CN104694656A - 用于检测人类红细胞Diego血型基因分型的引物组及试剂盒 - Google Patents

用于检测人类红细胞Diego血型基因分型的引物组及试剂盒 Download PDF

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的引物组及试剂盒。用于Diego血型基因测定的引物组包括Dia引物对，Dib引物对及内参引物对。本发明的试剂盒克服了血清学方法鉴定Diego血型的种种限制、是正确判定血型不可缺少的辅助手段，具有广泛的应用前景和临床参考价值。

Description

用于检测人类红细胞Diego血型基因分型的引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于检测人类红细胞Diego血型基因分型的试剂盒（PCR-SSP法）。
背景技术
传统的Dia和Dib相应的ISBT符号为DI1和DI2,这是Diego血型系统中最具有临床意义的一对抗原.Diego血型系统抗原相应的抗-Dia可以引起新生儿溶血病,也可以破坏输入的Dia抗原红细胞,抗-Dib非常罕见,但同样能引起新生儿溶血病(HDN)和溶血性输血反应,具有临床意义,Dia和Dib抗原可以用血清学方法鉴定,但试剂较为昂贵,特别是抗-Dib定型试剂,市场上更是难以购买,且临床因产生抗-Dib所引起的输血问题,寻找相合的血源是非常困难的,我国随机人群中调查DI1基因频率为0.0357,DI2基因频率为0.9643,Di(a+b-)表现型的人低于千分之一,因此,我们建立了Diego血型基因分型技术,并用于临床Diego血型的鉴定,以及Di(a+b-)献血人员的筛检。
Diego在1955年被发现，它因第一个产生抗新血型系统抗原的病人而命名，这个病人生下了一个患有新生儿溶血病的婴儿，在其血清中发现了一种抗体（现称为anti-Dia），这种抗体可以在怀孕期间通过胎盘屏障攻击胎儿（表达Dia抗原）的红细胞在1967，第二个diego抗原（Dib）被发现，直到1995其他的diego抗原相继被发现。现今已经发现了21种diego抗原，但以Dia和Dib最为重要，它是决定一个人diego血型的关键因素。Anti-Dia和anti-Dib既可以引起新生儿溶血病又可以引发输血不良反应，特别是新生儿溶血病在东南亚和南美普遍是由diego抗体所引起的，因此，通过对diego血型的深入研究可以预防新生儿溶血病和因diego血型不合而引起的输血不良反应的发生。对实现安全输血有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是：克服血清学检测试剂的价格昂贵，试剂不好购买等不足，提供一种免疫学方法能够简单方便的检测人类红细胞Diego血型基因的引物组。
本发明的第二个目的是提供一种具有灵敏、特异、经济、简便、快速的用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒。
一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的引物组，其特征是包括Dia引物对，Dib引物对及内参引物对。
所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒，其特征是包括包被有Dia引物对，Dib引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。
所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
附图说明
图 1为人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图。
图 2为实验结果阴阳性判读图。
图 3 为人类红细胞Diego血型基因测定结果分型读板纸。
图 4 为人类红细胞Diego血型基因测定试剂盒Diego电泳结果胶图。
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1。
依据美国国立生物技术信息中心基因库（NCBI Gene Bank）公开的Diego等位基因序列，设计出用于检测人类红细胞Diego血型基因的引物组，该引物组包括Dia引物对，Dib引物对及内参引物对。
实施例2。
一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒，包括包被有Dia引物对，Dib引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。
用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒的制备方法是：
(1)    依据人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图（见图1），分别将Dia引物对，Dib引物对及内参引物对包被至引物板的相应位置上，干燥处理；
(2)    依据配220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1% TritonX-100制备出440μl 浓缩dNTP-Buffer；
(3)    将包被有引物对的引物板每人份检测包括2孔特异性引物孔，浓缩dNTP-Buffer组成一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒。
实施例3。
使用操作流程。
一、2.5%琼脂糖凝胶的准备。
1. 将加入2.5g琼脂糖加入100ml 1×TBE 溶液（Tris-硼酸盐-EDTA溶液），加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂，混合均匀。
2. 将凝胶槽置于水平位置，向凝胶槽中加入适量凝胶溶液，插入电泳梳。前后水平移动凝胶槽，确保凝胶溶液覆盖均匀。
3. 待凝胶完全凝固后，竖直拔出电泳梳。
二、PCR循环参数见表1。
  表1 扩增参数特征表。
1 96℃/2 min 1 cycle
2 96℃/20 sec, 68℃/60 sec 5 cycles
3 96℃/20 sec, 65℃/45 sec, 72℃/30 sec 10 cycles
