CN101892314A - 用于检测人血小板同种抗原基因的引物组及试剂盒 - Google Patents

用于检测人血小板同种抗原基因的引物组及试剂盒 Download PDF

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CN101892314A CN 201010205552 CN201010205552A CN101892314A CN 101892314 A CN101892314 A CN 101892314A CN 201010205552 CN201010205552 CN 201010205552 CN 201010205552 A CN201010205552 A CN 201010205552A CN 101892314 A CN101892314 A CN 101892314A
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Abstract

本发明公开了一种用于检测人血小板同种抗原基因的引物组及试剂盒，用于检测人血小板同种抗原基因的引物组包括HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对和内参引物对，本发明的试剂盒的应用实现了对血小板基因分型，在临床和输血应用中对有效避免血小板特异性免疫的发生、选择输注HPA基因型相匹配的血液制品，具有重要的意义。

Description

用于检测人血小板同种抗原基因的引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测人血小板同种抗原基因的引物组及检测人血小板同种抗原基因的试剂盒。
背景技术
人类血小板表面具有复杂的血型抗原，血小板抗原根据其分布情况。可以分为两大类型。一类是与其他细胞或组织共有的抗原，如ABH、HLA-I类抗原等；另一类是血小板本身特有的同种抗原(HPA)，由血小板特有的抗原决定簇组成，HPA不匹配可引起血小板同种免疫反应，产生血小板同种抗体，一般由输血、妊娠或骨髓移植等免疫刺激而产生，导致同种免疫性血小板减少，诱发如输血后血小板减少性紫癜(PTP)、血小板输注无效(PTR)、被动性血小板减少症(PAIT)及新生儿同种免疫血小板减少性紫癜(NAITP)等疾病，同时在临床移植中还会引起移植排斥等相关疾病。因此，临床需要准确检测和鉴定HPA，对于研究血小板HPA同型输注；准确判定胎儿的HPA抗原，对新生儿进行筛查，以预防NAITP的发生；避免因HPA不合而产生移植排斥反应；有助于避免同种免疫造成的血小板输注无效发生，从而为血液的安全输注提供保障；有利于选择匹配型血小板输注，达到快速、有效的急救输血目的。
目前使用的HPA血清学分型方法存在两大弊端：一是有些抗血清很难获得；二是从新生儿同种免疫性血小板减少、输血后紫癜、血小板输注无效3种病人中较难获得大量的血小板用于血清检测。90年代以后，伴随分子生物学技术的迅速发展，使得可以从基因水平对HPA抗原系统进行研究和分型，从而克服了HPA血清学分型的弊端。HPA的分型方法重点转向分子生物学领域，主要是使用聚合酶链式反应(PCR)方法，包括PCR-RFLP[2]、PCR-ASO[3]、PCR-SSP[4]、PCR-SSCP[5]、PCR-PHFA[6]等。上述各方法的PCR扩增反应均相同，不同的是扩增产物的检测方法。PCR-RFLP的产物检测需用昂贵的限制性内切酶水解后电泳，再进行电泳片段的分析，结果的分析判断甚为复杂；PCR-ASO的产物检测需用不同的DNA标记探针杂交，再通过相应的方法(同位素或酶)，来显示杂交信号，非常繁琐而且耗时；PCR-SSCP和PCR-PHFA亦需用较复杂的方法进行产物的检测和分析。
而序列特异引物-聚合酶链式反应(PCR-SSP)检测技术灵敏度高、特异性强、检验周期短、操作简便。但是目前尚无应用此种方法实现对人血小板同种抗原HPA(1-17)基因的快速检测。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种用于检测人血小板同种抗原基因的引物组。
本发明的第二个目的是提供一种具有灵敏、特异、经济、简便、快速的特点的用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒。
一种用于检测人血小板同种抗原基因的引物组，包括HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对和内参引物对，所述HPA-6a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，所述HPA-6b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，所述HPA-15Gova引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列，所述HPA-15Govb引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.27、SEQ IDNO.28所示的核苷酸序列，所述内参引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70所示的核苷酸序列。
一种用于检测人血小板同种抗原基因的引物组，还包括HPA-1a引物对、HPA-1b引物对、HPA-2a引物对、HPA-2b引物对、HPA-3a引物对、HPA-3b引物对、HPA-4a引物对、HPA-4b引物对、HPA-5a引物对、HPA-5b引物对、HPA-7a引物对、HPA-7b引物对、HPA-8a引物对、HPA-8b引物对、HPA-9a引物对、HPA-9b引物对、HPA-10a引物对、HPA-10b引物对、HPA-11a引物对、HPA-11b引物对、HPA-12a引物对、HPA-12b引物对、HPA-13a引物对、HPA-13b引物对、HPA-14a引物对、HPA-14b引物对、HPA-16a引物对、HPA-16b引物对、HPA-17a引物对、HPA-17b引物对；
所述HPA-1a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述HPA-1b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述HPA-2a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述HPA-2b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
所述HPA-3a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
所述HPA-3b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
所述HPA-4a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；
所述HPA-4b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；
所述HPA-5a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；
所述HPA-5b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列；
所述HPA-7a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；
所述HPA-7b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；
所述HPA-8a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；
所述HPA-8b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；
所述HPA-9a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；
所述HPA-9b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；
所述HPA-10a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；
所述HPA-10b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；
所述HPA-11a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；
所述HPA-11b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；
所述HPA-12a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；
所述HPA-12b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；
所述HPA-13a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；
所述HPA-13b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；
所述HPA-14a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；
所述HPA-14b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列；
所述HPA-16a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列；
所述HPA-16b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64所示的核苷酸序列；
所述HPA-17a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66所示的核苷酸序列；
所述HPA-17b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68所示的核苷酸序列。
