Clone Tech 8460-2)]和0.5μl RNAse抑制剂。(总反应体积＝30μl.)在42℃温浴1-2小时。

6.加入1.6μl 5M NaOH(使最终浓度为0.25M)和20μl 0.5M EDTA并在65℃下温育15min。

7.用10μl 2M HEPES pH 8中和溶液。

Clean-up与清除Tris

8.用450μl水加入到Nanosep 30K浓缩器并加入上述中和了的反应溶液。

9.在5000g旋转5分钟。倒掉上清液。

10.用450微升水重复上述过程两次。

11.用微量移液器移走浓缩物。

12.在speed vac.中干燥浓缩物。

NHS-酯表面修饰的高荷信号载体的制备：

制备标记用HSC(NHSE)n和表面用亲和素包被的高聚物荧光微球[HSC(Av)n]。表面羧基修饰的HSC(NHSE)n[如Max.Ex.488nm。制备方法详见下面介绍]和HSC(Av)n[详见下述方法]。使用时，用超声波振荡器将荧光微球打散，使之悬浮于73微升的DMSO中。由于NHS酯能够同时水解，因此，要么立即使用，要么按每份45μl于-80℃储存。

制备HSC(NHSE)n 25mg表面为羧基[COOH-]的聚苯乙烯荧光微球被悬浮于1ml

MES缓冲溶液(0.5M MES，25mg/ml碳酸钠)并被200μl 0.05M EDC[1-乙基-3-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸(EDC)and N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)购自Pierce Chemicals公司]活化20min(室温下)；然后，200μl 0.1MNHS[溶解在MES缓冲溶液被加入并温育20min(室温).该悬浮液在1500g下离心5min，HSC(NHSE)n荧光微球经MES缓冲溶液两次清洗，即可存储以备后用。

制备HSC(Av)n 上述HSC(NHSE)n荧光微球经两次MES缓冲溶液清洗之后，将200μg的亲和素[溶解在1ml 0.1M MES加5mg/ml碳酸钠溶液中]加入并温育2h(室温)。经两次MES清洗之后，荧光微球上的游离结合位点在与1ml 0.5mM乙醇胺[溶解在MES缓冲溶液中]室温下温育10min之后被封闭。此后HSC(Av)n荧光微球经两次PBS[Sigma公司]清洗，并被调整到浓度为25mg/ml。-20℃储存。

HSC(Av)n亦可用下述方法制备：20ul 4g/L表面为羧基修饰的聚苯乙烯荧光微球(Molecular Probes Inc)在含有500μg的EDC和500μg的sulfo-NHS的100μL 50mmol/L磷酸钠缓冲溶液，pH7.0，被活化。荧光微球用100μL的PBS，pH7.4被两次洗涤，并在13 400g离心条件下离心30秒以提取荧光微球。活化和洗涤的荧光微球在50μL的稀释亲和素溶液(Av∶PBS稀释比例为1∶100，pH7.4)中被悬浮。2小时后，亲和素包被的荧光微球经用100μL的0.2mL/L Tween 20，1g/LBSA的PBS溶液，pH7.4(PBSTB)，洗涤两次。悬浮于1mL的PBSTB。荧光微球的浓度用PBSTB调节到3×10⁹/L并作为悬浮液储存于2-8℃。

杂交该部分技术操作详见实例三。

偶联

1.将cDNA重新悬浮在4.5μl的0.1M NaHCO3 pH9.0中，

2.将4.5μl溶解在DMSO中的NHS-酯表面修饰的聚苯乙烯荧光微球加入到上述cDNA悬浮液中，

3.将荧光微球与cDNA混合并在室温下温育1小时，

4.在杂交之前，必须用4.5μl 4M的羟胺加入到每个反应中并在室温下温育15分钟以终止偶联反应，

(1)荧光微球的选取：通式(I)中的F-选择高分子荧光微球，如聚苯乙烯荧光微球等。可以采购美国Molecular Probes公司，Duke公司或Bang’s Laboratories等公司的产品。作为最佳实施例，可以选择与市场上基因芯片扫描仪激发光/发射光波长相吻合的，激发光波长在488纳米、633纳米的聚苯乙烯荧光微球。

(2)荧光微球与核酸分子的共价键或非共价键偶联：[1]选择Molecular Probes Inc公司的表面羧基修饰的荧光微球，[2]用DNA合成仪合成3’-末端或5’-末端带氨基的寡聚核苷酸，[3]用水溶性碳二亚胺[EDAC]将前二者通过共价键偶联起来，形成与某靶基因可以互补杂交的标记探针。

(3)用(1)和(2)所述的方法，制备出与不同靶基因的特异性位点分别互补配对并杂交的标记探针。

实例二本实例的F选择量子点[QDs]、量子点微球[QD-tagged Microbeads，或QD-taggedPolymeric Microspheres，QD-Beads(这是一种将量子点包埋在高分子微球中的一种HSC。

实例三本实施例为双色法基因芯片放大标记。双色法标记的目的主要是为了用一张基因芯片同时检测来自不同细胞或组织样品来源的靶基因，并在同一张基因芯片上通过竞争性杂交进行比较，根据最终所显示出来的颜色来判断两种来源的靶基因丰度或含量或表达比例等相对值。这种方法尤其在分析基因差异表达谱中经常使用。目前，通常采用分别被Cy3和Cy5标记的碱基在对样品RNA逆转录[如果是DNA则多采用PCR扩增]中，并被混合在一起用来杂交并标记基因芯片。本发明中所揭示的酶介导HSC信号放大技术同样可以用双色法标记来自不同来源DNA或RNA样品中靶基因及其表达比例，并在基因芯片上进行检测。

本实施例将采用两种媒介碱基[Intermediary nucleotides]对不同来源的靶基因RNA进行标记。它们分别是氨基烯丙基-dUTP[aa-dUTP]和生物素化的dUTP[Biotin-dUTP]。

A.标记

1.用1mg氨基烯丙基-dUTP[Sigma Cat#A0410]溶解在19.1微升的0.1M KPO₄，pH7.5的缓冲液中，制备100mM氨基烯丙基-dUTP溶液，

