CN104694656A - 用于检测人类红细胞Diego血型基因分型的引物组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的引物组及试剂盒。用于Diego血型基因测定的引物组包括Di^a引物对，Di^b引物对及内参引物对。本发明的试剂盒克服了血清学方法鉴定Diego血型的种种限制、是正确判定血型不可缺少的辅助手段，具有广泛的应用前景和临床参考价值。

Description

用于检测人类红细胞Diego血型基因分型的引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于检测人类红细胞Diego血型基因分型的试剂盒（PCR-SSP法）。

背景技术

传统的Dia和Dib相应的ISBT符号为DI1和DI2,这是Diego血型系统中最具有临床意义的一对抗原.Diego血型系统抗原相应的抗-Dia可以引起新生儿溶血病,也可以破坏输入的Dia抗原红细胞,抗-Dib非常罕见,但同样能引起新生儿溶血病(HDN)和溶血性输血反应,具有临床意义,Dia和Dib抗原可以用血清学方法鉴定,但试剂较为昂贵,特别是抗-Dib定型试剂,市场上更是难以购买,且临床因产生抗-Dib所引起的输血问题,寻找相合的血源是非常困难的,我国随机人群中调查DI1基因频率为0.0357,DI2基因频率为0.9643,Di(a+b-)表现型的人低于千分之一,因此,我们建立了Diego血型基因分型技术,并用于临床Diego血型的鉴定,以及Di(a+b-)献血人员的筛检。

Diego在1955年被发现，它因第一个产生抗新血型系统抗原的病人而命名，这个病人生下了一个患有新生儿溶血病的婴儿，在其血清中发现了一种抗体（现称为anti-Dia），这种抗体可以在怀孕期间通过胎盘屏障攻击胎儿（表达Dia抗原）的红细胞在1967，第二个diego抗原（Dib）被发现，直到1995其他的diego抗原相继被发现。现今已经发现了21种diego抗原，但以Dia和Dib最为重要，它是决定一个人diego血型的关键因素。Anti-Dia和anti-Dib既可以引起新生儿溶血病又可以引发输血不良反应，特别是新生儿溶血病在东南亚和南美普遍是由diego抗体所引起的，因此，通过对diego血型的深入研究可以预防新生儿溶血病和因diego血型不合而引起的输血不良反应的发生。对实现安全输血有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是：克服血清学检测试剂的价格昂贵，试剂不好购买等不足，提供一种免疫学方法能够简单方便的检测人类红细胞Diego血型基因的引物组。

本发明的第二个目的是提供一种具有灵敏、特异、经济、简便、快速的用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒。

一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的引物组，其特征是包括Di^a引物对，Di^b引物对及内参引物对。

所述Di^a的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

所述Di^b的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒，其特征是包括包被有Di^a引物对，Di^b引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。

所述Di^a的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

所述Di^b的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

附图说明

图 1为人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图。

图 2为实验结果阴阳性判读图。

图 3 为人类红细胞Diego血型基因测定结果分型读板纸。

图 4 为人类红细胞Diego血型基因测定试剂盒Diego电泳结果胶图。

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1。

依据美国国立生物技术信息中心基因库（NCBI Gene Bank）公开的Diego等位基因序列，设计出用于检测人类红细胞Diego血型基因的引物组，该引物组包括Di^a引物对，Di^b引物对及内参引物对。

实施例2。

一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒，包括包被有Di^a引物对，Di^b引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。

用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒的制备方法是：

(1)    依据人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图（见图1），分别将Di^a引物对，Di^b引物对及内参引物对包被至引物板的相应位置上，干燥处理；

(2)    依据配220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1% TritonX-100制备出440μl 浓缩dNTP-Buffer；

(3)    将包被有引物对的引物板每人份检测包括2孔特异性引物孔，浓缩dNTP-Buffer组成一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒。

实施例3。

使用操作流程。

一、2.5%琼脂糖凝胶的准备。

1. 将加入2.5g琼脂糖加入100ml 1×TBE 溶液（Tris-硼酸盐-EDTA溶液），加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂，混合均匀。