4 96℃/20 sec, 62℃/45 sec, 72℃/30 sec 15 cycles
5 72℃/3 min 1 cycle
6 4℃保存  
三、必须满足的试验条件。
1.  从冷冻室取出Taq聚合酶，放置冰上备用。
2.   根据实验所需数量，将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出，放置室温解冻，备用。
3.   根据实验所需数量，将冷冻的DNA样本、浓缩dNTP-Buffer取出，彻底融化，混匀离心。
四、实验过程中的注意事项。
1.  PCR扩增前后使用的加样器具要分开，不得混用。
2.   所有血液制品均应按照潜在的传染物处理。
3.  当观察和拍摄胶凝体时，要戴防紫外光的保护镜，不要直视紫外光源。
4.  试剂和样本应加样到微孔板的底部。
5.   为避免交叉污染，在不同样本和试剂之间要更换加样枪头。
6.   在检测前应准备好所有试剂和样本，一旦开始试验，为确保得到可靠结果不可中断操作。
7.  Taq聚合酶粘性很大，在分装过程中必须小心操作确保准确。
8.   严格按照指定的顺序操作。
五、操作步骤。
 1.  选用实施例2制备的一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒，配制dNTP-Buffer工作液：
440μl浓缩dNTP-Buffer + 560μl无菌水=1000μl dNTP-Buffer工作液。
2.  配制Buffer-酶混合液：
每人份用量：20μl dNTP-Buffer工作液 + 0.3μl Taq酶（5 units/μl）+2μl DNA = 22.3μl 。
3.  漩涡混匀Buffer-酶混合液，并瞬时离心，，使液体位于管底。
4.  分别向每个引物孔加入10μl上述混合液。
5.  每孔再分别加入15-20μl石蜡油，用密封膜封好PCR反应板（引物板）。
6.  将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内，配合使用适当的板架适配器。PCR循环参数见上文。
7.   反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪，启动程序直至循环结束。
8.  启动PCR程序，直到循环结束。
9.  取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。或者如果不立即电泳，置于4℃可保存48小时。
10.按照引物孔位图的顺序，将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中。
11.140-150V电泳15-20分钟，内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳。
12.紫外光下观察结果并拍摄成像。
13.根据提供的读板纸解释分型结果。
六、质量控制程序：
内参质控带（缓慢迁移的）作为成功扩增的质控手段，在阴性孔应该总是可见的；阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。
七、实验结果的判读：
人类红细胞Diego血型基因检测试剂盒电泳结果胶图（见图4）；
实验结果阴阳性判读图（见图2）；
人类红细胞Diego血型基因测定结果分型读板纸（见图3）。
预期结果：
阳性孔：有两条带，一条是内参带，另一条是特异性扩增带；
阴性孔：只有一条带，是内参带，无特异性扩增带；
产物大小和孔位：见人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图（见图1）；
根据人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图（见图1）或该试剂配套软件进行分型结果的判定。
该实验为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读；扩增产物大小请参见人类红细胞Diego血型基因特异引物孔位图(见图1) ；并符合人类基因座位规则。
以上各实验涉及到的引物对如下。
所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
序列表
<110>天津市秀鹏生物技术开发有限公司
<120>人类红细胞Diego血型基因测定试剂盒（PCR-SSP法）
 
<160>17
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(19)
<400> 1
gggtggtgaagtccacgct   19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(20)
<400> 2
ccagtcgtgccatcacttcc   20
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222> (1)……(18)
<400> 3
ggtggtgaagtccacgcc   18
 

Claims (2)

1.一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的引物组，其特征是包括Dia引物对，Dib引物对及内参引物对；
所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测人类红细胞Diego血型基因的试剂盒，其特征是包括包被有Dia引物对，Dib引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer；
所述Dia的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述Dib的上下游引物位于Diego的DNA参考序列的EXON18 2541-2561和Intron18 203-223位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
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