CN104388570B - 一种基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法 - Google Patents

一种基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备人血小板HPA‑1突变检测磁珠，将第一特异性探针用磁珠进行标记；2)压电传感器表面处理，为提高生物相容性在压电传感器表面传感区域溅射或蒸发5～20nm厚度的金或铂；铂和金表面先涂布生物相容性材料，再修饰核酸探针或抗体探针；3)将待测基因片段与磁珠标记的第一特异性探针和带有FITC标记的第二特异性探针充分杂交，然后采用压电传感器进行检测。

Description

一种基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法。
背景技术
基因序列中由于单个碱基改变造成的突变称为点突变或单基因突变，即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。血型相关抗原2/3(约200种)与SNP的研究相关，其中，血小板抗原泛指存在与血小板膜的能够刺激机体产生抗体、并与之结合的血小板膜蛋白质和糖分子。血小板抗原检测在输血安全、产前诊断及临床疾病治疗等方面具有重要意义。1959年第一个人类血小板特异性抗原(HPA)被鉴定，至今由人血清免疫抗体已确定的HPA共28个。其中12个抗原被归为6个双等位基因系统(HPA-1,-2,-3,-4,-5,-15)。HPA主要分布于血小板膜糖蛋白复合物GPIIb/IIIa、GPIa/IIa、GPIb/IX/V及CD109上。HPA由常染色体双等位共显性基因构成，除HPA-14bw抗原是由于1901-1911位置上AAG 3个碱基缺失产生外，其他抗原均由于单核苷酸取代而产生，即单核苷酸多态性。因HPA抗体反应所致疾病主要有：胎母同种异体免疫血小板减少症、血小板输注无效症、输血后紫癜、被动同种异体免疫血小板减少症、移植相关同种异体免疫血小板减少症等。在白种人群中，78％以上的新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜(NAIPT)是由HPA-1a引起，而对我国HPA基因频率分析结果显示黄种人HPA-1a频率明显高于白种人群，因此，HPA血型分析具有重要的临床意义。
但由于检测技术及检测成本的限制，加之血小板供体少而需求量大，国内很多医疗机构尚未具备在输注血小板前进行HPA筛查的条件，一定几率上造成血小板输注无效，血小板减少，输血后紫癜甚至死亡等。血小板HPA抗原多态性是由单一氨基酸变化所致，该变化源自编码基因的一个核苷酸的置换，这为血小板抗原的基因检测创造了良好的基础条件。但由于缺乏血小板标准品，研制出的血小板单克隆抗体有限，只能应用来源极为有限的人血清免疫抗体试剂，同时基因检测可应用的血小板标本量很少，检测前几乎都需要先进行PCR扩增。
目前常规与PCR联用的SNP基因检测方法包括：限制片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)，序列特异性引物-PCR(sequence-specificprimer PCR,PCR-SSP)，单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)以及PCR特异性序列寡核苷酸探针法(sequence-specific oligonucleotide probe,SSOP)方法等。但PCR-RFLP需要繁杂酶切过程，使用范围受到一定限制；PCR-SSP需要设计大量引物，增加了结果判型的复杂度；PCR-SSCP较适合于大量样本的基因型检测，对于小样本的检测费时费力；PCR-SSOP需要大量探针设计困难，需要投入人力物力摸索实验最佳条件，而这些分型方法存在分型错误和实验室间可重复性差等问题。等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)可以在几十分钟内快速扩增DNA和RNA，但仍需要设计4种引物，如果操作不当扩增时也会产生假阳性信号。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法，包括以下步骤：
1)制备人血小板HPA-1突变检测磁珠，将第一特异性探针用磁珠进行标记，所述第一特异性探针为5’to 3’CAGATTCTCCTTCAGGTCACAGCGA(3’修饰NH2C6)；