2.制备50×标记溶液。该标记溶液中含有的氨基烯丙基-dUTP和未标记的dUTP的比例为2∶3。其他dNTP的最终浓度为，25mM dATP，25mM dCTP，25mM dGTP，15mM dTTP，10mM aa-dUTP：

dATP(100mM) 5μl

dCTP(100mM) 5μl

dGTP(100mM) 5μl

dTTP(100mM) 3μl

aa-dUTP(100mM) 2μl

Total： 20μl

3.在10μg DNase I处理和Qiagen Rneasy纯化了的真核细胞总RNA[或2μg poly(A+)]，或2μg细菌RNA中，加入2μl随机六聚体引物[Random Hexamer primers](3mg/ml；Life Tech#48190-011)和去RNAse的水至18.5μl。

4.混合均匀之后，在70℃温育10分钟，

5.在干冰/乙醇浴中快速冷却30秒，微分离1分钟，并在室温下继续，

6.在上述溶液体系中，也加入

5×Superscript II缓冲液6μl

0.1M DTT 3μl

50×氨基烯丙基-dNTP混合溶液0.6μl

SuperScript II RT(200U/μl)2μl

7.混合并在42℃下温育3小时直到过夜。

8.要水解RNA，加入1M NaOH 10μl和0.5M EDTA 10μl。并在65℃温育15分钟。

9.加入10μl 1M HCl，或25μl 1M的HEPES pH7.0进行中和反应。

将aa-dUTP替换为生物素化的dUTP[biotin-dUTP]，重复1-9之过程，可以得到生物素化的cDNA[biotin-cDNA]。

B.杂交

一、预杂交

1.制备预杂交缓冲液：含有5×SSC，0.1％SDS和1％BSA[Sigma Cat.#A-9418]。

2.制备1×杂交缓冲液，含有50％的formamide，5×SSC，0.1％的SDS。

3.将待分析基因芯片基片[以下简称基片]放入一个Coplin Jar[VWR Cat#25457-200]。用预杂交缓冲溶液注满，并在42℃温浴45分钟。

4.在室温下用MilliQ水将基片洗涤5遍。

5.在室温下将基片浸入异丙醇中，风干。

基片在预杂交之后应立即使用。

二、杂交

1.在12μl的1×杂交缓冲溶液中制备两种荧光发射波长的aa-cDNA和biotin-cDNA的报告靶基因溶液。

2.将两种各12ul cDNA溶液充分混合，加入COT1-DNA(20ug/ul)1ul[Life Technologies：Cat#25279-011]，poly(A)-DNA(20ug/ul)1ul[Pharmacia：Cat#27-7836-01]以封闭非特异性杂交。

3.加热标记探针混合物到95℃3分钟使变性。

4.在最大角速度下离心标记探针一分钟。

5.将报告靶基因溶液施加到已预杂交的基因芯片基片上，用22mm×60mm盖玻片盖好。

6.将基片放入一个封好的杂交室中[Corning Costar Cat#2551]。在基片末端加20微升水。

7.将封好的基因芯片杂交室放入42℃的水浴中，温育16-20小时。

8.将基因芯片从杂交室中取出，放入一个盛有低严谨度洗涤缓冲溶液[含有42℃，1×SSC和0.2％SDS]的染色皿。

9.当基片在溶液中时小心移走盖玻片，搅动4分钟。

10.室温下，在含有1×SSC和0.2％SDS的染色皿中和高严谨度的条件下，淋洗基片，搅动4分钟。

11.在0.1×SSC中淋洗基片，搅动4分钟。

12.风干基片。

C.将aa-cDNA与HSC(NHSE)n进行偶联、biotin-cDNA与HSC(Av)n反应

1.制备标记用HSC(NHSE)n和表面用亲和素包被的高聚物荧光微球[HSC(Av)n]。表面羧基修饰的HSC(NHSE)n[如Max.Ex.488nm]和HSC(Av)n详见实例一所述制备方法。使用时，用超声波振荡器将荧光微球打散，使之悬浮于73微升的DMSO中。由于NHS酯能够同时水解，因此，要么立即使用，要么按每份45μl于-80℃储存。

2.制备1M Na₂CO₃，pH9.0的碳酸缓冲溶液，以备偶联反应之用。

3.重新将aa-cDNA在4.5μl 0.1M的碳酸缓冲溶液中制成悬浮溶液，pH9.0。

4.在水溶液中加4.5μl的HSC(NHSE)n和HSC(Av)n。在室温下温育1小时使反应得以进行。

D.洗脱

1.在玻璃皿中制备洗液，以清洗未偶联或未反应的HSC(NHSE)n和HSC(Av)n。

洗液I：340ml Milli-Q水，10ml 20X SSC，1ml 10％SDS。洗液II：350ml Milli-Q水，1ml 20X SSC。

2.小心将基因芯片从水浴中取出，确保保持杂交室水平。用纸巾将杂交室擦干。

3.打开杂交室，取出基因芯片并将其水平放入洗液I。去掉盖玻片，将基片在其中沿着与基片平行方向上下移动。或用注射器将洗液用适当速度喷射到基片上，重复多次。

4.单个将基片转移到含有洗液II的玻璃皿中，重复3操作。

5.在室温下将基片在600rpm转速下持续5分钟，干燥之。

E.数据采集，归一化，和分析

用激光共聚焦或CCD检测仪，对上述两个波长的荧光进行检测。

实例四氨基烯丙基标记[简称aa-标记]RNA

A.在对RNA逆转录过程中进行aa-标记，产生aa-cDNA

dATP(100mM) 5μl

dCTP(100mM) 5μl

dGTP(100mM) 5μl

dTTP(100mM) 3μl

aa-dUTP(100mM) 2μl

Total： 20μl

3.在10μg DNase I处理和QiagenRneasy纯化了的真核细胞总RNA[或2μgpoly(A+)]，或2μg细菌RNA中，加入2μl随机六聚体引物[Random Hexamer primers](3mg/ml；LifeTech #48190-011)和去RNAse的水至18.5μl。

