CN109680045A - 一种基于磁纳米球的可重置分子逻辑门的合成及应用 - Google Patents

一种基于磁纳米球的可重置分子逻辑门的合成及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学的光学分子逻辑门技术领域，涉及一种可重置、免酶和高灵敏的miRNA三元智能检测方法的建立。所述的分子逻辑门是基于磁性纳米球和相应的探针DNA构建而成的，以标记在DNA上的羧基荧光素(FAM)的荧光强度相对值作为判断依据，当相对荧光强度大于0.3时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.3时，输出为“0”。所述的分子逻辑门体系包含多个级联的OR逻辑门和INHIBIT逻辑门，它们可以来检验实际样品中三种不同的miRNA(miR‑21、miR‑155和miR Let‑7a)是否存在以及三者的存在组合。该逻辑检测体系结合了靶标催化发夹状DNA的组装技术，提高了多目标分析的灵敏度，对于肿瘤标志物的诊断有着潜在的应用价值。

Description

一种基于磁纳米球的可重置分子逻辑门的合成及应用
技术领域
本发明属于分析化学的光学分子逻辑门技术领域，涉及一种可重置、免酶和高灵敏度的miRNA三元智能检测方法的建立。
背景技术
微小核糖核酸(miRNA)是一类在真核生物中发现的内源性非编码RNA，它由20-25个核糖核苷酸组成。它可以通过与信使RNA(mRNA)的特定序列相结合来调控信使RNA靶分子的蛋白表达，参与细胞发育、分化、增殖以及消亡等关键生命活动。研究表明60％以上编码蛋白质基因受到miRNA的调控。miRNA的稳定调控是一切正常生理过程所必需的，而miRNA的异常表达与癌症的发生、转移和进展密切相关。近年来，有大量miRNA被证明在肿瘤中扮演着“癌基因”或者“抑癌基因”的角色。现有的生物学提取技术已经可以从血清，血浆等体液以及尿液中提取具有生物学稳定性的miRNA，这使得miRNA迅速地成为新的肿瘤诊断和治疗的标志物。因此，对于特定的miRNA的高灵敏检测在重大疾病的早期诊断中发挥着重要的作用。
而分子逻辑门是A.Prasanna de Silva教授于1993年首次提出的。这种通过引入分子改变发光系统的信号输出进而构建分子逻辑门的方法，在化学家和分子物理学家的推动下已经稳步发展。目前，分子逻辑器件已经在信息处理，生化分析，疾病诊断和生物成像方面得到了广泛的应用。目前，已经有研究工作利用INHIBIT和OR逻辑门来实现对目标分析物的多元化检测。这种逻辑传感器可以实现对同一样品中的不同目标物的多元检测，对于推动分子逻辑门在分析化学中的应用具有重要的意义。然而仅有的几个分子逻辑传感体系只能完成不超过2个目标物的检测，而且分子逻辑传感体系缺乏重置功能，无法在完成检测后重新进行下一轮的分析。本专利利用磁性纳米球和荧光团标记的单链DNA，构建出一个基于OR和INHIBIT的多重逻辑门，首次实现了对三种不同的miRNA(miR-21，miR-155和miRLet-7a)的多元智能化检测，并且实现分子逻辑传感平台的重置和重构功能，与传统的传感器相比，它同时能检测出三种分析物的存在并可以进行多次分析操作。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种基于磁性纳米球和荧光标记DNA的多重分子逻辑门以及该逻辑器件在miRNA多元智能化检测中的应用。该分子逻辑门由级联的INHIBIT和OR逻辑门构成。这个分子逻辑传感体系中还引入了靶标催化发夹状DNA组装的反应，极大地提高了该分子逻辑传感体系的检测灵敏度。这种OR和INHIBIT级联的多重逻辑门可以用来实现对生物样品中三种不同的miRNA(miR-21，miR-155和miR Let-7a)的智能化检测。而且这种传感体系可以DNA通过加热变性和外加磁场分离进行重置操作，是其可以进行多次miRNA分析。
本发明是这样实现的，一种用于智能检测三种不同的miRNA(miR-21，miR-155和miR Let-7a)的逻辑传感体系，具体包括以下步骤：
1.Fe3O4@SiO2纳米磁球的制备：