2)压电传感器表面处理，为提高生物相容性在压电传感器表面传感区域溅射或蒸发5～20nm厚度的金或铂；铂和金表面先涂布生物相容性材料，再修饰核酸探针或抗体探针；
3)将待测基因片段与磁珠标记的第一特异性探针和带有FITC标记的第二特异性探针充分杂交，然后采用压电传感器进行检测，所述第二特异性探针为5’to 3’GAGCTGTCTCCAGAGCCCTTGTCGC(5’修饰FITC C6)。
进一步，制备人血小板HPA-1突变检测磁珠：取1mg直径为1.1μm表面带有-COOH的超顺磁性磁珠，用THST缓冲液清洗3-4次后重悬，新鲜配置0.02mol/L EDC水溶液和0.1mol/L NHS水溶液，将EDC水溶液和NHS水溶液按体积比1:1配制成混合溶液，磁珠表面羧基经NHS与EDC活化后与第一特异性探针的3’端NH2结合，将500pM第一特异性探针和300μL THS缓冲液充分混合颠倒37℃混合，然后加入1％BSA封闭30min，THST缓冲液冲洗后在50μL THST缓冲液中重悬。
进一步，压电传感器表面处理：将压电传感器芯片用5mmol/L的MUA的乙醇溶液处理至少12h，使用无水乙醇冲洗10min，新鲜配置0.02mol/L EDC水溶液和0.1mol/LNHS水溶液，将EDC水溶液和NHS水溶液按体积比1:1配制成混合溶液，将压电传感器芯片置于该混合溶液30min，将MUA末端羧基进行活化，加入100μg/mL的FITC标记的兔抗羊多抗，4℃过夜孵育，使用前，使用1％牛血清白蛋白溶液封闭多余结合位点，THST缓冲液冲洗备用。
进一步，压电传感器进行检测过程为：进样前，在薄膜上施加强磁场，控制待测样品与磁珠结合的混合物以200μL/min的流速流入反应腔，30s后撤去磁场，并以800μL/min低速冲洗持续1min将多余的磁珠和其他成分洗脱，在磁场的作用下，磁珠复合体末端FITC分子可以快速地与薄膜表面的FITC抗体结合，将磁珠复合体捕获，当撤去磁场用THST缓冲液冲洗时，非特异性分子及样品中其他分子被洗脱，只有形成带有FITC的磁珠复合体才留在压电薄膜上，获得稳定响应后，提高流速至1500μL/min冲洗，因出现突变的DNA与第一特异性探针之间(错配部位)的亲和常数和速率常数发生变化，结合力要弱于未突变的结合(完全匹配)，在变速洗脱时与磁珠脱离引起声波频率和相位的改变，此时响应信号为HPA-1a基因中突变为HPA-1b产生的信号。
进一步，压电传感器的再生方法是：检测完毕后，通入25mmol/L的磷酸溶液，使用饱和NaOH调整pH至6.5，以较大于1500μL/min的流速冲洗传感器表面3-5min即可。
进一步，THST缓冲液：50mM Tris-HCl[pH 7.4]、100mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、5mM CaCl2、0.05％Tween20。
进一步，THS缓冲液：50mM Tris-HCl[pH 7.4]、100mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、5mM CaCl2。
进一步，对于金表面，利用巯基与金的共价键结合，选用含HS-的分子将核酸探针或抗体探针固定于传感器表面。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)采用了磁珠标记的特异性探针增加核酸结合效率，同时增强核酸杂交的质量信号，提高检测的特异性；
2)使用了高性能压电薄膜传感器测定核酸质量，通过传感器特异性修饰及载液流速控制实现可解离式核酸检测，提高芯片使用寿命。
3)传感器检测过程只需一次进样，操作简单、快速，对操作人员要求低。传感芯片易于集成化加工，降低成本。提高了传感器的灵敏度，无需PCR扩增，缩短检测时间。
附图说明
图1为磁珠复合体示意图；
图2为压电传感器进行检测流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
1、人血小板HPA-1突变检测磁珠制备方法：
人血小板抗原-1(human platelet antigen-1，HPA-1)的对偶抗原HPA-1a和HPA-1b由一对等位基因控制，这对基因来自GPⅢa基因C12，HPA-1a与HPA-1b基因仅仅相差于第176碱基发生单碱基突变(T→C)，第33个氨基酸由亮氨酸(Leu)突变成脯氨酸(Pro)。
HPA-1a序列：5’to 3’CCTGCCTCTGGGCTCA；