4.混合均匀之后，在70℃温育10分钟，

6.在上述溶液体系中，也加入

5×Superscript II缓冲液6μl

0.1M DTT 3μl

50×氨基烯丙基-dNTP混合溶液0.6μl

SuperScript II RT(200U/μl)2μl

7.混合并在42℃下温育3小时直到过夜。

9.加入10μl 1M HCl，或25μl 1M的HEPES pH 7.0进行中和反应。

B.将aa-cDNA与HSC(NHSE)n进行偶联

5.制备标记用HSC(NHSE)n。HSC(NHSE)n[如Max.Ex.488nm]详见实例一所述制备方法。

使用时，用超声波振荡器将荧光微球打散，使之悬浮于73微升的DMSO中。由于NHS酯能够同时水解，因此，要么立即使用，要么按每份45μl于-80℃储存。

6.制备1M Na₂CO₃，pH9.0的碳酸缓冲溶液，以备偶联反应之用。

7.重新将aa-cDNA在4.5μl 0.1M的碳酸缓冲溶液中制成悬浮溶液，pH9.0。

8.在DMSO中加4.5μl的HSC(NHSE)n。在室温下温育1小时使反应得以进行。

D.反应物纯化II-----清除未偶联HSC(NHSE)n 在HSC(NHSE)n与aa-cDNA共价键偶联[形成HSC-cDNA]之后，未偶联HSC(NHSE)n在杂交反应之前必须得到清除。本实施例用QIAquick PCR纯化试剂盒可以进行快捷有效的纯化。

1.在反应混合物中加入35μl 100mM pH5.2 NaOAc。

2.250μl PB缓冲液。

3.按照Qiagen提供的PCR技术流程，用30微升的EB对总容积为60微升的反应溶液进行两次洗提。

4.用Speedvac.干燥反应产物。

E.杂交

一、预杂交

6.制备预杂交缓冲液：含有5×SSC，0.1％SDS和1％BSA[Sigma Cat.#A-9418]。

7.制备1×杂交缓冲液，含有50％的formamide，5×SSC，0.1％的SDS。

8.将待分析基因芯片基片[以下简称基片]放入一个Coplin Jar[VWR Cat#25457-200]。用预杂交缓冲溶液注满，并在42℃温浴45分钟。

9.在室温下用MilliQ水将基片洗涤5遍。

10.在室温下将基片浸入异丙醇中，风干。

基片在预杂交之后应立即使用。

二、杂交

1.在12μl的1×杂交缓冲溶液中通过超声波制备HSC-cDNA标记探针的悬浮液。

2.将纯化后的12ul HSC-cDNA标记探针悬浮液充分混合，加入COT1-DNA(20ug/ul)1ul[LifeTechnologies：Cat#25279-011]，poly(A)-DNA(20ug/ul)1ul[Pharmacia：Cat#27-7836-01]以封闭非特异性杂交。

3.加热标记探针混合物到95℃ 3分钟使变性。

4.在最大角速度下离心标记探针一分钟。

5.将标记探针施加到已经预杂交的基因芯片基片上，用22mm×60mm的盖玻片盖好。

6.将基片放入一个封好的杂交室中[Corning Costar Cat#2551]。在基片的末端加20微升的水。

9.当基片在溶液中时小心移走盖玻片，搅动4分钟。

11.在0.1×SSC中淋洗基片，搅动4分钟。

12.风干基片。

数据采集，归一化，和分析

实例五本实施例介绍为基因芯片杂交利用RNA聚合酶的体外转录技术[IVT]制备aa-RNA的技术过程。[注：杂交过程和化学偶联过程详见实例一至实例三]。

很多克隆的载体[Vectors]含有分散分布的噬菌体[phage]促进子[promoters]，可以借助它们从克隆好的DNA模板中合成RNA转录产品。SP6，T7和T3噬菌体聚合酶[phagepolymerases]被广泛地应用于生产体外转录产品[in vitro transcripts]。

一方面，由于RNA∶RNA和RNA∶DNA杂交双链比DNA∶DNA杂交双链更稳定，另一方面，标记RNA为单链，在与互补探针单链发生反应时不易与靶基因序列再次杂交，所以标记RNA[转录]在杂交过程中比它们相应的标记DNA可以提供更大的灵敏度。

试剂：

DNA模板[0.5-1μg/μl]，作为引物，含有T7 Promoter，Poly dT，1ul

总RNA，X ul，

RNase抑制剂[重组RNasin^_，Promega]，40U/μl，1.0μL

5x FS-buffer(第一链缓冲溶液)：4,0μL

0,1MDTT：2,0μL

10mM dNTP：1,0μL

T3，T7，SP6 RNA聚合酶[Promega]，

转录缓冲液[Promega公司的5×转录缓冲液]：200mM Tris-HCl，pH7.9，30mM MgCl，10mM亚精胺，50mM NaCl

100mM DTT，Promega，2,0μL

aa-UTP，Ambion

rNTP，Pharmacia

方法：下述试剂为20μl标记UTP而准备。

一、室温下，按下述顺序在微型离心管中加入如下所例之成分：

操作顺序加入量

5×转录缓冲液 4μl

100mM DTT 2μl

RNasin^_ 20U

10mMATP，GTP，CTP 各1μl

250μM UTP 1μl

模板DNA 2μl

aa-UTP 2μl

T3，T7，或SP6 RNA聚合酶 20U

总体积 20μl

二、T3，T7，或SP6的RNA聚合酶以IVT技术进行基因芯片杂交

1.将上述各成分在37℃混合并温育一小时，

2.取出1微升用以定量，

3.用Sephadex^_G25，G50层析柱去除未掺入aa-RNA的aa-UTP，

4.在微型离心管中省下1微升纯化转录aa-RNA产品以定量，

5.通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检查转录产品的完整性。

实例六本实施例介绍通过IVT技术制备生物素标记的RNA靶序列的过程。杂交与检测过程见实例四。

试剂盒：

成份及规格备注

NTP Mix[2×]，100μl 4mMATP，4mM GTP，4Mm UTP，1mM

CTP/Biotin-14CTP

反应缓冲溶液，5× 40μl

T3，T7，或SP6的RNA聚合酶，10U/μl 10μl

非生物素标记的DNA内参，250ng/μl 5μl

EDTA，pH8.0，500mM 1ml

去核酸酶水[Nuclease-free water] 1ml

LiCl，7.5M 1ml

DNase I，RNase-free，1U/μl 20μl

核糖核酸酶抑制剂，12.5U/μl 20μl

冰镇乙醇，70％

DTT，0.1M 20μl

标记路线

1.解冻5X反应缓冲液，2X NTP mix和去核酸酶水。

2.完全解冻后，离心收集离心管底部的全部溶液。

3.用洁净微型离心管，加入下列试剂(最终反应体积：20μl)：

试剂/规格备注

去核酸酶水到20μl

线性DNA模板0.2-1.0μg (为阳性控制，用2μl[0.5μg])