本发明用水热法合成200nm的Fe3O4纳米颗粒。将0.54gFeCl3·6H2O，1.5g丙烯酸钠，1.5g醋酸钠溶于20mL乙二醇中。然后将混合溶液置于聚四氟乙烯罐中并且在200℃加热10h。当聚四氟乙烯罐冷却到室温时，将黑色的产物用乙醇和水的混合溶液洗涤四次。把洗涤后的磁性Fe3O4加入到80mL的乙醇和20mL的水的混合液中进行超声分散。然后加入1mL的氨水和200μL的TEOS使其形成Fe3O4@SiO2结构。
2.Fe3O4@SiO2@Au的制备及其修饰：
将制得的Fe3O4@SiO2加入100μL APTES和2mL氨水，并在溶液中搅拌12h。然后将50mL的金纳米溶液(13nm)加入到氨基化的磁球中，由于Au-N作用，金纳米自组装到Fe3O4@SiO2上，这样200nm Fe3O4@SiO2@Au就制备完成了。
分子信标修饰的Fe3O4@SiO2@Au是利用Au-S键组装的。将巯基修饰的三种对应的分子信标(MB1，MB2和MB3)分别加入到Fe3O4@SiO2@Au中，机械搅拌16h。本发明把这种功能化的纳米粒子以及三种发夹结构DNA(H1，H2和H3)混合作为分子逻辑传感平台。
3.基于miR-21，miR-155和miR Let-7a的OR逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的miR-21，miR-155和miR Let-7a来构建OR逻辑门。当加入核酸序列(miR-21，miR-155和miR Let-7a)时，记输入为“1”，否则为“0”。根据相对荧光强度值是否大于0.3作为判断依据，当相对荧光强度大于0.3时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.3时，输出为“0”。miR-21，miR-155和miR Let-7a三种miRNA都可以引发靶标催化发夹状DNA组装反应，使得分子信标的荧光信号得到释放，输出荧光信号。因此可以在分子逻辑平台上构建一个OR逻辑门。当输入miR-21，miR-155或miR Let-7a中的任意一个值时，输出信号均为“1”。
4.基于miR-21和P1的INHIBIT逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的miR-21和P1来构建INHIBIT逻辑门。miR-21和P1可以发生完全互补杂交反应，阻止miR-21和分子逻辑平台发生靶标催化发夹状DNA组装的反应，使荧光信号无法释放。因此可以在分子逻辑平台上构建一个INHIBIT逻辑门。当输入P1时，无论体系中是否同时输入miR-21，输出信号均为“0”。只有体系中输入miR-21而不输入P1时，输出信号为“1”。
5.基于miR-155和P2的INHIBIT逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的miR-155和P2来构建INHIBIT逻辑门。miR-155和P2可以发生完全互补杂交反应，阻止miR-155和分子逻辑平台发生靶标催化发夹状DNA组装的反应，使荧光信号无法释放。因此可以在分子逻辑平台上构建一个INHIBIT逻辑门。当输入P2时，无论体系中是否同时输入miR-155，输出信号均为“0”。只有体系中输入miR-155而不输入P2时，输出信号为“1”。
6.基于miR Let-7a和P3的INHIBIT逻辑门的构建：以分子逻辑平台为基底，加入不同组合的miR Let-7a和P3来构建INHIBIT逻辑门。miR Let-7a和P3可以发生完全互补杂交反应，阻止miR Let-7a和分子逻辑平台发生靶标催化发夹状DNA组装的反应，使荧光信号无法释放。因此可以在分子逻辑平台上构建一个INHIBIT逻辑门。当输入P3时，无论体系中是否同时输入miR Let-7a，输出信号均为“0”。只有体系中输入miR Let-7a而不输入P3时，输出信号为“1”。