HPA-1b序列：5’to 3’CCTGCCTCCGGGCTCA；
第一特异性探针：5’to 3’CAGATTCTCCTTCAGGTCACAGCGA(3’修饰NH2C6)；
第二特异性探针：5’to 3’GAGCTGTCTCCAGAGCCCTTGTCGC(5’修饰FITC C6)；
冲洗缓冲液(THST：50mM Tris-HCl[pH 7.4],100mM NaCl,5mM KCl,1mM MgCl2,5mM CaCl2,0.05％Tween20)；结合缓冲液(THS：50mM Tris-HCl[pH 7.4],100mM NaCl,5mMKCl,1mM MgCl2,5mM CaCl2)。
取1mg直径为1.1μm的超顺磁性磁珠(表面带有-COOH)10mg/mL，约为7×108个/mL。用THST缓冲液清洗3-4次后重悬。新鲜配置0.02mol/L1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide(EDC)水溶液和0.1mol/L N-hydroxysuccinimide(NHS)水溶液，使用时将两种溶液按1:1配制成混合溶液。磁珠表面羧基经NHS与EDC活化后与第一特异性探针的3‘端NH2。将500pM第一特异性探针和300μL THS溶液充分混合颠倒37℃混合，然后加入1％BSA封闭30min。THST冲洗后在50μL THST缓冲液中重悬，并稀释到适当的浓度。
2、压电传感器表面制备方法
为提高压电传感器表面生物相容性，首先在压电传感器表面传感区域溅射或蒸发5～20nm厚度的金或铂材料。铂和金表面均可以先涂布明胶，或壳聚糖，或亲和素，或碳纳米管等生物相容性材料，再修饰核酸探针或其他生物分子。对于金表面，可利用巯基与金的共价键结合，选用含HS-的分子将核酸探针或抗体探针固定于传感器表面。
优选的，使用5mmol/L的11-Mercaptoundecanoic acid(MUA)的乙醇溶液处理至少12h。使用无水乙醇冲洗10min，以去除未结合的MUA分子。新鲜配置0.02mol/L 1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide(EDC)水溶液和0.1mol/L N-hydroxysuccinimide(NHS)水溶液，使用时将两种溶液按1:1配制成混合溶液。将压电传感器芯片置于该混合溶液30min，将MUA末端羧基进行活化。加入100μg/mL的Fluoresceinisothiocyanate isomer(FITC)兔抗羊多抗，4℃过夜孵育。使用前，使用1％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭多余结合位点，THST缓冲液冲洗备用。
3、可再生式HPA-1单基因突变检测
将红细胞裂解液加入提取的抗凝外周血中，离心后收集细胞沉淀物，加入DNA缓冲液，蛋白水解酶K及SDS等孵育后离心取上清。加入99.5％乙醇沉淀DNA，迅速用超纯水溶解待用。使用前95℃变性5min后迅速降温解链。将第一特异性探针、第二特异性探针和待测基因样本片段，37℃在THS缓冲液中振荡孵育，是探针与待测基因片段充分杂交。只有当两段探针均与样品杂交才能形成既有磁珠又带有荧光标记的磁珠-DNA复合体即如图1所示的磁珠复合体。
将孵育完毕的探针及样品混合物加入传感芯片，检测过程示意图如图2示。进样前，在薄膜上施加强磁场，控制待测样品与磁珠结合的混合物以200μL/min的流速流入反应腔，30s后撤销磁场，并以低流速800μL/min(低速冲洗)持续1min将多余的磁珠和其他成分洗脱。在磁场的作用下，磁珠复合体末端FITC分子可以快速地与薄膜表面的FITC抗体结合，将磁珠复合体捕获。当撤去磁场用THST冲洗时，非特异性分子及样品中其他分子被洗脱，只有形成三明治结构的末端带有FITC分子的磁珠复合体才留在压电薄膜上。获得稳定响应后，再逐渐提高流速至1500μL/min(高速冲洗)冲洗，因出现突变的DNA与探针之间(错配部位)的亲和常数和速率常数发生变化，结合力要弱于未突变的结合(完全匹配)，在变速洗脱时与磁珠脱离引起声波频率和相位的改变，此时响应信号为HPA-1a基因中突变为HPA-1b产生的信号
检测完毕时，通入25mmol/L的磷酸溶液(使用饱和NaOH调整pH至6.5)，以较高流速(大于1500μL/min)冲洗传感器表面3到5min，在此条件下，FITC抗原与其抗体之间的结合力被削弱，与薄膜结合的磁珠-FITC复合物会被洗脱，达到传感器再生的目的。再生后的传感器可进行下一组样品的检测。

