CN103290129A - 一种用于人血小板同种抗原基因的检测方法 - Google Patents

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尹焕才
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Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
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Abstract

本发明公开了一种用于人血小板同种抗原基因的检测方法，包括步骤为：对用第一标记物标记的引物进行聚合酶链式反应得到扩增产物；取出部分所述扩增产物，加入缓冲液，缓冲液中包括用第二标记物标记的载体和用第三标记物标记的探针，得到混合物；将混合物滴加到试纸条上，试纸条上包括能与所述第三标记物特异性结合的生物物质，得到检测结果。通过上述方式，本发明提供的一种用于人血小板同种抗原基因的检测方法，本检测方法采用PCR方法进行HPA基因扩增，并结合侧向流免疫层析技术，实现了HPA基因的快速分型，缩短了检测的时间，提高了检测的灵敏度，在HPA的快速分型中具有重要的临床意义与价值。

Description

一种用于人血小板同种抗原基因的检测方法
技术领域
本发明涉及血小板检测领域，特别是涉及一种用于人血小板同种抗原基因的检测方法。
背景技术
血小板是1882年由意大利医师 Bizzozero 发现并首次命名的，其在血液止血机制中有重要作用。近年来随着临床上成分输血的推广和应用，输血治疗中血小板用量比例逐年上升，已广泛应用于原发性及继发性血小板数量减少或血小板功能缺陷所致的出血性疾病，具有恢复和维持人体正常的止血和凝血功能，并成为治疗各种血液病、肿瘤患者大剂量化疗或放疗后、骨髓移植后等不可缺少的治疗方法之一，可以降低或减少患者的严重并发症及死亡率。
血小板因其表面抗原的不同，也存在血型系统，进行血小板输血时需要考虑血型相容性。随机血小板输血至少有70%为无效输血，而采用交叉配型相容性血小板有效率为92%。未考虑血小板交叉配型在耽误病人治疗的同时也会引起免疫病理性反应，浪费了极为宝贵的医疗资源，增加了病人的经济负担。因此，临床上要求血小板输血安全、有效且科学。
临床输用血小板之前应该严格地进行三大项血型相容性实验，如交叉配血实验、抗原检测（血型定型）和抗体检测（筛检），此三项检测是临床血小板输血前最基本的相容性实验。血型相容性实验目的是保障输血安全，血小板血型不相容性输血的必然结局就是病人可能不是死于原发疾病，而是死于输血免疫反应。
抗原检测包含两个方面，其一为HLA-I抗原交叉反应型检测，另一检测为HPA基因定型检测。对于HPA检测而言，临床一直沿用传统的血清学方法进行HPA分型。至今世界各国都没有研制成功系列的HPA特异性单克隆抗体，同时取自病人的HPA单价特异性人血清也非常缺少，因此缺少HPA血清学定型的抗体试剂。同时往往血小板标本的血小板数目很少，也造成血清学定型的困难。
随着对HPA基因的深入研究，发现该基因具有单核苷酸多态性。不同HPA型间仅仅为一个核苷酸上的差别，因此完全可以采用基因检测的方法进行HPA分型。近几年，发展的基于DNA的HPA定型技术较多。其中应用序列特异性引物的多聚核苷酸链反应即PCR-SSP更具有实用性，是当前应用最普遍和最为可靠的血小板基因定型方法。该方法依赖于PCR技术，使用特异性引物对待检测样本进行扩增，进而通过对扩增产物的电泳观察来确定HPA的基因分型。但应用PCR-SSP方法进行基因分型时，其后续扩增产物的鉴定需要通过核酸电泳观察扩增片段大小来完成。核酸电泳技术进行时，需要经历制胶、上样、电泳、紫外观察成像等一系列操作。技术本身耗时耗力，而且在成像的过程中需要使用EB等有毒染料才能配合完成。可对人体产生巨大伤害，对操作者健康构成巨大威胁。
侧向流免疫层析技术是指将液相层析技术，与免疫分析技术相结合而产生的免疫分析技术，作为一种性价比高、可用于现场诊断的可靠性方法，至诞生之日起便引起了极大的关注，特别适合床旁检测的优势使其近年来发展势头十分强劲。传统的胶体金类试纸条检测的目标物均为蛋白质和小分子抗原等，近几年随着技术的发展，拓展了其在基因检测方面的应用，具有简单、快速、使用方便的特点。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种用于人血小板同种抗原基因的检测方法，检测步骤简单且快速。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种用于人血小板同种抗原基因的检测方法，包括步骤为：
（1）对用第一标记物标记的引物进行聚合酶链式反应得到用第一标记物标记的扩增产物；
（2）取出部分所述扩增产物，加入缓冲液，所述缓冲液中包括用第二标记物标记的载体和用第三标记物标记的探针，得到混合物；
（3）将所述混合物滴加到试纸条上，所述试纸条上包括能与所述第三标记物特异性结合的生物物质，得到检测结果。
在本发明一个较佳实施例中，所述引物是针对特异性扩增序列设计的。