一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒，包括包被有HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对、内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer，所述HPA-6a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，所述HPA-6b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，所述HPA-15Gova引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列，所述HPA-15Govb引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列，所述内参引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70所示的核苷酸序列。
一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒，所述引物板上还包被有HPA-1a引物对、HPA-1b引物对、HPA-2a引物对、HPA-2b引物对、HPA-3a引物对、HPA-3b引物对、HPA-4a引物对、HPA-4b引物对、HPA-5a引物对、HPA-5b引物对、HPA-7a引物对、HPA-7b引物对、HPA-8a引物对、HPA-8b引物对、HPA-9a引物对、HPA-9b引物对、HPA-10a引物对、HPA-10b引物对、HPA-11a引物对、HPA-11b引物对、HPA-12a引物对、HPA-12b引物对、HPA-13a引物对、HPA-13b引物对、HPA-14a引物对、HPA-14b引物对、HPA-16a引物对、HPA-16b引物对、HPA-17a引物对、HPA-17b引物对；
所述HPA-1a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述HPA-1b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述HPA-2a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述HPA-2b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
所述HPA-3a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
所述HPA-3b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
所述HPA-4a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；
所述HPA-4b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；
所述HPA-5a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；
所述HPA-5b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列；
所述HPA-7a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；
所述HPA-7b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；
所述HPA-8a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；
所述HPA-8b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；
所述HPA-9a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；
所述HPA-9b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；
所述HPA-10a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；
所述HPA-10b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；
所述HPA-11a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；
所述HPA-11b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；
所述HPA-12a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；
所述HPA-12b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；
所述HPA-13a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；
所述HPA-13b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；
所述HPA-14a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；
所述HPA-14b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列；
所述HPA-16a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列；
所述HPA-16b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64所示的核苷酸序列；
所述HPA-17a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66所示的核苷酸序列；
所述HPA-17b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68所示的核苷酸序列。
本发明的试剂盒的应用实现了对血小板基因分型，在临床和输血应用中对有效避免血小板特异性免疫的发生、选择输注HPA基因型相匹配的血液制品，具有重要的意义。
附图说明
图1为检测HPA电泳结果胶图。
图2为HPA(1-17)特异引物孔位图。
图3为实验结果阴阳性判读图。
图4为检测HPA6、15电泳结果胶图。
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
依据美国国立生物技术信息中心基因库(NCBI Gene Bank)公开的HPA等位基因序列，设计出用于检测人血小板同种抗原基因的引物组，该引物组包括HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对和内参引物对。
实施例2
依据美国国立生物技术信息中心基因库(NCBI Gene Bank)公开的HPA等位基因序列，设计出用于检测人血小板同种抗原基因的引物组，该引物组包括HPA-1a引物对、HPA-1b引物对、HPA-2a引物对、HPA-2b引物对、HPA-3a引物对、HPA-3b引物对、HPA-4a引物对、HPA-4b引物对、HPA-5a引物对、HPA-5b引物对、HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对、HPA-7a引物对、HPA-7b引物对、HPA-8a引物对、HPA-8b引物对、HPA-9a引物对、HPA-9b引物对、HPA-10a引物对、HPA-10b引物对、HPA-11a引物对、HPA-11b引物对、HPA-12a引物对、HPA-12b引物对、HPA-13a引物对、HPA-13b引物对、HPA-14a引物对、HPA-14b引物对、HPA-16a引物对、HPA-16b引物对、HPA-17a引物对、HPA-17b引物对和内参引物对。
实施例3
一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒，包括包被有HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对、内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer，
用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒的制备方法是：
(1)依据HPA(1-17)特异引物孔位图(见图2)，分别将HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对、内参引物对包被至引物板的相应位置上，干燥处理；
(2)依据配方200mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL，100mM Tris-HCL，1％TritonX-100，制备出440μl浓缩dNTP-Buffer；
(3)将包被有引物对的引物板及浓缩dNTP-Buffer，组成一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒。
实施例4
一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒，包括引物板和浓缩dNTP-Buffer，制备方法是：
(1)依据HPA(1-17)特异引物孔位图(图2)，分别将HPA-1a引物对、HPA-1b引物对、HPA-2a引物对、HPA-2b引物对、HPA-3a引物对、HPA-3b引物对、HPA-4a引物对、HPA-4b引物对、HPA-5a引物对、HPA-5b引物对、HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对、HPA-7a引物对、HPA-7b引物对、HPA-8a引物对、HPA-8b引物对、HPA-9a引物对、HPA-9b引物对、HPA-10a引物对、HPA-10b引物对、HPA-11a引物对、HPA-11b引物对、HPA-12a引物对、HPA-12b引物对、HPA-13a引物对、HPA-13b引物对、HPA-14a引物对、HPA-14b引物对、HPA-16a引物对、HPA-16b引物对、HPA-17a引物对、HPA-17b引物对和内参引物对，包被至引物板的相应位置上，干燥处理；