2. 将凝胶槽置于水平位置，向凝胶槽中加入适量凝胶溶液，插入电泳梳。前后水平移动凝胶槽，确保凝胶溶液覆盖均匀。

3. 待凝胶完全凝固后，竖直拔出电泳梳。

二、PCR循环参数见表1。

  表1 扩增参数特征表。

1	96℃/2 min	1 cycle
			2	96℃/20 sec, 68℃/60 sec	5 cycles
3	96℃/20 sec, 65℃/45 sec, 72℃/30 sec	10 cycles
			4	96℃/20 sec, 62℃/45 sec, 72℃/30 sec	15 cycles
5	72℃/3 min	1 cycle
			6	4℃保存

三、必须满足的试验条件。

1.  从冷冻室取出Taq聚合酶，放置冰上备用。

2.   根据实验所需数量，将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出，放置室温解冻，备用。

3.   根据实验所需数量，将冷冻的DNA样本、浓缩dNTP-Buffer取出，彻底融化，混匀离心。

四、实验过程中的注意事项。

1.  PCR扩增前后使用的加样器具要分开，不得混用。

2.   所有血液制品均应按照潜在的传染物处理。

3.  当观察和拍摄胶凝体时，要戴防紫外光的保护镜，不要直视紫外光源。

4.  试剂和样本应加样到微孔板的底部。

5.   为避免交叉污染，在不同样本和试剂之间要更换加样枪头。

6.   在检测前应准备好所有试剂和样本，一旦开始试验，为确保得到可靠结果不可中断操作。

7.  Taq聚合酶粘性很大，在分装过程中必须小心操作确保准确。

8.   严格按照指定的顺序操作。

五、操作步骤。

 1.  选用实施例2制备的一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒，配制dNTP-Buffer工作液：

440μl浓缩dNTP-Buffer + 560μl无菌水=1000μl dNTP-Buffer工作液。

2.  配制Buffer-酶混合液：

每人份用量：20μl dNTP-Buffer工作液 + 0.3μl Taq酶（5 units/μl）+2μl DNA = 22.3μl 。

3.  漩涡混匀Buffer-酶混合液，并瞬时离心，，使液体位于管底。

4.  分别向每个引物孔加入10μl上述混合液。

5.  每孔再分别加入15-20μl石蜡油，用密封膜封好PCR反应板（引物板）。

6.  将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内，配合使用适当的板架适配器。PCR循环参数见上文。

7.   反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪，启动程序直至循环结束。

8.  启动PCR程序，直到循环结束。

9.  取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。或者如果不立即电泳，置于4℃可保存48小时。

10.按照引物孔位图的顺序，将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中。

11.140-150V电泳15-20分钟，内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳。

12.紫外光下观察结果并拍摄成像。

13.根据提供的读板纸解释分型结果。

六、质量控制程序：

内参质控带（缓慢迁移的）作为成功扩增的质控手段，在阴性孔应该总是可见的；阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。

七、实验结果的判读：

人类红细胞Diego血型基因检测试剂盒电泳结果胶图（见图4）；

实验结果阴阳性判读图（见图2）；

人类红细胞Diego血型基因测定结果分型读板纸（见图3）。

预期结果：

阳性孔：有两条带，一条是内参带，另一条是特异性扩增带；

阴性孔：只有一条带，是内参带，无特异性扩增带；

产物大小和孔位：见人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图（见图1）；

根据人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图（见图1）或该试剂配套软件进行分型结果的判定。

该实验为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读；扩增产物大小请参见人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图(见图1) ；并符合人类基因座位规则。

以上各实验涉及到的引物对如下。

所述Di^a的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

所述Di^b的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

序列表

<110>天津市秀鹏生物技术开发有限公司

<120>人类红细胞Diego血型基因测定试剂盒（PCR-SSP法）

 

<160>17

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mutation

<222> (1)……(19)

<400> 1

gggtggtgaagtccacgct   19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mutation

<222> (1)……(20)

<400> 2

ccagtcgtgccatcacttcc   20

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mutation

<222> (1)……(18)

<400> 3

ggtggtgaagtccacgcc   18

 

Claims (2)

1.一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的引物组，其特征是包括Di^a引物对，Di^b引物对及内参引物对；

所述Di^a的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述Di^b的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒，其特征是包括包被有Di^a引物对，Di^b引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer；

所述Di^a的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述Di^b的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。