7.miRNA的三元检测：为了能够判断出样品中是否分别存在三种不同的miRNA以及它们的相互组合(miR-21，miR-155和miR Let-7a)，本发明将同一样品分为八份，首先，把八份相同样品分别加入MB1/MB2/MB3/H1/H2/H3分子逻辑平台，记为样品1，样品2，样品3，样品4，样品5，样品6，样品7，样品8。对于第一个样品，不再加入其它输入。对于第二个样品，加入2nM P1。对于第三个样品，加入2nM P2。对于第四个样品，加入2nM P3。对于第五个样品，加入2nM P1和2nM P2。对于第六个样品，加入2nM P1和2nM P3。对于第七个样品，加入2nM P2和2nM P3。对于第八个样品，加入2nM P1，2nM P2和2nM P3。根据样品1-8的相对荧光强度值输出“1”和“0”，用真值表判断样品中miR-21，miR-155和miR Let-7a是否存在。
8.在本发明中，我们可以利用热变性和磁场分离效应轻易地对逻辑元件进行重置。由于分子信标是固定在磁球上的，当我们把磁球从反应后的溶液中分离出来，然后在95℃中加热5min。在分子信标上杂交的互补DNA就可以被去除。然后我们将磁球重新溶于缓冲溶液中。当该逻辑元件被重置之后，该体系又可以重新进行三元逻辑检测。
附图说明
图1纳米磁球(Fe3O4@SiO2@Au)的TEM表征；
图2(A)三输入OR逻辑门构建示意图。(B)三输入OR逻辑门的荧光光谱图。(C)三输入OR逻辑门的相对荧光强度柱状图。(D)三输入OR逻辑门的真值表；
图3(A)基于可重置分子逻辑平台的双输入INHIBIT逻辑门(miR-21和P1)构建示意图。(B)该INHIBIT逻辑门(miR-21和P1)的荧光光谱图。(C)该INHIBIT逻辑门(miR-21和P1)的相对荧光强度柱状图。(D)INHIBIT逻辑门的真值表；
图4(A)基于可重置分子逻辑平台的双输入INHIBIT逻辑门(miR-155和P2)构建示意图。(B)该INHIBIT逻辑门(miR-155和P2)的荧光光谱图。(C)该INHIBIT逻辑门(miR-155和P2)的相对荧光强度柱状图。(D)INHIBIT逻辑门的真值表；
图5(A)基于可重置分子逻辑平台的双输入INHIBIT逻辑门(miRLet-7a和P3)构建示意图。(B)该INHIBIT逻辑门(Let-7a和P3)的荧光光谱图。(C)该INHIBIT逻辑门(Let-7a和P3)的相对荧光强度柱状图。(D)INHIBIT逻辑门的真值表；
图6(A)INHIBIT和OR级联逻辑门用于miR-21，miR-155和miRLet-7a的多元化检测(B)级联逻辑门的真值表。“\”代表这种情况可以忽略；
图7INHIBIT和OR级联逻辑门的的重置和循环操作。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
实施例1
基于磁纳米球和荧光标记DNA的OR逻辑门的构建：以修饰了分子信标的磁纳米球(MB1，MB2和MB3)和发夹DNA(H1，H2和H3)为分子逻辑传感平台，加入不同组合的miR-21，miR-155和miR Let-7a来构建OR逻辑门。当加入核酸序列(miR-21，miR-155和miR Let-7a)时，记输入为“1”，否则为“0”。根据相对荧光强度值是否大于0.3作为判断依据，当相对荧光强度大于0.3时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.3时，输出为“0”。当没有任何输入时，分子信标处于闭合的状态，整个计算体系的荧光也处于一个较低值，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。而miR-21，miR-155和miRLet-7a三种miRNA都可以引发靶标催化发夹状DNA组装反应，使得分子信标的荧光信号得到释放，被淬灭的荧光团离开了金纳米粒子，呈现出一个很强的荧光信号。相对荧光强度大于0.3，记为输出为“1”。因此，miR-21，miR-155和miRLet-7a三者任意一个都可以使计算体系的荧光强度得到增加。由此可见，miR-21，miR-155和miR Let-7a可以在分子逻辑平台上构建一个OR逻辑门。当平台输入miR-21，miR-155和miR Let-7a中的任意一个值时，输出信号均为“1”。
实施例2