5X反应缓冲溶液 4.0μl

0.1M DTT 2.0μl

2X NTP mix 10.0μl

核糖核酸酶抑制剂 1.0μl

SP6，T7或T3 RNA聚合酶 1.0μl

4.通过轻敲试管充分混合上述试剂。简短离心收集试管底部的反应混合物。

5.在37℃温育60分钟。

6.在反应试管中加2μl DNase I并在37℃温育15分钟。

注：此步降解原DNA模板。

7.加入1μl 500mM EDTA，pH 8.0使酶失活。

去除未反应核苷

LiCl沉淀

1.加27μl去核酸酶水，再加入25μl的7.5M LiCl溶液，振荡混匀。

2.迅速将试管放到-20℃持续30分钟。

3.在4℃或室温下以10,000rpm转速离心试管15分钟。

4.小心吸去上清液。

5.用冰镇70％乙醇洗涤核酸小球。

6.在50μl的去核酸酶水中溶解核酸小球。

7.在-20℃下存储生物素化的靶序列。

实例七本实施例用地高辛标记的UTP[digoxigenin-UTP，Roche公司]通过IVT技术对RNA进行标记。所用酶为SP6，T7 and T3 RNA聚合酶。所用试剂盒如下所示：

标记	内容
标记	内容	DIG RNA Labeling Mix，10×	40μl，10×，10mM ATP，10mM CTP，10mM GTP，6.5mM UTP，3.5mM DIG-11-UTP，Ph7.5(20℃)

用DIG-11-UTP进行标记的操作过程与实例六相似。

用地高辛标记的RNA杂交反应过程

在每毫升的杂交溶液中，加入20ng[高丰度基因转录检测]或多达100ng[为低丰度转录检测]的DIG-RNA。可以采用罗氏公司的DIG Easy Hyb缓冲溶液为获得强信号和低背景噪音。

检测DIG标记的RNA 在杂交反应之后，用表面修饰有抗地高辛抗体的HSC检测已经杂交的DIG-RNA。

实例八对于表达芯片分析，常用的有以下几种方法制备和标记探针：将纯化的样品RNA通过特定的引物逆转录合成单链cDNA探针，在合成的过程中掺入标记物；或者先将待测样品的RNA转录合成cDNA，再进一步通过加入标记物进行体外转录合成cRNA单链探针。

以Affymetrix的表达芯片为例。标记过程要求制备样品的cRNA探针。为保证制备出足够的cRNA用于杂交和每一步的样品分析，Affymetrix公司推荐用1μg以上的mRNA(最少0.2μg以上)或者5μg以上的总RNA开始合成cDNA。以HPLC纯的T7-(dT)24 Primer(GENSET公司产品)作为逆转录引物合成cDNA。由于引物中带有T7序列，因此合成的cDNA的3′端也带有T7序列。

一种方法是用生物素-亲和素法进行标记。采取这种方法可以直接选用Affymetrix公司提供的RNATranscript Labeling Kit(Cat.#900182)，通过试剂盒提供的生物素标记的核糖核酸和T7 RNA聚合酶，以体外转录(IVT)的方式扩增并标记cRNA探针。试剂盒提供体外转录和标记的所有试剂。标记好的探针经过随机片断化(fragmentation，试剂自行配制)后得到大小约为35-200个碱基大小的RNA片断即可和芯片进行杂交。杂交之后选用表面修饰有亲和素或链霉亲和素的聚苯乙烯荧光微球[Sigma公司或Molecular Probes Inc.产品]，可以实现放大标记。

另一种方法是用实例七所提供的试剂盒和技术流程，用aa-UTP标记，从而产生氨基烯丙基标记的cRNA[aa-cRNA]。标记好的探针经过随机片断化后得到大小约为35-200个碱基大小的RNA片断即可和芯片进行杂交。杂交之后选用表面修饰有NHS-的聚苯乙烯荧光微球[详见实例一之制备方法]，可以实现放大标记。

cRNA标记，在IVT反应中，用aa-UTP[5-(3-aminoallyl)uridine 5′-triphosphate(Sigma)]和UTP[uridine triphosphate]的1∶3混合物。氨基烯丙基修饰的cRNA[aa-cRNA]用QIAquick或RNeasy columns(Qiagen)纯化，用80％的乙醇洗涤三次，再用水洗提。纯化的产品与HSC(NHSE)_n反应。来自参照[control]细胞的aa-cRNA与等量的生物素化的样品细胞[experiment cells]biotin-cRNA(5μg cRNA每人份每次杂交。对来自酵母，则每次杂交需要～2μg cRNA).杂交前，在60℃和10mM ZnCl2溶液环境下，经30min的温育，标记cRNA被片段化为平均长度为～50-100nt的小片段。被片段化的cRNAs被加到杂交缓冲溶液(1MNaCl，0.5％肌氨酸钠[sodium sarcosine]，50mM MES，pH6.5，和40μg鱼精DNA；LifeTechnologies)。如未专门说明，杂交严谨度通过最终浓度为30％的甲酰胺调节。杂交反应在3毫升大的柔性塑料密闭室中在40℃的旋转平台上的杂交炉中进行(Robbins Scientific，Sunnyvale，CA)。杂交16-24小时后，基因芯片基片经如下淋洗(在6×SSPE，0.005％肌氨酸中摇荡～30s，再在0.06×SSPE摇荡～30s)，并按实例一中所述与HSC(NHSE)_n之化学偶联，与HSC(Av)n进行免疫反应。HSC(NHSE)_n和HSC(Av)n分别选用发射波长为500nm和650nm的两种颜色的荧光标记。经洗脱，并用激光共聚焦扫描仪(General Scanning，Wilmington，MA；Genetic Microsystems，Woburn，MA；或Axon，Foster City，CA)。扫描图像的荧光强度被量化，背景校正和数据归一化。