(2)依据配方200mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL，100mM Tris-HCL，1％TritonX-100，制备出440μl浓缩dNTP-Buffer；
(3)将包被有引物对的引物板、每人份检测包括34孔特异性引物孔；浓缩dNTP-Buffer组成一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒。
实施例5
使用操作流程：
一、2.5％琼脂糖凝胶的准备：
1.将加入2.5g琼脂糖加入100ml 1×TBE溶液(Tris-硼酸盐-EDTA溶液)，加热直到形成均匀的凝胶溶液；再加入5μl EB(10mg/ml)，混合均匀；
2.将凝胶槽置于水平位置，向凝胶槽中加入适量凝胶溶液，插入电泳梳；前后水平移动凝胶槽，确保凝胶溶液覆盖均匀；
3.待凝胶完全凝固后，竖直拔出电泳梳；
二、PCR仪循环参数：
见表1
表1：扩增参数特征表
  1   96℃/2min   1 cycle
  2   96℃/20sec，70℃/60sec   5 cycles
  3   96℃/20sec，65℃/50sec，72℃/45sec   10 cycles
  4   96℃/20sec，62℃/50sec，72℃/45sec   22 cycles
  5   72℃/5min   1 cycle
  6   4℃保存
注：如果按此循环参数扩增有假阳性的浅带，可以做如下调整：
1.第4步循环参数调整为：96℃/20sec，62.5℃/50sec，72℃/45sec
2.或者降低Taq酶为3.0-3.2μl(5units/μl)
三、必须满足的测试条件：
1.从冷冻室取出Taq聚合酶，置于冰上备用；
2.根据实验所需数量，将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出，放置室温解冻，备用；
3.根据实验所需数量，将冷冻的DNA样本、浓缩dNTP-Buffer取出，彻底融化，混匀离心；
四、测试过程中的注意事项：
1.PCR扩增前后使用的加样器具要分开，不得混用。
2.EB是强诱变剂，并有中度毒性，操作时请务必戴手套，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。
3.所有血液制品均应按照潜在的传染物处理。
4.当观察和拍摄胶凝体时，要戴防紫外光的保护镜，不要直视紫外光源。
5.试剂和样本应加样到微孔板的底部。
6.为避免交叉污染，在不同样本和试剂之间加样要更换枪头。
7.所有试剂和样本在检测前应准备好，一旦开始试验，为确保得到可靠结果不可中断操作。
8.Taq聚合酶粘性很大，在分装过程中必须小心操作确保准确。
9.严格按照指定的顺序操作。
五、测试步骤：选用实施例4制备的一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒
1.配制dNTP-Buffer工作液：
440μl浓缩dNTP-Buffer+560μl无菌水＝1000μl dNTP-Buffer工作液
2.配制Buffer-酶-样本混合液：
每人份用量：320μl dNTP-Buffer工作液+3.3μl Taq酶+50μl DNA＝373.3μl混合液；
3.漩涡混匀Buffer-酶-样本混合液，并瞬时离心，使液体置于管底；
4.分别向每个引物孔(1-34孔)各加入10μl上述混合液；
5.每孔再分别加入15-20μl石蜡油，用密封膜封好PCR反应板(引物板)；
6.将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内，配合使用适当的PCR板适配器。PCR循环参数见“步骤二”表1；
7.反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪，启动程序直至循环结束；
8.启动PCR程序，直到循环结束；
9.取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。或者如果不立即电泳，置于4℃可保存48小时；
10.按照引物孔位图的顺序，将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5％琼脂糖凝胶孔中；
11.开启电泳仪，在140-150V下电泳15-20分钟；
12.紫外光或紫外/凝胶成像系统下观察结果并拍摄成像，保存试验结果；
13.根据提供的HPA(1-17)特异性引物孔位图(图2)解释分型结果；
六、质量控制程序：
内参质控带(缓慢迁移的)作为成功扩增的质控手段，在阴性孔应该总是可见的；阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。
七、实验结果的判读：
A检测HPA电泳结果胶图(图1)，实验结果阴阳性判读图(图3)。
B预期结果：
阳性孔：有两条带，一条是434bp内参带，另一条是特异性扩增带
阴性孔：只有一条带，为434bp内参带，无特异性扩增带
产物大小和孔位：见HPA(1-17)特异性引物孔位图(图2)。
根据所附的“引物孔位图”或该试剂配套软件进进行分型结果的判定
该实验为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读；内参大小和扩增产物大小请参见HPA(1-17)特异性引物孔位图(图2)；并符合人类基因座位规则。
实施例6
步骤一、二、三、四和六同实施例5
五、测试步骤为：选用实施例3制备的一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒
1.配制dNTP-Buffer工作液：
440μl浓缩dNTP-Buffer+560μl无菌水＝1000μl dNTP-Buffer工作液
2.配制Buffer-酶-样本混合液：
每人份用量：320μl dNTP-Buffer工作液+3.3μl Taq酶+50μl DNA＝373.3μl Buffer-酶-样本混合液；
3.漩涡混匀Buffer-酶-样本混合液，并瞬时离心，使液体置于管底；
4.分别向引物板上第11、12、13、14引物孔各加入10μl Buffer-酶-样本混合液；
5.每孔再分别加入15-20μl石蜡油，用密封膜封好PCR反应板(引物板)；
6.将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内，配合使用适当的PCR板适配器。PCR循环参数见“步骤二”表1；
7.反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪，启动程序直至循环结束；
8.启动PCR程序，直到循环结束；
9.取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。或者如果不立即电泳，置于4℃可保存48小时；
10.按照引物孔位图的顺序，将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5％琼脂糖凝胶孔中；
11.开启电泳仪，在140-150V下电泳15-20分钟；
12.紫外光或紫外/凝胶成像系统下观察结果并拍摄成像，保存试验结果；
13.根据提供的HPA(1-17)特异性引物孔位图(图2)解释分型结果；
七、实验结果的判读：
A检测HPA6、15电泳结果胶图(图4)，实验结果阴阳性判读图(附图3)。
B预期结果：
阳性孔：有两条带，一条是434bp内参带，另一条是特异性扩增带
阴性孔：只有一条带，为434bp内参带，无特异性扩增带
产物大小和孔位：见HPA(1-17)特异性引物孔位图(图2)。
根据所附的“引物孔位图”或该试剂配套软件进进行分型结果的判定
该实验为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读；内参大小和扩增产物大小请参见HPA(1-17)特异性引物孔位图(图2)；并符合人类基因座位规则。以上各实施例涉及到的引物对如下：
HPA-1a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
HPA-1b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
HPA-2a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
HPA-2b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
HPA-3a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
HPA-3b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
HPA-4a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；
HPA-4b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；
HPA-5a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；
HPA-5b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列；
HPA-6a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；
HPA-6b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列；
HPA-15Gova引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列；
HPA-15Govb引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列；
HPA-7a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；
HPA-7b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；