基于miR-21和P1的INHIBIT逻辑门的构建：以修饰了分子信标的磁纳米球(MB1，MB2和MB3)和发夹DNA(H1，H2和H3)为分子逻辑传感平台，加入不同组合的miR-21和P1来构建INHIBIT逻辑门。当加入核酸序列(miR-21和P1)时，记输入为“1”，否则为“0”。根据相对荧光强度值是否大于0.3作为判断依据，当相对荧光强度大于0.3时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.3时，输出为“0”。当没有任何输入时，分子信标处于闭合的状态，整个计算体系的荧光也处于一个较低值，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。由于miR-21可以引发分子信标(MB1)和发夹探针(H1)的链置换反应，分子信标打开，被淬灭的荧光团离开了金纳米粒子，呈现出一个很强的荧光信号。相对荧光强度大于0.3，记为输出为“1”。而P1本身无法引发分子信标(MB1)和发夹探针(H1)的链置换反应，这样分子信标处于闭合状态，荧光信号不变，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。当miR-21和P1同时存在时，由于miR-21和P1是完全互补的，所以miR-21和P1会优先进行杂交，这样miR-21也无法引发分子信标(MB1)和发夹探针(H1)的链置换反应，分子信标处于闭合状态，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。由此可见，miR-21和P1可以在分子逻辑平台上构建一个INHIBIT逻辑门。
实施例3
基于miR-155和P2的INHIBIT逻辑门的构建：以修饰了分子信标的磁纳米球(MB1，MB2和MB3)和发夹DNA(H1，H2和H3)为分子逻辑传感平台，加入不同组合的miR-155和P2来构建INHIBIT逻辑门。当加入核酸序列(miR-155和P2)时，记输入为“1”，否则为“0”。根据相对荧光强度值是否大于0.3作为判断依据，当相对荧光强度大于0.3时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.3时，输出为“0”。当没有任何输入时，分子信标处于闭合的状态，整个计算体系的荧光也处于一个较低值，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。由于miR-155可以引发分子信标(MB2)和发夹探针(H2)的链置换反应，分子信标打开，被淬灭的荧光团离开了金纳米粒子，呈现出一个很强的荧光信号。相对荧光强度大于0.3，记为输出为“1”。而P2本身无法引发分子信标(MB2)和发夹探针(H2)的链置换反应，这样分子信标处于闭合状态，荧光信号不变，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。当miR-155和P2同时存在时，由于miR-155和P2是完全互补的，所以miR-155和P2会优先进行杂交，这样miR-155也无法引发分子信标(MB2)和发夹探针(H2)的链置换反应，分子信标处于闭合状态，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。由此可见，miR-155和P2可以在分子逻辑平台上构建一个INHIBIT逻辑门。
实施例4
基于miR Let-7a和P3的INHIBIT逻辑门的构建：以修饰了分子信标的磁纳米球(MB1，MB2和MB3)和发夹DNA(H1，H2和H3)为分子逻辑传感平台，加入不同组合的miR Let-7a和P3来构建INHIBIT逻辑门。当加入核酸序列(miR Let-7a和P3)时，记输入为“1”，否则为“0”。根据相对荧光强度值是否大于0.3作为判断依据，当相对荧光强度大于0.3时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.3时，输出为“0”。当没有任何输入时，分子信标处于闭合的状态，整个计算体系的荧光也处于一个较低值，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。