实例九实例八之方法亦很适合于cDNA标记和杂交过程。首先，氨基烯丙基修饰的核苷被酶法掺入到cDNA中。对于cDNA标记，aa-TTP[5-(3-aminoallyl)thymidine 5′-triphosphate(Sigma)]和thymidine triphosphate(TTP)按摩尔比为1∶1的混合物在cDNA合成中被用来替代TTP。其中所需每人份每次杂交为～30μgcDNA。用RT酶替代IVT中的RNA聚合酶。适用于cDNA表达芯片或寡聚DNA芯片的杂交、标记和检测。

实例十 Nick Translation[NT]标记比较适用于双链DNA长度较大[＞1Mb]的固相杂交。杂交之后，用带有化学修饰[如氨基、生物素、地高辛等]的核苷通过NT反应进行DNA探针的标记。用可与NT DNA探针上面的化学修饰基团发生相互作用的基团或半抗原结合蛋白修饰高荷信号载体表面。通过此探针与高荷信号载体的相互作用可以检测NT DNA。从Enzo Life Sciences Inc购买用于膜DNA微点阵的NT生物素或地高辛标记试剂盒。根据该公司的技术指导可以进行杂交和标记。用实例三和实例九中的亲和素包被的HSC与抗地高辛抗体包被的HSC及其偶联方法，可以对上述标记好的基因芯片进行标记和检测。

1.制备标记试剂盒：

Stock 最终浓度 (2.5％Dic)50ul RXN

10X NT缓冲溶液 1X 5.0ul

10mM dATP 100uM 0.5ul

10mM dCTP 100uM 0.5ul

10mM dGTP 100uM 0.5ul

10mM TTP 97.5uM 0.4875ul

1mM Dig-dUTP 2.5uM 0.125ul

10X Enzyme Mix 2.5U Pol I 5.0ul

0.0375U DNase I

ddH2O 加到50微升为止

DNA 0.5-1ug 加到38微升

2.将所需量的DNA加到500μl的离心管中，

3.将适量的上述混合液加到每一个盛有DNA的离心管中，

4.在16℃温育1-2h.

5.通过加入2μl 0.5M EDTA-8.0终止反应，

6.未反应的dig-dUTP可通过乙醇沉淀法或Sephadex G-50 spin columns清除。

7.后续偶联、检测等过程可从前述方法中寻找。

10XNT缓冲溶液(购自BRL Bionick Kit)组分

500mM Tris-7.8

50mM MgCl2

100mM β-巯基乙醇

100μg/ml BSA(去核酸酶)

酶混合溶液[Enzyme Mix](购自BRL Bionick Kit)组分

0.5U/μl DNA聚合酶I 1mM β-巯基乙醇

0.0075U/μl DNase I 0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride50mM Tris-HCl，pH 7.5 50％甘油

5mM MgOAc 100μg/ml BSA(去核酸酶)

实例十一本实施例用 Biotin-16-dUTP替代实例九中的 Digoxigenin-11-dUTP，1nmol/μl(Boehringer Mannheim)。

实例十二本实施例为合成氨基烯丙基反义RNA[aa-aRNA]以用于DNA微阵列杂交检测。下面介绍aa-aRNA的制备方法。关于杂交、化学偶联等过程参见实例一等相关介绍。

为体外转录[IVT]制备dsDNA

试剂：

DNA模板[0.5-1μg/μl]，作为引物，含有T7 Promoter，Poly dT，1ul总RNA，Xul，

DEPC H2O，加到9.5ul。

在70℃下温育10分钟，立即放置到冰块上冰镇。

加RNase抑制剂[重组RNasin^_，Promega]，40U/μl，1.0μL

T4gp32(8μg/μl)1,0μL

5x FS-buffer(第一链缓冲溶液)：4,0μL

0,1MDTT：2,0μL

10mM dNTP：1,0μL

在冰块上制备Mix总量9,0μL

在37℃温育2分钟。加入Super-Script逆转录酶：1,5μL(1,0μL/8μg总RNA)，使总量达到20μL。

在42℃温育1小时。

在上述20ul的反应溶液中加入下述混合物[mix](该混合物在冰块上制备)：

试剂用量

DEPC H2O 90,0μL

5x第二链缓冲溶液 30,0μL

dNTP 10mM 3,0μL

E.coliRNAseH 1.0μL

E.coli DNA连接酶 1,0μL

E.coli DNA聚合酶 4,0μL

总容积 149μl

在16℃温育2小时。在-20℃冷藏。

在65℃温育10分钟。在-20℃冷藏。

Vortex，在12000rpm，4C离心10分钟，

将上清液[水相]转移到一个新试管。

乙醇沉淀：加到～150,0μL

乙酸铵(7,5M，Sigma)80,0μL

96％乙醇(-20C)400,0μL。混合。全速离心30min.4C.