Claims (6)

1.一种用于非疾病诊断目的的基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备人血小板HPA-1突变检测磁珠，将第一特异性探针用磁珠进行标记，所述第一特异性探针为5’-3’CAGATTCTCCTTCAGGTCACAGCGA，其中，3’修饰NH2C6；
2)压电传感器表面处理，为提高生物相容性在压电传感器表面传感区域溅射或蒸发5～20nm厚度的金或铂；铂和金表面先涂布生物相容性材料，再修饰核酸探针或抗体探针；
3)将待测基因片段与磁珠标记的第一特异性探针和带有FITC标记的第二特异性探针充分杂交，然后采用压电传感器进行检测，所述第二特异性探针为5’-3’GAGCTGTCTCCAGAGCCCTTGTCGC，其中，5’修饰FITC C6；
压电传感器表面处理：将压电传感器芯片用5mmol/L的MUA的乙醇溶液处理至少12h，使用无水乙醇冲洗10min，新鲜配置0.02mol/L EDC水溶液和0.1mol/L NHS水溶液，将EDC水溶液和NHS水溶液按体积比1:1配制成混合溶液，将压电传感器芯片置于该混合溶液30min，将MUA末端羧基进行活化，加入100μg/mL的FITC标记的兔抗羊多抗，4℃过夜孵育，使用前，使用1％牛血清白蛋白溶液封闭多余结合位点，THST缓冲液冲洗备用；
压电传感器进行检测过程为：进样前，在薄膜上施加强磁场，控制待测样品与磁珠结合的混合物以200μL/min的流速流入反应腔，30s后撤去磁场，并以800μL/min低速冲洗持续1min将多余的磁珠和其他成分洗脱，在磁场的作用下，磁珠复合体末端FITC分子可以快速地与薄膜表面的FITC抗体结合，将磁珠复合体捕获，当撤去磁场用THST缓冲液冲洗时，非特异性分子及样品中其他分子被洗脱，只有形成带有FITC的磁珠复合体才留在压电薄膜上，获得稳定响应后，提高流速至1500μL/min冲洗，因出现突变的DNA与第一特异性探针之间的亲和常数和速率常数发生变化，结合力要弱于未突变的结合，在变速洗脱时与磁珠脱离引起声波频率和相位的改变，此时响应信号为HPA-1a基因中突变为HPA-1b产生的信号；
检测完毕后，通入25mmol/L的磷酸溶液，使用饱和NaOH调整pH至6.5，以大于1500μL/min的流速冲洗传感器表面3到5min即可。
2.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法，其特征在于，制备人血小板HPA-1突变检测磁珠：取1mg直径为1.1μm表面带有-COOH的超顺磁性磁珠，用THST缓冲液清洗3-4次后重悬，新鲜配置0.02mol/L EDC水溶液和0.1mol/L NHS水溶液，将EDC水溶液和NHS水溶液按体积比1:1配制成混合溶液，磁珠表面羧基经NHS与EDC活化后与第一特异性探针的3’端NH2结合，将500pM第一特异性探针和300μLTHS缓冲液充分混合颠倒37℃混合，然后加入1％BSA封闭30min，THST缓冲液冲洗后在50μLTHST缓冲液中重悬。
3.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法，其特征在于，THST缓冲液：pH为7.4的50mMTris-HCl、100mM NaCl、5mM KCl、1mMMgCl2、5mM CaCl2、0.05％Tween20。
4.根据权利要求2所述的用于非疾病诊断目的的基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法，其特征在于，THS缓冲液：pH为7.4的50mMTris-HCl、100mM NaCl、5mM KCl、1mMMgCl2、5mM CaCl2。
5.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法，其特征在于，对于金表面，利用巯基与金的共价键结合，选用含HS-的分子将核酸探针或抗体探针固定于传感器表面。
6.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于压电薄膜技术的核酸单基因突变检测方法，其特征在于，所述生物相容性材料为明胶，或壳聚糖，或亲和素，或碳纳米管。
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