由于miR Let-7a可以引发分子信标(MB3)和发夹探针(H3)的链置换反应，分子信标打开，被淬灭的荧光团离开了金纳米粒子，呈现出一个很强的荧光信号。相对荧光强度大于0.3，记为输出为“1”。而P3本身无法引发分子信标(MB3)和发夹探针(H3)的链置换反应，这样分子信标处于闭合状态，荧光信号不变，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。当miR Let-7a和P3同时存在时，由于miR Let-7a和P3是完全互补的，所以miR Let-7a和P3会优先进行杂交，这样miR Let-7a也无法引发分子信标(MB3)和发夹探针(H3)的链置换反应，分子信标处于闭合状态，相对荧光强度小于0.3，记为输出为“0”。由此可见，miR Let-7a和P3可以在分子逻辑平台上构建一个INHIBIT逻辑门。
将实施例中构建的三输入OR和INHIBIT逻辑门应用于同一样品中的miRNA的三元检测，其具体操作方法及结果如下应用实例：
应用实例1
为了能够判断出样品中是否分别存在三种不同的miRNA(miR-21，miR-155和miRLet-7a)，本发明通过INHIBIT-OR级联逻辑门输出的真值表来判断其miRNA的组成。首先，我们将同一样品(原样品)分为八份。然后，将把八份相同样品分别加入分别加入MB1/MB2/MB3/H1/H2/H3分子逻辑平台，记为样品1，样品2，样品3，样品4，样品5，样品6，样品7，样品8。对于第一个样品，不再加入其它输入。对于第二个样品，加入2nM P1。对于第三个样品，加入2nM P2。对于第四个样品，加入2nM P3。对于第五个样品，加入2nM P1和2nM P2。对于第六个样品，加入2nM P1和2nM P3。对于第七个样品，加入2nM P2和2nM P3。对于第八个样品，加入2nM P1，2nM P2和2nM P3。当第一个样品没有明显的荧光信号时，我们可以认为原样品中不存在miR-21，miR-155和miR Let-7a中的任意一个，测试结束。如果第一个样品产生了荧光信号时，说明原样品中至少含有miR-21，miR-155和miR Let-7a三者之一。这样我们对第二个样品进行荧光测试。如果第二个没有产生荧光信号时，说明原样品中含有miR-21，这是因为第二个样品和第一个样品相比多加入P1，使得原样品中的miR-21被抑制了，无法引发MB1和H1的链置换反应，因此分子信标无法打开，不能产生荧光信号。如果第二个仍然有荧光信号时，说明原样品中至少含有miR-155或者miR Let-7a其中之一。我们需要进一步测试原样品含有miR-155和miR Let-7a中的哪一个。这就需要对第三个样品进行荧光测试，如果第三个样品没有产生荧光信号时，说明原样品只含有miR-155。这是因为第三个样品比第一个样品多加入了P2，使得原样品中的miR-155被抑制了，无法引发MB2和H2的链置换反应，因此分子信标无法打开，不能产生荧光信号。如果第三个仍然有荧光信号时，我们则需要对第四个样品进行荧光测试。如果第四个样品没有荧光信号，说明原样品只含有miR Let-7a。这是因为第四个样品比第一个样品多加入了P3，使得原样品中的miR Let-7a被抑制了，无法引发MB3和H3的链置换反应，因此分子信标无法打开，不能产生荧光信号。如果第四个样品仍然有荧光信号，则说明单独的P1，P2和P3均不能阻止miRNA引发的发夹自组装反应，样品中存在着多种miRNA的组合。这样，我们对第五个样品进行测试，如果第五个样品没有荧光信号，说明原样品同时含有miR-21和miR-155两种miRNA。这样只有当同时加入P1和P2的时候，荧光信号才会被猝灭。同理，如果第五个样品存在荧光信号，说明原样品至少含有miR Let-7a。那我们对第六个样品进行测试，如果第六个样品荧光信号消失，说明原样品同时含有miR-21和miRLet-7a。如果第六个样品仍然有荧光信号，则需要对第七个样品进行测试。如果第七个样品荧光信号消失，说明原样品同时含有miR-155和miR Let-7a。如果第七个样品仍然有荧光信号，说明原样品同时含有miR-21，miR-155和miR Let-7a。这样只有当同时加入P1，P2和P3的时候，荧光信号才会被猝灭(见第八个样品)。具体的真值表见附图6B。这种结合了分子逻辑器件的智能检测方法为重大疾病的预先诊断和多目标分析提供了很好的解决思路。