HPA-8a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；
HPA-8b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；
HPA-9a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；
HPA-9b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；
HPA-10a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；
HPA-10b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；
HPA-11a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；
HPA-11b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；
HPA-12a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；
HPA-12b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；
HPA-13a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；
HPA-13b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；
HPA-14a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；
HPA-14b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列；
HPA-16a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列；
HPA-16b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64所示的核苷酸序列；
HPA-17a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66所示的核苷酸序列；
HPA-17b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68所示的核苷酸序列。
内参引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70所示的核苷酸序列。
序列表
<110>天津市秀鹏生物技术开发有限公司
<120>用于检测人血小板同种抗原基因的引物组及试剂盒
 
<160>70
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
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<400>1
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<221>mutation
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<211>20
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<213>人工序列
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<211>17
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<213>人工序列
<220>
<221>mutation
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<400>7
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<211>20
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<213>人工序列
<220>
<221>mutation
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<221>mutation
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<213>人工序列
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<221>mutation
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<221>mutation
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<400>24
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<211>23
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<213>人工序列
<220>
<221>mutation
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<400>25
ttcaaattct tggtaaatcc tgt 23
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
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<213>人工序列
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<221>mutation
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<221>mutation
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<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<211>18
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<210>51
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<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(1)…(18)
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<210>52
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(1)…(18)
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gcacaaggcg gcagtcgc  18
<210>53
<211>24
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<213>人工序列
<220>
<221>mutation
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
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<210>57
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(1)…(22)
<400>57
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<210>58
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(1)…(22)
<400>58
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<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(1)…(22)
<400>59
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<221>mutation
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ccactcacgg atttctgttg tgtttc  26

Claims (4)

1.一种用于检测人血小板同种抗原基因的引物组，其特征是包括HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对和内参引物对，所述HPA-6a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，所述HPA-6b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，所述HPA-15Gova引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列，所述HPA-15Govb引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.27、SEQ IDNO.28所示的核苷酸序列，所述内参引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测人血小板同种抗原基因的引物组，其特征是还包括HPA-1a引物对、HPA-1b引物对、HPA-2a引物对、HPA-2b引物对、HPA-3a引物对、HPA-3b引物对、HPA-4a引物对、HPA-4b引物对、HPA-5a引物对、HPA-5b引物对、HPA-7a引物对、HPA-7b引物对、HPA-8a引物对、HPA-8b引物对、HPA-9a引物对、HPA-9b引物对、HPA-10a引物对、HPA-10b引物对、HPA-11a引物对、HPA-11b引物对、HPA-12a引物对、HPA-12b引物对、HPA-13a引物对、HPA-13b引物对、HPA-14a引物对、HPA-14b引物对、HPA-16a引物对、HPA-16b引物对、HPA-17a引物对、HPA-17b引物对；