弃去上清液。用200μL 70％EtOH(-20)洗涤一次。干燥小球，并在3,5μL DEPC H2O使之重新悬浮。

制备氨基烯丙基标记的aRNA[aa-aRNA]

将RNA聚合酶混合物放置到冰块上，由于储存于甘油中，因而-20℃不会结霜。振荡该10X反应缓冲液与四种核糖核苷溶液(ATP，CTP，GTP and UTP)，直至完全溶解。

当模板DNA和水在试管中时，加10x反应缓冲溶液。下面是为一个20μl的反应而准备的。

对每一个反应(20μl)：aa-UTP：UTP[Amino-allyl-UTP：UTP]之比为10∶1。

(5-(3-aminoallyl)-2′-oxyuridine 5′-triphosphate，Sigma A5660)。

ds-cDNA 3.0μl(总量～1μg)

水3.41μl(分子级或DEPC)

10x缓冲溶液2.0μl(室温)8.41μl

当加入下面试剂时务须使该混合物保持室温。

ATP，CTP，GTP 2μl每个都是75mM原液(Ambion)[皆7.5mM]

UTP 0.18μl的75mM UTP[0.7mM]

aa-UTP 3.41μl的40mM aa-UTP[6.8mM]

酶mix 10x 2μl

总计 20μl

充分混合，提取，并在37℃温育6小时。

用“RNeasy”(Qiagen)纯化aRNA 将350μl RLT缓冲溶液及3.5μl 2-巯基乙醇加入到aRNA样品(在一个1.5ml试管中)中。

1)混合，再加250μl 96％乙醇。

2)将此样品转移到一个Rneasy spin column中，在10k rpm速度下旋转15sec。

3)收集流出液并把它再次转移到spin column。以同样的速度旋转15sec。

4)加500μl RPE，在10k rpm.旋转15sec.(室温)。

5)重复第4步。

6)将该spin column转移到一个新的试管并在10k rpm.旋转2min以干燥此柱。

7)用50μl DEPC H₂O(65℃)在加热块中洗提aRNA 4min。

8)将此柱在最低的速度下旋转1分钟；再在10k rpm旋转1min。

9)重复第8步。

10)在260和280nm(1μl样品+59ml H2O)检测吸收。计算aRNA浓度

11)每5μg等量储存在-80℃。

片段化aa-aRNA.

将4.5μl 50mMZnCl₂(使用前振荡)加入试管。用PCR仪在60℃温育30min。

实例十三本实施例为使用不同规格信号放大能力的高荷信号载体[HSC]进行标记提供方法。由于本发明所介绍的信号放大技术是依靠不同大小和种类的HSC可以携带不同量的信号分子进行信号放大的，尺寸越大的HSC可以携带的信号分子越多，在信号检测中可以发出越强的信号，其信号放大能力就越强。但是，随着HSC尺寸的增大，它们在被标记到基因芯片上之后所占据的空间就会越大。以下是由美国Molecular Probes公司提供的荧光高分子微球的尺寸和所携带的信号分子[荧光素当量]之间的关系^*。

荧光微球直径[微米] 每个荧光微球的荧光素当量

0.02 1.8×10²

0.04 3.5×10²

0.1 7.4×10³

0.2 1.1×10⁵

0.5 2.0×10⁶

1.0 1.3×10⁷

2.0 3.1×10⁷

10 1.1×10¹⁰

15 3.7×10¹⁰

^*注：本表摘自《Handbook of Fluorescent Probes and Research Products》第九版，第177页。by RichardP.Haugland。

根据这些数据可以计算出每种尺寸的荧光微球可以占据的基因芯片空间面积，并继而计算出通过使用该尺寸的荧光微球在基因芯片上的基因点的直径为200微米[所占据基因芯片面积为10⁴π微米²]时可以达到的理论灵敏度检测线性范围[见下表]。表中还附带了一些关于胶体半导体[CdSe]纳米晶量子点[QDs]的直径尺寸[一般在2-5纳米。此处取值4纳米。根据报道其信号强度是一般荧光信号分子，如荧光素强度的20倍]。借助于激光共聚焦基因芯片检测仪[根据Affymetrix公司的介绍，他们依靠此技术检测灵敏度下限为30万个分子。即只有在待测标本中有30万个DNA分子时，采可以检测得到]所能达到的灵敏度下限[可检测分子数]。

每个荧光微球荧光微球在基因芯片每个基因点上可以标记的最大荧光激光共聚焦基因芯片扫描

的荧光素当量上占据的面积[微米²] 微球数目[灵敏度线性检测上限] 仪可以达到的灵敏度下限

1.8×10² 1×10^-4π 1×10⁸ 1667

3.5×10² 4×10^-4π 2.5×10⁷ 857

7.4×10³ 25×10^-4π 4×10⁶ 40

1.1×10⁵ 1×10^-2π 1×10⁶ 3

2.0×10⁶ 0.0625π 1.6×10⁵ 0.15

1.3×10⁷ 0.25π 4×10⁴ -

3.1×10⁷ π 1×10⁴ -

1.1×10¹⁰ 25π 4×10² -

3.7×10¹⁰ 56.25π 1.7×10² -

QD的荧光素 QD在基因芯片上占每个基因点上可以标记的最大QD 激光共聚焦基因芯片扫描

当量据的面积[微米²] 数目[灵敏度线性检测上限] 仪可以达到的灵敏度下限

20 1.6×10^-5π 6.25×10⁸ 1.5×10⁴

从上表可以看出在灵敏度提高的同时，检测的线性范围数量级大致不变，而线性检测的上限开始下移。我们可以根据检测灵敏度与线性范围的需求，设计出不同信号放大倍数和线性范围的BALEIN试剂盒。

实例十四根据实例十三中例表中所示的不同规格荧光微球进行的标记，由于在灵敏度下限和上限之间存在着一定的矛盾。随着灵敏度提高，灵敏度的检测范围的上限会下降。

为了克服这个矛盾，本实施例采用不同信号放大能力的HSC联合使用的技术。即，采用不同尺寸[即不同信号放大能力]的同一种颜色或不同颜色的高分子荧光微球，或者较大尺寸的荧光高分子微球和QD的组合使用。选材时，尽量力求不同品种、规格或颜色的HSC的灵敏度上限和下限的衔接，以确保低信号放大能力的HSC的高的线性检测上限与高信号放大能力HSC的低的线性检测下线衔接起来，从而优势互补。比如，采用200纳米直径的高分子荧光微球[灵敏度线性检测范围为3～10⁶个分子]]与4纳米直径的半导体纳米晶QD[灵敏度线性检测范围为1.5×10⁴～6.25×10⁸个分子]联合使用，可以将实际测量的线性范围扩大到3～6.25×10⁸个分子。当然，也可以选择和20纳米直径的高分子荧光微球联合使用，从而将线性检测范围扩展到3～1×10⁸个分子。