Claims (3)

1.一种基于磁纳米球的可重置分子逻辑门的合成及应用，其特征在于，所述的分子逻辑门是基于修饰在磁性纳米球表面的分子信标与磁性纳米球表面的金纳米颗粒接触后发生荧光猝灭，用目标物(miRNA)引发链置换反应后分子信标打开，荧光恢复的原理构建而成的，以分子信标的荧光强度相对值作为判断依据，当相对荧光强度大于0.3时，输出为“1”，当相对荧光强度小于0.3时，输出为“0”。所述分子逻辑门包括三输入的OR逻辑门和INHIBIT逻辑门，以及二者串联而成的级联逻辑门并应用于miRNA的三元智能检测。
2.如权利要求1所述的OR逻辑门和INHIBIT逻辑门的构建方法以及逻辑检测应用，其特征如下：
(1)OR逻辑门：以分子信标功能化的磁性纳米粒子(Fe3O4@SiO2@Au)以及三种发夹结构DNA(H1，H2和H3)作为分子逻辑传感平台。按照图2所示以加入的核酸序列(miR-21，miR-155和miR Let-7a)为输入信号，以分子信标的相对荧光强度值作为输出信号构建三输入的OR逻辑门。
(2)基于miR-21和P1的INHIBIT逻辑门：以(1)中所用的磁性纳米粒子和三种发夹结构DNA(H1，H2和H3)作为分子逻辑传感平台，按照图3所示以加入的核酸序列(miR-21和P1)为输入信号，荧光强度作为输出信号构建INHIBIT逻辑门。
(3)基于miR-155和P2的INHIBIT逻辑门：以(1)中所用的磁性纳米粒子和三种发夹结构DNA(H1，H2和H3)作为分子逻辑传感平台，按照图4所示以加入的核酸序列(miR-155和P2)为输入信号，荧光强度作为输出信号构建INHIBIT逻辑门。
(4)基于miR Let-7a和P3的INHIBIT逻辑门：以(1)中所用的磁性纳米粒子和三种发夹结构DNA(H1，H2和H3)作为分子逻辑传感平台，按照图5所示以加入的核酸序列(miR Let-7a和P3)为输入信号，荧光强度作为输出信号构建INHIBIT逻辑门。
(5)miRNA的三元智能检测：利用INHIBIT-OR级联逻辑门判断出样品中是否分别存在三种不同的miRNA(miR-21，miR-155和miRLet-7a)，根据荧光检测结果输出“1”和“0”，用真值表判断样品中miR-21，miR-155和miR Let-7a是否存在。
(6)如权利要求1和2所述的逻辑门的构建中，所需的DNA序列如下：
miR-21:UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miR-155：UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU
miRNALet-7a：UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
MB1：FAM-TAGCTTATCAGACTGCCTACAGTAGATCAACATCAGTCTGATAAGCTA-SH
MB2：FAM-TTAATGCTAATCGTGCCTACAGTAGAACCCCTATCACGATTAGCATTAA-SH
MB3：FAM-TGAGGTAGTAGGTTGCCATGTGTAGAAACTATACAA CCTACTACCTCA-SH
H1：CCTACAGTAGATAGCTTATCAGACTGTAGTTGATCTACTGTAGGCAGTCTG
H2：CCTACAGTAGATTAATGCTAATCGTGATACGGCTTCTACTGTAGGCACGATT
H3：CCATGTGTAGATGAGGTAGTAGGTTGTAAAGATTCTACACATGGCAACCTA。
3.如权利要求1所述的基于磁性纳米球的分子逻辑器件可以实现对miRNA的多次逻辑检测功能。
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