在本发明一个较佳实施例中，所述第一标记物为生物素、亲和素、适配体、普通生物蛋白、葡萄球菌A蛋白或生物抗原物质。
在本发明一个较佳实施例中，所述载体为荧光分子、量子点、胶体金、乳胶颗粒、彩色微球、碳纳米颗粒、荧光微球或磁性纳米颗粒。
在本发明一个较佳实施例中，所述第二标记物为与所述第一标记物特异性结合的物质。
在本发明一个较佳实施例中，所述探针的基因序列为与所述扩增引物的基因序列相互补的任意序列。
在本发明一个较佳实施例中，所述第三标记物为与第一标记物不同的其他生物分子。
在本发明一个较佳实施例中，所述第三标记物为异硫氰酸荧光素、葡萄球菌A蛋白、生物抗原物质或生物抗体物质。
在本发明一个较佳实施例中，所述生物物质能特异性识别第三标记物，所述生物物质为特异性单克隆抗体、适配体或生物抗原物质。
本发明的有益效果是：本发明的用于人血小板同种抗原基因的检测方法，本检测方法采用PCR方法进行HPA基因扩增，并结合侧向流免疫层析技术，实现了HPA基因的快速分型，缩短了检测的时间，提高了检测的灵敏度，在HPA的快速分型中具有重要的临床意义与价值。
附图说明
图1是本发明用于人血小板同种抗原基因的检测方法一较佳实施例的检测示意图；
附图中各部件的标记如下：1、亲和素标记的纳米荧光微球，2、带有生物素标记的扩增序列，3、带有异硫氰酸荧光素的探针，4、异硫氰酸荧光素特异性单克隆抗体，5、检测线，6、试纸条。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明提供一种用于人血小板同种抗原基因的检测方法，包括步骤为：
（1）将引物用生物素标记，所述引物是针对特异性扩增序列如HPA-1基因序列设计的，所述特异性引物可以是引物中的一条，也可以是两条同时标记；
（2）将用生物素标记的引物放入到聚合酶链式反应仪中，通过普通的聚合酶链式反应体系进行基因扩增，若含有目的基因，则扩增产物中将含有大量用生物素标记的扩增序列2； 
（3）取出部分所述扩增产物，加入上样缓冲液，所述缓冲液中含有用亲和素标记的免疫荧光微球1和用异硫氰酸荧光素标记的探针3，当所述引物末端用葡萄球菌A蛋白标记时，所述免疫荧光微球末端也可用葡萄球菌A蛋白抗体标记，所述探针可以为一小段核酸序列；
（4）在所述缓冲液中，所述免疫荧光微球上的亲和素与所述扩增产物上的生物素相结合，所述探针与所述扩增引物相结合，得到混合物；
（5）将所述混合物滴加到试纸条6上，所述试纸条上固定有与所述异硫氰酸荧光素特异性结合的生物物质即异硫氰酸荧光素抗体4，进行免疫层析，进而捕获探针，间接捕获扩增产物以及荧光微球，得到检测结果。
本发明揭示的用于人血小板同种抗原基因分型检测方法，采用PCR方法进行HPA基因扩增，并结合侧向流免疫层析技术，实现了HPA基因的快速分型，缩短了检测的时间，提高了检测的灵敏度，在HPA的快速分型中具有重要的临床意义与价值，其国内潜在市场达数亿人民币。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于人血小板同种抗原基因的检测方法，其特征在于，包括步骤为：
（1）对用第一标记物标记的引物进行聚合酶链式反应得到用第一标记物标记的扩增产物；
（2）取出部分所述扩增产物，加入缓冲液，所述缓冲液中包括用第二标记物标记的载体和用第三标记物标记的探针，得到混合物；
（3）将所述混合物滴加到试纸条上，所述试纸条上包括能与所述第三标记物特异性结合的生物物质，得到检测结果。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物是针对特异性扩增序列设计的。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第一标记物为生物素、亲和素、适配体、普通生物蛋白、葡萄球菌A蛋白或生物抗原物质。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述载体为荧光分子、量子点、胶体金、乳胶颗粒、彩色微球、碳纳米颗粒、荧光微球或磁性纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二标记物为与所述第一标记物特异性结合的物质。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述探针的基因序列为与所述扩增引物的基因序列相互补的任意序列。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第三标记物为与第一标记物不同的其他生物分子。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第三标记物为异硫氰酸荧光素、葡萄球菌A蛋白、生物抗原物质或生物抗体物质。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述生物物质能特异性识别第三标记物，所述生物物质为特异性单克隆抗体、适配体或生物抗原物质。
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