不同粒径、不同发射光颜色[不同的荧光波长]和不同表面化学功能团修饰[用以连接不同的连接臂]的荧光高分子微球可直接购买[Molecular Probes，Merck，Bangs Laboratories公司.，Brookhaven仪器有限公司或Duke科学公司等]。

QD的表面化学修饰和共价偶联技术可以参照Bawendi等人的美国专利：US.Pat6,306,610，2001年10月23日。

HSC诸如不同发光波长和信号强度的量子点微球、高分子微球、量子点等都是非常好的选材。

Claims

1.一种基因芯片酶法微球信号放大标记技术，其特征是，将携带Y-功能团的媒介核苷[Intermediary Nucleotides]，以样品中待测基因序列为模板，在酶的作用下掺入到靶基因序列中，合成媒介靶基因[intermediary target sequences]，后者与被固定在基因芯片上的探针阵列杂交[若为缺口转移标记则待测基因与探针已经事先杂交好，过程实质是用媒介靶基因替换原先的未标记靶基因]，形成媒介靶基因与其互补探针的杂合双链，用表面修饰有Y’-功能团的高荷信号载体[HSC]与该杂合双链反应并与之结合，从而实现信号放大标记。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，是由基底及其表面的镀层或涂层和固定在基底[缩写为S]或镀层[缩写为C]表面的不少于两个阵列式排列的捕获探针组成，用于检测样品中的基因靶基因，

基底和/或镀层或涂层的材料可以由但不限于如下材料中任意一种或一种以上不同材料组合制成：

(1)无机物片状材料类如玻璃、石英、云母，透明导电材料如透明导电氧化物类[TCO]，如氧化铟锡[indium tin oxide，ITO，或写为In₂O₃:Sn]、SnO₂:F、砷化镓[GaAs]、氧化镁等镀层，氧化锡[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，CdIn₂O₄，Cd₂SnO₄，Zn₂SnO₄和In₂O₃-ZnO等，以及碳/陶复合导电陶瓷，各种半导体材料等，

(2)单质类：铂、金、银、铝、铬[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金属以及硅非金属等，

(4)高分子类：尼龙膜、醋酸纤维素膜、各种塑料、橡胶、树脂，基底的结构可以是但不限于如下种类：

(1)薄片式：如玻璃片、硅片、尼龙膜、塑料片、微孔板，微滴板式等，

(2)电极式：在薄片式基因芯片上以一定规律排列而成的各种电极阵列，如在半导体、绝缘体等基底上制成的铂电极、金电极等，

(3)微管式：由毛细管或有毛细管管状内腔结构特点的其它材料，按预先设定的位置对应规则排列而成的各种矩阵式毛细管基因芯片[二维平面排列]、线形毛细管基因芯片[一维线形排列]、以及在基片式结构中制作出的各种不少于一个微管道式空腔结构的矩阵式并行排列[即微流体电泳芯片等]，

(4)微粒式：以微小颗粒为固相载体，生物分子或化学分子被固定在其表面，通过微小颗粒的大小、[发光]颜色、表面电势、表面电荷密度等性质元素进行分类组合从而产生出大量不同组合的微粒，分别用某一特定组参数的组合[某一尺寸和某发光波长等的特殊组合---编码]的微小颗粒作为某生物或化学分子的载体，从而可以用大量不同且特殊编码微小颗粒制成基因芯片，

3.根据权利要求1所述的探针、模板或靶基因可以是，但不限于如下种类之一或不同种类的组合：

(1)核糖核酸[RNA]，各种核糖核酸[″ribonucleic acid′and″RNA″]，包括信使RNA[简称mRNA]、转录RNA[简称tRNA]、反义核糖核酸[aRNA]、互补RNA[cRNA]等，

(2)脱氧核糖核酸[DNA]如DNA，互补DNA[cDNA]等，

(5)脱氧核糖核酸、核糖核酸及其结构相似物的互补双链、三[重]链、四[重]链等形式的杂交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等，

基因芯片的检测原理可以是，但不限于如下种类之一或不同原理的结合：

(1)通过对固相表面定位在不同位置的探针-靶特异性杂交反应进行光学信号[如荧光分子、化学发光等]标记，然后经激发产生荧光、化学或生物发光并进行检测，

(2)通过对标记的或未标记的探针或靶在施加了电压的液相中的移动速度或迁移率进行检测，即电泳技术或由电泳技术与其他技术结合而产生的其他技术，如毛细管电泳[capillary electrophoresis，CE]、毛细管区带电泳[capillary zone electrophoresis，CZE]、毛细管凝胶电泳[CGE]、高效毛细管电泳[HPCE]、毛细管等电聚焦[capillaryisoelectric focusing(CIEF)]、等速电泳[isotachophoresis(ITP)]、动电色谱[electrokinetic chromatography(EKC)]、胶束动电毛细管色谱[micellarelectrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛细管电色谱法[capillary electrochromatography(CEC)]、非水相毛细管电泳[non-aqueous capillary electrophoresis(NACE)]等，

(3)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们的标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析，如亲和层析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gelpermeation chromatography]，MCC[metal chelate chromatography]等，

(4)利用具有氧化还原性质的分子或分子的部分结构[即化学基团或功能团]、金属络合物或(核酸)嵌入剂与被定位并固定在固相表面不同位置或电极上的探针、靶或探针-靶络合物结合并在外加适当方式或适当大小的电压(或电势差)作用(直流电压或交变电流或脉冲电场或电压)下，发生氧化还原反应，致使从还原性分子或基团(电子授体，electron donor)的电子转移到氧化性分子或基团(电子受体，electronacceptor)，形成电子流，通过电极传送到检测系统进行测量，所测得的电流强度大小与杂交并被标记的双链核酸的量成正比，