所述HPA-1a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述HPA-1b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述HPA-2a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述HPA-2b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
所述HPA-3a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
所述HPA-3b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
所述HPA-4a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；
所述HPA-4b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；
所述HPA-5a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；
所述HPA-5b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列；
所述HPA-7a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；
所述HPA-7b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；
所述HPA-8a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；
所述HPA-8b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；
所述HPA-9a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；
所述HPA-9b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；
所述HPA-10a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；
所述HPA-10b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；
所述HPA-11a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；
所述HPA-11b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；
所述HPA-12a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；
所述HPA-12b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；
所述HPA-13a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；
所述HPA-13b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；
所述HPA-14a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；
所述HPA-14b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列；
所述HPA-16a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列；
所述HPA-16b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64所示的核苷酸序列；
所述HPA-17a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66所示的核苷酸序列；
所述HPA-17b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68所示的核苷酸序列。
3.一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒，包括包被有HPA-6a引物对、HPA-6b引物对、HPA-15Gova引物对、HPA-15Govb引物对、内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer，所述HPA-6a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，所述HPA-6b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，所述HPA-15Gova引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列，所述HPA-15Govb引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列，所述内参引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70所示的核苷酸序列。
4.根据权利3所述的一种用于检测人血小板同种抗原基因的试剂盒，其特征是所述引物板上还包被有HPA-1a引物对、HPA-1b引物对、HPA-2a引物对、HPA-2b引物对、HPA-3a引物对、HPA-3b引物对、HPA-4a引物对、HPA-4b引物对、HPA-5a引物对、HPA-5b引物对、HPA-7a引物对、HPA-7b引物对、HPA-8a引物对、HPA-8b引物对、HPA-9a引物对、HPA-9b引物对、HPA-10a引物对、HPA-10b引物对、HPA-11a引物对、HPA-11b引物对、HPA-12a引物对、HPA-12b引物对、HPA-13a引物对、HPA-13b引物对、HPA-14a引物对、HPA-14b引物对、HPA-16a引物对、HPA-16b引物对、HPA-17a引物对、HPA-17b引物对；
所述HPA-1a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述HPA-1b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述HPA-2a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述HPA-2b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
所述HPA-3a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
所述HPA-3b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
所述HPA-4a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；
所述HPA-4b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；
所述HPA-5a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；
所述HPA-5b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列；
所述HPA-7a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；
所述HPA-7b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；
所述HPA-8a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；
所述HPA-8b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；
所述HPA-9a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；
所述HPA-9b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；
所述HPA-10a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；
所述HPA-10b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；
所述HPA-11a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；
所述HPA-11b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；
所述HPA-12a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；
所述HPA-12b引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；
所述HPA-13a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；
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所述HPA-14a引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；
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