(5)利用双链核酸和单链核酸的导电性能差异，或利用由序列完全互补配对的核酸杂交所形成的双链核酸分子与有错配碱基对(Mismatches)存在的双链核酸(nucleic acidsduplexes)分子之间在导电性能差异，通过对经由核酸分子传导的电子流大小的测量而对核酸分子由此所反映的其他方面所进行的各种鉴别、检测和考察，如在基因突变、基因多态性、基因测序、基因表达谱研究、疾病机理分析和疾病诊断等方面的应用，

(7)直接或间接以具有氧化还原性物质(如二茂铁基)对探针或靶分子标记物，通过标记后可以使标记物接近电极表面而发生电子转移反应从而实现对发生在电极表面的生物或化学反应的检测。

4.根据权利要求1所述的基因芯片酶法微球信号放大技术，其样品制备、杂交、标记反应模式可以是，但不限于如下通式所描述的情景之一或不同情景之组合，

酶法标记反应可以用如下通式表示，

a)核酸模板(XNA，可以是各种单链或双链的DNA和RNA)在酶(Enz)的作用下，利用Y-功能团修饰了的媒介核苷(与未经修饰的核苷混合在一起)，在杂交前或杂交后，合成媒介靶基因ZNA(Y)n[ZNA可以是DNA或RNA片段]，

XNA+nY-dNTP/NTP+Enz→ZNA(Y)n [I]

b)若a)过程为杂交前标记，则媒介靶基因ZNA(Y)n与基因芯片上的核酸探针杂交，

若过程a)发生在杂交过程之后，则其通式为，

c)表面修饰有可与Y-功能团特异性反应的生物或化学基团Y’-的高荷信号载体与基因芯片上的XNA:ZNA(Y)n进行化学共价键或非共价键偶联，

上述n，m，p为从0到无穷大的任一自然数数值1，2，3...

上述通式中所说的酶[Enzymes]可以是，但不限于，

a)DNA聚合酶，如Taq酶，大肠埃希菌或大肠杆菌DNA聚合酶I，

b)RNA聚合酶，如SP6，T7和T3噬菌体RNA聚合酶[phage RNApolymerases]，可用于体外转录[in vitro transcription]法标记，Superscript II RT，

c)逆转录酶，包括但不限于Superscript II RT(LifeTechnologies；Cat#18064-014)、禽白血病毒(Avian Myoblastosis Virus，AMV)逆转录酶和小鼠反转录病毒(MMLV)逆转录酶，或者StrataScript逆转录酶(StrataGene公司，Cat#600085)、PowerScript逆转录酶(CloneTech公司，Cat#8460-2)]，可用于逆转录过程中掺入媒介核苷，如Taq酶，

d)缺口转移、切口平移法或缺口翻译法[Nick Translation]标记中使用的大肠埃希菌或大肠肝菌[E.coli]DNA聚合酶I和(胰腺)DNase I，Klenow片段，

e)连接酶，如T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶，

f)限制性内切酶，如I型、II型限制性内切酶，

g)核酸酶，如核酸酶S1，DNase，RNase，RNaseA，RNase H，

h)末端转移酶，末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal DeoxyribonucleotidylTransferase，缩写为TdT)，

i)碱性磷酸酶，细菌碱性磷酸酶(BAP)和牛小肠磷酸酶(CIP)，

j)T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)，简称为T4激酶，

Y-功能团修饰的媒介核苷[intermediary nucleotides]可以是，但不限于，

1.基烯丙基-核苷，如氨基烯丙基-dUTP[aa-dUTP]，

3.地高辛修饰的核苷，如DIG-11-UTP，

这些修饰核苷的特点是，可以在核酸合成、转录或逆转录过程中，能够在酶的作用下，被掺入到合成后的靶基因序列中。

5.根据权利要求1和权利要求4所述的Y-和Y’-可以分别是，但不限于如下表所示的反应对之一或它们的组合： Y-或Y’- Y-NTP或Y-dNTP实例 Y’-或Y- Phenyldiboronic acid，PDBA地高辛，DIG氨基，如氨基烯丙基-，aa-生物素基-， PDBA-UTPDIG-11-UTPaa-dUTP，aa-UTP[Ambion，(Cat.#8437]Biotin-UTP，biotin-dCTP，biotin-dUTP SHA抗地高辛N-羟基琥珀酰亚胺基-，亲和素-，链霉亲和素-

6.根据权利要求1中所述的高荷信号载体[HSC]可以是，但不限于，以各种微小颗粒形式存在的高载荷光学、磁性、电子学或电化学信号载体，它可以是高聚物或共聚物荧光微球、表面修饰有荧光染料的硅氧磁珠[silica beads]、半导体纳米晶量子点[quantum dots，QDs]、高分子微球与量子点相结合的产物量子点微球[QD-tagged nanobeads ormicrospheres]、蛋白质包裹的半导体纳米颗粒或微颗粒或量子点[如Chaperonin mediatedsemiconductor nanoparticles]、树枝状高分子或树形分子[dendrimers]、星形树枝状高分子[dendrimeric stars]、胶束[micelles]、分子磁体[molecular magnets]、胶囊式微球[encapsulated spheres]、胶体纳米金[colloidal gold nanoparticles]、电致发光分子[electroluminescent molecules]、二茂金属基共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如二茂铁基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂锆[polyzirconocene，PZC]、多聚二茂金属基修饰或接枝的树枝状高分子[包括但不限于，聚二茂铁基接枝的树枝状高分子(polyferrocenyl-brancheddendrimers)]、二茂金属基或多聚二茂金属基修饰或接枝的纳米金胶体[包括但不限于，胺基二茂铁基功能化的纳米金胶体(Gold colloids functionalized with amidoferrocenylstructures)等]、共聚物微球或纳米球、含有富勒烯结构的或以富勒烯为单体之一的高聚物或共聚物、其它含荧光染料或化学发光[chemiluminescence]、生物发光[bioluminescence]材料的载体，藻胆蛋白类[phycobiliproteins]及其各种衍生物或生物或化学修饰物，以及上述每一种载体中不同参数[如大小、光学发射光波长、电磁学性质、表面生物或化学功能团修饰等物理或化学性质]载体的组合，或各种不同载体之间的相互组合。

7.根据权利要求4所述的酶法标记反应，可以是，但不限于如下过程之一或不同过程之组合，